BR112014001834B1

BR112014001834B1 - Método para controlar nematoides e uso de bacillus subtilis qst713

Info

Publication number: BR112014001834B1
Application number: BR112014001834-0A
Authority: BR
Inventors: Reed Nathan Royalty; Varghese THOMAS; Roy WHITSON
Original assignee: Bayer Cropscience Lp
Priority date: 2011-07-25
Filing date: 2012-07-24
Publication date: 2019-03-12
Also published as: MX2014000984A; JP6054392B2; WO2013016328A1; MX361288B; EP2736340A1; US20130189227A1; CR20140073A; AR087314A1; ZA201400808B; CN103796516A; BR112014001834A2; TW201316901A; CN103796516B; MA35359B1; ES2663372T3; PT2736340T; US9554578B2; EP2736340B1; DOP2014000015A; GT201400014A

Abstract

resumo patente de invenção: "biocontrole de nematoides". a presente invenção refere-se a um método para usar uma cepa de bacillus como um nematicida e composições relacionadas.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício dos seguintes pedidos provisórios de patentes sob 35 U.S.C. Seção 119: Pedido Provisório U.S. N° 61/511 508, depositado em 25 de julho de 2011, Pedido Provisório U.S. N° 61/556 016, depositado em 4 de novembro de 2011, e Pedido Provisório U.S. N° 61/661 763, depositado em 19 de junho de 2012. Cada um dos pedidos de 10 patente provisórios acima mencionados são incorporados por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao controle de nematoides parasitas de plantas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Nematoides parasitas de plantas causam dano significativo a uma ampla variedade de culturas, resultando em perdas globais de produção em sulfuras estimadas em 5% a 12% anualmente. Dano às raízes por nematoides é muito comum e leva a plantas raquíticas, que possuem sistemas radiculares 20 menores, apresentam sintomas de deficiências minerais em suas folhas e murcham facilmente. Dano por nematoides também predispõe as plantas à infecção por uma ampla variedade de fungos e bactérias patogênicos para plantas.

Para combater e controlar nematoides, fazendeiros tipicamente 25 usam nematicidas químicos. Estes vão de fumigação com gás e líquido, como brometo de metila e cloropicrina, à aplicação de organofosfatos e carbamatos, como tionazina e oxamila. O uso destes nematicidas químicos está em curso há várias décadas. A despeito da eficácia do nematicida químico no controle de nematoides alvo, existem sérias limitações a estes 30 métodos. Uma limitação é que nematicidas químicos não podem agir contra nematoides que já penetraram na raiz. Outra limitação é o perigo associado com a produção e uso de nematicidas químicos. Nematicidas químicos são altamente tóxicos e podem levar a envenenamento e morte de humanos. Em

Petição 870180154639, de 23/11/2018, pág. 7/68

2/30 resultado disso, países restringiram e algumas vezes aboliram certos pesticidas. Brometo de metila em particular é proibido na maioria dos países devido a seus efeitos de destruição do ozônio.

Por causa destas restrições e proibições oficiais, existe uma falta de soluções viáveis para nematoides. A presente invenção provê um meio seguro e eficaz de substituir ou diminuir o uso de pesticidas químicos. É também excepcional no provimento de uma solução que tanto inibe a penetração do nematoide na raiz da planta quanto impede a maturação dos nematoides que conseguem superar esta barreira inicial.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê métodos e composições para o controle de nematoides parasitas de plantas. A invenção provê um método para controlar nematoides consistindo em aplicar a uma planta, uma parte de planta e/ou um local da planta uma quantidade eficaz de Bacillus subtilis QST713, mutantes de Bacillus subtilis QST713 e/ou metabolitos de Bacillus subtilis QST713. Em algumas modalidades, o Bacillus subtilis QST713 é aplicado como um produto de fermentação que inclui o Bacillus subtilis QST713, seus metabolitos e, opcionalmente, caldo residual de fermentação. Em uma modalidade, o produto de fermentação é composto substancialmente de células de Bacillus subtilis QST713 ou células de um mutante de Bacillus subtilis QST713.

As composições baseadas em Bacillus subtilis da presente invenção reduzem ovos de nematoides das galhas radiculares (root-knot nematodes), reduzem a penetração em plantas de nematoides das galhas radiculares, e/ou inibem a maturação de nematoides das galhas radiculares que penetram nas plantas. Em algumas modalidades, os nematoides alvo (isto é, nematoides que são controlados) são nematoides das galhas radiculares causadores de doenças. Em certos casos, os nematoides são da espécie Meloidogyne. Em outras modalidades, os nematoides alvo das composições da presente invenção são nematoides de cisto. Em certos casos, os nematoides alvo são da espécie Heterodera. Em outras modalidades, os nematoides alvo são da espécie Globodera. Em outras modalidades, os ne

3/30 matoides alvo são das seguintes espécies: Paratylenchus, Pratylenchus, Paratríchodorus, Críconemella, Helícotylenchus, Meloídogyne, e Criconemoides. Em um caso particular, os nematoides são Helícotylenchus pseudorobustus (Spiral HP) ou Helícotylenchus digonicus (Spiral HD).

Em algumas modalidades, as composições acima descritas são misturadas com pelo menos um outro pesticida, como um fungicida, inseticida, nematicida ou herbicida. Em uma modalidade, o pesticida é um nematicida. Em certas modalidades a composição baseada em Bacillus subtilis da presente invenção é misturada em tanque com um nematicida formulado que pode ser comercialmente disponível. Em outras modalidades, a composição baseada em Bacillus subtilis é misturada com um ingrediente ativo (isto é(um) composto(s) que é(são) ativo(s) contra fungos, insetos, nematoides ou ervas daninhas) e então formulada com inertes, de modo que os vários ativos formem um produto. Em uma modalidade o outro ingrediente ativo nematicida é carbamato ou organofosfato. Em outro é um nematicida biológico.

A presente invenção provê composições contendo Bacillus subtilis QST713 ou mutantes dos mesmos e um segundo agente de controle de nematoide. Em algumas modalidades, o segundo agente de controle de nematoide é um carbamato ou um organofosfato.

A presente invenção inclui ainda quaisquer das composições da presente invenção contendo adicionalmente um inerte de formulação ou outro ingrediente de formulação como polissacarídeos (amidos, maltodextrinas, metilceluloses, proteínas, como proteína do soro do leite, peptídeos, gomas), açúcares (lactose, trealose, sacarose), lipídios (lecitina, óleos vegetais, óleos minerais), sais (cloreto de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio), e silicatos (argilas, sílica amorfa, sílicas pirogênicas / precipitadas, sais silicato). Em algumas modalidades, como aquelas em que as composições são aplicadas ao solo, as composições da presente invenção incluem um portador como água ou um mineral ou material orgânico como turfa, que facilita a incorporação das composições no solo. Em algumas modalidades, como aquelas em que a composição é usada para tratamento de sementes ou co

4/30 mo imersão de raízes, o portador é um ligante ou adesivo que facilita a aderência da composição à semente ou raiz. Em outra modalidade na qual as composições são usadas como tratamento de sementes, o ingrediente de formulação é um colorante. Em outras composições, o ingrediente de formulação é um conservante.

Em algumas modalidades, as composições são aplicadas a plantas, partes de plantas ou locais das plantas, como solo, antes da plantação. Em outras modalidades, as composições são aplicadas na hora do plantio. Em ainda outras, as composições são aplicadas após plantio.

Em certas modalidades, aplicação das composições é precedida por uma etapa que compreende identificar que a planta ou local da planta para crescimento necessita de tratamento. Em algumas modalidades, a identificação inclui determinar se o local para desenvolvimento da planta excede o limiar econômico para infestação por nematoide.

Em algumas modalidades, a presente invenção abrange um kit que inclui Bacillus subtilis QST713 ou mutantes do mesmo e instruções para seu uso como nematicida. Em algumas modalidades estas instruções são um rótulo do produto. Em algumas modalidades, as instruções direcionam o usuário a usar o Bacillus subtilis QST713 ou um mutante do mesmo a uma taxa de cerca de 2 x 10¹² a cerca de 6 x 10¹³ cfu por acre. Em algumas modalidades, estas instruções são para uso do Bacillus subtilis como nematicida em combinação com um nematicida químico. Em certos casos, as instruções direcionam o usuário a usar o nematicida químico a uma taxa que é inferior à taxa recomendada em um rótulo de produto para o nematicida químico quando usado como um tratamento autônomo. Em algumas outras modalidades, as instruções podem direcionar o usuário a aplicar o Bacillus subtilis QST713 ou mutantes do mesmo ao solo em contato com as raízes da plantaao solo na base da planta, ou ao solo dentro de uma distância específica ao redor da base da planta (por exemplo, em uma distância de cerca de 5 cm, cerca de 10 cm, cerca de 15 cm, cerca de 20 cm, cerca de 25 cm, cerca de 30 cm, cerca de 35 cm, cerca de 40 cm, cerca de 45 cm, cerca de 50 cm, cerca de 55 cm, cerca de 60 cm, cerca de 65 cm, cerca de 70 cm,

5/30 cerca de 75 cm, cerca de 80 cm, cerca de 85 cm, cerca de 90 cm, cerca de 95 cm, cerca de 100 cm, ou mais ao redor da base da planta). As instruções podem também direcionar o usuário a fazer múltiplas aplicações do Bacillus subtilis QST713 ou mutantes do mesmo em intervalos de cerca de 10 a cerca de 18 dias e/ou a uma taxa de cerca de 7 x 10⁵ a cerca de 1 x 10⁷ cfu. por grama de solo por aplicação. As instruções podem ainda direcionar o usuário a usar o Bacillus subtilis QST713 ou mutantes do mesmo em combinação com o nematicida químico no plantio e usar Bacillus subtilis QST713 ou mutantes do mesmo sozinho em aplicações subsequentes. Em uma modalidade, as instruções direcionam o usuário a aplicar o Bacillus subtilis QST713 ou mutantes do mesmo uma única aplicação a uma taxa de cerca de 7 x 10⁵a cerca de. 1 x 10⁷ cfu por grama de solo. Em outra modalidade, as instruções direcionam o usuário a aplicar o Bacillus subtilis QST713 ou mutantes do mesmo em múltiplas aplicações a uma taxa de cerca de 1 x 10⁵ a cerca de 3 x 10⁶ cfu por grama de solo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra o efeito de tratamento com caldo integral de QST713 em galhas de raízes infestadas com nematoides das galhas radiculares. Note que caldo integral de QST713 é designado como AQ713 nesta e nas outras figuras. O controle não tratado é designado como UTC na figura.

A Figura 2 mostra o efeito do tratamento com o produto SERENADE® ASO com várias taxas em plântulas infestadas com nematoides das galhas radiculares. Especificamente, resultados mostram a extensão de formação de galhas nas raízes e penetração e efeitos no desenvolvimento do nematoide. A primeira barra de cada conjunto de três barras correspondente a cada tratamento (Serenade ASO 5,0%, 2,5% e 1,0% e UTC) representa formação de galhas, a segunda barra representa a penetração do nematoide e a terceira representa o desenvolvimento do nematoide.

A Figura 3 representa ovos de nematoide das galhas radiculares por planta tratada com várias bateladas de caldo integral AQ713 em comparação com plantas não tratadas (designadas como UTC na figura).

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A Figura 4 representa ovos de nematoide das galhas radiculares por planta tratada com o produto SERENADE SOIL®, independentemente ou em combinação com o produto INLINE (com ingredientes ativos de 1,3dicloropropeno + cloropicrina em comparação com plantas não tratadas (designadas como UTC) e plantas tratadas com o produto INLINE sozinho.. Vários tratamentos indicados na Tabela 2 são designados como T1, T2, T3 e T4 na figura.

A Figura 5 representa penetração de nematoides das galhas radiculares por raiz de planta (Figura 5A) e desenvolvimento de nematoides das galhas radiculares por raiz de planta (Figura 5B) tratada com caldo integral AQ713 e desafiada com nematoides juvenis em intervalos de 1 dia, 6 dias, 9 dias, e 14 dias (T1 , T6, T9 e T14). Na Figura 5A, a linha pontilhada representa o controle não tratado (UTC) enquanto a linha contínua representa o tratamento com AQ713.

A Figura 6 representa o total de ovos produzidos por nematoides das galhas radiculares por raiz de planta após as plantas serem encharcadas com caldo integral AQ713 no Dia 0 (TO) e serem desafiadas com nematoides em 1, 2, ou 3 semanas (T7, T14, ou T21). O controle não tratado (UTC) é a primeira barra em cada par de barras providas para cada data de inoculação. A segunda barra de cada par representa resultados com tratamento com AQ713.

A Figura 7 representa taxa de galhas (Figura 7A) total de ovos por raiz (Figura 7B) e pesos de brotos novos (Figura 7C) de plantas tratadas com aplicações únicas ou múltiplas do produto SERENADE® ASO.

A Figura 8 representa o total de ovos por grama de raiz para plantas tratadas com uma única aplicação de SERENADE® ASO em várias dosagens.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente, incluindo desenhos e apêndices aqui são incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

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A seguinte descrição inclui informação que pode ser útil para entender a presente invenção. Não é reconhecido que qualquer informação aqui fornecida constitua técnica anterior ou seja relevante para as invenções presentemente reivindicadas, ou que qualquer publicação especifica ou implicitamente referenciada seja técnica anterior.

O produto SERENADE® (Registro EPA No. 69592-12) contém uma única cepa patenteada de Bacillus subtilis (cepa QST713) e muitos lipopeptídeos diferentes que trabalham sinergicamente para destruir patógenos de doenças e prover atividade antimicrobiana superior. O produto SERENADE® é usado para proteger plantas como vegetais, frutas, nozes e vinícolas contra doenças como Fogo Bacteriano (Fire Blight), Mofo cinzento (Botrytis), Podridão Ácida (Sour Rot), Ferrugem (Rust), Mofo Branco ou podridão da haste (Sclerotinia), Oídio (Powdery Mildew), Mancha Bacteriana (Bacterial Spot) e Mofo branco (White Mold). Os produtos SERENADE® são disponíveis como formulações líquidas ou secas que podem ser aplicadas como tratamento foliar ou de solo. Cópias de EPA Master Labeis para produtos SERENADE®, incluindo SERENADE® ASO, SERENADE® MAX, e SERENADE SOIL®, estão publicamente disponíveis através de National Pesticide Information Retrieval Systerrfs (NPIRS®) USEPA/OPP Pesticide Product Labei System (PPLS).

SERENADE® ASO (Aqueous Suspension-Organic - suspensão orgânica aquosa) contém 1,34% de QST713 seco como um ingrediente ativo e 98,66% de outros ingredientes. SERENADE® ASO é formulado para conter um mínimo de 1 x 10⁹ cfu/g de QST713 enquanto a quantidade máxima de QST713 foi determinada como sendo de 3,3 x 10¹° cfu/g. Nomes comerciais alternativos para SERENADE® ASO incluem SERENADE BIOFUNGICIDE®, SERENADE SOIL® e SERENADE® GARDEN DISEASE. Para mais informações, ver os U.S. EPA Master Labeis para SERENADE® ASO datados de 4 de janeiro de 2010 e SERENADE SOIL®, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

SERENADE® MAX contém 14,6% de QST713 seco como ingrediente ativo e 85,4% de outros ingredientes. SERENADE® MAX é formulado

8/30 para conter um mínimo de 7,3 x 10⁹ cfu/g de QST713 enquanto a quantidade máxima de QST713 foi determinada como sendo 7,9 x 10¹° cfu/g. Para mais informação, ver o U.S. EPA Master Labei para SERENADE® MAX, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Bacillus subtilis QST713, seus mutantes, seus sobrenadantes, e seus metabolitos lipopeptídicos, e métodos para seu uso para controlar patógenos de plantas e insertos são totalmente descritos nas Patentes U.S. Nos. 6 060 051; 6 103 228; 6 291 426; 6 417 163; e 6 638 910; cada um dos quais é especifica e inteiramente incorporados por referência aqui por tudo que ensina. Nestas patentes U.S., a cepa é referida como AQ713, que é sinônimo de QST713. Bacillus subtilis QST713 foi depositado com o NRRL em 7 de maio de 1997, de acordo com as disposições do Tratado de Budapest sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para fins de Procedimentos de patentes com o Número de Acesso B21661. Quaisquer referências neste relatório a QST713 se referem a Bacillus subtilis QST713 (aka AQ713) como presente nos produtos SERENADE®, depositado com o número de acesso a NRRL B21661, ou preparado em biorreatores ou frascos de sacudimento em condições que simulam a produção do produto SERENADE®.

As patentes acima referenciadas descrevem teste do sobrenadante de caldo integral de Bacillus subtilis QST713 contra a cepa N2 do nematoide Caenorhabditis elegans. Estes testes mostraram que o sobrenadante não tinha atividade nematicida.

Na ocasião do depósito do Pedido de Patente U.S. N° 09/074.870 em 1998, que corresponde às patentes acima, a cepa QST713 foi designada como Bacillus subtilis com base em métodos morfológicos, bioquímicos e fisiológicos clássicos. Taxonomia da espécie Bacillus evoluiu desde então, especialmente à luz de avanços na genética e ciências de sequenciamento, de modo que a designação da espécie é baseada amplamente em sequência de DNA ao invés de métodos usados em 1998. Após alinhar sequências de proteína de B. amyloliquefaciens FZB42, B. subtilis 168 e QST713, aproximadamente 95% das proteínas encontradas em B. amylo

9/30 liquefaciens FZB42 são 85% ou mais iguais às proteínas encontradas em QST713; enquanto somente 35% das proteínas em B. subtilis 168 são 85% ou mias iguais às proteínas in QST713. No entanto, mesmo com a maior confiança na genética, existe ainda ambiguidade taxonômica na literatura científica relevante e documentos regulamentares pertinentes refletindo a compreensão evolutiva da taxonomia de Bacillus ao longo dos últimos 15 anos. Por exemplo, um produto pesticida baseado na cepa B. subtilis FZB24, que é tão proximamente relacionada a QST713 quanto FZB42, é classificada em documentos da Agência de Proteção Ambiental (Environmental Protection Agency) como B. subtilis var amyloliquefaciens. Devido a estas complexidades da nomenclatura, esta espécie particular de Bacillus é variadamente designada, dependendo do documento, como B. subtilis, B. amyloliquefaciens e B. subtilis var amyloliquefaciens. Portanto, foi mantida a designação B. subtilis de QST713 ao invés de alterá-la para B. amyloliquefaciens, como seria esperado correntemente com base somente na comparação sequencial e taxonomia inferida.

O termo mutante refere-se a uma variante genética derivada de QST713. Em uma modalidade, o mutante tem todas as características identificadoras de QST713. Em um caso particular, o mutante controla nematoides pelo menos tão bem quanto a cepa pai QST713. Em outra modalidade, mutantes são variantes genéticas tendo sequência genômica que tem mais que cerca de 85%, mais que cerca de 90%, mais que cerca de 95%, mais que cerca de 98%, ou mais que cerca de 99% de identidade de sequência com a cepa QST713. Mutantes podem ser obtidos tratando células QST713 com produtos químicos ou irradiação ou selecionando mutantes espontâneos de uma população de células QST713 (como mutantes resistentes a fagos) ou por outros meios bem conhecidos dos praticantes da técnica.

Composições da presente invenção podem ser obtidas cultivando Bacillus subtilis QST713 ou mutantes do mesmo de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, inclusive usando os meios e outros métodos descritos na Patente U.S. N° 6 060 051. Processos de cultura microbiana de

10/30 larga escala convencionais incluem fermentação submersa, fermentação no estado sólido, ou fermentação líquida de superfície. Ao final da fermentação, como os nutrientes são gastos, células de Bacillus subtilis começam a transição da fase de crescimento para a fase de espoliação de modo que o produto final da fermentação é amplamente esporos, metabolitos e meio de fermentação residual. Esporulação faz parte do ciclo natural da vida de Bacillus subtilis e é geralmente iniciada pela célula em resposta à limitação de nutrientes. Fermentação é configurada para obter altos níveis de unidades formadoras de colônia de Bacillus subtilis e para promover esporulação. As células bacterianas, esporos e metabolitos no meio de cultura resultante da fermentação podem ser usados ou concentrados por métodos indusrtriais convencionais, como centrifugação, filtração em fluxo tangencial, filtração de profundidade, e evaporação. Caldo e concentrado de caldo de fermentação são ambos referidos aqui como produtos de fermentação Composições da presente invenção incluem produtos de fermentação. Em algumas modalidades, o caldo concentrado de fermentação é lavado, por exemplo, por meio de um processo de diafiltração, para remover caldo e metabolitos de fermentação residuais.

O caldo ou o concentrado de caldo de fermentação pode ser seco com ou sem a adição de portadores usando processos ou métodos de secagem como secagem por atomização, liofilização (freeze drying), secagem em bandeja, secagem em leito fluidizado, secagem em tambor rotativo, ou evaporação.

Os produtos secos resultantes podem ser adicionalmente processados, como pro moagem ou granulação, para alcançar tamanho de partícula ou formato físico específicos. Portadores, descritos abaixo, podem também ser adicionados após secagem.

Preparações livres de células de caldo de fermentação das novas variantes e cepas de Bacillus da presente invenção podem ser obtidas por quaisquer meios conhecidos na técnica, como extração, centrifugação e/ou filtração de caldo de fermentação. Os versados na técnica apreciarão que as assim chamadas preparações livres de células podem não ser des

11/30 providas de células, mas são, em grande parte livres de células ou essencialmente livres de células, dependendo da técnica usada (por exemplo, velocidade de centrifugação) para remover as células. A preparação livre de células resultante pode ser seca e/ou formulada com componentes que auxiliam em sua aplicação a plantas ou a meios de crescimento de plantas. Métodos de concentração e técnicas de secagem descritas acima para caldo de fermentação são também aplicáveis a preparações livres de células.

Metabolitos de Bacillus subtilis podem ser obtidos de acordo com os métodos apresentados na Patente U.S. N° 6 060 051. O termo metabolitos, aqui utilizado, pode se referir a metabolitos semipuros e puros ou essencialmente puros, ou a metabolitos que não foram separados de Bacillus subtilis. Em algumas modalidades, após uma preparação livre de células ser feita por centrifugação de caldo de fermentação, os metabolitos podem ser purificados por filtração de exclusão por tamanho como resinas Sephadex incluindo LH-20, G10, e G 15 e G25 que agrupam metabolitos em diferentes frações com base no corte de peso molecular, como peso molecular de menos de cerca de 2000 dáltons, menos de cerca de 1500 dáltons, menos de cerca de 1000 dáltons, etc., já que lipopeptídeos ficam entre 800 dáltons e 1600 dáltons.

Métodos de concentração e técnicas de secagem descritas acima para formulação de caldo de fermentação são também aplicáveis a metabolitos.

Composições da presente invenção podem incluir inertes de formulação adicionados a composições contendo células, preparações livres de células ou metabolitos para melhorar a eficácia, estabilidade de usabilidade e/ou para facilitar o processamento, embalagem e aplicação de uso final. Esses inertes e ingredientes de formulação podem incluir portadores, agentes de estabilização, nutrientes, ou agentes modificadores de propriedade física, que podem ser adicionados individualmente ou em combinação. Em algumas modalidades, os portadores podem incluir materiais líquidos como água, óleo, e outros solventes orgânicos ou inorgânicos e materiais sólidos como minerais, polímeros, ou complexos poliméricos derivados bio

12/30 logicamente ou por síntese química. Em algumas modalidades, o portador é um ligante ou adesivo que facilita a aderência da composição a uma parte de planta, como semente ou raiz. Ver, por exemplo, Taylor, A.G., et. al., Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments (Conceitos e Tecnologias de tratamentos de semente selecionados), Annu. Rev. Phytopathol. 28: 321-339 (1990). Os agentes de estabilização podem incluir agentes antiaglutinantes, antioxidantes, dessecantes, protetores ou conservantes. Os nutrientes podem incluir fontes de carbonoo, nitrogênio, e fósforo como açúcares, polissacarídeos, óleo, proteínas, aminoácidos, ácidos graxos e fosfatas. Os modificadores de propriedade física podem incluir agentes de volume (bulking agents), umectantes, espessantes, modificadores de pH, modificadores de reologia, dispersantes, adjuvantes, tensoativos, agentes anticongelantes ou colorantes. Em algumas modalidades, a composição contendo células, preparação livre de células, ou metabolitos produzidos por fermentação podem ser usados diretamente com ou sem água como diluente sem qualquer outra preparação de formulação. Em algumas modalidades, os inertes de formulação são adicionados após concentração do caldo de fermentação e durante e/ou após secagem.

Composições da presente invenção podem incluir portadores que são ingredientes inertes de formulação adicionados a composições incluindo um produto de fermentação contendo lipopeptídeo, preparações de lipopeptídeos livres de células ou extratas purificados, semipurificados ou brutas de lipopeptídeos para melhorar a recuperação, eficácia, ou propriedades físicas, e/ou auxiliar na embalagem e administração. Esses portadores podem ser adicionados individualmente ou combinados.

As composições da presente invenção podem ser misturadas com e/ou usadas em rotação com outros aditivos químicos e não químicos, auxiliares e/ou tratamentos, em que esses tratamentos incluem, mas não se limitam a fungicidas químicos e não químicos, inseticidas, acaricidas, nematicidas, fertilizantes, nutrientes, minerais, auxinas, estimulantes de crescimento e similares.

Nematicidas com os quais as composições baseadas em Bacil

13/30 lus subtilis da presente invenção podem ser misturadas podem ser nematicidas químicos ou biológicos. O termo nematicida químico, neste contexto, exclui fumigantes, e o termo fumigantes abrange produtos químicos pesticidas de amplo espectro que são aplicados ao solo antes do plantio e que se difundem através do solo (no ar do solo e/ou água do solo) e podem ser aplicados como gases, como brometo de metila, líquidos voláteis como cloropicrina ou sólidos voláteis como dazomet.

Em algumas modalidades, o nematicida químico ou biológico é um produto formulado comercialmente disponível e é misturado em tanque e/ou usado em rotação com as composições da presente invenção. Em outras modalidades, o ingrediente ativo (sem inertes) do nematicida químico ou biológico é misturado com a composição baseada em Bacillus subtilis QST713 antes da formulação (com inertes) de modo que as composições formam um produto formulado.

Nematicidas químicos usados nessas misturas ou programas rotacionais são carbamatos, carbamatos de oxima e nematicidas organofosforados. Nematicidas carbamato incluem benomil, carbofuran (FURADAN®), carbosulfan e cloetocarb. Carbamatos oxima incluem alanicarb, aldicarb (TEMIK® ou como parte do tratamento de sementes AVICTA® Complete Pak da Syngenta), aldoxicarb, (STANDAK®), oxamil (VYDATE®), tiodicarb (parte do sistema aplicado a sementes AERIS® da Bayer CropScience), e tirpate. Nematicidas organofosforados incluem fensulfotion (DASANIT®), etoprop, (MOCAP®), diamidafos, fenamifós, fostietano, fosfamidon, cadusafós, clorpirifós, diclofention, dimetoato, fostiazato, heterofos, isamidofos, isazofos, forato, fosfocarb, terbufos, tionazina, triazofos, imicyafos, e mecarphon. Os nomes entre parênteses que seguem cada composto são formulações comerciais representativas de cada um dos produtos químicos acima. Outros nematicidas químicos úteis para essas misturas incluem spirotetramat (MOVENTO®), nematicida MON37400 e fipronila.

Nematicidas biológicos usados nessas misturas ou programas rotacionais incluem misturas de quitina e uréia, extratos e chás de compostagem (aerados e não aerados); composições contendo o fungo Myrotheci

14/30 um verrucaria e/ou metabolitos dos mesmos (comercialmente disponíveis como DITERA®), composições contendo o fungo Paecílomyces lilacinus (comercialmente disponíveis como, por exemplo, MELOCON® ou BIOACT); composições contendo a bactéria Pasteuría including P. usgae (comercialmente disponível como, por exemplo, ECONEM®); composições contendo bactérias de Bacillus sp., incluindo Bacillus firmus (incluindo a cepa depositada como CNMC 1-1582 na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institute Pasteur, França em 29 de maio de 1995, e comercialmente disponível como, por exemplo, VOTIVO®), Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus (incluindo a cepa depositada em NRRL como B30087 em 14 de janeiro de 1999 e seus mutantes) e Bacillus cereus', e composições contendo Streptomycete sp nematicida, como Streptomyces lydicus (comercialmente disponível como ACTINOVATE®). Nematicidas biológicos também incluem nematicidas de base botânica como produtos baseados em plantas de NIM (incluindo sementes ou óleo das plantas) ou azadiractina um metabolito secundário das sementes de NIM, produtos baseados em óleo de gergelim como DRAGONFIRE®), carvacrol e produtos baseados em extratos de planta (como NEMA-Q®’ obtida da árvore Quillaja saponaria do Chile). Nematicidas biológicos também incluem compostos isolados produzidos por bactérias, como as mectinas, que são produzidas por Streptomyces avermentilis, incluindo abamectina (consistindo de uma combinação de abamectina B1a e B1b) e avermectina B2a, e as proteínas harpin, originalmente identificadas em Erwinia amylovora, incluindo harpin_EA θ harpin_ap.

Composições da presente invenção são úteis para controlar os nematoides parasíticos da planta, como, por exemplo, nematoides das galhas radiculares, dos cistos, das lesões e anelados, incluindo Meloidogyne spp., Heterodera spp., Globodera spp., Pratylencus spp, e Criconemella spp. Composições são também úteis para controlar Tylenchulus semipenetrans, Trichodorus spp., Longidorus spp., Rotylenchulus spp,, Xiphinema spp., Belonolaimus spp. (como B. longicaudatus), Criconemoides spp., Tylenchorhynchus spp., Hoplolaimus spp., Rotylenchus spp,, Helícotylenchus spp. (como Helícotylenchus pseudorobustus (Spiral HP) e Helícotylenchus digoni

15/30 cus (Spiral HD)), Radopholus spp. (como R. citrophilis e R. similis), Ditylenchus spp. , Paratríchodorus spp. e outros nematoides parasíticos de planta. Em algumas modalidades os alvos são nematoides dos cistos, como Heterodera glycínes (nematoides de cisto da soja), Heterodera schachtíí (nematoide de cisto da beterraba), Heterodera avenae (nematoide de cisto de cereal), Meloidigyne incógnita (nematoide das galhas radiculares de algodão (ou do sul), Globodera rostochiensis e Globodera pallida (nematoides de cisto da batata). Em outras modalidades, os alvos são nematoides das galhas radiculares, como M. incógnita (nematoide das galhas radiculares de algodão), M. javanica (nematoide javanês), M. hapla (nematoide das galhas radiculares do norte), e M. arenaria (nematoide das galhas radiculares do amendoim).

O termo controle, neste contexto, significa matar, reduzir o número, e/ou reduzir o desenvolvimento, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal, incluindo, para nematoides das galhas radiculares, a capacidade de penetrar nas raízes e de se desenvolver no interior das raízes. Uma quantidade eletiva é uma quantidade capaz de reduzir notadamente o desenvolvimento de nematoide, alimentação, penetração na raiz, maturação na raiz, e/ou desenvolvimento fisiológico geral normal do nematoide e/ou sintomas da planta hospedeira resultantes de infecção pelo nematoide como formação de galhas ou desenvolvimento reduzido da raiz e/ou planta. Em algumas modalidades, sintomas e/ou nematoides são reduzidos em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, oru pelo menos cerca de 90%.

Composições da presente invenção são usadas para tratar uma ampla variedade de culturas agrícolas e/ou hortícolas, inclusive aquelas desenvolvidas para semeadura, produção e paisagismo. Plantas representativas que podem ser tratadas usando as composições da presente invenção incluem, mas não se limitam às seguintes vegetais bulbosos; grãos; frutas cítricas (como toranja, limão e laranja); algodão e outras culturas de fibra;

16/30 cucurbiáceas; vegetais frutíferos; vegetais folhosos (como aipo, cabeça e folha de alface, e espinafre); legumes; culturas de sementes oleosas; amendoim; frutos de pomáceas (como maçã e pera); drupas (como amêndoa, pecan, e noz); vegetais de raiz; tubérculos; vegetais de cormos; tabaco, morango e outras frutinhas vermelhas; crucíferas (como brócolis e repolho); uva; abacaxi; e plantas floríferas, plantas de canteiro, e ornamentais (samambaias e hosta). Composições da presente invenção são também usadas para tratar plantas perenes, incluindo culturas de plantação como banana e café e aquelas presentes em florestas, parques ou paisagismo.

Composições aqui descritas são aplicadas a uma planta, uma parte de planta, como semente, raiz, rizoma, cormo, bulbo, ou tubérculo, e/ou um local no qual a planta ou as partes de planta se desenvolvem, como solo, para controlar nematoides parasíticos de planta. As composições da presente invenção podem ser administradas como um spray foliar, como um tratamento de semente/raiz/tubérculo/rizoma/bulbo/cormo e/ou como um tratamento de solo. As sementes/raízes/tubérculos/rizomas/bulbos/cormos podem ser tratados antes do plantio, durante o plantio ou após o plantio.

Composições aqui descritas são também aplicadas a uma planta, uma parte de planta, como uma semente, raiz, rizoma, cormo, bulbo, ou tubérculo, e/ou um local no qual a planta ou partes de planta se desenvolvem, como solo, para controlar nematoides, aumentando assim, o rendimento da cultura. Em algumas modalidades, o rendimento da cultura é aumentado por pelo menos cerca de 5%, em outras por pelo menos cerca de 10%, em ainda outras por pelo menos cerca de 15%, e em ainda outras por pelo menos cerca de 20%.

Quando usado como um tratamento de sementes, as composições da presente invenção são aplicadas a uma taxa de cerca de 1 x 10² a cerca de 1 x 10⁹ cfu/semente, dependendo do tamanho da semente. Em algumas modalidades, a taxa de aplicação é de cerca de 1 x 10³ a cerca de 1 x 10⁸ cfu/semente ou cerca de 1 x 10⁴ a cerca de 1 x 10⁷ cfu/semente.

As presentes composições podem também ser aplicadas por imersão das raízes em uma taxa de cerca de 1 x 10³ a cerca de 1 x 10⁸ cfu/

17/30 sistema radicular da planta.

Quando usadas como tratamento de solo, as composições da presente invenção podem ser aplicadas como encharque da superfície do solo, aplicadas por sonda, injetadas e/ou aplicadas em sulco ou por mistura com água de irrigação. A taxa de aplicação para tratamentos de encharque de solo, que podem ser aplicados na ocasião do plantio, durante ou após a semeadura ou após transplante e em qualquer estágio de desenvolvimento da planta é de cerca de 4 x 10⁷ a cerca de 8 x 10¹⁴ cfu por acre ou cerca de 4 x 10⁹ a cerca de 8 x 10¹³ cfu por acre ou cerca de 4 x 10¹¹ a cerca de 8 x 10¹² cfu por acre ou cerca de 2 x 10¹² a cerca de 6 x 10¹³ cfu por acre ou cerca de 2 x 10¹² a cerca de 3 x 10¹³ cfu por acre. Em algumas modalidades, a taxa de aplicação é de cerca de 1 x 10¹² a cerca de 6 x 10¹² cfu por acre ou cerca de 1 x 10¹³ a cerca de 6 x 10¹³ cfu por acre. A taxa de aplicação para tratamentos em sulco, aplicados na ocasião do plantio, é de cerca de 2,5 x 10¹° a cerca de 5 x 10¹¹ cfu por ~305 m (1000 pés) de sulco (cfu per 1000 row feet). Em algumas modalidades, a taxa de aplicação é de cerca de 6 x 10¹° a cerca de 3 x 10¹² cfu por ~305 m de sulco ou cerca de 6 x 10¹° a cerca de 4 x 10¹¹ cfu por ~305 m de sulco ou cerca de 6 x 10¹¹ a cerca de 3 x 10¹² cfu por ~305 m de sulco ou cerca de 6 x 10¹¹ a cerca de 4 x 10¹² cfu por ~305 m de sulco. Os versados na técnica entenderão como ajustar as taxas para tratamentos de espalhamento e outros tratamentos de solo menos comuns.

As composições da presente invenção podem ser introduzidas no solo antes do plantio ou antes da germinação da semente. As composições da presente invenção podem também ser introduzidas ao solo em contato com raízes de planta, ao solo na base da planta, ao solo ao redor da base da planta (por exemplo , em uma distância de cerca de 5 cm, cerca de 10 cm, cerca de 15 cm, cerca de 20 cm, cerca de 25 cm, cerca de 30 cm, cerca de 35 cm, cerca de 40 cm, cerca de 45 cm, cerca de 50 cm, cerca de 55 cm, cerca de 60 cm, cerca de 65 cm, cerca de 70 cm, cerca de 75 cm, cerca de 80 cm, cerca de 85 cm, cerca de 90 cm, cerca de 95 cm, cerca de 100 cm, ou mais ao redor ou abaixo da base da planta). As composições

18/30 podem também ser aplicadas utilizando várias técnicas incluindo, mas não limitadas a, irrigação por gotejamento, sprinklers, injeção no solo ou encharque do solo. As composições podem também ser aplicadas ao solo e/ou plantas em bandejas (plug trays) ou a plântulas antes do transplante para um local de planta diferente. Quando aplicada ao solo em contato com as raízes de planta, à base da planta, ou ao solo em uma distância específica ao redor da base da planta, incluindo tratamento de encharque de solo, a composição pode ser aplicada como uma única aplicação ou como aplicações múltiplas. As composições podem ser aplicadas nas taxas apresentadas acima para tratamentos de encharque ou uma taxa de cerca de 1 x 10⁵a cerca de 1 x 10⁸ cfu por grama de solo, 1 x 10⁵ a cerca de 1 x 10⁷ cfu por grama de solo, 1 x 10⁵ a cerca de 1 x 10⁶ cfu por grama de solo, 7 x 10⁵ a cerca de 1 x 10⁷ cfu por grama de solo, 1 x 10⁶ a cerca de 5 x 10⁶ cfu por grama de solo, ou 1 x 10⁵ a cerca de 3 x 10⁶ cfu por grama de solo. Em uma modalidade, as composições da presente invenção são aplicadas como uma única aplicação a uma taxa de cerca de 7 x 10⁵ a cerca de 1 x 10⁷ cfu por grama de solo. Em outra modalidade, as composições da presente invenção são aplicadas como uma única aplicação a uma taxa de cerca de 1 x 10⁶ a cerca de 5 x 10⁶ cfu por grama de solo. Em outras modalidades, as composições da presente invenção são aplicados como aplicações múltiplas a uma taxa de cerca de 1 x 10⁵ a cerca de 3 x 10⁶ cfu por grama de solo.

Quando as composições da presente invenção são aplicadas como aplicações múltiplas, estas aplicações podem ocorrer em intervalos de cerca de 1 a cerca de 28 dias, de cerca de 1 a cerca de 21 dias, de cerca de. 1 a cerca de 14 dias, de cerca de 7 a cerca de 28 dias, de cerca de 7 a cerca de 21 dias, de cerca de 7 a cerca de 14 dias, ou de cerca de 10 a cerca de 18 dias.

Composições baseadas em Bacillus subtilis da presente invenção podem ser aplicadas independentemente ou em combinação com um ou mais outros nematicidas, como nematicidas químicos e biológicos. Em algumas modalidades, Bacillus subtilis QST713 é coformulado com pelo menos um outro nematicida e o produto coformulado é aplicado à planta ou ao

19/30 local da planta. Em algumas outras modalidades, as composições de Bacillus subtilis são misturadas em tanque com formulações comercialmente disponíveis dos nematicidas químicos ou biológicos e aplicadas a plantas e locais de planta. Em outras modalidades, as composições baseadas em Bacillus subtilis da presente invenção são aplicadas a plantas e/ou locais de planta imediatamente antes ou após as formulações comercialmente disponíveis dos nematicidas químicos ou biológicos. Em outras modalidades, as composições baseadas em Bacillus subtilis da presente invenção são aplicadas a plantas e/ou locais de planta em rotação com as formulações comercialmente disponíveis dos nematicidas químicos ou biológicos. Em um programa rotacional envolvendo várias aplicações de nematicidas, as composições da presente invenção podem ser aplicadas sozinhas ou em combinação com outros nematicidas. Em um caso, as composições baseadas em Bacillus subtilis são aplicadas como tratamento de sementes ou como um tratamento em sulco ou de encharque, como discutido em maiores detalhes abaixo.

Embora os requerentes não desejem se ater a qualquer teoria particular pensa-se que Bacillus subtilis QST713 controla nematoides por resistência sistêmica induzida (Induced Systemic Resistance - (ISR)) nas plantas tratadas. Para uma explanação sobre ISR, ver Bakker, P.A.H.M., Induced Systemic Resistance by Fluorescent Pseudomonas spp. (Resistência sistêmica induzida por Pseudomonas spp fluorescente) Phytophatholoqy 97(2): 239- 243 (2007). ISR pode produzir efeito somente após um certo período de latência entre o tempo de tratamento com Bacillus subtilis QST713 e desafio subsequente com nematoide à planta. Em algumas modalidades as composições baseadas em Bacillus subtilis são aplicadas em combinação com um segundo nematicida no plantio e as composições baseadas em Bacillus subtilis são aplicadas sozinhas ou em combinações com outro nematicida em aplicações subsequentes. O tratamento inicial com o segundo nematicida pode proteger a planta durante o período de latência até que as composições baseadas em Bacillus subtilis tenham desencadeado a ISR. Em alguns casos das modalidades acima, a formulação comercialmente disponível do segundo nematicida químico ou biológico é

20/30 aplicada a uma taxa abaixo da recomendação do rótulo para uso como um tratamento nematicida autônomo. Em uma modalidade, Bacillus subtilis QST713 é aplicado com oxamil (VYDATE®) no plantio e o Bacillus subtilis QST713 é aplicado sozinho em aplicações subsequentes.

Em outras modalidades, as composições baseadas em Bacillus da presente invenção são aplicadas às plantas e/ou locais de planta após aplicação de um fumigante. Fumigantes podem ser aplicados por injeção por sonda (shank injection), geralmente a um mínimo de ~20 cm (8 polegadas) abaixo da superfície do solo. Formulações líquidas de fumigantes podem também ser aplicadas através de quimigação por gotejamento superficial para mover o fumigante para uma profundidade de ~20 cm ou mais abaixo da superfície do solo. Leitos de solo tratado são cobertos com uma lona de plástico para reter o fumigante no solo por vários dias. Isto é feito antes do plantio e deixa-se arejar antes do plantio. As composições baseadas em Bacillus aqui descritas seriam aplicadas após este período de arejamento, antes, na ocasião, ou após o plantio. Em alguns casos, os fumigantes são aplicados a uma taxa que é menor do que a taxa recomendada no rótulo do produto.

Nematicidas químicos e biológicos são descritos acima. Nematicidas de fumigantes incluem hidrocarbonetos halogenados, como cloropicrina (CMLOR-O-PIC); brometo de metila (METH-O-GAS) e combinações dos mesmos (como BROM-O-GAS e TERR-O- GAS) 1,3-dicloropropeno (TELONE II, TELONE EC, CURFEW) e combinações de 1,3- dicloropropeno com cloropicrina (TELONE C-17, TELONE C-35, e INLINE); iodeto de metila (MlDAS); liberadores de isocianato de metila, como ditiocarbamato de metil e sódio (VAPAM, SOILPREP, METAM-SODIUM); combinações de 1,3 dicloropropeno e isotiocianato de metila (VORLEX); e liberadores de dissulfeto de carbono, como tetratiocarbonato de sódio (ENZONE); e dissulfeto de dimetila ou DMDS (PALADINO). Formulações comerciais de exemplo de cada um dos fumigantes são fornecidas entre parênteses após o(s) nome(s) químico(s).

Composições da presente invenção podem também ser aplica

21/30 das como parte de um programa de gerenciamento integrado de pragas (IPM). Esses programas são descritos em várias publicações, especialmente em programas cooperativos de extensão universitária. Esses programas incluem rotação de culturas com culturas que não podem hospedar o nematoide alvo, práticas de culturas e lavouras, e uso de transplantes. Por exemplo, as composições baseadas em Bacillus poderíam ser aplicadas após uma estação de desenvolvimento com mostarda e outra cultura supressiva de nematoide.

Em algumas modalidades, aplicação das composições da presente invenção a plantas, partes de plantas ou locais de plantas é precedida por identificação de um local com necessidade de tratamento. Essa identificação pode ocorrer através de identificação visual de plantas que parecem cloróticas, atrofiadas, necróticas, ou murchas (isto é, que parecem ter deficiências de nutrientes) tipicamente acoplada com o conhecimento de um histórico de problemas com nematoides; amostragem de planta; e/ou amostragem do solo. Amostragem de planta pode ocorrer durante a estação de crescimento ou imediatamente após a colheita final. Plantas são removidas do solo e suas raízes examinadas para determinar a natureza e extensão do problema de nematoide em um campo. Para nematoide das galhas radiculares, gravidade das galhas radiculares é determinada medindo a proporção do sistema radicular em que há formação das galhas. Galhas causadas por nematoide das galhas radiculares podem ser distinguidas de nódulos de bactérias de solo fixadoras de nitrogênio pelo fato das galhas não serem facilmente separadas da raiz. Níveis de população de nematoide das galhas radiculares no solo aumentam com a gravidade das galhas radiculares. Em alguns casos, a detecção de qualquer nível de formação de galhas de raiz sugere um problema de nematoide das galhas radiculares para plantio de qualquer cultura susceptível, especialmente na área de amostragem ou próxima a ela. Nematoides de cistos podem também ser identificadas por amostragem de plantas e análise de raízes quanto a cistos.

Amostragem de solo oferece um meio para determinar o número de nematoides e/ou nematoide de ovos de nematoide que infestam um certo

22/30 volume de solo ou raízes. Amostragem de solo pode ser realizada quando se suspeita de um problema pela primeira vez, no final da colheita, ou a qualquer tempo antes de plantar uma nova cultura, inclusive antes da destruição da cultura anterior. Programas cooperativos de extensão universitária, incluindo a University of Florida, Oregon State University e a University of Nebraska-Lincoln, oferecem serviços de amostragem de solo. Além disso, esses programas proporcionam um guia de como coletar amostras. Por exemplo, em um método de amostragem preditiva pós colheita, amostras são coletadas a uma profundidade de solo de ~15 cm a ~25 cm ( 6 a 10 polegadas) de 10 a 20 locais de campo ao longo de 5 ou 10 acres (dependendo do valor da cultura, com menos acres amostrados para culturas de maior valor) em um padrão regular de zigzag. Em um método de teste amostras de plantas estabelecidas, raiz e solo são removidas a um profundidade de solo de ~15 cm a ~25 cm ( 6 a 10 polegadas) de plantas suspeitas que são sintomáticas mas que não estão mortas ou morrendo, isto é, se decompondo.

Em algumas modalidades, identificação envolve determinar se um limiar econômico de infestação por nematoide foi atingido, isto é, um ponto em que as perdas econômicas esperadas sem tratamento excedem os custos com tratamento. O limiar econômico varia dependendo da cultura, geografia, clima, tempo de plantio, tipo de solo e/ou temperatura do solo. Numerosos trabalhos foram publicados neste tópico e diretrizes vindas dos programas de extensão cooperativos de universidades em diferentes áreas estão disponíveis. Ver, por exemplo, Robb, J.G., et aL Factors Affecting the Economic Threshold for Heterodera schachtíí Control in Sugar Beet (Fatores que afetam o limiar econoômico para controle de Heterodera schachtíí em beterraba) Economics of Nematode Control Janeiro-Junho 1992; Hafez, Saad L., Management of Sugar Beet. Nematode (Gerenciamento de nematoide de beterraba) University of Idaho Current Information Series (CIS) 1071 (1998); e UC IPM Pest Management Guidelines: Tomato (Diretrizes de gerenciamento de pragas de IPM UC: tomate) UC ANR. Publicação 3470 Nematodes A. Ploeg, Nematology, UC Riverside (Janeiro 2008). A determinação do limiar econômico para uma cultura particular em um período particu

23/30 lar do ano faz parte do conjunto de habilidades de uma pessoa versada na técnica.

Em algumas modalidades, a amostragem do solo revela que a infestação por nematoide causará uma produção que é cerca de 80%, cerca de 90%, ou cerca de 95% do normal para solo não infestado.

Em algumas modalidades, o limiar econômico de juvenis de nematoide das galhas por quilograma de amostra de solo é pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 750, pelo menos cerca de 1000, pelo menos cerca de 2000, pelo menos cerca de 3000, pelo menos cerca de 4000, pelo menos cerca de 5000. ou pelo menos cerca de 6000.

Em algumas modalidades, o limiar econômico de ovos e larvas de nematoides dos cistos por 1 cm³ de solo é de pelo menos cerca de 0,5, pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4. De acordo com Hafez (1998), supra, um cisto pode ser estimado como 500 ovos e larvas viáveis.

Os seguintes exemplos são fornecidos para fins puramente ilustrativos e não limitativos da presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Atividade de Bacillus subtilis QST713 contra Meloidocivne iavanica

Foram feitos estudos com sementes de pepino var. Sultan para determinar atividade de QST713 contra Meloidogyne javanica, nematoide das galhas radiculares. Tubos de centrífuga de 50 ml contendo 20 g de areia e uma semente não germinada foram tratados com diferentes taxas de caldo integral de QST713 ou do produto comercialmente disponível SERENADE® ASO. O caldo integral e o produto SERENADE® ASO diferem por ser o produto muito mais concentrado em termos de unidades formadoras de colônias (cfu) e metabolitos, com o produto tendo pelo menos 1 log cfu maior que o caldo integral. Além disso, o produto é formulado com, entre outras coisas, conservantes, de modo que o produto é mais ácido que o caldo integral. Para obter culturas de caldo integral QST713, frascos de semente contendo

24/30

Luria Broth (LB) foram inoculados com QST713 e cultivados de um dia para o outro a 30°C. No próximo dia, alíquotas de cada frasco de semente foram inoculadas em 200 ml de um meio baseado em soja em um frasco agitador de IL e cultivadas até esporulação. Resumidamente, a cultura do frasco agitador foi mantida em uma temperatura entre 30°C e 32°C e com um ajuste do agitador em 200 a 220 rpm. Após aproximadamente 3 dias de incubação, quando o crescimento de células e a produção de metabolito tinham terminado, o caldo de cultura foi coletado. As sementes tratadas foram deixadas germinar e se desenvolver em uma estufa. Quatro a cinco dias após o tratamento (DAT) cada tubo foi inoculado com 100 nematoides das galhas radiculares juvenis de segundo estágio. 10 DAT as plântulas foram classificadas pela percentagem de formação de galhas na raiz em uma escala de 0-4, que é descrita na Tabela 1.

As raízes foram então coradas com ácido fuscínico para observar penetração e desenvolvimento de nematoides e observadas com um microscópio de dissecção Leica. Como penetração de nematoides, foi feita a contagem do total de nematoides jovens dentro de cada raiz. Como desenvolvimento de nematoides, o total de juvenis gordos incluindo juvenis do estágio J2 tardio (J2's) e juvenis do terceiro estágio (J3's) foi contado. Penetração de nematoides na raiz e desenvolvimento de nematoides após penetração foram avaliados como detalhado na Tabela 1. Para detalhes sobre as técnicas usadas ver C. O. Omwega, et al., A Nondestructive Technique for Screening Bean Germ Plasm for Resistance to Meloidogyne incógnita (Uma técnica não destrutiva para seleção de germoplasma de feijão para resistência a Meloidogyne incógnita) Plant Disease (1988) 72(11) : 970-972.

Tabela 1. Esquema de avaliação para atividade antagonística contra nematoides de caldos bacterianos integrais. O índice de formação de galhas (galling index) foi baseado na percentagem de formação de galhas na raiz. A escala de penetração foi calculada como o número total médio de nematoides juvenis em relação ao número de nematoides juvenis no controle não tratado (UTC). A escala de desenvolvimento reflete o número total de nematoides juvenis gordos (estágio J2 tardio/estágio J3) dentro da raiz.

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Índice de formação de galhas	Escala de Penetração	Escala de desenvolvimento
0	Nenhum	0	Nenhum	0	Nenhum
1	1-24%	1	1-10%	1	1-3
2	25-49%	2	11-50%	2	3-10
3	50-74%	3	51-75%	3	11-30
4	>75%	4	76-100%	4	>30

A Figura 1 mostra que a aplicação de caldo integral QST713 reduz a formação de galhas na raiz. A Figura 2 mostra que a aplicação de taxas variadas do produto SERENADE® ASO reduz a formação de galhas, penetração e desenvolvimento na comparação com o controle não tratado. Notar que com os dados baseados no sistema de avaliação acima descrito não é sempre possível observar uma resposta à dose.

Exemplo 2

Eficácia de AQ713 para controle de ovos de nematoide das galhas radiculares em tomates

Outro experimento foi efetuado com sementes de tomate para testar a eficácia de QST713 contra ovos de nematoide das galhas radiculares. A Batelada 1 de AQ713 era um caldo integral de cultura preparado como descrito no Exemplo 1. A Batelada 2 de AQ713 e Batelada 3 de AQ713 foram preparadas em biorreator. Resumidamente, um frasco de cultura de estoque foi descongelado e transferido para um frasco esterilizado de caldo nutriente Difco (Difco Nutrient Broth). A cultura do frasco foi então incubada em um agitador rotatório, em temperatura entre 28°C e 32°C, em uma velocidade de rotação de 200 a 220 rpm para promover crescimento de células e obter alta densidade de células, e então adicionada a 12 L de um meio de crescimento baseado em soja em um biorreator de 20 L. O biorreator foi ajustado em temperatura entre 30 e 32°C, agitação de 500 a 1000 rpm, pH tamponado entre 6 e 8, e aeração entre 0,5 e 1,0 VVM Após aproximadamente 3 dias de incubação, quando o crescimento de células e produção de metabolitos tinham cessado, o caldo de cultura foi coletado. Tomateiros de três semanas foram tratados com QST713 por imersão. Potes foram então

26/30 mantidos em uma estufa por dez dias antes de serem inoculados com 5000 ovos de nematoides das galhas radiculares (root-knot nematode - RKN) por pote. Plantas foram colhidas quarenta e dois dias após inoculação de nematoides. Ovos foram coletados das raízes das plantas de tomate usando uma solução de 1% de NaOCl como detalhado em Hussey RS, Barker KR, A Comparison of Methods of Collecting Inocula of Meloidogyne spp. Including a New Technique (Comparação de métodos de coleta de inóculos de Meloidogyne spp. incluindo uma nova técnica) Disease Reporter, 1973; 57: 10251028. AQ713 diminuiu o número de ovos de nematoides de galhas radiculares observados por planta. Os dados representam contagens diretas de ovos em vez de um sistema de escore. Resultados comparados com uma amostra não tratada (UTC) são mostrados na Figura 3.

Exemplo 3

Eficácia do produto SERENADE SOIL® contra vários nematoides

Estudos de saco enterrado foram feitos para determinar a eficácia do produto SERENADE SOIL® contra vários tipos de nematoides em um campo de morangos. Estudos de saco enterrado são comumente usados para avaliar a eficácia de tratamentos de solo, especialmente fumigantes. Uma amostra de solo contendo uma concentração conhecida de nematoides foi colocada em sacos de malha de náilon e enterrado em uma profundidade de cerca de 15 a 20 cm (seis a oito polegadas) no canteiro de morangueiros Vários tratamentos foram aplicados como mostrado na Tabela 2. O produto INLINE foi usado como um controle positivo e em combinação com o produto SERENADE SOIL®.

Tabela 2

Trt. N°	Nome do tratamento	Taxa	Código Appl	Datas Appl
1	Controle não tratado	-		-
2	Serenade Soil®	4 qt/ac	BCD	24/11/11,27/01/11, 1/04/11
3	Inline seguido	20 gal/ac	A	3/11/10
	por Serenade Soil®	4 qt/ac	BCD	24/11/10, 27/01/11, 1/04/11
4	Inline	20 gal/ac	A	3/11/10

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Sacos foram coletados em 8 de Dezembro 2010, após tratamento B, e os nematoides (adultos e larvas) foram contados. Resultados são mostrados abaixo.

Nematoide avaliado	Controle não tratado	Serenade Soil® @ 4 qts	InLine @ 20 gal	InLine @ 20 gal + Serenade Soil® @ 4qts
Nematoide das galhas radiculares (Meloidogyne)	578 a	69 b	18 b	20 b
Nematoide anelado (Criconemella)	1.322 a	36 b	10 b	10 b
Nematoide Pino (Paratylenchus)	15 a	2 a	11 a	6 a

Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente em P = 0,05 (Student-Newman-Kewls).

Poucas semanas após a última aplicação mostrada acima, algumas plantas foram removidas dos lotes e as raízes foram analisadas quanto a nematoides das galhas radiculares, como descrito no Exemplo 2. Figura 4 mostra que todos os tratamentos reduziram ovos de nematoides das galhas radiculares/raiz.

Em experimentos subsequentes, o produto SERENADE SOIL® mostrou ser eficaz para controlar Paratrichodorus sp. e Paratylenchus sp. em plantas de batata quando comparado com controle não tratado. Produto SERENADE SOIL® mostrou também atividade contra Helicotylenchus pseudorobustus (Spiral. HP), Helicotylenchus digonicus (Spiral HD) e Criconemella sp. em morangueiros, contra Criconemella sp. em tomateiros e contra Paratylenchus sp. em batatas na comparação com controle não tratado. Exemplo 4

Período de latência entre tratamento com Bacillus subtilis QST713 e eficácia contra Meloidogyne javanica

As técnicas experimentais já descritas no Exemplo 1 foram usadas para o experimento seguinte com pepineiros. Resumidamente, culturas de caldo integral de AQ713 foram preparadas e foram usadas para tratar sementes de pepino (10⁵ CFU/g semente) no dia 0 (T0). Os pepineiros foram

28/30 desafiados com nematoides juvenis em intervalos de 1 dia, 6 dias, 9 dias, e 14 dias (T1, T6, T9 e T14). Fez-se a colheita de cada ponto no tempo 14 dias após inoculação (DPI) com nematoides juvenis. O número de nematoides das galhas radiculares (RKN) Meloidogyne Javanica que penetraram nas raízes foi quantificado (ver Figura 5A) bem como o número de juvenis desenvolvidos (ver Figura 5B). Cada ponto de dados representa o número médio de nematoides em 6 pepineiros. AQ713 foi eficaz para controlar níveis de penetração e desenvolvimento de RKN comparados com controle não tratado (UTC) quando existia uma latência maior que 6 dias entre o tratamento com AQ713 e o desafio com nematoides nos pepineiros.

Para confirmar a observação que AQ713 trabalha bem quando há um período de latência entre o tratamento e o desafio com nematoides, tomateiros novos de 4 semanas foram encharcados com caldo integral de AQ713 (105 CFU/g de areia) no dia 0 (T0) e foram desafiados em 1, 2, ou 3 semanas (T7, T14,ouT21) com 1000 RKN juvenis/pote como descrito no Exemplo 2. Fez-se a colheita de cada ponto no tempo foi colhido em 42 DPI e o total de ovos por raiz foi contado. Cada ponto de dados representa o número médio de ovos em 5 tomateiros. O período de latência entre o tratamento com AQ713 e o subsequente desafio com nematoides requerido para eficácia no decréscimo do número de ovos de RKN na raiz do tomateiro abaixo dos níveis do controle não tratado (UTC) foi de cerca de 14 dias ou mais neste experimento (ver Figura 6).

Exemplo 5 SERENADE® ASO aplicado várias vezes comparado com aplicação única

O produto SERENADE® ASO foi aplicado a tomateiros no transplante para potes com um diâmetro de cerca de 20 cm (oito polegadas) e em seguida a cada duas semanas (isto é, bissemanalmente) para tratamento com múltiplas aplicações como detalhado na Tabela 3. O produto SERENADE® ASO foi aplicado ao solo em redor da base da planta, dentro dos limites de cerca de 5 a 7,5 cm (2 a 3 polegadas) da base da planta. Uma dosagem de 6 qt/A é aproximadamente equivalente a 1 x 10⁵ CFU/g de solo (isto é solo dentro dos limites de 5 a 7,5 cm (duas a três polegadas) da base da

29/30 planta). Os potes foram então mantidos em uma estufa por dez dias antes de serem inoculados com 1000 larvas J2 de nematoides das galhas radiculares por pote. As plantas foram colhidas 42 dias após inoculação com nematoides, e as galhas foram avaliadas (ver Figura 7A) e o total ovos contados 5 (ver Figura 7B) como descrito nos Exemplos 1 e 2. Os brotos novos foram também pesados para identificar os efeitos dos tratamentos sobre o crescimento da planta (ver Figura 7C). Todos os pontos de dados representam a média de 4 medições. Múltiplas aplicações do produto SERENADE® ASO geralmente aumentou o controle de nematoides e o correspondente cresci10 mento da planta na comparação com a aplicação única.

Tabela 3

T ratamento	Dosagem	Aplicação
Serenade ASO	6 qt/A	No transplante
Serenade ASO	3 qt/A	3 aplicações em intervalos bissemanais
Serenade ASO	6 qt/A	3 aplicações em intervalos bissemanais
Serenade ASO	12 qt/A	3 aplicações em intervalos bissemanais
Serenade ASO	18 qt/A	3 aplicações em intervalos bissemanais
Controle não tratado	nenhuma	nenhuma

Exemplo 6

SERENADE® ASO aplicado uma vez no transplante em várias dosagens

Produto SERENADE® ASO foi aplicado em tomateiros em potes no transplante em várias dosagens como detalhado na Tabela 4

Tabela 4

Tratamento	Dosagem	Aplicação
Serenade ASO	4 qt/A	No transplante
Serenade ASO	20 qt/A (5 x)	No transplante
Serenade ASO	40 qt/A (10 x)	No transplante
Serenade ASO	80 qt/A (20 x)	No transplante
Serenade ASO	160 qt/A (40 x)	No transplante
Controle não tratado	nenhuma	nenhuma

Como notado acima, uma dosagem de 6 qt/A é aproximadamente equivalente a 1 x 10⁵ CFU/g solo. Potes foram então mantidos em uma

30/30 estufa por dez dias antes da inoculação com 3000 ovos de nematoides das galhas radiculares por pote. As plantas foram colhidas 7 semanas após a inoculação de nematoides e o total de ovos foi contado (ver Figura 8). Todos os pontos de dados representam uma média de 4 medições. Geralmente, 5 taxas maiores que 4 qt/A resultaram em maior controle da produção de ovos de nematoides, com o tratamento de 40 qt/A resultando em cerca de 70% controle quando comparado com o grupo de plantas não tratadas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para controlar nematoides, caracterizado pelo fato de que compreende aplicar a uma planta e/ou um local para crescimento de planta Bacillus subtilis QST713;

em que o Bacillus subtilis QST713 é aplicado sozinho.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que caldo de cultura completo compreendendo Bacillus subtilis QST713 é aplicado à planta ou ao local para crescimento de planta.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a aplicação é precedida pela identificação de que a planta e/ou o local para crescimento da planta necessita de tratamento.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a identificação compreende identificação visual de plantas que parecem cloróticas, atrofiadas, necróticas ou murchas; amostragem de planta; e/ou amostragem do solo.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende aplicar Bacillus subtilis QST713 ao solo antes do plantio e/ou no plantio.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o Bacillus subtilis QST713 é aplicado em uma taxa de 2x10¹² a 6x10¹³ cfu por 4.047 m² (1 acre) para tratamentos de encharque de solo ou de 6x10¹⁰ a 4x10¹² cfu por 305 m (1000 pés) de sulco para tratamentos em sulco.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a taxa é de 1 x 10¹³ cfu a 6 x10¹³ cfu por 4.047 m² (1 acre) ou de 7,5 x 10¹¹ a 4 x 10¹² cfu por 305 m (1000 pés) de sulco.
8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o Bacillus subtilis QST713 é aplicado ao solo em contato com as raízes da planta ou solo na base da planta.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o Bacillus subtilis QST713 é aplicado como aplicação única em uma taxa de 7 x 10⁵ a 1 x 10⁷ cfu por grama de solo.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo

Petição 870180154639, de 23/11/2018, pág. 8/68

2/2 fato de que o Bacillus subtilis QST713 é aplicado em múltiplas aplicações em intervalos de 10 a 18 dias.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as aplicações múltiplas são realizadas em uma taxa de 1x10⁵ a 3 x 10⁶ cfu por grama de solo por aplicação ou em uma taxa de 2 x 10¹² a 6 x10¹³ cfu por 4.047 m² (1 acre) por aplicação para tratamentos por encharque de solo.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Bacillus subtilis QST713 é aplicado à semente.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Bacillus subtilis QST713 é um produto de fermentação.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação compreende células de Bacillus subtilis QST713, metabolitos e caldo residual de fermentação.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os nematoides são selecionados de um grupo que consiste em Paratylenchus spp., Paratrichodorus spp., Criconemella spp., Helicotylenchus spp., Meloidogyine spp., Criconemoides spp., Helicotylenchus pseudorobustus (Spiral HP) e Helicotylenchus digonicus (Spiral HD).
16. Uso de Bacillus subtilis QST713, caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma composição para controle de nematoides em plantas e que a composição compreendendo Bacillus subtilis QST713 é aplicada sozinha.