JP3849882B2 - メロイドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属の線虫に対する新しい食線虫剤 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、キノコのアルトロボトリス・コノイデス・ドレクスラー（Arthrobotrys conoides Drechsler）の新しい菌株を利用することによってメロイドギネ属の線虫に対抗することを目的とした新しい食線虫剤に関し、またこれら線虫の増殖に対抗する方法に関する。
背景技術
草食線虫が栽培作物に年間30億フランにも及ぶ重大な損失を生じさせることは古くからよく知られてきた。全世界で最も重大な損失を与える最も広がった線虫の種は、メロイドギネ属に属する。「こぶ線虫」として農業経営者間でよりよく知られているこの属は、事実感染植物の幼根組織上にこぶの形成の原因となる。これら非常に多食性の線虫はいずれの植物もほとんど攻撃し、かくして約50〜70％の悲惨な収穫損失の原因となる。
特にヘテロデラ・カロテー（Heterodera carotae）が多くの地域でニンジン栽培作物に損害を与え、その刺毛がニンジンに異常な側面支根の生成をもたらす限り、市場に供給できなくなる。
もう一つの線虫、ディティレンカス・ミセリオファガス（Ditylenchus myceliophagus）はキノコ栽培床に発生するハラタケ類に重大な損害を与える。
これらの障害と闘うために、農業経営者は可能な幾つかの対抗手段をもっているが、それらは集約農業においては以下のようになる。
燻蒸剤（臭化メチル、トリクロロニトロメタン、ジクロロプロペン、等）を用いた栽培前の予防土壌消毒である。非常に広い有効性スペクトルを有するこれらの製品は土壌を痩せさせ、そして生態的均衡を破壊する。更にそれらは軽い土壌においては地下水に入り、また重い土壌においてはそれらが低拡散のゆえに有効性が低下する。
又は花卉栽培又は苗木床のような非食用産物用に用いられる樹液で運搬される浸透性製品（カーバメート又はオリゴ-リン成分）による作物上の現場治療処理である。これらの製品は植物に取り込まれそして毒性残余物が残るので、動物及人間両方に危険である。
両技術ともに土壌の上層30cmにのみ作用する。しかしもっとも深く棲息している線虫は次に来るべき栽培時に再び処理領域に感染する。これら終わりのない消毒を伴う。
更にこれらは人間に毒性であるため、幾つかの殺線虫薬剤はオランダ、スイス、ドイツのような多くの国で禁止されている。
発明の概要
従って本発明の目的は、人間及び環境に無害な天然の抗線虫剤を用いることである。
従って、本発明はメロイドギネ、ヘテロデラ及びディティレンカス・ミセリオファガス属の線虫と対抗させることを目的とした新しい食線虫剤であって、アルトロボトリス・コノイデス・ドレクスラー種のキノコの６株の中から選ばれたものに関する。
本発明のもう一つの観点は、キノコ接種原をあらかじめ接種した穀粒を用いることによって、アルトロボトリス・コノイデス・ドレクスラー種のキノコを栽培土壌にブレンドすることから成るメロイドギネ・ヘテロデラ及びディティレンカス・ミセリオファガス属の線虫に対抗する方法である。
【図面の簡単な説明】
本発明の幾つかの側面を説明する添付図面と関連させた以下の記述によっで本発明の目的及び特徴を紹介する。
第１図は、本発明に従う株アルトロボトリス・コノイデスの分生子柄及び分生子を図式的に表す。
第２図は、本発明に従う株アルトロボトリス・コノイデスによって線虫を捕らえるように形成されたわなの図式的表示である。
第３図は、アルトロボトリス・コノイデスの異なった株を識別するために用いた電気泳動ゲルで得た結果の表である。
発明の詳細な説明
本発明に従うアルトロボトリス・コノイデス・ドレクスラーの６株は異なった場所から入手した。異なった株が同一種に属するかどうかを照合する主な基準は分生子（これらキノコの再生器官）の測定である。
第１図に示したように、分生子は分生子柄の上で20又は30の群に集まっている。分生子柄は、第一分生子の頭部の後に更に成長しそしてある長さ成長後に分生子の第二群を形成し、追加の５〜６群が成長するまで続く。
株42Ａは、ブルキナ・ファソ（Burkina Faso）のファーダ・ングルマ（Fada N’Gourma）で採取し、区分されたガラス様糸から成る菌糸体でつくられている。
この分生子柄は最後には約20の堅い分生子の頭部に達し、古い培養株上で成長し続けそして継続的に５〜10の追加群の分生子を産生する。
分生子は基底部に向かってかなり細くなりほとんど円錐形であり、また異なった大きさの二つの小室から成り、合計平均長さは27μｍである。
この株はパスツール研究所のナショナル・コレクション・オブ・マイクロ・オーガニズム・カルチャーズ（National Collection of Micro-organism Cultures）（ＣＮＣＭ）にNo.Ｉ-1425として寄託した。
株42Ａ’は、ブルキナ・ファソのレグエマ（Leguema）で採取した。
この分生子柄は最後には３〜20の堅い分生子の頭部に達し、古い培養株上で成長し続けそして継続的に３〜５の追加群の分生子を産生する。
分生子は基底部に向かってかなり細くなりほとんど円錐形であり、また異なった大きさの二つの小室から成り、合計平均長さは30μｍである。
この株はＣＮＣＭ（パスツール研究所）にNo.Ｉ-1426として寄託した。
株42Ｂは、オランダのバールン・マシュルーム・コレクション（Baarn Mushroom Collection）から得た。
若い培養株（１ヶ月より若い）では、分生子柄はまばらでまた最後には３〜20の堅い分生子の頭部に達し、分生子の追加群の形成は稀である。
分生子は基底部に向かってかなり細くなりほとんど円錐形であり、また異なった大きさの二つの小室から成り、合計平均長さは28μｍである。
この株はＣＮＣＭ（パスツール研究所）にNo.Ｉ-1427として寄託した。
株42Ｂrは、ブラジルで採取した。
この分生子柄は最後には10〜20の堅い分生子の頭部に達する。これらは成長し続けそして継続的に５〜10の追加群の分生子を産生する。
分生子は基底部に向かってかなり細くなりほとんど円錐形であり、また異なった大きさの二つの小室から成り、合計平均長さは23μｍである。
この株はＣＮＣＭ（パスツール研究所）にNo.Ｉ-1428として寄託した。
株42Ｔはトゥール・アンドル-エ-ロワール（Tours Indre-et-Loire）（フランス）で採集した。
この分生子柄は最後には10〜20の堅い分生子の頭部に達する。古い培養株上で成長し続けそして継続的に３〜５の追加群の分生子を産生する。
分生子は基底部に向かってかなり細くなりほとんど円錐形であり、また異なった大きさの二つの小室から成り、合計平均長さは28μｍである。
この株はＣＮＣＭ（パスツール研究所）にNo.Ｉ-1429として寄託した。
株42Ｖ1はビルヌーブ・ルーベ・アルプ-マリティーム（Villeneuve Loubet Alpes-Maritimes）９（フランス）で採集した。
この分生子柄は最後には10〜20の堅い分生子の頭部に達する。古い培養株上で成長し続けそして継続的に20〜30の追加群の分生子を産生する。
この分生子は基底部に向かってかり細くなりほとんど円錐形であり、また異なった大きさの二つの小室から成り、合計平均長さは23μｍである。
この株はＣＮＣＭ（パスツール研究所）にNo.Ｉ-1430として寄託した。
食線虫キノコの菌糸体は線虫をわなにかける捕捉器官をつくる能力を有する。本発明に従った６種のアルトロボトリス・コノイデス株の菌糸体のわなは、第２図に示したように、多少錯綜した網目に吻合を通して自己を変態する菌糸ループの形状を有する。
試験した６株のうち、株42Ａのみが自然にわなを形成する。他の５種については、成長培地内の線虫の存在がわなの形成を誘導する。両方の場合ともに、このわなは多少錯綜した網目に吻合を通して変態した菌糸ループから成っている。
６種の株は、ＲＡＰＤ技術を用いたゲノムの研究で明らかになったオリゴヌクレオチドによって明白に識別することができる。
電気泳動ゲルの使用によってバンドを図示し、またＤＮＡ断片の大きさを測るために対照例を用いた第３図の結果を導いた。
以下に記述するような方法によって、アルトロボトリス・コノイデスの異なった株を線虫と対抗するために産業的に用いることができる。キノコを良好な条件に維持するために、穀粒を基礎とした成長培地が用いられる。キノコが穀粒の内部に隠れており、かくして外部の攻撃に対して低感受性となる。更に他面に広がった各々の穀粒新しい菌糸体コロニーの出発点である。
穀粒は水に24時間以上浸漬し、その後殺菌消毒する。次に穀粒にキノコ接種原を接種する。
支持体として最良の種を用いて最も短い時間における最大の成長を可能にする。第二の基準は、成長頂点で達するグラム当たりの増殖単位数である。この増殖単位は、最小菌糸体断片又は単独分生子にも対応する。
用いられる支持体種は、イネ科草、マメ科又は油質植物のうちから選択する。かくして最大成長に達する時間が14日であるハンプ（hamp）、ヒマワリ及び米が用いられる。オートムギ、モロコシ、オオムギ、コムギ、ヒラマメ、トウモロコシ、クサヨシの種子、ダイズ、豆、ルピナス、ヒヨコマメ、ソラマメが同様に用いられる。
上記種のうち、ルピナス、ヒラマメ、トウモロコシ、豆、クサヨシの種子、ヒヨコマメ、米によって増殖単位の最大数約3.10⁷/ｇが達成される。
キノコをよく分布させるためには、等しい重量で小穀粒を広げることが推奨される。この理由または他の理由で、クサヨシの種子、ヒラマメ及びトウモロコシが好ましく用いられる。トウモロコシについては、土壌１リットル当たり２ｇの比率で満足な混合を可能にする。成長頂点を達成することが要求されるときには、キノコとその支持体を植えつけ15日前に混合することが推奨される。
異なった株のアルトロボトリス・コノイデスは同様に凍結乾燥物の形態でも用いることができる。凍結乾燥はここでは、あらかじめ凍結によって固化した組織の溶液又は懸濁液液中に含まれる氷の昇華による乾燥技術である。この技術はナショナル・マッシュルーム・コレクションズ（National Mashroom Corections）において微生物を保存するのに普通に用いられている。これは厳密な操作条件、すなわち
・生成物の凍結を確実にする低温、
・氷の昇華を確実にする低圧
・氷昇華時の侵入液体の不存在
を含んでいる。
これらの条件を満たすためには、蒸気を吸引しながら温度を上げることによって、凍結乾燥する生成物の圧力及び温度の間の不均衡をつくりだすことである。菌糸体は温度及び圧力変化に感受性が高く、菌糸体についてはキノコを凍結乾燥してはならない。従って凍結乾燥を遂行できるようにするには、抵抗性組織として挙動する分生子を得るようにキノコを増殖させなければならない。分生子を使用する必要性は、同時に液体培地の使用を不要にする。このキノコは寒天大豆粉末系培地で生育する。
寒天の存在及び培地の重量によってもたらされる不便をなくすために、セロハンフィルムを寒天培地とキノコ接種原の間に挿入する。このフィルムはキノコを培地から分離するが、このことはキノコがフィルム表面を通して自身を送り込むことを特徴としている。菌糸体が一旦成長培地の全表面を侵略したら、フィルムを引き抜きそしてビタミン及び微量元素に富んだ液体に浸漬する。菌糸体及び分生子をセロハンフィルムから離す。菌糸体、分生子、ビタミン及び微量元素を次に一緒に凍結乾燥する。ビタミン及び微量元素の存在は土壌での活動開始を助ける。
この技術は、菌画分を成長に用いる栄養培地からあらかじめ分離している点で斬新である。この凍結乾燥したキノコはかくして粉末状であり、水溶性でそして従って農業経営者にとって使用し易い。キノコはこの形状で、化学薬品のように機械散布によって用いられる。この方法では土壌に散布される生成物量がかなり低減され、また生成物は良好にそして長く保存される。成長頂点に達する必要時間が長いために、キノコのアルトロボトリス・コノイデスは好ましくは植えつけ約15日前に処理土壌と混合される。
種々の株のアルトロボトリス・コノイデスがメロイドギネ、ヘテロデラ及びディティレンカス・ミセリオフォガスと戦いこれに対抗する有効性は、最初にペトリ皿の上で生体外で試験した。これら生体外試験のために、ペトリ皿上の寒天培地（トウモロコシ粉培地：１、寒天：１）で異なった株のアルトロボトリス・コノイデスを生育した。キノコがすべての寒天に侵入したら、寒天培地のみを含有する対照試験用皿を含めて、200匹の線虫をキノコの各皿に無菌的に入れた。１、２、８及び24時間後に、真下にある他のもう一つの皿に含まれる水の表面に底が位置する100μｍメッシュ篩の上で皿を逆さにする。この状況下でキノコに捕捉されていない線虫は、篩を通して水に到達する。次に線虫を捕捉して顕微鏡で数える。
メロイドギネ及びディティレンカス・ミセリオフォガスの場合は、６つの株を二つの群に分けたが、株Ａ、Ａ’及びＢは24時間に60〜100％を捕捉し、他の三つの株は有効性が低い。
ヘテロデラ・カロテーの場合は、６株が24時間に50〜75％線虫を捕捉する。
一方、キノコの成長が速いことを観察した（平均1.5cm／24時間）。かくしてこれは、農業及び花卉栽培、同様に苗床の植物用の食線虫剤として実用的にそして満足な結果で用いることができる。
食線虫キノコの新しい菌株の生態系に関連した試験の枠内で、この新しい株は塩分が３g/ｌを越えない土壌で良好に成長することを観察した。
また、食線虫キノコによる培地の侵食は、キノコを高用量で混合したときにずっと激しいことを認めた。更にキノコは10容量％土壌の用量でも、かなり培地にコロニーをつくる。
異なった株のアルトロボトリス・コノイデス42の捕食活性は幾つかの実際的試験によって確認できるが、それらの結果を次に示す。
Ｉ．メロイドギネに対する室温試験管試験
試験する株をそれらの捕捉能力によって二つの範疇に分けたが、平均でＡ、Ａ’及びＢは24時間当たり80％線虫を捕捉し、Ｂr、Ｔ及びＶ1は24時間当たりわずか30％メロイドギネを捕捉する。
この試験を実際に行うために、各範疇の最も代表的な株すなわちＡ及びＶ1を選んだ。試験は30ml土壌を含有する50ml試験管中で行った。殺菌消毒し、加熱しそして粉砕したトモロコシ系培地上で生育したキノコ株を100g/ｍ²の比率で土壌に混合した。
試験管は以下のように処理した。

Ｄ日目に、30匹のメロイドギネ幼虫を各試験管に入れた。24時間後に、一連の試験管を取り出しそれらの線虫含量を分析し、どれだけの線虫が捕捉されたかを測定した。この実験をすべての線虫が捕捉されるまで毎日繰り返した。
結果を次の表に示した。いずれのアルトロボトリス・コノイデス株についても、キノコを植えつけ15日前に混合したときに（従って宿主植物による線虫の活性化前に）捕捉速度が最初の日にかなり変化するが、しかしこの相違は急速に減少した。

II．メロイドギネ・ハプラ（Meloidogyne Hapla）に対する温室ミニポット試験
この試験はメロイドギネ・ハプラに対するキノコのアルトロボトリス・コノイデスの作用を明らかにし、またｍ²当たりの生成物の使用量を特定することを目的とした。アルトロボトリス・コノイデスの６株をこの線虫で試験した。300ｇ土壌を含有するミニポットで実験を行い、選択した植物は線虫に非常に感受性であるサン・ピエール（Saint Pierre）トマトとした。各ポットに土壌100ｇ当たり100匹の線虫を感染させたが、これは平均農場感染の上限に相当する。結果の読みは、根をエオシンで着色することによって示した。この生物組織の染料着色は、幼根組織を通して浸透する幼虫感染から起こる第一世代の多量の卵を数えるのに役立つ。
アルトロボトリス・コノイデスは、線虫が存在しないときには、有機化合物を消化する（腐食性）ことによって土壌中で生き続けることができる捕食性キノコである。このことが、無菌の有機富栄養化剤（微生物を含まない）を無菌生育土壌に加える理由である。これは実験の最初の15日間キノコの良好な成長を助ける。
処理用量の計算。基準は10⁸増殖単位／ｍ²土壌に等しい増殖単位の数である。６種のアルトロボトリス・コノイデス株について、この数値は平均して15ｇのオートクレーブで消毒し、粉砕したトウモロコシ系の調合物で達成される。試験に余裕をもたせるために、６株で試験した平均通常用量を40g/ｍ²とし、そして第二の用量をこれの２倍すなわち80g/ｍ²にした。各株及び各用量について５つの重複分を調製し、キノコのない対照物も加えた。
結果。６株に共通な40g/ｍ²に相当する平均用量については、結果は以下の如くである。

株Ａが最良の結果を与える。
80g/ｍ²の２倍用量では、結果は以下の如くであった。

40g/ｍ²の用量に関しては、株Ａが最良の結果を与えたが、しかし株Ｖ1も同様にこの用量で有効であった。迅速に信頼性ある結果を得るためには、加熱しそして粉砕したトウモロコシ系の培地上で生育するときに80g/ｍ²の用量で株Ａを用いることがよい。
III．ヘテロデラ・カロテーで攻撃されるニンジン栽培に関するポット試験
株Ａ、Ｂ、Ｔ及びＶ1を用いてこの実験を行った。この試験を準備するために、加熱しそして粉砕したトウモロコシ系の培地上で種々の株を生育した。常に同数の増殖単位／リットル土壌（10⁸増殖単位／100Ｌ）が存在するように、収穫したキノコ量を各株に厳格に適応させる。Ａ及びＢ株については、接種量を60g/100Ｌ土壌とした。株Ｔについては、接種量を190g/100ｇ土壌とした。株Ｖ1については、接種量は少なくとも80g/100Ｌ土壌とした。ニンジン栽培は未処理のままでも保持し、対照物として加えた。
この試験中に、感染幼虫発生から放出されるヘテロデラ・カロテーの包のうの数を数えた。

株Ａ及びＶ1が、メロイドギネ・ハプラによる場合と同様に、ヘテロデラ・カロテーでも最良の結果を与えることが分かる。
IV．室温トマト栽培に関する試験
この試験はアルトロボトリス・コノイデス42Ａを用いて農場環境の温室で行った。地面に散布する捕食キノコの必要用量を特定することを目的とした。
この試験には、粉砕したトウモロコシ系の培地でキノコを生育した。培地の含有は10⁷増殖単位／ｇである。
ここで処置した耕地区域は120ｍ²の広さである。より良く隔離するために厚板によって分離した各々40ｍ²の３区画に分けた。第一の区画は対照物であり、次の区画は株42Ａの50g/ｍ²調合物で処理し、また最後の区画は100g/ｍ²調合物で処理した。
試験を準備する前に、現行の培養株（サラダ）からとった土壌を分析した。
線虫の存在を証明するために、若い高感受性のトマト苗木（サン・ピエール変種）を土壌に植えて試験を行った。植えつけ１ヶ月後、根をメチルブルー・ラクトフェノール（GUIRAN,1966）で着色した。着色はトマトの根を浸透した若いメロイドギネを示した。
平均感染に相当する10gの根当たり620匹のメロイドギネの幼虫を認めた。
この平均感染率は食線虫キノコを試験するのに十分なものである。事実、すべての生物学的攻撃手段と同様にキノコは非常にゆっくりと作用し、ただ一回のみの栽培活動で高過ぎる線虫の増殖を抑制することはできない。
トマトの植えつけ15日前にアルトロボトリス・コノイデス42Ａを散布した。この15日の期間は捕食キノコに土壌にコロニーをつくる機会を与え、植えつけ時に使用できるようになる。実際にトマト苗木は、若い幼虫を根に導くことを助けるある程度の根滲出液を地下に生成する。
トマト苗木は二つの中間配列で（周辺効果を回避するため）４列に分布させ、10本のトマト苗木（サン・ピエール変種）を植えた。これを引き抜いて分析用とした。試料は栽培の終期に採取した。この感受性植物を引き抜きそしてその根を分析した。
この目的のため、いったん幼根組織を洗浄してから、12°塩素滴定時に次亜塩素酸カルシウムの１％溶液中で粉砕する。この混合物を一連の篩に通し、植物組織の断片を除く。根から発生するメロイドギネの卵を５μｍメッシュ篩に集め、顕微鏡で数える。これらは以後の培養株の襲撃能を構成する。

幾つかの項目は特筆すべきである。すなわち
-メロイドギネの雌は気候条件によって300〜500個の卵を産むことができる。
-10ｇの根当たりの幼虫数が100〜1000匹であるときは、感染は平均感染と考えられる。
対照区域及び100g/ｍ²のアルトロボトリス・コノイデス42Ａで処理した区域で、襲撃能の低下（半分を越える）が顕著である。
ランプ（集塊）、ポット又はコンテナーで輸送される植物については、食線虫キノコをランプ、ポット又はコンテナーに直接混合される。
捕食キノコは、市場植物用に用いられる圧縮ランプに初期に播種される。このような方法では、ランプ中で新たにほぐされた植物が温暖湿潤環境下の温室で成長する20〜30日内に、キノコは成長しそして全ランプに侵入し、次に栽培中に植えつけられると接種原として挙動するようである。ランプ、ポット、コンテナー又は類似のもので輸送される植物に適用できる本発明のこの別の形態は、以下のような明確な利点を示す。
普通ランプを調製するには中性pHの腐植質に富んだ土壌が用いられ、そしてこれはアルトロボトリス・コノイデス42Ａの成長に特に好ましい。更に植物幼根組織は完全に菌糸体フェルトに包まれ、しかも菌糸体フェルトは幼根の成長を全く阻害しない。強く襲撃された土壌にランプを植えつけたときでも、幼根組織はかくて線虫に対して保護される。このようにして植物が線虫の攻撃に最も傷つきやすい期間を通して、若い植物が成長開始と同時に保護される。
別の試験は、ランプが重要な接種原をつくり、それからキノコが周囲の土壌に非常に容易に広がることを証明した。
かかるランプ、ポット、コンテナー又は類似のものを調製することは、また使用においても植物の作成においても、何ら困難を伴わない。穀粒を例えばホッパーを用いて土壌混合物に単に入れるだけである。このような方法で作成された植物の植えつけは通常通り行うことができる。
結論すると本発明方法は、幾つかはメロイドギネ線虫に感受性ではないが、市場園芸、花卉培養種又は苗木床用植物に適用できる。これは同様にヘテロデラ・カロテーに感受性であるニンジン培養株を処理するために、又は栽培キノコのアガリカス・ビスポラス（Agaricus Bisporus）の場合のディティレンカス・ミセリオフォガスに対抗させるためにも用いることができる。後者の場合は、食線虫キノコを殺菌後の堆肥に添加する。

Claims (12)

1. メロイドギネ（Meloidogyne）、ヘテロデラ（Heterodera）及びディティレンカス・ミセリオフォガス（Ditylenchus Myceliophagus）属の線虫と対抗することを目的とした食線虫剤であって、
   それぞれＩ-1425、Ｉ-1426、Ｉ-1427、Ｉ-1428、Ｉ-1429及びＩ-1430の番号でナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズム・カルチャーズ（National Collection of Micro-organism Culturse、パスツール研究所）に寄託されたアルトロボトリス・コノイデス・ドレクスラー（Arthrobotrys conoides Drechsler）の６株から選択される少なくとも１種の株を含むことを特徴とする食線虫剤。
2. 請求の範囲第１項に記載の食線虫剤を栽培土壌に混合することからなる、培養株中のメロイドギネ、ヘテロデラ及びディティレンカス・ミセリオフォガス属の成虫と対抗する方法。
3. 食線虫剤の接種原をあらかじめ接種した穀粒を用いて、前記食線虫剤を土壌と混合する請求の範囲第２項記載の方法。
4. 穀粒を、クサヨシの種子、ヒラマメ及びトウモロコシからなる群から選択する請求の範囲第３項記載の方法。
5. 粉砕トウモロコシ系培地に食線虫剤をあらかじめ接種し、少なくとも１ｇ当たり10⁷増殖単位を含有する請求の範囲第５項記載の方法。
6. 粉砕、加熱及び消毒したトウモロコシ系の培地に食線虫剤をあらかじめ接種し、該接種培地を次に８０g/ｍ²の比率で土壌に混合する請求の範囲第４又は５項記載の方法。
7. 粉砕、加熱及び消毒したトウモロコシ系の培地に食線虫剤をあらかじめ接種し、該接種培地を次に２g/リットルの比率で土壌に混合する請求の範囲第４又は５項記載の方法。
8. 食線虫剤をあらかじめ凍結乾燥し、次に粉末状で土壌に混合する請求の範囲第２項記載の方法。
9. 食線虫剤を培地に入れて成長させ、凍結乾燥前に分生子を発生させる請求の範囲第３項記載の方法。
10. 成長させる食線虫剤と培地との間にセロファンフィルムを挿入し、該セロファンフィルムを液体に浸漬することによって分生子を含有する該食線虫剤の部分を採集する請求の範囲第９項記載の方法。
11. 植物を苗木床又は市場園芸に輸送するために用いられる土壌の塊、ポット又はコンテナーに、食線虫剤を直接混合する請求の範囲第２項記載の方法。
12. 食線虫剤を植えつけ、約１５日前に土壌に混合する請求の範囲第２〜１１項いずれかに記載の方法。

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