EP0766513A1 - Agent nematophage - Google Patents

Agent nematophage

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Publication number
EP0766513A1
EP0766513A1 EP95923388A EP95923388A EP0766513A1 EP 0766513 A1 EP0766513 A1 EP 0766513A1 EP 95923388 A EP95923388 A EP 95923388A EP 95923388 A EP95923388 A EP 95923388A EP 0766513 A1 EP0766513 A1 EP 0766513A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
soil
agent
nematophagous
strains
nematophagous agent
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95923388A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Elisabeth Panchaud
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IDRO 2000 SA
Original Assignee
IDRO 2000 SA
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Filing date
Publication date
Application filed by IDRO 2000 SA filed Critical IDRO 2000 SA
Publication of EP0766513A1 publication Critical patent/EP0766513A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi

Definitions

  • the present invention relates to a new nematophagous agent intended for combating nematodes of the genus
  • Nematodes which can be found at a greater depth will again invade the treated area during the following culture. This implies a continual repetition of disinfections.
  • chemical nematicides tend to be banned in many countries, as is the case in the Netherlands, Switzerland, Germany.
  • the object of the invention is to use a natural agent to fight against nematodes, which is not dangerous for man and his environment.
  • the main object of the invention is therefore a new nematophagous agent intended to combat nematodes of the genus Meloidogyne, Heterodera and Ditylenchus myceliophagus, chosen from six strains of the fungus ArtiiroJbotrys conoides Drechsler.
  • Another subject of the invention is a method of combating nematodes of the genus Meloidogyne, Heterodera and
  • Ditylenchus myceliophagus consisting of incorporating the Art Kingotrys conoides Drechsler fungus into the soil where the cultures are carried out by means of seeds sown beforehand by the inoculum of the fungus.
  • FIG. 1 schematically represents a conidiophore and its conidia of strains c ⁇ * Arthrobotrys conoides according to the invention.
  • FIG. 2 is a schematic representation of the traps formed by the strains of Arthrobotrys conoides according to
  • FIG. 3 represents a table giving the result obtained with an electrophoresis gel used to differentiate the different strains of ArtiiroJotrys conoides.
  • the six strains of ⁇ rt ⁇ roJotrys conoides Drechsler which are the subject of the invention come from different places.
  • the main criterion for verifying that the different strains belong to the same species is the measurement of conidia (reproductive organs of these fungi).
  • the conidia are grouped by 20 or 30 on the conidophore.
  • the conidiophores can continue to develop beyond a first head of conidia and after a certain length of growth form a second group of conidia and so on until the development of 5 to 6 additional groups.
  • the 42A strain originates from Fada N'Gourma in Burkina Faso, it is constituted by a mycelium composed of hyaline cloisonné hyphae.
  • the conidiophores end in a head of about 20 tight conidia; on older crops they continue to develop and may successively produce 5 to 10 additional groups of conidia.
  • the conidia attenuate in a pronounced manner towards their base, they have an almost conical shape and consist of two cells of different sizes, the total length of the conidia is on average 27 ⁇ m.
  • the 42A 'strain originates from Leguéma in Burkina Faso.
  • the conidiophores end in a head formed from 3 to 20 tight conidia; on older crops, they continue to develop and can successively produce 3 to 5 additional groups of conidia.
  • the conidia attenuate in a pronounced manner towards their base, they have an almost conical shape and are made up of two cells of different sizes, the total length of the conidia is on average 30 ⁇ m.
  • the 42B strain comes from the Baarn mycotheque in the Netherlands.
  • conidiophores are rare and end in a head formed from 3 to 20 tight conidia; the formation of additional conidial groups is rare.
  • the conidia attenuate in a pronounced manner towards their base, they have an almost conical shape and are made up of two cells of different sizes, the total length of the conidia is on average 28 ⁇ m.
  • the conidiophores end in a head formed from 10 to 20 tight conidia. They continue to develop and successively produce 5 to 10 additional groups of conidia.
  • the conidia attenuate in a pronounced manner towards their base, they have an almost conical shape and consist of two cells of different sizes, the total length of the conidia is on average 23 ⁇ m.
  • the 42T strain was collected at Tours Indre-et-Loire (France).
  • the conidiophores end in a head formed from 10 to 20 tight conidia. On the old cultures, they continue to develop and successively produce 3 to 5 additional groups of conidia.
  • the conidia attenuate in a pronounced manner towards their base, they have an almost conical shape and are made up of two cells of different sizes, the total length of the conidia is on average 28 ⁇ m.
  • the conidiophores end in a head formed from 10 to 20 tight conidia. On older crops, they continue to develop and successively produce 20 to 30 additional groups of conidia.
  • the conidia attenuate in a pronounced manner towards their base, they have an almost conical shape and consist of two cells of different sizes, the total length of the conidia is on average 23 ⁇ m.
  • This strain was the subject of a deposit with the CNCM (Institut Pasteur), where it was registered under the number 1-1430.
  • the mycelium of nematophagous fungi has the ability to produce capture organs that trap nematodes.
  • the mycelial traps of the six strains of ArthroJ otrys conoides according to the invention are in the form of hyphal loops which by anastomosis become more or less complicated networks as illustrated in FIG. 2.
  • strain 42A spontaneously forms traps.
  • the other 5 form traps induced by the presence of nematodes in the culture medium. Whether spontaneous or induced, the traps are made up of hyphal loops which anastomose become more or less complicated networks.
  • a seed-based culture medium allows good preservation of the fungus.
  • the latter takes refuge inside the seed and therefore becomes less sensitive to attack from the outside environment.
  • each seed spread on the ground is the starting point for a new mycelial colony.
  • the seeds are soaked for 24 hours in excess water before being sterilized. Then the seeds are sown with the mushroom inoculum.
  • the best species to use as support are those that allow maximum growth to be achieved in the shortest time.
  • a second criterion is the number of propagules per gram of support medium reached at the time of maximum growth, the propagation corresponding to a minimum fragment of mycelium or even a single conidium.
  • the species that can be used are among grasses, legumes, or oilseeds.
  • hemp, sunflower and rice for which the time to reach maximum growth is 14 days.
  • Oats, sorghum, barley, wheat, lentils, corn, canarygrass, soybeans, beans, lupins, chickpeas, and beans can still be used.
  • those which make it possible to obtain a maximum number of propagules, that is to say approximately 3.10 7 / g are lupine, lentil, corn, bean, canary seed, chickpea and rice.
  • the seeds to use preferably are those of canarygrass, lentil and corn.
  • the incorporation into the soil is satisfactory at the rate of 2 g per liter of soil. Due to the time required to obtain maximum growth, the fungus on its support is preferably incorporated into the soil about 15 days before planting.
  • lyophilization is a drying technique by sublimation of ice from solutions or suspensions of tissue, previously solidified by freezing. This technique commonly used for the conservation of micro ⁇ organisms in National Myco reviews, implies great respect for the operating conditions:
  • Lyophilization of fungi can not be done on the mycelium too sensitive to temperature and pressure variations, we must therefore make the fungus fruit to obtain conidia which can be assimilated to resistance organs capable of being lyophilized. This need to use conidia eliminating the use of any liquid medium, the fungus is grown on an agar medium based on soy flour.
  • a sheet of cellophane paper is interposed between the agar medium and the inoculum of the mushroom. This paper, while separating the fungus from the agar medium, has the particularity of allowing the fungus to feed through the surface of the paper.
  • the paper is removed and soaked in a liquid containing vitamins and microelements.
  • the mycelium and the conidia detach from the cellophane paper.
  • the whole consisting of the mycelium, the conidia and the vitamins and microelements is then lyophilized. The presence of vitamins and micro-elements will allow better recovery in the field.
  • the lyophilized fungus is in the form of a powder which can be diluted in water, therefore more easily usable by the farmer.
  • the fungus can be used in the same way as a chemical, by mechanical spreading.
  • this formulation has the advantage of considerably reducing the quantities of product to be spread on the ground and allows better and longer conservation of the product. Due to the time required to obtain maximum growth, the fungus Arthrobotrys conoides is preferably incorporated into the soil to be treated about 15 days before planting.
  • the agar contained in the dishes is inverted on a 100 ⁇ m mesh sieve, the bottom of which is flush with the water of an underlying Petri dish.
  • This arrangement allows nematodes not trapped by the fungus to actively cross the sieve fabric to reach the water. The non-trapped nematodes are then counted under the magnifying glass.
  • strains A, A 'and B trap between 60% and 100% of nematodes in 24 hours, the other three strains being below this threshold .
  • the six strains trap between 50% and 75% of the nematodes in 24 hours.
  • strains studied fall into 2 categories with different trapping capacity: A, A 'and B trap on average 80% of nematodes in 24 hours; Br, T and VI only trap 30% of Meloidogyne in 24 hours.
  • the tubes were treated as follows: Control soil not containing predatory fungus
  • VU Soil containing the Vl strain the nematodes are inoculated on the same day as the fungus is incorporated into the soil.
  • the strain V1 is incorporated into the soil (in half dose: 50 g / m 2 ) 15 days before inoculation of the nematodes, and the strain A is added in half dose on the same day as the nematodes.
  • the purpose of this test is to highlight the action of the fungus Arthroiotrys conoides on the nematode Meloidogyne hapla as well as to specify the quantity of product useful per m 2 .
  • the 6 strains of Arthrobotrys conoides were tested with this nematode. The test was carried out in a mini-pot containing 300 g of soil, the plant used was a St Pierre tomato, a variety very sensitive to nematodes.
  • Each pot was contaminated with 300 Meloidogyne hapla or 100 nematodes per 100 g of soil, which corresponds to the upper threshold of an average infestation in the fields.
  • results were read using a coloration of the roots with eosin, this vital coloration making it possible to count the masses of first generation eggs from the infesting larvae which have entered the root system.
  • Arthrobotrys conoides is a predatory fungus which, in the absence of nematodes, can be maintained in the soil by digesting organic matter (saprophagous nutrition). This is why to the sterile soil of the station is added a sterile organic amendment (without micro ⁇ organisms) which allows a better development of the fungus during the first 15 days of the test.
  • Mass number 65 150 145 150 125 123 163 eggs / plant
  • strain A As for the 40 g / m 2 dose, the best results were obtained with strain A, but strain VI at this dose is also effective. To obtain rapid and reliable results, it is better to use strain A at a dose of 80 g / m 2 when it is produced on a medium based on cooked cracked corn.
  • strains A, B, T and VI This test was carried out with strains A, B, T and VI. To make this test, the different strains were cultivated on a substrate based on cracked cooked corn. The quantities of mushroom brought in were rigorously adjusted according to the strains so that there is always the same number of propagules per liter of soil (10 8 propagules / 100 1). For strains A and B the inoculation dose was 60 g / 100 l of soil. For strain T the inoculation dose was 190 g / 100 1. Finally for strain VI, a dose of 80 g / 100 1 of sol was used. A culture of carrots not treated with fungus served as a control.
  • This test was carried out in a greenhouse, in an agricultural environment with Arthro & otrys conoides 42A. It is intended to evaluate the dose of predatory fungus to be spread on the ground.
  • the fungus is grown on a medium based on cracked corn.
  • the content of this medium is 10 7 propagules / g.
  • the plot available to us is 120 m 2 . It was divided into three zones of 40 m 2 each, which are separated from each other by planks in order to isolate them well. The first plot constitutes the control area, it is followed by an area treated with 50 g of preparation of 42A per m 2 , then a plot containing 100 g of preparation per m 2 .
  • the tomato plants are distributed in four rows, in the two middle rows (in order to avoid border effects), 10 feet of sensitive tomatoes (St Pierre variety) have been distributed, these plants will be uprooted for analysis .
  • the radical system once washed is ground in a 1% solution of calcium hypochlorite at 12 * chlorometric.
  • This ground material is passed through a series of sieves in order to remove the fragments of plant tissue.
  • the Meloidogyne eggs from the root are collected on a 5 ⁇ m sieve and counted with a binocular magnifier. They will constitute the infesting potential for the next crop.
  • a Meloidogyne female can give, depending on the climatic conditions, from 300 to 3000 eggs, an infestation is considered to be average when the number of larvae per 10 g of root is between 100 and 1000.
  • the nematophagous fungus is directly incorporated into the root ball, bucket or container.
  • the sowing by the predatory fungus is carried out from the start in the pressed clods which are used for the manufacture of market garden plants. By operating in this way, it appeared that in the 20 to 30 days when the newly transplanted plants in the clods remain in the greenhouse in hot and humid conditions, the predatory fungus has time to grow and invade all of the clod which then behaves like an inoculum when it is placed in culture.
  • the soil usually used for making clods is a mixture rich in humus, at neutral pH, it is therefore particularly favorable for the development of Arthroiotrys conoides 42.
  • the plant's root system is literally enveloped in the mycelial felting which does not however absolutely disturb its growth. The root system is therefore protected from attack by nematodes, even if the root ball is planted in particularly contaminated soil. It thus appears that the young plant is well protected from the start of the vegetation, but it is generally when a plant is young that it most fears attacks by nematodes.
  • the method of the invention can be applied to all vegetable, floral, or nursery plants, although some of these plants do not suffer too much from Meloidogyne nematodes. It can also be used on carrot crops which are sensitive to Heterodera carotae, or against Ditylenchus myceliophagus in the case of the layer fungus Agaricus bisporu ⁇ . In the latter case, the nematophagous fungus can be added to the compost after pasteurization.

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Abstract

Agent nématophage destiné à lutter contre les nématodes du genre Meloidogyne, Heterodera et Ditylenchus myceliophagus, caracterisé en ce qu'il est choisi parmi un groupe de six souches de Arthrobotrys conoides Drechsler (42A, 42A', 42B, 42Br, 42T et 42Vl), déposées à la Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes (Institut Pasteur) sous les numéros I-1425 à I-1430, et procédé de mise en application consistant à incorporer l'agent nématophage dans le sol où sont effectuées les cultures au moyen de graines ensemencées au préalable par l'inoculum de l'agent nématophage.

Description

Nouvel agent nematophage contre les nematodes du genre
Méloidogyje
Domaine technique
La présente invention concerne un nouvel agent nematophage destiné à lutter contre les nematodes du genre
Meloidogyne, et un procédé de lutte contre la prolifération de ces nematodes en mettant en oeuvre des nouvelles souches du champignon ArtΛro-otrys conoides Drechsler.
L'état de la technique
Il est connu depuis longtemps que les nematodes phytophages occasionnent des pertes considérables aux cultures, estimées à 3 milliards de francs chaque année. Les espèces les plus répandues et causant les dégâts les plus importants dans le monde appartiennent au genre Meloidogyne. Ce genre plus connu chez les agriculteurs sous le nom de "nematodes à galles" induit en effet la formation de galles sur le système radiculaire des plantes attaquées. Ces nematodes extrêmement polyphages, attaquent pratiquement toutes les cultures et sont de ce fait responsables de baisses de rendements catastrophiques de l'ordre de 50 à 70%. Dans de nombreuses régions, Heterodera carotae est un dangereux ravageur spécifique des cultures de carottes pour lesquelles ses piqûres déclenchent une production anormale de radicelles latérales et qui rend les carottes non commercialisables. Un autre nématode, Ditylenchus myceliophagus, peut causer des dégâts importants sur les cultures de l'agaric dans les champignonnières.
Pour lutter contre ces ravageurs, les agriculteurs disposent de plusieurs moyens qui, en culture intensive, se résument à faire appel :
- soit à une désinfection préventive du sol avant la mise en culture à l'aide de fumigants (Bromure de Méthyle, Chloropicrine, Dichloropropène... ) . Ces produits, à spectre d'action très large, stérilisent le sol et détruisent ainsi l'équilibre écologique du milieu. De plus en sol léger, leurs résidus peuvent passer dans la nappe phréatique, et en sol lourd leur efficacité est réduite par leur mauvaise diffusion soit à des traitements curatifs sur certaines cultures en place au moyen de produits systémiques, véhiculés par la sève (carbamates ou organophosphorés) , ceci pour des productions non consommées telles les cultures florales ou les pépinières. Ces produits sont dangereux aussi bien pour les animaux que pour l'homme, car ils passent dans la plante en y laissant des résidus toxiques. Ces deux techniques n'agissent que sur les trente premiers centimètres de sol. Les nematodes qui peuvent se trouver à une plus grande profondeur vont de nouveau envahir la zone traitée au cours de la culture suivante. Ceci implique une répétition continuelle des désinfections. En outre, du fait de leur toxicité pour l'homme, plusieurs nématicides chimiques tendent à être interdits dans de nombreux pays, comme c'est le cas aux Pays-Bas, en Suisse, en Allemagne.
Exposé de l'invention
C'est pourquoi, le but de l'invention est d'utiliser un agent naturel pour lutter contre les nematodes, qui ne soit pas dangereux pour l'homme et son environnement.
L'objet principal de l'invention est donc un nouvel agent nematophage destiné à lutter contre les nematodes du genre Meloidogyne, Heterodera et Ditylenchus myceliophagus, choisi parmi six souches du champignon ArtiiroJbotrys conoides Drechsler.
Un autre objet de l'invention est un procédé de lutte contre les nematodes du genre Meloidogyne, Heterodera et
Ditylenchus myceliophagus consistant à incorporer le champignon Art roiotrys conoides Drechsler dans le sol où sont effectuées les cultures au moyen de graines ensemencées au préalable par l'inoculum du champignon.
Brève Description des igures Les buts, objets et caractéristiques de la présente invention font l'objet de la description suivante pour laquelle les dessins joints illustrent certains aspects de l'invention.
La figure 1 représente schématiquement un conidiophore et ses conidies des souches c\ * Arthrobotrys conoides selon l'invention.
La figure 2 est une représentation schématique des pièges formés par les souches d 'Arthrobotrys conoides selon
1'invention pour capturer les nematodes. La figure 3 représente une table donnant le résultat obtenu avec un gel d'électrophorèse utilisé pour différencier les différentes souches d'ArtiiroJotrys conoides.
Description détaillée de l'invention
Les six souches d'ΛrtήroJotrys conoides Drechsler qui font l'objet de l'invention proviennent d'endroits différents. Le critère principal pour vérifier que les différentes souches appartiennent à la même espèce est la mesure des conidies (organes de reproduction de ces champignons).
Comme illustré sur la figure 1, les conidies sont groupées par 20 ou 30 sur le conidophore. Les conidiophores peuvent continuer à se développer au delà d'une première tête de conidies et après une certaine longueur de croissance former un second groupe de conidies et ainsi de suite jusqu'au développement de 5 à 6 groupes additionnels.
La souche 42A est originaire de Fada N'Gourma au Burkina Faso, elle est constituée par un mycélium composé d'hyphes cloisonnés hyalins.
Les conidiophores se terminent par une tête d'environ 20 conidies serrées ; sur les cultures âgées, ils continuent à se développer et peuvent produire successivement 5 à 10 groupes additionnels de conidies.
Les conidies s'atténuent d'une manière prononcée vers leur base, elles ont une forme presque conique et sont constituées de deux cellules de tailles différentes, la longueur totale de la conidie est en moyenne de 27 μm.
Cette souche a fait l'objet d'un dépôt auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes (CNCM) à l'Institut Pasteur, où elle a été enregistrée sous le n* 1-1425.
La souche 42A' est originaire de Leguéma au Burkina Faso.
Les conidiophores se terminent par une tête formée de 3 à 20 conidies serrées ; sur les cultures âgées, ils continuent à se développer et peuvent produire successivement 3 à 5 groupes additionnels de conidies.
Les conidies s'atténuent d'une manière prononcée vers leur base, elles ont une forme presque conique et sont constituées de deux cellules de tailles différentes, la longueur totale de la conidie est en moyenne de 30 μm.
Cette souche a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM (Institut Pasteur), où elle a été enregistrée sous le n* 1-1426.
La souche 42B provient de la mycothèque de Baarn aux Pays-Bas.
Sur les cultures jeunes (moins d'un mois), les conidiophores sont rares et se terminent par une tête formée de 3 à 20 conidies serrées ; la formation de groupements additionnels de conidies est rare. Les conidies s'atténuent d'une manière prononcée vers leur base, elles ont une forme presque conique et sont constituées de deux cellules de tailles différentes, la longueur totale de la conidie est en moyenne de 28 μm.
Cette souche a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM (Institut Pasteur), où elle a été enregistrée sous le n* 1-1427.
La souche 42Br provient du Brésil. O 95/34209 PC17FR95/00785
Les conidiophores se terminent par une tête formée de 10 à 20 conidies serrées. Ils continuent à se développer et produisent successivement 5 à 10 groupes additionnels de conidies. Les conidies s'atténuent d'une manière prononcée vers leur base, elles ont une forme presque conique et sont constituées de deux cellules de tailles différentes, la longueur totale de la conidie est en moyenne de 23 μm.
Cette souche a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM (Institut Pasteur), où elle a été enregistrée sous le n* 1-1428.
La souche 42T a été récoltée à Tours Indre-et-Loire (France) .
Les conidiophores se terminent par une tête formée de 10 à 20 conidies serrées. Sur les cultures âgées, ils continuent à se développer et produisent successivement 3 à 5 groupes additionnels de conidies.
Les conidies s'atténuent d'une manière prononcée vers leur base, elles ont une forme presque conique et sont constituées de deux cellules de tailles différentes, la longueur totale de la conidie est en moyenne de 28 μm.
Cette souche a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM (Institut Pasteur), où elle a été enregistrée sous le n* 1-1429. La souche 42V1 a été prélevée à Villeneuve Loubet Alpes-Maritimes (France).
Les conidiophores se terminent par une tête formée de 10 à 20 conidies serrées. Sur les cultures âgées, ils continuent à se développer et produisent successivement 20 à 30 groupes additionnels de conidies.
Les conidies s'atténuent d'une manière prononcée vers leur base, elles ont une forme presque conique et sont constituées de deux cellules de tailles différentes, la longueur totale de la conidie est en moyenne de 23 μm. Cette souche a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM (Institut Pasteur), où elle a été enregistrée sous le n* 1-1430. Le mycélium des champignons nématophages a la capacité de produire des organes de capture qui piègent les nematodes. Les pièges du mycélium des six souches d'ArthroJ otrys conoides selon l'invention sont en forme d'anses hyphales qui deviennent par anastomose des réseaux plus ou moins compliqués comme illustré sur la figure 2.
Des six souches étudiées, seule la souche 42A forme spontanément des pièges. Les 5 autres forment des pièges induits par la présence des nematodes dans le milieu de culture. Qu'ils soient spontanés ou induits, les pièges sont constitués par des anses hyphales qui deviennent par anastomose des réseaux plus ou moins compliqués.
L'étude du génome des six souches par la technique des RAPD permet de différencier sans ambiguïté les six souches grâce à un oligonucléotide.
L'emploi d'un gel d'électrophorèse a permis de révéler les résultats de la figure 3 où les bandes ont été schématisées, et où le témoin sert à déterminer la taille des fragments d'ADN. Les différentes souches d 'Arthrobotrys conoides peuvent être utilisées de façon industrielle pour lutter contre les nematodes en utilisant les procédés décrits ci- après.
L'utilisation d'un milieu de culture à base de graines permet une bonne conservation du champignon. Ce dernier se réfugie à l'intérieur de la graine et devient donc moins sensible aux agressions du milieu extérieur. De plus, chaque graine épandue sur le sol est le point de départ d'une nouvelle colonie mycélienne. Les graines sont mises à tremper 24 heures dans l'eau en excès avant d'être stérilisées. Puis les graines sont ensemencées avec l'inoculum de champignon.
Les meilleures espèces à utiliser comme support sont celles qui permettent d'atteindre le maximum de croissance en un minimum de temps. Un deuxième critère est le nombre de propagules par gramme de milieu support atteint au moment du maximum de croissance, la propage correspondant à un fragment minimum de mycélium ou même à une seule conidie.
Les espèces qui peuvent être utilisées sont parmi les graminées, les légumineuses, ou les oléagineux. Ainsi, on peut utiliser le chanvre, le tournesol et le riz pour lesquels le temps pour atteindre le maximum de croissance est de 14 jours. On peut encore utiliser l'avoine, le sorgho, l'orge, le blé, la lentille, le maïs, l'alpiste, le soja, le haricot, le lupin, le pois chiche, la fèverole. Parmi les espèces ci-dessus, celles qui permettent d'obtenir un nombre de propagules maximum, soit environ 3.107/g, sont le lupin, la lentille, le maïs, le haricot, l'alpiste, le pois chiche et le riz.
Pour une meilleure répartition du champignon, il est préférable d'epandre, à poids égal, des petites graines. Pour cette raison et d'autres, les graines à utiliser de préférence sont celles d'alpiste, lentille et maïs. Dans le cas du maïs, l'incorporation dans le sol est satisfaisante à raison de 2 g par litre de sol. En raison de la durée nécessaire pour obtenir le maximum de croissance, le champignon sur son support est de préférence incorporé dans le sol environ 15 jours avant la plantation.
Les différentes souches d 'Arthrobotrys conoides peuvent également être utilisées sous forme d'un produit lyophilisé. Il est rappelé ici que la lyophilisation est une technique de dessiccation par sublimation de la glace provenant de solutions ou de suspensions de tissus, préalablement solidifiées par congélation. Cette technique couramment employée pour la conservation des micro¬ organismes dans les Mycothèques Nationales, implique un grand respect des conditions opératoires :
. basse température pour assurer la congélation du produit . pression réduite pour assurer la sublimation de la glace absence de liquide interstitiel lors de la sublimation de la glace.
Pour remplir ces conditions, il suffit d'induire au niveau du produit à cryodessécher un déséquilibre entre la pression et la température par élévation de la température et d'empêcher l'équilibre de se restaurer par évacuation de la vapeur.
La lyophilisation des champignons ne pouvant pas se faire sur le mycélium trop sensible aux variations de température et de pression, on doit donc faire fructifier le champignon pour obtenir des conidies qui peuvent être assimilées à des organes de résistance capables d'être lyophilisés. Cette nécessité d'utiliser des conidies éliminant l'utilisation de tout milieu liquide, le champignon est cultivé sur un milieu gélose à base de farine de soja.
Afin d'éliminer l'inconvénient présenté par la présence de l'agar-agar (gélose) et par le poids du milieu de culture (farine de soja), on intercale une feuille de papier cellophane entre le milieu gélose et l'inoculum du champignon. Ce papier, tout en séparant le champignon du milieu gélose, a la particularité de permettre au champignon de se nourrir à travers la surface du papier.
Une fois que le mycélium a envahi toute la surface du milieu de culture, on retire le papier et on le trempe dans un liquide contenant des vitamines et des micro-éléments. Dans le liquide, le mycélium et les conidies se détachent du papier de cellophane. L'ensemble constitué du mycélium, des conidies et des vitamines et micro-éléments est ensuite lyophilisé. La présence des vitamines et des micro-éléments permettra une meilleure reprise sur le terrain.
L'originalité de cette technique consiste en la séparation préalable de la fraction fongique du milieu nutritif qui a servi à sa culture. Ainsi, le champignon lyophilisé se présente sous la forme d'une poudre pouvant se diluer dans l'eau, donc plus facilement utilisable par l'agriculteur. Sous cette forme, le champignon peut être utilisé de la même manière qu'un produit chimique, par épandage mécanique. De plus, cette formulation a l'avantage de réduire considérablement les quantités de produit à épandre sur le sol et permet une meilleure et plus longue conservation du produit. En raison de la durée nécessaire pour obtenir le maximum de croissance, le champignon Arthrobotrys conoides est de préférence incorporé dans le sol à traiter environ 15 jours avant le plantation.
L'efficacité des différentes souches d 'Arthrobotrys conoides vis à vis de Meloidogyne, Heterodera et Ditylenchus myceliophagus a d'abord été testée lors d'essais in-vitro effectués en boîte de Pétri. Pour réaliser ces essais in-vitro, les différentes souches de 1'Artήroiotrys conoides ont été cultivées sur milieu gélose (Corn meal agar : 1, Agar-agar : 1) en boîtes de Pétri. Quand le champignon a envahi toute la gélose, 200 nematodes sont déposés aseptiquement dans chaque boîte de champignons y compris des boîtes témoins contenant seulement du milieu gélose. Après un laps de temps de lh, 2h, 8h, et 24 heures, la gélose contenue dans les boîtes est renversée sur un tamis de mailles de 100 μm dont le fond affleure l'eau d'une boîte de Pétri sous-jacente. Ce montage permet aux nematodes non piégés par le champignon, de traverser activement la toile de tamis pour atteindre l'eau. Les nematodes non piégés sont ensuite comptés sous la loupe.
Dans le cas de Meloidogyne et Ditylenchus myceliophagus, les six souches se séparent en 2 groupes : les souches A, A' et B piègent entre 60% et 100% de nematodes en 24 heures, les trois autres souches se trouvant en dessous de ce seuil.
Dans le cas d'Heterodera carotae, les six souches piègent entre 50% et 75% des nematodes en 24 heures.
Il a par ailleurs été observé que le développement du champignon était rapide (en moyenne 1,5 cm par 24 heures). II peut donc être utilisé de façon satisfaisante dans la pratique en tant qu'agent nematophage dans les cultures maraîchères et florales ainsi que dans les plants de pépinières.
Dans le cadre d'essais relatifs à l'écologie des nouvelles souches de champignon prédateur de nematodes, il a été observé que celles-ci se développent bien dans les sols dont la salinité ne dépasse pas 3 g/1.
Il a été également noté par ailleurs que le champignon prédateur envahit beaucoup plus intensément le milieu quand il est introduit à forte dose, mais ceci ne 1'empêche pas de coloniser les substrats de manière appréciable même à la dose de 10% du volume de terre.
L'activité prédatrice des différentes souches d 'Arthrobotrys conoides 42 a par ailleurs été confirmée par un certain nombre d'essais d'applications pratiques dont quelques résultats sont rappelés ci-après à titre indicatif.
I. Essai en tubes sous serre contre Meloidogyne
Les souches étudiées se divisent en 2 catégories dont la capacité de piégeage est différente : A, A' et B piègent en moyenne 80% des nematodes en 24 heures ; Br, T et VI ne piègent que 30% de Meloidogyne en 24 heures.
Pour réaliser cet essai, nous avons pris les 2 souches les plus représentatives dans chaque catégorie soit A et VI. Cet essai a été fait dans des tubes de 50 ml contenant 30 ml de sol. Les souches de champignons cultivées sur un milieu à base de maïs concassé cuit et stérilisé, ont été incorporées au sol à la dose de 100 g/m2.
Les tubes ont été traités comme suit : Témoin Sol ne contenant pas de champignon prédateur
A1 Sol contenant la souche A, l'inoculation des nematodes s'effectue le même jour que l'incorporation du champignon dans le sol.
VU Sol contenant la souche Vl, l'inoculation des nematodes s'effectue le même jour que l'incorporation du champignon dans le sol.
A15 Sol contenant la souche A, l'inoculation des nematodes s'effectue 15 jours après l'incorporation du champignon dans le sol.
V1 15 Sol contenant la souche Vl, l'inoculation des nematodes s'effectue 15 jours après l'incorporation du champignon dans le sol.
A1 + V1 15 La souche Vl est incorporée au sol (en demi dose : 50 g/m2) 15 jours avant l'inoculation des nematodes, et la souche A est ajoutée en demi dose le même jour que les nematodes.
Le jour J, 30 larves de Meloidogyne sont déposées dans chaque tube. Au bout de 24 heures, les tubes de chaque série sont sortis et leur contenu est analysé afin de connaître le nombre de nematodes piégés. Cette manipulation est renouvelée tous les jours jusqu'au piégeage complet de tous les nematodes.
Les résultats obtenus présentés dans le tableau qui suit montrent que, quelle que soit la souche d'ArtiiroJotrys conoides, si le champignon est incorporé 15 jours avant la mise en culture (donc avant l'activation des nematodes par sa plante hôte), le piégeage varie de manière significative durant les premiers jours, mais cette différence s'atténue rapidement.
% moyen de % moyen de % moyen de nematodes piégés à nematodes piégés à nematodes piégés à
J+1 J+2 J+3
A1 46,14 66,67 90,28
VU 32,09 59,44 87,22
A15 63,12 80,28 94,44
V1 15 61 ,8 86,11 93,06
A1 + V1 15 44,92 88,89 95,06 II. Essai sous serre en mini-pots avec Meloidogyne hapla
Cet essai a pour but de mettre en évidence l'action du champignon Arthroiotrys conoides sur le nématode Meloidogyne hapla ainsi que de préciser la quantité de produit utile au m2. Les 6 souches d 'Arthrobotrys conoides ont été testées avec ce nématode. L'essai a été réalisé en mino-pot contenant 300 g de sol, la plante utilisée était une tomate St Pierre, variété très sensible aux nematodes.
Chaque pot a été contaminé avec 300 Meloidogyne hapla soit 100 nematodes pour 100 g de sol, ce qui correspond au seuil supérieur d'une infestation moyenne aux champs.
La lecture des résultats a été effectuée grâce à une coloration des racines à l'éosine, cette coloration vitale permettant de compter les masses d'oeufs de la première génération issues des larves infestantes ayant pénétré dans le système radiculaire.
Arthrobotrys conoides est un champignon prédateur qui, en l'absence de nematodes, peut se maintenir dans le sol en digérant la matière organique (nutrition saprophage). C'est pourquoi au sol stérile de la station est ajouté un amendement organique stérile (sans micro¬ organismes) qui permet un meilleur développement du champignon pendant les 15 premiers jours de l'essai.
Calcul des doses de traitement : on prend pour base un nombre de propagules équivalent à 108 propagules/m2 de sol. Or, pour les 6 souches d'ArfchroJotrys conoides , on atteint en moyenne ce chiffre avec 15 g de préparation à base de graines de maïs concassées et autoclavées. Pour se laisser une certaine marge de manoeuvre, la dose moyenne testée commune aux 6 souches a été de 40 g/m2, la deuxième dose d'essai équivalait au double soit 80 g/m2. 5 répétitions ont été faites pour chaque souche et pour chaque dose, sans oublier un témoin sans champignon. Résultats : pour la dose d'essai moyenne commune aux 6 souches et correspondant à 40 g/m2 les résultats sont les suivants :
A A' B Br T VI Témoin
Nb de masse 65 150 145 150 125 123 163 d'oeufs/plant
% d'efficacité du 60% 8% 11% 8% 23% 24% champignon
Les meilleurs résultats ont été obtenus avec la souche A.
A la dose d'essai double de 80 g/m2 les résultats ont été les suivants :
2A 2A' 2B 2Br 2T 2V1 Témoin
Nb de masse 32 116 133 146 94 77 163 d'oeufs/plant
% d'efficacité du 80% 28% 18% 10% 42% 53% champignon
Comme pour la dose de 40 g/m2, les meilleurs résultats ont été obtenus avec la souche A, mais la souche VI à cette dose est elle aussi efficace. Pour obtenir des résultats rapides et fiables, il vaut mieux utiliser la souche A à la dose de 80 g/m2 quand celle-ci est produite sur un milieu à base de maïs concassé cuit.
III. Essai en pot sur culture de carottes attaquées par Heterodera carotae
Cet essai a été réalisé avec les souches A, B, T et VI. Pour faire ce test, les différentes souches ont été cultivées sur un substrat à base de maïs cuit concassé. Les quantités de champignon apportées ont été rigoureusement ajustées en fonction des souches de manière à ce qu'il y ait toujours le même nombre de propagules par litre de sol (108 propagules/100 1) . Pour les souches A et B la dose d'inoculation a été de 60 g/100 1 de sol. Pour la souche T la dose d'inoculation a été de 190 g/100 1. Enfin pour la souche VI on a utilisé une dose de 80 g/100 1 de sol. Une culture de carottes non traitées avec du champignon a servi de témoin.
Cet essai a permis de dénombrer les kystes d'Heterodera carotae issus de la génération des larves infestantes.
A B T Vl Témoin
Nb de 39 49 96 40 106 kystes
% d'efficacité du 63% 54% 9% 62% champignon
On remarque qu'avec Heterodera carotae comme avec Meloidogyne hapla, les souches qui donnent les meilleurs résultats sont les souches A et VI.
IV. Essai sous serre sur culture de tomates
Cet essai a été réalisé sous serre, en milieu agricole avec de l'Arthro&otrys conoides 42A. Il est destiné à évaluer la dose de champignon prédateur à épandre sur le sol.
Pour ce test, le champignon est cultivé sur un milieu à base de maïs concassé. La teneur de ce milieu est de 107 propagules/g.
La parcelle mise à notre disposition est de 120 m2. Elle a été découpée en trois zones de 40 m2 chacune, qui sont séparées entre elles par des planches afin de bien les isoler. La première parcelle constitue la zone témoin, elle est suivie d'une zone traitée avec 50 g de préparation de 42A par m2, puis d'une parcelle contenant 100 g de préparation par m2.
Avant de mettre en place cet essai, une première analyse a été faite sur du sol prélevé entre la culture en place (salade).
Elle a été réalisée en mettant des jeunes plants de tomates sensibles (variété St Pierre) dans ce sol afin de révéler la présence de nematodes. Un mois après la plantation, une coloration des racines au Lactophénol Bleu- Coton (de GUIRAN, 1966) est réalisée. Cette coloration met en évidence les juvéniles de Meloidogyne ayant pénétré dans les racines de la tomate.
Nous avons trouvé 620 larves de Me2oidogyne/10 g de racines, ce qui correspond à une infestation moyenne. Ce taux moyen d'infestation est idéal pour tester le champignon nematophage. En effet, comme tout moyen de lutte biologique, il agit lentement et ne peut arriver à réguler une très forte pullulation de nematodes sur une seule campagne de culture. L'ArtήroJbotr s conoides 42A a été épandu 15 jours avant la plantation des pieds de tomates. Ce laps de temps de 15 jours permet au champignon prédateur de commencer à coloniser le sol et donc d'être opérationnel au moment de la mise en place de la culture. En effet, les plants de tomates émettent dans le sol des exsudats radicalaires, qui activent l'éclosion des oeufs de Meloidogyne et permettent aux jeunes larves de se diriger jusqu'aux racines.
Les plants de tomates sont répartis sur quatre rangs, dans les deux rangs du milieu (afin d'éviter les effets de bordure), 10 pieds de tomates sensibles (variété St Pierre) ont été répartis, ce sont ces plants qui seront arrachés pour analyse.
Les derniers prélèvements ont été faits en fin de culture. Les plants sensibles ont été arrachés et les racines analysées.
Pour cela, le système radicalaire une fois lavé est broyé dans une solution à 1% d'Hypochlorite de calcium à 12* chlorométrique. Ce broyât est passé sur une série de tamis afin d'éliminer les fragments de tissus végétal. Les oeufs de Meloidogyne issus de la racine sont recueillis sur un tamis de 5 μm et comptés à la loupe binoculaire. Ils vont constituer le potentiel infestant pour la culture suivante.
Parcelle témoin Parcelle à 50g/m2 Parcelle à 100 g/m2
Nombre d'oeufs pour 10 g de 44581 25 838 17725 racine
Il est bon de préciser certains points :
- une femelle de Meloidogyne peut donner, suivant les conditions climatiques, de 300 à 3000 œufs, une infestation est considérée comme moyenne lorsque le nombre de larves pour 10 g de racine est compris entre 100 et 1000.
On remarque une diminution sensible du potentiel infestant (plus de la moitié) entre la parcelle témoin et la parcelle traitée avec 100 m2 d'ArtiîroJ otrys conoides 42A.
Pour les plantes livrables en mottes, godets ou conteneurs, on incorpore directement le champignon nematophage au sein de la motte, du godet ou du conteneur.
L'ensemencement par le champignon prédateur s'effectue dès le départ dans les mottes pressées qui sont utilisées pour la fabrication des plants maraîchers. En opérant de la sorte, il est apparu que dans les 20 à 30 jours où les plants nouvellement repiqués dans les mottes restent en serre au chaud et à l'humidité, le champignon prédateur à le temps de croître et d'envahir la totalité de la motte qui se comporte alors comme un inoculum lorsqu'elle est mise en place en culture. Cette variante du procédé selon l'invention, applicable aux plants livrables O 95/34209
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en mottes, godets, conteneurs ou analogues, s'est avéré présenter les avantages décisifs suivants :
Le sol habituellement utilisé pour la confection des mottes est un mélange riche en humus, à pH neutre, il est donc particulièrement favorable au développement de l'Arthroiotrys conoides 42. On a par ailleurs constaté que le système radiculaire de la plante se trouve littéralement enveloppé dans le feutrage mycélien qui ne perturbe cependant absolument pas sa croissance. Le système radiculaire est donc protégé des attaques des nematodes, même si la motte est plantée dans un sol particulièrement contaminé. Il apparaît donc ainsi que la jeune plante est bien protégée dès le départ de la végétation, or, c'est généralement lorsqu'une plante est jeune qu'elle craint le plus les attaques des nematodes.
Les différentes expériences conduites ont démontré que la motte constitue un inoculum important, à partir duquel le champignon gagne très facilement le sol environnant. La préparation de tels mottes, godets, conteneur ou équivalent ne soulève pas le moindre problème technique d'emploi ni de fabrication de plants. Il suffit en effet d'amener le granulé dans le mélange par exemple à l'aide d'une trémie. La plantation des végétaux ainsi préparée s'effectue par ailleurs de façon tout à fait habituelle.
En résumé, le procédé de l'invention peut être appliqué à toutes les cultures maraîchères, florales, ou plants de pépinières, bien que certains de ces plants ne souffrent pas trop de nematodes Meloidogyne. Il peut aussi être employé sur cultures de carottes qui sont sensibles à Heterodera carotae, ou contre Ditylenchus myceliophagus dans le cas du champignon de couche Agaricus bisporuε . Dans ce dernier cas, le champignon nematophage peut être ajouté au compost après pasteurisation.

Claims

O 95/34209 PCÏ7FR95/0078518REVENDICATIONS
1. Agent nematophage destiné à lutter contre les nematodes du genre Meloidogyne caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe de six souches de Arthrobotrys conoides Drechsler consistant en souches 42A, 42A' , 42B, 42Br, 42T et 42V1.
2. Agent nematophage selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit groupe de six souches comprend les souches déposées à la Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes (Institut Pasteur) respectivement sous les numéros : 1-1425, 1-1426, 1-1427, 1-1428, 1-1429 et 1-1430.
3. Procédé de lutte contre les nematodes du genre Meloidogyne, Heterodera et Ditylenchus myceliophagus dans les cultures, consistant à incorporer dans le sol où sont effectuées les cultures, l'agent nematophage selon la revendication 1 ou 2.
4. procédé selon la revendication 3, dans lequel 1'agent nematophage est incorporé dans le sol au moyen de graines ensemencées au préalable par l'inoculum dudit agent nematophage.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel lesdites graines sont choisies dans le groupe consistant en alpistes, lentille et maïs.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel 1'agent nematophage est préalablement ensemencé sur un milieu à base de maïs concassé contenant au moins 107 propagules dudit agent par gramme.
7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, dans lequel 1'agent nematophage est préalablement ensemencé sur un milieu à base de maïs concassé, cuit et stérilisé, ledit milieu ensemencé étant ensuite incorporé dans le sol à la dose de lOOg/ 2.
8. Procédé selon la revendication 5 ou 6, dans lequel 1'agent nematophage est préalablement ensemencé sur un milieu à base de maïs concassé, cuit et stérilisé, ledit milieu ensemencé étant ensuite incorporé dans le sol à la dose de 2 g par litre de sol.
9. Procédé selon la revendication 3, dans lequel 1'agent nematophage est préalablement lyophilisé avant d'être incorporé dans le sol sous forme de poudre.
10. Procédé selon la revendication 4, dans lequel 1'agent nematophage est préalablement mis à fructifier sur un milieu de culture pour le développement des conidies avant d'être lyophilisé.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel on intercale une feuille de papier cellophane entre l'agent nematophage mis à fructifier et le milieu de culture de façon à ce que les éléments dudit agent nematophage contenant les conidies soient recueillis en trempant ladite feuille de cellophane dans un liquide.
12. Procédé selon la revendication 3, dans lequel 1'agent nematophage est incorporé directement dans la motte, le godet ou conteneur qui est utilisé pour livrer des plants de pépinières ou de culture maraîchère.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 12, dans lequel ledit agent nematophage est incorporé dans le sol environ 15 jours avant la plantation.
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