CN104010511A

CN104010511A - 线虫的生物控制

Info

Publication number: CN104010511A
Application number: CN201280060948.5A
Authority: CN
Inventors: R·N·罗亚尔蒂; V·P·托马斯
Original assignee: AgraQuest Inc
Current assignee: AgraQuest Inc
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2012-11-02
Publication date: 2014-08-27
Also published as: AR088660A1; PT2773214T; EP2773214A1; EP2773214B1; WO2013067275A1; US9023339B2; US20130142759A1; PL2773214T3; BR112014010587A2; TW201334695A; ZA201403776B; TR201808629T4; ES2681889T3

Abstract

提供了用于控制植物、植物部分和/或植物生长的场所中或其上的线虫的方法，所述方法包括给需要防护所述线虫的植物、植物部分或植物生长的场所施用有效量的短小芽胞杆菌、短小芽胞杆菌的突变体或短小芽胞杆菌的至少一种代谢物。具体地，所述短小芽胞杆菌可以是菌株QST2808。

Description

线虫的生物控制

发明背景

植物寄生线虫引起对多种农作物的严重损害，每年导致据估计从5％至12％的全球农作物产率损失。线虫对根的损伤是非常普遍的，导致具有较小的根系、在它们的叶中显示矿物质不足的症状以及容易枯萎的矮化植物。线虫造成的损害也使植物易受多种植物致病性真菌和细菌引起的感染。

为了抵抗和控制线虫，农民通常使用化学杀线虫剂。这些杀线虫剂从气体和液体熏烟消毒法(例如甲基溴化物和氯化苦)到有机磷酸盐和氨基甲酸酯例如硫磷嗪和草氨酰的施用。这些化学杀线虫剂的使用已进行了数十年。尽管化学杀线虫剂在控制目标线虫中具有有效性，但存在对这些方法的严重限制。一个限制是化学杀线虫剂不能作用于已穿透根的线虫。另一个限制是与化学杀线虫剂的生产和使用相关的危害。化学杀线虫剂是高度毒性的，并且可导致人中毒和死亡。因此，许多国家已限制和有时禁用某些杀虫剂。例如，甲基溴化物因其臭氧耗损效应而在大多数国家被禁用。

由于这些限制和禁止，缺乏切实可行的线虫解决方案。本公开内容提供了安全和有效的替代化学杀虫剂的使用或减少其使用的工具。本公开内容在提供抑制线虫至植物根内的穿透和阻止最终克服该最初屏障的那些线虫成熟的解决方案中也是独特的。

发明概述

本公开内容提供了用于控制植物寄生线虫的方法和组合物。本公开内容提供了用于控制线虫的方法，包括给植物、植物部分或植物的场所施用有效量的短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、短小芽胞杆菌的突变体、短小芽胞杆菌的孢子或短小芽胞杆菌的代谢物和特别地短小芽胞杆菌QST2808、短小芽胞杆菌QST2808的突变体、短小芽胞杆菌QST2808的孢子或短小芽胞杆菌QST2808的代谢物。在一些实施方案中，将短小芽胞杆菌(例如，短小芽胞杆菌QST2808)作为包括短小芽胞杆菌、其代谢物和任选地残留发酵液的发酵产物来施用。

在一些实施方案中，目标线虫是引起疾病的根结线虫。在某些情况下，线虫来自根结线虫属(Meloidogyne)的种类。本发明的组合物杀死根结线虫的卵、减少根结线虫植物穿透和/或抑制穿透植物的根结线虫的成熟。

在其它实施方案中，目标线虫是孢囊线虫。在某些情况下，线虫来自异皮线虫属(Heterodera)的种。在其它情况下，线虫来自胞囊线虫属(Globodera)的种。

在一些实施方案中，将上述组合物与至少一种其它杀虫剂例如杀真菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂或除草剂混合。在一个实施方案中，杀虫剂是杀线虫剂。在某些实施方案中，将基于短小芽胞杆菌QST2808的杀线虫剂与商购可得的配制的杀线虫剂混合于罐中。在其它实施方案中，将基于短小芽胞杆菌的组合物(例如，短小芽胞杆菌QST2808)与至少一种其它杀虫剂混合，随后配制，以便多种活性物形成一种产物。

本公开内容还提供了本公开内容的任何组合物，所述组合物还包含配制惰性物或其它配制成分例如多糖(淀粉、麦芽糊精、甲基纤维素、蛋白质例如乳清蛋白、肽、树脂)、糖(乳糖、海藻糖、蔗糖)、脂质(卵磷脂、植物油、矿物油)、盐(氯化钠、碳酸钙、柠檬酸钠)和硅酸盐(粘土、无定形硅、烟雾/沉淀硅酸盐、硅酸盐)。在一些实施方案，例如其中将组合物用于土壤的那些实施方案中，本公开内容的组合物包含载体，例如水或矿物质或有机材料例如促进组合物至土壤的掺入的泥炭(peat)。在一些实施方案，例如其中将组合物用于种子处理或用作根浸渍的那些实施方案中，载体是促进组合物至种子或根的粘附的粘合剂或粘着剂。在其中将组合物用作种子处理的另一个实施方案中，配制成分是着色剂。在其它组合物中，配制成分是防腐剂。

在一些实施方案中，在种植之前，将组合物施用于植物、植物部分或植物的场所例如土壤。在其它实施方案中，在种植时施用组合物。在其它实施方案中，在种植后施用组合物。

在某些实施方案中，在施用组合物之前，进行下列步骤，包括鉴定植物或用于生长的植物场所需要处理。在一些实施方案中，鉴定包括确定：用于植物生长的场所超过线虫侵染的经济阈值(economicthreshold)。

在一些实施方案中，本公开内容涉及包括短小芽胞杆菌及其用作杀线虫剂的使用说明书的试剂盒。优选地，所述短小芽胞杆菌为短小芽胞杆菌QST2808。在一些实施方案中，这些说明书是产品标签。在一些实施方案中，这些说明书是关于短小芽胞杆菌QST2808作为杀线虫剂与化学杀线虫剂组合使用的。在某些情况下，说明书指导用户以低于化学杀线虫剂的产品标签所推荐的比率(当用作独立的处理时)使用所述化学杀线虫剂。

发明详述

所有公开物、专利和专利申请，包括本文中的任何附图和附录通过引用并入，其引用程度就如同将每一个个别公开物或专利申请明确且个别地通过引用并入一样。

下列描述包括可用于理解本公开内容的信息。其不是对本文中提供的任何信息是现有技术或与目前要求保护的发明相关的承认，或不是对明确或隐含地参考的任何公开物是现有技术的承认。

短小芽胞杆菌QST2808、其突变体、上清液和它们用于控制植物病原体和昆虫的方法详尽地描述于美国专利号6,245,551和6,586,231中；所述专利的每一个对于其教导的每件事明确且完整地通过引用并入本文。在这些美国专利中，菌株称为NRRL No.B-30087，其与QST2808同义。短小芽胞杆菌QST2808于1999年1月14日在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯协议的条款下在登录号B-30087下保藏在NRRL中。本说明书中对QST2808的任何提及是指短小芽胞杆菌QST2808。

术语“突变体”是指来源于短小芽胞杆菌的遗传变体。在一个实施方案中，突变体具有短小芽胞杆菌的一个或多个或全部鉴定(功能)特征。在另一个实施方案中，突变体具有短小芽胞杆菌菌株QST2808的一个或多个或全部鉴定(功能)特征。在具体情况下，突变体或其发酵产物控制(作为鉴定功能特征)至少线虫以及亲代短小芽胞杆菌(例如，亲代短小芽胞杆菌QST2808菌株)。这样的突变体可以是具有与短小芽胞杆菌、特别是与短小芽胞杆菌菌株QST2808具有大于约85％，大于约90％，大于约95％，大于约98％或大于约99％的序列同一性的基因组序列的遗传变体。突变体可通过如下方式获得：利用化学药品或辐射处理短小芽胞杆菌细胞，特别地短小芽胞杆菌菌株QST2808细胞，或通过从一群这样的细胞(例如具有噬菌体抗性或抗生素抗性的突变体)选择自发突变体，或通过本领域技术人员公知的其它方法。在一些实施方案中，术语突变体不包括在swrA基因中具有功能突变的丢失的短小芽胞杆菌细胞。

本公开内容的组合物可通过按照本领域公知的方法(包括美国专利号6,245,551中描述的培养基和其它方法的使用)培养短小芽胞杆菌，具体地短小芽胞杆菌菌株QST2808来获得。常规大规模微生物培养法包括深层发酵、固态发酵或液体表面培养。朝向发酵的终点，当营养物被耗尽时，短小芽胞杆菌细胞开始从生长期转换成孢子形成期，以便发酵的终产物主要为孢子、代谢物和残留发酵介质。孢子形成为短小芽胞杆菌的自然寿命周期的部分，并且通常被响应于营养物限制的细胞引发。发酵被构造来获得高水平的短小芽胞杆菌的菌落形成单位(“cfu”)和促进孢子形成。可直接使用由发酵产生的培养基中的细菌细胞、孢子和代谢物或通过常规工业方法例如离心、切向流过滤、深度过滤和蒸发来浓缩。发酵液和发酵液浓缩物在本文中都称为“发酵产物”。本公开内容的组合物包括发酵产物。在一些实施方案中，通过透析过滤法洗涤浓缩发酵液以除去残留发酵液和代谢物。

使用常规干燥处理或方法(包括但不限于喷雾干燥、冷冻干燥、盘式干燥(tray drying)、流化床干燥、转鼓式干燥或蒸发)在添加或不添加载体的情况下干燥发酵液或发酵液浓缩物。

所得干燥产物还可例如通过研磨或造粒进一步加工，以获得特定粒度(例如，约1至约5,000、约1至约2,500、约1至约500、约1至约250、约1至约100、约1至约50、约1至约25、约1至约10μm的平均粒度，或期望的和本领域已知的任何其它粒度或其范围)或物理形式。还可在干燥后添加下文中描述的载体。

本公开内容的芽孢杆菌属(Bacillus)的新型变体和菌株的发酵液的无细胞制剂可通过本领域已知的任何方法例如发酵液的提取、离心和/或过滤来获得。本领域技术人员将理解所谓的无细胞制剂可以不是不含细胞，而是大体上无细胞或基本上无细胞，这取决于用于除去细胞的技术(例如，离心的速度)。可干燥所得无细胞制剂和/或利用帮助其对植物或植物生长介质的施用的组分来配制所述制剂。上述用于发酵液的浓缩法和干燥技术也适用于无细胞制剂。

短小芽胞杆菌包括短小芽胞杆菌菌株QST2808的代谢物可按照美国专利号6,245,551中所示的方法来获得。如本文中所用，术语“代谢物”可指半纯的和纯的或基本上纯的代谢物，或指未与短小芽胞杆菌分离的代谢物。

上述用于配制发酵液的浓缩法和干燥技术也适用于代谢物。

本公开内容的组合物可包括添加至包含细胞、无细胞制剂或代谢物的组合物以改善效力、稳定性和可用性和/或有利于加工、包装和终端用户应用的配制惰性物。这样的配制惰性物和成分可包括载体、稳定剂、营养物或物理性质改性剂，可单独地或组合地添加所述成分。

在一些实施方案中，载体可包括液体材料例如水、油和其它有机或无机溶剂以及固体材料例如矿物质、聚合物或生物来源的或通过化学合成产生的多聚体复合物。在一些实施方案中，载体是有利于组合物至植物部分例如种子或根的粘附的粘合剂或粘着剂。参见，例如，Taylor,A.G.,等人,“Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments”,Annu.Rev.Phytopathol.28:321-339(1990)，将所述文献针对其教导的每一件事明确且完整地通过引用并入本文。稳定剂可包括抗结块剂、抗氧化剂、干燥剂、保护剂或防腐剂。营养物可包括碳、氮和磷源例如糖、多糖、油、蛋白质、氨基酸、脂肪酸和磷酸盐。物理性质改性剂可包括填充剂、湿润剂、增稠剂、pH调节剂、流变学改性剂、分散剂、佐剂、表面活性剂、防冻剂或着色剂。在一些实施方案中，可在利用水或不利用水作为稀释剂的情况下直接使用包含细胞、无细胞制剂或通过发酵产生的代谢物的组合物而无需任何其它制剂制备。在一些实施方案中，在浓缩发酵液之后和在干燥过程中和/或干燥后添加配制惰性物。

本公开内容的组合物可包含载体，其为添加至发酵产物或无细胞制剂以改善回收、效力或物理性质和/或帮助包装和施用的惰性配制成分。可单独地或组合地添加这样的载体。

可将本公开内容的组合物与其它化学药品和非化学添加剂、佐剂和/或处理混合，其中这样的处理包括但不限于化学和非化学杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、肥料、营养物、矿物质、生长素、生长刺激物等。

可与本公开内容的基于短小芽胞杆菌的组合物混合的杀线虫剂可以是化学或生物杀线虫剂。如本文中所用，术语“化学杀线虫剂”不包括熏剂，术语“熏剂”包括在种植前被用于土壤并通过土壤(在土壤空气和/或土壤水中)扩散的广谱杀虫化学药品，并且可作为气体例如甲基溴化物、挥发性液体例如氯化苦或挥发性固体例如福美甲酯施用。

在一些实施方案中，化学或生物杀线虫剂是商购可得的配制产品，与本公开内容的组合物配制于罐中。在其它实施方案中，在配制之前将化学或生物杀线虫剂与基于短小芽胞杆菌的组合物(例如，来自短小芽胞杆菌QST2808)混合，以便组合物形成一种配制产品。

用于这样的混合物的化学杀线虫剂是氨甲酸酯类、氨基甲酸肟酯和有机磷杀线虫剂。氨甲酸酯杀线虫剂包括苯菌灵、虫螨威()、丁硫克百威和除线威。氨基甲酸肟酯包括棉铃威、涕灭威(或作为来自Syngenta的Complete Pak种子处理的部分)、涕灭砜威(),草氨酰(),硫双威(来自Bayer CropScience的种子应用系统的部分)和环线威。有机磷杀线虫剂包括丰索磷(),丙线磷()、二甲基氨基磷酸酯、苯线磷、丁硫环磷、磷胺、硫线磷、毒死蜱、除线磷(dichlofenthion)、乐果、噻唑磷、速杀硫磷、isamidofos、氯唑磷、甲拌磷、磷虫威、特丁磷、硫磷嗪、三唑磷、imicyafos和四甲磷。每一种化合物后的括号中的名称是上述化学药品的每一种的代表性商业制剂。用于这样的混合物的其它化学杀线虫剂包括螺虫乙酯()、杀线虫剂和氟虫腈。

生物杀线虫剂包括壳多糖和尿素混合物；堆肥提取物和茶剂(充气的和非充气的)；包含真菌疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)和/或来自其的代谢物(作为商购可得的)的组合物；包含拟青霉属(Paecilomyces)真菌包括淡紫拟青霉(P.lilacinus)的组合物(作为例如或商购可得的)；包含巴斯德氏芽菌属(Pasteuria)细菌包括P.usgae的组合物(作为例如商购可得的)；包含来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的细菌，包括坚硬芽胞杆菌(Bacillus firmus)(例如菌株CNMC I-1582，于1995年5月29日保藏在Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,InstitutePasteur,France中的，并且作为例如商购可得的)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的组合物；和包含杀线虫链霉菌属的种(Streptomycete sp.)例如利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)(作为商购可得的)的组合物。生物杀线虫剂还包括基于植物的杀线虫剂例如基于苦楝植物的产物(包括来自植物的种子或油)或印楝素、苦楝种子的次级代谢物、基于芝麻油的产品(例如)、香芹酚和基于植物提取物的产品(例如获自智利的皂树树)。生物杀线虫剂还包括由细菌产生的分离的化合物例如mectins，其由阿弗曼链霉菌(Streptomyces avermentilis)产生，包括阿巴克丁(由阿巴克丁B_1a和B_1b组合组成)和阿佛菌素B_2a以及最初在解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)中鉴定的harpin蛋白，包括harpin_EA和harpin_αβ。

本公开内容的组合物用于控制植物寄生线虫例如根结线虫、孢囊线虫、损伤和环形线虫，包括根结线虫属的种、异皮线虫属的种、胞囊线虫属(Globodera)的种、短体线虫属的种和小环线虫属的种(Criconemella sp.)。组合物还用于控制柑橘半穿刺线虫,轮胎虫属的种、长针线虫属的种、肾状线虫属的种、剑线虫属的种、刺线虫属的种(例如长尾刺线虫(B.longicaudatus))、轮线虫属的种、矮化线虫属的种、纽带线虫的某些种、盘旋属的种、螺旋属的种、香蕉穿孔线虫的种(例如柑橘穿孔线虫和香蕉穿孔线虫)、双垫刃线虫属的种和其它植物寄生线虫。在一些实施方案中，目标为孢囊线虫，例如大豆胞囊线虫(大豆孢囊线虫)、甜菜孢囊线虫(甜菜孢囊线虫)、禾谷孢囊线虫(谷孢囊线虫)、番茄根结线虫(棉花(或南方)根结线虫)、马铃薯金线虫和马铃薯白线虫(马铃薯孢囊线虫)。在其它实施方案中，目标是根结线虫例如南方根结线虫(棉花根结线虫)、爪哇根结线虫(爪哇人根结线虫)、北方根瘤线虫(北方根结线虫)和花生根结线虫(花生根结线虫)。

如本文中所用，术语“控制”意指线虫的杀死、线虫的数目和/或线虫的生长、进食或线虫的任何或所有生命期的正常生理发育(包括，对于根结线虫，穿透根和在根内发育的能力)的减少、线虫感染和/或侵染(例如，瘿瘤、穿透和/或根内的发育)的作用的减少、植物对线虫感染和/或侵染(例如，瘿瘤和/或穿透)的抗性、植物对线虫的感染和/或侵染的耐受性、植物对线虫感染和/或侵染(例如，瘿瘤和/或穿透)的作用的耐受性或其任意组合。植物对寄生线虫的抗性和耐受性对于本领域普通技术人员来说是已知的，如由Trudgill,D.L.“Resistance to andTolerance of Plant Parasitic Nematodes in Plants.”Annual Review ofPhytopathology.1991；29:167-192(将其就其教导的每一件事明确且完整地通过引用并入本文)证明的。有效量是能够显著地减少害虫生长、进食、根穿透、根中成熟和/或一般正常生理发育和因线虫感染而引起的症状的量。在一些实施方案中，症状和/或线虫相对于未处理的对照减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。

本公开内容的组合物用于治疗多种农业和/或园艺作物，包括为了种子、生产和景观美化而生长的那些作物。可使用本公开内容的组合物处理的代表性植物包括但不限于下列植物：球茎蔬菜；谷粒；柑橘类水果(例如葡萄柚、柠檬和桔子)；棉花和其它纤维作物；葫芦科植物；果菜类；叶用蔬菜(例如芹菜、结球莴苣和散叶莴苣和菠菜)；豆类；油料种子作物；花生；仁果(例如苹果和梨)；核果(例如杏仁、美洲山核桃和胡桃)；根菜类；块茎菜类；球茎菜类；烟草、草莓和其它浆果；油菜作物(例如绿花椰菜和包菜)；葡萄；菠萝；显花植物；花坛植物；和观赏植物(例如蕨类植物和玉簪属)。本公开内容的组合物还可用于处理多年生植物，包括种植作物例如香蕉和咖啡，以及存在于森林、公园或园林设计中的那些植物。

本文中公开的组合物用于植物、植物部分例如种子、根、根茎、球根、球茎或块茎，和/或在其上生长植物或植物部分的场所，例如土壤，以控制植物寄生线虫。可以以叶喷雾、种子/根/块茎/根茎/球茎/球根处理，和/或作为土壤处理的形式来施用本公开内容的组合物。可在种植之前、种植期间或种植之后处理种子/根/块茎/根茎/球茎/球根、叶和/或土壤。

还将本文中描述的组合物用于植物、植物部分例如种子、根茎、球根、球茎或块茎和/或在其上生长植物或植物部分的场所例如土壤以增加作物产率。在一些实施方案中，作物产率增加至少约5％，在其它实施方案中至少约10％，在其它实施方案中至少约15％，在其它实施方案中至少约20％。在一些实施方案中，根重增加至少约5％，在其它实施方案中至少约10％，在其它实施方案中至少约15％，在其它实施方案中至少约20％。

当用作种子处理时，取决于种子的尺寸，以约1x10²至约1x10⁹cfu/种子的比率应用本公开内容的组合物。在一些实施方案中，施用比率为1x10⁴至约1x10⁷cfu/种子。在一些实施方案中，施用比率为约1x10²至约1x10⁸、约1x10²至约1x10⁷、约1x10²至约1x10⁶、约1x10²至约1x10⁵、约1x10²至约1x10⁴、约1x10²至约1x10³、约1x10³至约1x10⁵或优选约1x10⁴cfu/种子。当将所述组合物与至少一种另外的活性成分(“ai”)组合或一起使用时，所述至少一种另外的活性成分可以以约0.001至约1000克、约0.01至约500克、约0.1至约300克、约1至约100克、约1至约50克、约1至约25克，优选约1至约10克/100kg种子，和/或约1x10²至约1x10⁸、约1x10²至约1x10⁷、约1x10²至约1x10⁶、约1x10²至约1x10⁵、约1x10²至约1x10⁴、约1x10²至约1x10³、约1x10³至约1x10⁵或优选约1x10⁴cfu/种子的量存在。

本发明的组合物还可以以根浸渍的形式以约1x10³至约1x10⁸cfu/植物根系的比率施用。当将所述组合物与至少一种另外的活性成分组合或一起使用时，所述至少一种另外的活性成分可以以约0.001至约1000mg、约0.01至约500、约0.1至约400、约1至约300、约10至约250，优选约25至约200mg ai/L和/或约1x10³至约1x10⁸cfu/植物根系的量存在。

当用作土壤处理时，可将本公开内容的组合物以土壤表面浸透、插柄(shanked-in)、沟内注射和/或施用或通过与灌溉水的混合物的形式进行施用。可在种植时、播种过程中或播种后或在移植后和在植物生长的任何时期施用的土壤表面浸透处理的施用率为约4x10⁷至约8x10¹⁴、约4x10⁹至约8x10¹³、约4x10¹¹至约8x10¹²、约2x10¹²至约6x10¹³、约2x10¹²至约3x10¹³或约4x10¹³至约2x10¹⁴cfu/英亩。在一些实施方案中，施用率为约1x10¹²至约6x10¹²或约1x10¹³至约6x10¹³cfu/英亩。种植时施用的沟内处理的施用率为约2.5x10¹⁰至约5x10¹¹cfu/1000排英尺(row feet)。在一些实施方案中，施用率为约6x10¹⁰至约3x10¹²、约6x10¹⁰至约4x10¹¹、约6x10¹¹至约3x10¹²或约6x10¹¹至约4x10¹²cfu/1000排英尺。当向土壤中插柄或注射时施用率为约4x10⁷至约8x10¹⁴、约4x10¹³至约2x10¹⁴、约4x10⁸至约8x10¹³、约4x10⁹至约8x10¹²、约2x10¹⁰至约6x10¹¹、约4x10⁷至约8x10¹³、约4x10⁷至约8x10¹²、约4x10⁷至约8x10¹¹、约4x10⁷至约8x10¹⁰、约4x10⁷至约8x10⁹或约4x10⁷至约8x10⁸cfu/英亩。本领域技术人员将理解如何调整撒播处理(其中以更低的比率但更频繁地进行施用)和其它不太常用的土壤处理的比率。当将所述组合物与至少一种另外的活性成分组合或一起使用时，所述至少一种另外的活性成分可以以约10至约1,000、约10至约750、约10至约500、约25至约500、约25至约250，优选约50至约200g ai/ha和/或约4x10⁷至约8x10¹⁴、约4x10¹³至约2x10¹⁴、约4x10⁸至约8x10¹³、约4x10⁹至约8x10¹²、约2x10¹⁰至约6x10¹¹、约4x10⁷至约8x10¹³、约4x10⁷至约8x10¹²、约4x10⁷至约8x10¹¹、约4x10⁷至约8x10¹⁰、约4x10⁷至约8x10⁹或约4x10⁷至约8x10⁸cfu/英亩的量存在。

可在种植之前或在种子萌发之前将本公开内容的组合物引入土壤。还可将本公开内容的组合物引入植物的场所，与植物根接触的土壤，植物基部的土壤，或植物基部周围的土壤(例如，在植物基部周围或下面约5cm、约10cm、约15cm、约20cm、约25cm、约30cm、约35cm、约40cm、约45cm、约50cm、约55cm、约60cm、约65cm、约70cm、约75cm、约80cm、约85cm、约90cm、约95cm、约100cm或更多的距离内)。组合物可通过利用多种技术(包括但不限于滴灌、喷洒、土壤注射或土壤表面浸透)来施用。还可将组合物施用于土壤或穴盘(plug tray)中的植物或在移植至不同植物场所之前施用至幼苗。当施用至与植物根接触的土壤、植物的基部或植物基部周围指定的距离内的土壤(包括以土壤浸透处理的形式)时，可以以单次施用或多次施用的形式施用组合物。组合物(包括具有至少一种另外的活性成分的那些组合物)可以以上述对于浸透处理所示的比率或以约1x10⁵至约1x10⁸cfu/克的土壤、1x10⁵至约1x10⁷cfu/克的土壤、1x10⁵至约1x10⁶cfu/克的土壤、7x10⁵至约1x10⁷cfu/克的土壤、1x10⁶至约5x10⁶cfu/克的土壤或1x10⁵至约3x10⁶cfu/克的土壤和/或约4x10⁷至约8x10¹⁴、约4x10⁸至约8x10¹³、约4x10⁹至约8x10¹²、约2x10¹⁰至约6x10¹¹、约4x10⁷至约8x10¹³、约4x10⁷至约8x10¹²、约4x10⁷至约8x10¹¹、约4x10⁷至约8x10¹⁰、约4x10⁷至约8x10⁹或约4x10⁷至约8x10⁸cfu/英亩的比率来施用。在一个实施方案中，将本公开内容的组合物作为单次施用以约7x10⁵至约1x10⁷cfu/克的土壤的比率施用。在另一个实施方案中，将本公开内容的组合物以单次施用的形式以约1x10⁶至约5x10⁶cfu/克的土壤的比率施用。在其它实施方案中，将本公开内容的组合物以多次施用的形式以约1x10⁵至约3x10⁶cfu/克的土壤的比率施用。

优选地，本公开内容的基于短小芽胞杆菌的组合物为基于完整制剂约1％w/w至约99％w/w。更优选，基于短小芽胞杆菌的组合物以约1％w/w至约80％w/w、约1％w/w至约60％w/w、约1％w/w至约50％w/w、约1％w/w至约40％w/w、约1％w/w至约30％w/w、约1％w/w至约20％w/w、约1％w/w至约10％w/w，最优选约5％w/w至约50％w/w的量存在。

可将本公开内容的基于短小芽胞杆菌的组合物单独地施用或与一种或多种其它杀线虫剂例如化学和生物杀线虫剂组合地施用。在一些实施方案中，用至少一种其它杀线虫剂共配制短小芽胞杆菌QST2808，将共配制的产物用于植物或植物场所。在一些实施方案中，将基于短小芽胞杆菌的组合物与商购可得的化学或生物杀线虫剂的制剂混合于罐中，给植物或植物场所施用。在其它实施方案中，在即将施用化学或生物杀线虫剂的商购可得的制剂之前或施用后立即将本公开内容的基于短小芽胞杆菌的组合物施用于植物和/或植物场所。在其它实施方案中，将本公开内容的基于短小芽胞杆菌的组合物与化学或生物杀线虫剂的商购可得的制剂轮流给植物和/或植物场所施用。在一个情况下，如下文中更详细地论述的，以种子处理或沟内或浸透处理的方式施用基于短小芽胞杆菌的组合物。在上述实施方案的一些情况下，以比产品标签上推荐的这样的杀线虫剂作为独立处理使用时的比率小例如约1％、约2％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约35％、约45％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约90％或约95％的比率施用。

在其它实施方案中，在施用熏剂后，将本公开内容的基于芽孢杆菌属的组合物用于植物和/或植物场所。熏剂可通过在土壤表面下最少8英寸处插柄注射释来施用。还可通过表面滴注化学灌溉施用熏剂的液体制剂以将熏剂移至土壤表面下8英寸或更低的深度。用塑料防水布覆盖处理的土壤以将熏剂保留在土壤中数日。这在种植之前进行，随后让土壤排气，然后进行种植。可在种植之前、种植时或种植之后，在这样的排气之后施用本文中描述的基于芽孢杆菌属的组合物。在一些情况下，以小于产品标签上推荐的比率的比率施用熏剂。

化学和生物杀线虫剂在上文中进行了描述。下列熏剂的每一种的示例性商业制剂提供于化学名称后的括号中。熏剂杀线虫剂包括卤代烃例如氯化苦()；甲基溴化物()及其组合(例如和)；1,3-二氯丙烯(II、EC、)和1,3-二氯丙烯与氯化苦的组合(C-17、C-35和)；1,2-二氯丙烯；碘代甲烷()；异氰酸甲酯释放剂例如甲基二硫代氨基甲酸钠()和福美甲酯；1,3二氯丙烯与异硫氰酸甲酯的组合()；和二硫化碳释放剂例如甲硫代碳酸钠()；和二甲基二硫化物或DMDS()。

还可将本公开内容的组合物作为病虫害综合治理(“IPM”)项目的一部分施用。这样的项目描述于不同的出版物中，特别地通过大学合作推广。这样的项目包括与不能让目标线虫寄生的作物的作物轮作、培养和耕作措施以及移植的使用。例如，基于芽孢杆菌属的组合物可在与芥子植物或其它线虫抑制性作物的一季生长后施用。

在一些实施方案中，在鉴定需要处理的场所之后给植物、植物部分或植物场所施用本公开内容的组合物。这样的鉴定可通过植物(所述植物表现出通常与线虫问题的历史的知识偶联的萎黄、矮化、坏死或枯萎(即，表现出具有营养缺乏))的目测鉴定；植物取样和/或土壤取样来进行。植物取样可在生长季节过程中或在最终收获后立即进行。从土壤除去植物，检查它们的根以测定田中线虫问题的性质和程度。对于根结线虫，根瘿严重度通过测量长根瘿的根系的比例来测定。由根结线虫引起的根瘿可与固氮土壤菌的根瘤区别，因为根瘿不容易与根分离。根结线虫土壤群体水平随着根瘿严重度增加而增加。在一些情况下，任意水平的根瘿的检测表明种植任何易感作物的根结线虫问题，尤其在取样区域中或其附近。孢囊线虫还可通过植物取样和对根的孢囊的细察来鉴定。

土壤取样提供了测定浸染特定体积的土壤或根的线虫和/或线虫卵的数目的方法。当首先怀疑问题时，可在最终收获时或种植新的作物之前的任意时间(包括在对先前的作物进行作物破坏之前)进行土壤取样。大学合作推广项目提供了土壤取样服务，包括佛罗里达大学、俄勒冈州立大学和内布拉斯加林肯大学。此外，这样的项目提供了如何收集样品的指导方针。例如，在收获后预测取样的一个方法中，以规则的之字形图形在来自范围5或10英亩(取决于作物的值，作物的值越高取样的英亩数越少)的10至20块田间位置的6至10英寸的土壤深度收集样品。在测试已建立的植物的方法中，在来自显示症状但未死亡或濒死(即分解)的怀疑植物的6至10英寸的土壤深度取出根和土壤样品。

在一些实施方案中，鉴定包括确定线虫侵染的经济阈值是否已达到，即在无处理的情况下预期的经济损失超过处理成本时所处的点。经济阈值取决于作物、地理、气候、种植时间、土壤类型和/或土壤温度而变化。关于该课题已发表了许多论文，并且指导方针可从不同地区的大学合作推广项目获得。参见，例如，Robb,J.G.,等人,“FactorsAffecting the Economic Threshold for Heterodera schachtii Control inSugar Beet,”Economics of Nematode Control,January-June1992；Hafez,Saad L.,“Management of Sugar Beet Nematode,”University ofIdaho Current Information Series(CIS),1071(1998)；和“UC IPMPest Management Guidelines:Tomato”,UC ANR Publication3470Nematodes A.Ploeg,Nematology,UC Riverside(January2008)，将所述文献的每一篇就其教导的每一件事明确且完整地通过引用并入本文。测定特定作物在一年中的特定时间的经济阈值完全在本领域普通技术人员的能力范围内。

在一些实施方案中，土壤取样显示线虫侵染将引起为未被侵染的土壤的标准的约80％、约90％或约95％的产率。

在一些实施方案中，以根结幼虫/千克(kg)的土壤样品表示的经济阈值为约250、至少约300、至少约500、至少约750、至少约1000、至少约2000、至少约3000、至少约4000、至少约5000或至少约6000。

在一些实施方案中，以孢囊线虫卵和幼虫/1cm³的土壤表示的经济阈值为至少约0.5、至少约1、至少约2、至少约3、至少约4。根据Hafez(1998)(同上)，孢囊可据估计为500个有活力的卵和幼虫。

下列实施例被提供来仅用于举例说明本公开内容而不是为了限定本公开内容。

实施例

实施例1

利用黄瓜种子苏丹变种进行研究来测定QST2808抗爪哇根结线虫的活性。为了进行该研究，使用装有20g沙和利用QST2808全发酵液预处理的一粒未萌发种子的50ml离心管。

用QST2808接种装有75ml的8g基于TSB的Schaeffer’s培养基(TSB8g/L；10％KCl(w/v),10ml/L；1.2％MgSO₄7H₂O(w/v),10ml/L；1M Ca(NO₃)₂,1.0ml/L；0.010M MnCl₂,1.0ml/L；1mM FeSO₄,1.0ml/L)的250ml培养瓶。将接种的培养瓶在～200rpm的摇动下于30℃温育2天。测量光密度，利用期望数目的菌落形成单位(参见表2)涂覆种子，并进行干燥。

使处理的种子萌发并在温室中生长。处理后(“DAT”)4至5天，用100只二期根结线虫幼虫接种每一管。在第10DAT，按照0-4的等级对幼苗的百分比根瘿进行评分(这描述于表1中)。

随后利用酸性品红对根进行染色以观察线虫穿透和发育(参见表2)，在Leica解剖显微镜下进行观察。对于线虫穿透，计数每一条根内的总的线虫幼虫。对于线虫发育，计数总的肥胖幼虫，包括二期晚期幼虫(J2’s)和三期幼虫(J3’s)。如表1中所述对线虫至根内的穿透和穿透后线虫发育进行评分。关于所使用的技术的详细内容，参见C.O.Omwega,等人,“A Nondestructive Technique for Screening BeanGerm Plasm for Resistance to Meloidogyne incognita,”Plant Disease(1988)72(11):970-972，将所述文献就其教导的每一件事明确且完整地通过引用并入本文。

表1.细菌全发酵液的线虫拮抗活性的评级方案。根瘿指数(gallingindex)基于根瘿的百分比。

表2.利用短小芽胞杆菌QST2808的种子预处理的结果

QST2808的CFU	根瘿指数	穿透	发育
				1x10³	0.75	28.50	9.00
1x10⁴	0.75	24.00	4.50
				1x10⁵	1.25	26.25	8.00
1x10⁶	1.00	27.50	6.75
				1x10⁷	1.50	30.00	13.25
未处理的对照	2.75	36.25	23.50

CFU比率1x10³至1x10⁶之间的发育程度(肥胖线虫的总数)无显著不同，但与未处理对照和1x10⁷CFU显著不同。穿透数据显示相似的(尽管不太强)的趋势。根瘿指数随CFU的增加而增加可归因于不断增加的根的质量。

实施例2

利用黄瓜种子苏丹变种进行研究来测定QST2808抗爪哇根结线虫的活性。为了进行该研究，将用QST2808孢子以10⁴CFU的比率预处理的未萌发种子种植在32oz.杯中的沙子中。

为了获得孢子，用QST2808接种装有75ml的8g基于TSB的Schaeffer’s培养基(TSB8g/L；10％KCl(w/v),10ml/L；1.2％MgSO₄7H₂O(w/v),10ml/L；1M Ca(NO₃)₂,1.0ml/L；0.010M MnCl₂,1.0ml/L；1mM FeSO₄,1.0ml/L)的250ml培养瓶。将接种的培养瓶在～200rpm的摇动下于30℃温育2天。测量光密度，利用期望数目的菌落形成单位涂覆种子，并进行干燥。

将处理的种子种植在32oz.盆中，让其萌发和在温室中生长。种植后约30天，用约2000个二期根结线虫幼虫接种每一株植物的土壤。接种后约4周收获根，称重，评价其疾病严重度，根据根瘿进行评级。按照0-3的等级对疾病严重度进行评级，其中0＝无症状，3＝根腐朽和变色的严重症状。使用Bridge,J.和Page,S.J.L.,Tropical PestManagement26(3)1980pp.296-298中描述的方法对根瘿进行评级。QST2808处理的种子的根看起来比未处理的对照和利用其它细菌候选者处理的根更大和更健康。定量结果—其表明短小芽孢杆菌可促进对线虫的耐受性—示于下面表3中。

表3

Claims

1.一种方法，其用于控制植物、植物部分和/或植物生长的场所中或其上的线虫，包括给需要防护所述线虫的植物、植物部分或植物生长的场所施用有效量的短小芽胞杆菌QST2808、短小芽胞杆菌QST2808的突变体或短小芽胞杆菌QST2808的至少一种代谢物。

2.权利要求1的方法，其中在所述施用之前进行鉴定需要防护所述线虫的植物、植物部分或植物生长的场所的步骤。

3.权利要求2的方法，其中所述鉴定包括确定：植物生长的场所超过线虫侵染的经济阈值。

4.权利要求1的方法，其中所述场所为土壤。

5.权利要求4的方法，其中在种植前施用所述短小芽胞杆菌QST2808。

6.权利要求4的方法，其中在种植时施用所述短小芽胞杆菌QST2808。

7.权利要求4的方法，其中在种植后施用所述短小芽胞杆菌QST2808。

8.权利要求1的方法，其中以约4x10⁷至约8x10¹⁴cfu/英亩的比率施用所述短小芽胞杆菌QST2808。

9.权利要求1的方法，其中将所述短小芽胞杆菌QST2808施用至种子。

10.权利要求1的方法，其中所述短小芽胞杆菌QST2808为发酵产物。

11.权利要求1的方法，其中所述发酵产物包含短小芽胞杆菌QST2808、代谢物和残留发酵液。

12.权利要求1的方法，还包括施用第二杀线虫剂。

13.权利要求12的方法，其中所述第二杀线虫剂是选自氨基甲酸酯、有机磷酸盐及其组合的化学杀线虫剂。

14.权利要求12的方法，其中将所述第二杀线虫剂与所述短小芽胞杆菌QST2808组合施用。

15.权利要求12的方法，其中将所述第二杀线虫剂与所述短小芽胞杆菌QST2808轮流施用。

16.权利要求14的方法，其中所述第二杀线虫剂是配制的商购可得产品。

17.权利要求16的方法，其中以这样的比率施用所述第二杀线虫剂：所述比率低于当所述第二杀线虫剂用作独立处理时所述第二杀线虫剂的产品标签上推荐的比率。

18.权利要求1-17的任一项的方法，其中所述线虫是引发根结病的线虫。

19.权利要求18的方法，其中所述线虫来自根结线虫属的种。

20.一种组合物，其包含短小芽胞杆菌QST2808和第二杀线虫剂。

21.权利要求20的组合物，其中所述第二杀线虫剂选自氨基甲酸酯和有机磷酸盐。

22.一种试剂盒，其包含短小芽胞杆菌QST2808及其用作杀线虫剂的说明书。

23.权利要求22的试剂盒，其中所述说明书指导用户以约4x10⁷至约8x10¹⁴cfu/英亩的比率使用短小芽胞杆菌QST2808。

24.权利要求22的试剂盒，其中所述说明书指导用户将所述短小芽胞杆菌QST2808与化学杀线虫剂组合使用，并进一步指导用户以低于所述化学杀线虫剂的产品标签上推荐的比率使用所述化学杀线虫剂。

25.一种方法，其用于控制植物、植物部分和/或植物生长的场所中或其上的线虫，包括给需要防护所述线虫的植物、植物部分或植物生长的场所施用有效量的短小芽胞杆菌、短小芽胞杆菌的突变体或短小芽胞杆菌的至少一种代谢物。