TW201334695A - 對線蟲之生物防除法 - Google Patents

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    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
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Abstract

本發明提供使用芽孢桿菌(Bacillus)菌株作為線蟲防除劑的方法及相關組成物。

Description

對線蟲之生物防除法
本發明係有關對線蟲之生物防除法。
植物寄生性線蟲對許多種作物造成重大損害，估計每年造成5%至12%之全球作物產量損失。線蟲造成根部損傷是很常見的且會導致具有較小之根系的植物發育不良，其葉片顯示出缺乏礦物質的症狀且很容易枯萎。線蟲造成之損害亦使植物易於被許多種植物致病性真菌及細菌感染。
為了打擊和防除線蟲，農民通常使用化學殺線蟲劑。這些包括氣體及液體熏蒸(諸如甲基溴及氯化苦(chloropicrin))以施放有機磷酸鹽及胺基甲酸酯類，諸如硫磷嗪(thionazin)及歐殺滅(oxamyl)。這些化學殺線蟲劑已經持續使用了幾十年。雖然化學殺線蟲劑可有效防除標的線蟲，但這些方法有嚴格限制。一種限制為該化學殺線蟲劑不能用來對抗已經滲透入根部之線蟲。另一限制為與製造及使用化學殺線蟲劑相關之危險。化學殺線蟲劑具有很強的毒性並可導致人體中毒及死亡。因此，國家對此有所限制且有時禁用某些殺蟲劑。例如，由於甲基溴具有消耗臭氧的作用其在大多數國家中被禁用。
由於這些限制和禁令，目前缺乏可行之線蟲解決方案。本揭露內容提供用於取代或減少使用化學殺蟲劑之安 全且有效的方法。本揭露內容在提供既能抑制線蟲滲透入植物根部，並能同時防止那些線蟲成熟以克服此初始障礙的解決方法上亦是獨一無二的。
本揭露內容提供用於防除植物寄生性線蟲的方法及組成物。本揭露內容提供用於防除線蟲之方法，其包含對植物、植物部分和/或植物位置施放有效量之短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，短小芽孢桿菌的突變體，短小芽孢桿菌的孢子或短小芽孢桿菌的代謝物，尤其是短小芽孢桿菌QST2808、短小芽孢桿菌QST2808之突變體、短小芽孢桿菌QST2808之孢子或短小芽孢桿菌QST2808之代謝物。於一些實施例中，該短小芽孢桿菌(例如短小芽孢桿菌QST2808)係以包括短小芽孢桿菌、其代謝物以及可選擇地，殘留之醱酵基質的醱酵產物形式施放。
於一些實施例中，該標的線蟲為引起疾病之根結線蟲。於某些情況中，該線蟲係來自根結線蟲(Meloidogyne)品種。本發明之組成物殺死根結線蟲之蟲卵、降低根結線蟲之植物滲透和/或抑制滲透入植物之根結線蟲成熟。
於其它實施例中，該標的線蟲為囊線蟲(cyst nematode)。於某些情況中，該標的線蟲係來自囊線蟲(Heterodera)品種。於其它情況中，該標的線蟲係來自黃金線蟲(Globodera)品種。
於一些實施例中係將上述組成物與至少一種其他殺蟲 劑(諸如殺真菌劑、殺昆蟲劑、殺線蟲劑)或除草劑混合。於一實施例中，該殺蟲劑為殺線蟲劑。於某些實施例中係將本發明之以短小芽孢桿菌QST2808為基礎之殺線蟲劑與市售之經配製的殺線蟲劑在桶中混合。於其它實施例中係將以短小芽孢桿菌為基礎(例如短小芽孢桿菌QST2808)之組成物與至少一種其他殺蟲劑混合，然後再配製，從而使多種活性物質形成一種產品。
本揭露內容進一步提供另外包含配製惰性劑或其它配製成分的任何本揭露內容之組成物，該其它配製成分為，諸如多醣(澱粉、麥芽糊精、甲基纖維素)、蛋白質(諸如乳清蛋白質、肽類、膠)、糖類(乳糖、海藻糖、蔗糖)、脂質類(卵磷脂、植物油、礦物油)、鹽類(氯化鈉、碳酸鈣、檸檬酸鈉)及矽酸鹽(黏土、無定形二氧化矽、煙化/沉澱之二氧化矽、矽酸鹽)。於一些實施例(諸如那些其中係將組成物施放至土壤中者)中，本揭露內容之組成物包含可促進該組成物併入土壤中之載體，諸如水或礦物質或有機物質(諸如泥炭)。於一些實施例(諸如那些其中該組成物係用於處理種子或作為根浸液者)中，該載體為促進組成物黏附在種子或根部之結合劑或黏貼劑。於其中該組成物係作為種子處理劑之另一實施例中，該配製成分為著色劑。於其他組成物中，該配製成分為防腐劑。
於一些實施例中，該組成物係在種植前被施放至植物、植物部分或植物之位置(諸如土壤)。於其它實施例中，該組成物係在種植時施放。再於其他實施例中，該組 成物係在種植後施放。
於某些實施例中，在施放該組成物前先進行包含鑑別需要處理之植物和/或植物生長位置的步驟。於一些實施例中，鑑別工作包括測定該植物生長的位置是否超過線蟲侵染之經濟閾值。
於一些實施例中，本揭露內容包含套組，該套組包括短小芽孢桿菌及使用其作為殺線蟲劑之指示說明。較佳地，該短小芽孢桿菌為短小芽孢桿菌QST2808。於一些實施例中，這些指示說明為產品標籤。於一些實施例中，這些指示說明係用於將作為殺線蟲劑之短小芽孢桿菌QST2808與化學殺線蟲劑組合使用。於某些情況中，該指示說明指導使用者當使用化學殺線蟲劑作為單獨之處理劑時以低於該化學殺線蟲劑之產品標籤上所推薦者之比率使用該化學殺線蟲劑。
發明之詳細說明
此處所提及之所有出版物、專利及專利申請案，包括任何圖形及附錄均以引用方式併入本文中，其程度如同各個別出版物或專利申請案被具體且個別地指明以引用方式併入本文中。
下列描述中包含可能有用於理解本揭露內容之信息。該描述並非承認此處提供之任何信息為先前技藝或與本發明目前所主張之專利有關，或者任何明確或含蓄地引用之出版物為先前技藝。
短小芽孢桿菌QST2808、其突變株、上清液以及使用彼等來防除植物病原體和昆蟲的方法被充分地描述於美國專利案第6,245,551和6,586,231號中；各篇中所教示之每一項各被具體且全部以引用方式併入本文中。在這些美國專利案中，該菌株被稱為NRRL B-30087號，其與QST2808同義。在為專利申請程序之微生物備案取得國際承認的布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)的規定下，短小芽孢桿菌QST2808已在1999年1月14日被存放在NRRL中，保存編號為B-30087。本專利說明書中關於QST2808之任何引用係指短小芽孢桿菌QST2808。
術語“突變株”一詞係指自短小芽孢桿菌衍生之遺傳變種。於一實施例中，該突變株具有短小芽孢桿菌之一或多種或全部識別(功能)特性。於另一實施例中，該突變株具有短小芽孢桿菌株QST2808之一或多種或全部識別(功能)特性。於一特定之情況中，該突變株或其醱酵產物至少可如短小芽孢桿菌母株(例如短小芽孢桿菌QST2808母菌株)般防除(此為一種識別之功能性特性)線蟲。這類突變株可能為其基因組序列與短小芽孢桿菌(尤其是短小芽孢桿菌株QST2808)具有大於約85%、大於約90%、大於約95%、大於約98%或大於約99%之序列同一性的遺傳變異體。突變株可經由以下方式取得：以化學劑或放射線處理短小芽孢桿菌細胞(尤其是短小芽孢桿菌株QST2808細胞) 或從這類細胞群中選擇自發性突變株(諸如具噬菌體抗性或抗生素抗性之突變株)，或藉由本技藝之人士所熟知之其他方式取得。於一些實施例中，術語突變株排除那些其swrA基因中存有功能損失之突變的短小芽孢桿菌細胞。
本揭露內容之組成物可根據本技藝中所熟知之方法(包括使用美國專利案第6,245,551號中所描述的基質及其他方法)經由培養短小芽孢桿菌，尤其是短小芽孢桿菌株QST2808取得。傳統之大規模微生物培養方法包括液體深層醱酵、固態醱酵或液體表面培養。趨向醱酵結束時，當營養素被耗盡，短小芽孢桿菌細胞開始從生長階段轉移到孢子形成階段，從而使醱酵的最終產物大部分為孢子、代謝物及殘餘的醱酵基質。孢子形成為短小芽孢桿菌之自然生命週期的一部分，一般係由細胞回應養分限制來起動。醱酵係經過設置以取得大量之短小芽孢桿菌菌落形成單位(“cfu”)，促進孢子形成。從醱酵產生之培養基質中的細菌細胞、孢子和代謝產物可以直接使用或藉由習知之工業方法(諸如離心、切向流過濾、深部過濾及蒸發)濃縮。本文中醱酵基質及基質濃縮物二者均稱為“醱酵產物”。本揭露內容之組成物包括醱酵產物。於一些實施例中，該濃縮之醱酵基質係經由例如滲濾過程清洗，以移除殘留之醱酵基質及代謝物。
醱酵基質或基質濃縮物可在添加或不添加載體下使用習知之乾燥過程或方法(包括，但不限於噴霧乾燥、冷凍乾燥、盤式乾燥、流化床乾燥、滾筒乾燥或蒸發)乾燥。
所產生之乾燥產物可進一步加工(例如，諸如藉由研磨或造粒)以取得特定之顆粒大小(例如，平均粒徑為約1至約5,000、約1至約2,500、約1至約500、約1至約250、約1至約100、約1至約50、約1至約25、約1至約10微米，或任何其所需及本領域中已知之其他顆粒大小或範圍)或物理模式。下文中描述之載體亦可在乾燥後添加。
本揭露內容之新穎變種及芽孢桿菌株的不含細胞之醱酵基質製品可藉由本技藝已知之任何方式取得，諸如萃取、離心和/或過濾醱酵基質。那些熟習本技藝之人士將可察知所謂的不含細胞之製品可能不會毫無細胞，而是根據用來去除細胞之技術(例如，離心之速度)大致上不含細胞或基本上不含細胞。所產生之不含細胞的製品可經乾燥和/或與協助其施放在植物或植物生長基質中的組分一起配製。上文中描述之用於醱酵基質的濃縮方法和乾燥技術亦適用於不含細胞之製品。
短小芽孢桿菌(包括短小芽孢桿菌QST2808)之代謝物可根據美國專利案第6,245,551號中所提出之方法取得。本文所使用之術語“代謝物”可能指半純化和純化或大致上純化的代謝物，或尚未從短小芽孢桿菌分離出的代謝物。
上文中描述之用於配製醱酵基質的濃縮方法和乾燥技術亦適用於代謝物。
本揭露內容之組成物可包括用於添加在包含細胞、 不含細胞之製品或代謝物的組成物中以提高效力、穩定性及可用性和/或用於協助加工、包裝及最終用途之配製惰性劑。這類配製惰性劑及成分可包括載體、穩定劑、營養素或物理性能改質劑，其可個別或組合添加。於一些實施例中，該載體可能包括液體物質，諸如水、油和其他有機或無機溶劑，以及固體物質，諸如礦物質、聚合物或經生物衍生或藉由化學合成之聚合物複合物。於一些實施例中，該載體為促進該組成物黏附至植物之一部分(諸如種子或根)的結合劑或黏接劑。見，例如Taylor,A.G.,et al.,“Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments”,Annu.Rev.Phytopathol.28：321-339(1990)(其教示之全部內容以引用方式被具體且完全併入本文)。穩定劑可包括抗結塊劑、抗氧化劑、乾燥劑、防護劑或防腐劑。該營養素可包括碳、氮及磷的來源，諸如糖、多醣、油、蛋白質、胺基酸、脂肪酸及磷酸鹽。物理性能改質劑可包括膨脹劑、潤濕劑、增稠劑、pH調節劑、流變改質劑、分散劑、佐劑、表面活性劑、抗凍劑或著色劑。於一些實施例中，該包含細胞、不含細胞之製品或藉由醱酵產生之代謝物的組成物可不使用任何其他配製劑，在有或沒有作為稀釋劑之水的存在下直接使用。於一些實施例中，該配製惰性劑係在濃縮醱酵基質後，及乾燥期間和/或乾燥後加入。
本揭露內容之組成物可能包含為惰性配製成分之用於添加在配製之產品中或不含細胞之製品中的載體，以改善 回收率、效力或物理性質和/或用於協助包裝及投服。這類載體可個別或組合添加。
本揭露內容之組成物可與其它化學和非化學添加劑、佐劑和/或處理劑混合，其中這類處理劑包括，但不限於化學和非化學殺真菌劑、殺昆蟲劑、殺蟎劑、殺線蟲劑、肥料、營養素、礦物質、植物生長素、生長刺激劑，等。
可能與本揭露內容之以短小芽孢桿菌為基礎的組成物混合之殺線蟲劑可能為化學或生物殺線蟲劑。本文所使用之術語“化學殺線蟲劑”不包括熏蒸劑，而術語“熏蒸劑”包含在種植前施放在土壤且透過土壤(在土壤空氣中和/或土壤水分中)擴散，並可以氣體(諸如甲基溴)、揮發性液體(諸如氯化苦)或揮發性固體(諸如棉隆(dazomet))形式施放的廣譜殺蟲化學劑。
於一些實施例中，該化學或生物殺線蟲劑為市售之經配製產品且與本揭露內容之組成物在桶中混合。於其它實施例中，該化學或生物殺線蟲劑係在配製前與以短小芽孢桿菌為基礎之組成物(諸如來自短小芽孢桿菌QST2808)混合，從而使該組成物形成一種經配製之產品。
這類混合物中所使用之化學殺線蟲劑有胺基甲酸酯、胺基甲酸肟酯(oxime carbamates)及有機磷殺線蟲劑。胺基甲酸酯類殺線蟲劑包括苯菌靈(benomyl)、克百威(carbofuran)(呋喃丹(FURADAN®)、丁硫克百威(carbosulfan)及除線威(cloethocarb)。胺基甲酸肟酯包括碸滅威(alanycarb)、涕滅威(aldicarb)(TEMIK®或為來自 Syngenta之AVICTA® Complete Pak種子處理劑的一部分)、涕滅碸威(aldoxycarb)(STANDAK®)、歐殺滅(oxamyl)(VYDATE®)、硫雙滅多威(thiodicarb)(來自拜耳作物科學之AERIS®種子施放系統的一部分)及威線肟(tirpate)。有機磷殺線蟲劑包括豐索磷(fensulfothion)(DANSANIT®)、滅克磷(ethoprop)(MOCAP®)、除線特(diamidafos)、苯線磷(fenamiphos)、伐線丹(fosthietan)、磷胺(phosphamidon)、硫線磷(cadusafos)、毒死蜱(chlorpyrifos)、酚線磷(dichlofenthion)、大滅松(dimethoate)、噻唑磷(fosthiazate)、速殺硫磷(heterophos)、依殺滅朵松(isamidofos)、依殺松(isazofos)、甲拌磷(phorate)、磷克(phosphocarb)、特丁磷(terbufos)、硫磷嗪(thionazin)、三唑磷(triazophos)、依米噻磷(imicyafos)及甲基滅蚜磷(mecarphon)。各化合物後之附加說明的名稱為上述各化學物質之代表性市售配製劑。其他有用於這類混合物之化學殺線蟲劑包括螺蟲乙酯(spirotetramat)(MOVENTO®)、MON37400®殺線蟲劑及氟蟲腈(fipronil)。
生物殺線蟲劑包括幾丁質與尿素混合物；堆肥萃取物及茶(包括經曝氣及未經曝氣二者)；包含真菌疣疱漆斑菌(Myrothecium verrucaria)和/或來自疣疱漆斑菌之代謝物的組成物(市售商品為DITERA®)、包含真菌擬青黴(包括淡紫擬青黴(P.lilacinus))之組成物(市售商品為，例如MELOCON®或BIOACT®)；包含巴斯德氏芽菌(包括P.usgae)的組成物(市售商品為，例如ECONEM®)；包含來自 芽孢桿菌屬之細菌的組成物，該芽孢桿菌包括堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)(諸如在1995年5月29日保存在法國巴斯德研究所國家微生物收集和培養中心之菌種CNMC I-1582，市售商品為，例如VOTIVO®)、枯草芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌及蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)；以及包含殺線蟲之鏈黴菌屬(諸如利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus))的組成物(市售商品為ACTINOVATE®)。生物殺線蟲劑亦包括以植物為基礎之殺線蟲劑，諸如以楝樹(包括來自該植物的種子或油)或印楝素(azidirachtin)、楝樹種子之二次代謝物為基礎的產品、以芝麻油為基礎的產品(諸如DRAGONFIRE®)、香芹酚及以植物萃取物(諸如NEMA-Q®，從智利之奎拉雅皂樹(Quillaja saponaria)取得)為基礎的產品。生物殺線蟲劑亦包括分離出之由細菌所產生的化合物，諸如由阿弗曼鏈黴菌(Streptomyces avermentilis)製造之菌素(mectins)，包括阿維菌素(abamectin)(其係由阿維菌素B1a及B1b之組合物所組成)和除蟲菌素(avermectin)B2a，以及最初在梨火疫菌(Erwinia amylovora)中鑑定出之超敏蛋白(Harp in蛋白)，包括超敏蛋白EA及超敏蛋白αβ。
本揭露內容之組成物有用於防除植物寄生性線蟲，諸如，例如根結、囊、病變及環線蟲，包括根結線蟲屬(Meloidogyne spp.)、孢囊線蟲屬(Heterodera spp.)、黃金線蟲屬(Globodera spp.)、短體線蟲屬(Pratylenchus spp.)及小環線蟲屬(Criconemella sp.)。該組成物亦有用於防除杉木半穿刺線蟲(Tylenchulus semipenetrans)、毛刺線蟲屬 (Trichodorus spp.)、長針線蟲屬(Longidorus spp.)、腎狀線蟲屬(Rotylenchulus spp.)、劍線蟲屬(Xiphinema spp.)、刺線蟲屬(Belonolaimus spp.)(諸如長尾刺線蟲(B.longicaudatus))、輪線蟲屬(Criconemoides spp.)、矮化線蟲屬(Tylenchorhynchus spp.)、紐帶線蟲屬(Hoplolaimus spp.)、盤旋線蟲屬(Rotylenchus spp.)、螺旋線蟲屬(Helicotylenchus spp.)、穿孔線蟲屬(Radopholus spp.)(諸如柑橘穿孔線蟲(R.citrophilis)及相似穿孔線蟲(R.similis))、莖線蟲屬(Ditylenchus spp.)及其他植物寄生性線蟲。於一些實施例中，該標的為孢囊線蟲，諸如大豆孢囊線蟲(Heterodera glycines)(soybean cyst nematode)、甜菜孢囊線蟲(Heterodera schachtii)(beet cyst nematode)、禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)(Cereal cyst nematode)、南方根結線蟲(Meloidigyne incognita)(棉花(或南方)根結線蟲)、馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)及馬鈴薯孢囊線蟲(Globodera pallida)(potato cyst nematodes)。於其它實施例中，該標的為根結線蟲，諸如南方根結線蟲(棉根結線蟲)、爪哇根結線蟲(M.javanica)(Javanese root knot nematode)、北方根結線蟲(M.hapla)(Northern root knot nematode)及花生根結線蟲(M.arenaria)(peanut root knot nematode)。
本文中所使用之術語“防除”係指滅殺、在數量上減少和/或減少根結線蟲之任何或所有生命階段之生長、攝食或正常生理發育(包括根結線蟲滲透根及在根內發育的 能力)、降低根結線蟲感染及/或侵染的影響(諸如形成蟲癭、滲透和/或根內發育)、植物對抗根結線蟲造成之感染及/或侵染(諸如形成蟲癭和/或滲透)、植物對根結線蟲造成之感染及/或侵染具耐受力或彼等之任何組合。如Trudgill,D.L."Resistance to and Tolerance of Plant Parasitic Nematodes in Plants." Annual Review of Phytopathology.1991；29：167-192(其每一項教示內容以引用方式具體且全部納入本文)所表明，本技藝之一般技術人士已知植物對寄生性根結線蟲之抵抗力及耐受力。有效量為能顯著減少害蟲生長、進食、根系滲透、在根內成熟和/或一般正常的生理發育及由線蟲感染引起之症狀的量。於一些實施例中，相對於未處理之對照組，症狀和/或線蟲係減少至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。
本揭露內容之組成物可用於處理多種農業和/或園藝作物，包括用於長成種子、生產和景觀美化者。可使用本揭露內容之組成物處理的代表性植物包括，但不限於下列者：球根類蔬菜；穀物；柑橘類水果(諸如葡萄柚、檸檬和橙橘)；棉花及其他纖維作物；葫蘆科植物；茄果類蔬菜；葉菜類蔬菜(諸如芹菜、結球和散葉萵苣及菠菜)；豆類；油籽作物；花生；梨果類水果(諸如蘋果及梨)；核果類(諸如杏仁、胡桃及核桃)；根蔬菜；塊莖類蔬菜；球莖類蔬菜；煙草、草莓和其他漿果；油菜作物(諸如西蘭花 和捲心菜)；葡萄；菠蘿；開花植物；花壇植物；和觀賞植物(諸如蕨類及玉簪)。本揭露內容之組成物亦可用於處理多年生植物，包括種植作物，諸如香蕉和咖啡，以及出現在森林，公園或景觀美化場者。
本文所描述之組成物係施放在植物、植物之一部分(諸如種子、根、根莖、球莖、球根或塊莖)和/或該植物或植物部分生長的位置(諸如土壤)以防除植物寄生性線蟲。本揭露內容之組成物可以葉面噴灑液之形式、種子/根/塊莖/根莖/球根/球莖處理劑之形式和/或土壤處理劑之形式施放。該種子/根/塊莖/根莖/球根/球莖、葉和/或土壤可在種植前、種植期間或種植後接受處理。
本文所描述之組成物亦施放在植物、植物之一部分(諸如種子、根、根莖、球莖、球根或塊莖)和/或該植物或植物部分生長的位置(諸如土壤)以增加作物產量。於一些實施例中，作物產量係增加至少約5%，於其他實施例中，增加至少約10%，再於其他實施例中，增加至少約15%，再於其他實施例中，增加至少約20%。於一些實施例中，根部重量增加至少約5%，於其他實施例中，增加至少約10%，再於其他實施例中，增加至少約15%，再於其他實施例中，增加至少約20%。
當作為種子處理劑時，本揭露內容之組成物根據種子的大小以約1×102至約1×109cfu/種子之比率施放。於一些實施例中，該施放率為1×104至約1×107cfu/種子。於一些實施例中，該施放率為約1×102至約1×108、約1×102至 約1×107、約1×102至約1×106、約1×102至約1×105、約1×102至約1×104、約1×102至約1×103、約1×103至約1×105、或較佳地，約1×104 cfu/種子。當該組成物與至少一種額外之活性成分(“ai”)組合或一起使用時，該至少一種額外之活性成分可能之存在量為每100公斤種子約0.001至約1000克、約0.01至約500克、約0.1至約300克、約1至約100克、約1至約50克、約1至約25克，較佳地，約1至約10克，和/或約1×102至約1×108 cfu/種子、約1×102至約1×107 cfu/種子、約1×102至約1×106 cfu/種子、約1×102至約1×105 cfu/種子、約1×102至約1×104 cfu/種子、約1×102至約1×103 cfu/種子、約1×103至約1×105 cfu/種子，或較佳地，約1×104 cfu/種子。
本發明之組成物亦可以根浸液之形式，以約1×103至約1×108 cfu/植物根系之比率施放。當該組成物與至少一種額外之活性成分組合或一起使用時，該至少一種額外之活性成分可能之存在量為約0.001至約1000毫克ai/升、約0.01至約500毫克ai/升、約0.1至約400毫克ai/升、約1至約300毫克ai/升、約10至約250毫克ai/升，較佳地，約25至約200毫克ai/升和/或約1×103至約1×108cfu/植物根系。
當作為土壤處理劑時，本揭露內容之組成物可以土壤表面灌注液之形式從稈柄打入、注入和/或施放在犁溝中或與灌溉用水混合進行施放。該可在種植前、播種期間、或播種後、或移栽後及植物生長的任何階段施放之灌注液 土壤處理劑的施放率為每英畝約4×107至約8×1014cfu、約4×109至約8×1013cfu、約4×1011至約8×1012cfu、約2×1012至約6×1013cfu、約2×1012至約3×1013cfu、或約4×1013至約2×1014cfu。於一些實施例中，該施放率為每英畝約1×1012至約6×1012cfu，或每英畝約1×1013至約6×1013 cfu。犁溝處理劑在種植時之施放率為每1000行腳約2.5×1010至約5×1011 cfu。於一些實施例中，該施放率為每1000行腳約6×1010至約3×1012cfu、約6×1010至約4×1011cfu、約6×1011至約3×1012cfu、或約6×1011至約4×1012cfu。當從稈柄打入或注入土壤時，該施放率為施放率為每英畝約4×107至約8×1014cfu、約4×1013至約2×1014cfu、約4×108至約8×1013cfu、約4×109至約8×1012cfu、約2×1010至約6×1011cfu、約4×107至約8×1013cfu、約4×107至約8×1012、約4×107至約8×1011cfu、約4×107至約8×1010cfu、約4×107至約8×109cfu或約4×107至約8×108cfu。熟習本技藝之人士將理解如何調整用於撒播處理劑(當施放比率較低且較常施放時)和其他較不常見的土壤處理劑之比率。當該組成物與至少一種額外之活性成分相結合或一起使用時，該至少一種額外之活性成分可能之存在量為約10至約1000、約10至約750、約10至約500、約25至約500、約25至約250，較佳地，約50至約200克ai/升和/或每英畝約4×107至約8×1014cfu、約4×1013至約2×1014cfu、約4×108至約8×1013cfu、約4×109至約8×1012cfu、約2×1010至約6×1011cfu、約4×107 至約8×1013cfu、約4×107至約8×1012、約4×107至約8×1011cfu、約4×107至約8×1010cfu、約4×107至約8×109cfu或約4×107至約8×108cfu。
本揭露內容之組成物可在種植之前或種子發芽之前被引入土壤中。本揭露內容之組成物亦可被引入植物之位置、與植物的根接觸之土壤、植物基部的土壤或植物基部周圍的土壤中(例如在植物基部周圍或下方約5厘米、約10厘米、約15厘米、約20厘米、約25厘米、約30厘米、約35厘米、約40厘米、約45厘米、約50厘米、約55厘米、約60厘米、約65厘米、約70厘米、約75厘米、約80厘米、約85厘米、約90厘米、約95厘米、約100厘米或更遠的距離內)。該組成物可使用多種技術施放，包括，但不限於滴灌、噴水器、土壤注射或土壤灌藥。該組成物亦可施放在塞狀育苗盤中之土壤和/或植物上，或在移栽到不同的植物位置之前施放至幼苗。當施放在與植物的根接觸之土壤、植物基部或植物基部周圍之特定距離內(包括為土壤灌藥處理劑之形式)的土壤時，該組成物可以單次施藥或多次施藥之形式施放。該組成物(包括那些具有至少一種額外之活性成分者)可以上文列舉之用於灌藥處理的比率或每克土壤約1×105至約1×108cfu、每克土壤1×105至約1×107cfu，每克土壤1×105至約1×106cfu、每克土壤7×105至約1×107cfu、每克土壤1×106至約5×106cfu或每克土壤1×105至約3×106 cfu施放，和/或每英畝約4×107至約8×1014cfu、約4×108至約8×1013cfu、 約4×109至約8×1012cfu、約2×1010至約6×1011cfu、約4×107至約8×1013cfu、約4×107至約8×1012、約4×107至約8×1011cfu、約4×107至約8×1010cfu、約4×107至約8×109cfu或約4×107至約8×108cfu之比率施放。於一實施例中，本揭露內容之組成物係以每克土壤約7×106至約1×107cfu之比率單次施放。於其它實施例中，本揭露內容之組成物係以每克土壤約1×106至約5×106cfu之比率單次施放。於其它實施例中，本揭露內容之組成物係以每克土壤約1×105至約3×106cfu之比率多次施放。
較佳地，本揭露內容之以短小芽孢桿菌為基礎的組成物占全部配製劑之約1%重量/重量至約99%重量/重量。更佳地，該以短小芽孢桿菌為基礎的組成物之存在量為約1%重量/重量至約80%重量/重量、約1%重量/重量至約60%重量/重量、約1%重量/重量至約50%重量/重量、約1%重量/重量至約40%重量/重量、約1%重量/重量至約30%重量/重量、約1%重量/重量至約20%重量/重量、約1%重量/重量至約10%重量/重量，最佳地，約5%重量/重量至約50%重量/重量。
本揭露內容之以短小芽孢桿菌為基礎的組成物可獨立施放或與一或多種其它殺線蟲劑(諸如化學和生物殺線蟲劑)組合施放。於一些實施例中係將短小芽孢桿菌QST2808與至少一種其他殺線蟲劑共同配製並將該經共同配製之產品施放在植物或植物位置上。於一些其它實施例中，該以短小芽孢桿菌為基礎的組成物係與市售之化學或 生物殺線蟲配製劑在桶中混合，並施放在植物及植物位置上。於其它實施例中，本揭露內容之以短小芽孢桿菌為基礎的組成物係緊接在該市售之化學或生物殺線蟲劑之配製劑之前或之後施放在植物和/或植物位置上。於其它實施例中，本揭露內容之以短小芽孢桿菌為基礎的組成物係與市售之化學或生物殺線蟲配製劑輪流施放在植物和/或植物位置上。於一種情況中，如下文中所更詳細討論者，該以短小芽孢桿菌為基礎的組成物係以種子處理劑之形式施放，或以犁溝或灌注處理劑之形式施放。於上述實施例之一些情況中，該化學或生物殺線蟲劑之市售配製劑係以低於該產品標籤上所推薦之比率施放，該產品標籤上所推薦之比率係這類殺線蟲劑單獨作為處理劑時所施放者，例如約1%、約2%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約35%、約45%、約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約90%或約95%以下。
於其他實施例中，本揭露內容之以芽孢桿菌為基礎的組成物係在施放熏蒸劑之後施放至植物和/或植物位置。熏蒸劑可藉由旋液肥開溝器(shank injection)進行施放，一般係在土壤表面下最少8英寸。熏蒸劑之液體配製劑亦可以透過表面滴灌化學灌溉施放以使熏蒸劑移至土壤表面下8英寸或更深。以塑膠布覆蓋經處理之土壤床以將熏蒸劑保留在土壤中數天。此係在種植前完成並使空氣在種植前排出。此處所描述之以芽孢桿菌為基礎的組成物係在將空氣排出後，在種植之前、種植時或種植之後施放。於一 些情況中，該熏蒸劑係以低於該產品標籤上所推薦之比率施放。
化學和生物殺線蟲劑描述於上文中。下述各熏蒸劑之商品配製劑的實例提供在化學名稱後之括號內。熏蒸劑殺線蟲劑包括鹵代烴類，諸如氯化苦(CHLOR-O-PIC®)；甲基溴(METH-O-GAS®)及彼等之組合(諸如BROM-O-GAS®及TERR-O-GAS®)；1,3-二氯丙烯(TELONE®II、TELONE® EC、CURFEW®)及1,3-二氯丙烯與氯化苦之組合物(TELONE® C-17、TELONE®C-35及INLINE®)；1,2-二氯丙烯；碘甲烷(MIDAS®)；甲基異氰酸酯釋出劑類，諸如甲基二硫代胺基甲酸鈉(VAPAM®、SOILPREP®、METAM-SODIUM®)及棉隆；1,3-二氯丙烯與異硫代氰酸甲酯(VORLEX®)之組合物；和二硫化碳釋出劑，諸如四硫代碳酸鈉(ENZONE®)；及二甲基二硫化物或DMDS(PALADINO®)。
本揭露內容之組成物亦可作為經整合之蟲害管理("IPM")方案的一部分來施放。這類方案描述於各種出版物中，尤其是由大學合作推展所出版者。這類方案包括以不能作為目標線蟲之宿主的作物進行輪作、實施栽培和耕作以及使用移植。例如，該以芽孢桿菌為基礎之組成物可在芥末或其他抑制線蟲作物之生長季節後施放。
於一些實施例中，先鑑別需要處理之位置後再將本發明之組成物施放在植物、植物部分或植物位置上。這種鑑別可能透過視覺鑑定顯示出萎黃病、發育不良、壞死或枯 萎(即，顯示出營養不足)的植物，通常再加上關於線蟲問題歷史之知識；植物採樣；和/或土壤採樣來進行。植物採樣可能在生長季節期間進行或在最終收穫後立即進行。將植物從土壤中移出並檢查其根，以測定在一片田野內之線蟲問題的性質和程度。在根結線蟲方面，根癭嚴重性係經由測量形成蟲癭之根系的比例來測定。由根結線蟲引起的蟲癭可與固氮土壤細菌之小瘤區別，因為蟲癭不容易與根部分離。根結線蟲土壤族群隨著根癭之嚴重性而增加。於一些情況中，在種植任何易感染的作物時檢測到任何程度之根癭形成係暗示有根結線蟲的問題，尤其是在採樣區中或採樣區附近。孢囊線蟲亦可藉由植物採樣及詳盡檢查根部之孢囊來鑑別。
土壤採樣提供測定侵染一定體積之土壤或根部的線蟲和/或線蟲蟲卵的數量之方法。在初次懷疑問題時、最後收穫時或在種植新作物之前的任何時間(包括進行先前作物之作物破壞前)可進行土壤採樣。大學合作推廣方案提供土壤採樣服務，包括佛羅里達大學、俄勒岡州立大學及內布拉斯加-林肯大學。此外，這類方案提供如何收集樣本之指導。例如，於收穫後預測採樣之一種方法中係以規律的之字形模式從超過5或10英畝(取決於作物的價值，較高價值之作物的採樣英畝較少)之10至20個田野位置收集6到10英寸深之土壤樣本。於一測試已建立之植物的方法中係從有症狀，但並非死亡或垂死(即，腐爛)的可疑植物移出根及土壤深度為6至10英寸之土壤樣本。
於一些實施例中，鑑別工作涉及測定線蟲侵染是否已達到經濟閾值，亦即，預計不處理的經濟損失會超過處理費用的點。該經濟閾值會根據種植之作物、地理、氣候、時間、土壤類型和/或土壤溫度而改變。關於此主題之論文已發表多篇且可從不同領域之大學合作推廣方案中取得指導方針。見，例如Robb,J.G.,et al.,"Factors Affecting the Economic Threshold for Heterodera schachtii Control in Sugar Beet," Economics of Nematode Control,January-June 1992；Hafez,Saad L.,"Management of Sugar Beet Nematode," University of Idaho Current Information Series(CIS),1071(1998)；及"UC IPM Pest Management Guidelines：Tomato”,UC ANR Publication 3470 Nematodes A.Ploeg,Nematology,UC Riverside(January 2008)，以上各篇之每一項教示內容被具體且全部地以引用方式併入本文中。本技藝之一般技術人士熟知測定特定作物在一年之特定時間內的經濟閾值之技術。
於一些實施例中，該土壤採樣透露出線蟲侵染將導致產量為未受侵染土壤之正常產量的約80%、約90%或約95%。
於一些實施例中，每公斤土壤樣本之根結線蟲幼蟲的經濟閾值為至少約250、至少約300、至少約500、至少約750、至少約1000、至少約2000、至少約3000、至少約4000、至少約5000或至少約6000。
於一些實施例中，每1立方厘米土壤之孢囊線蟲卵及 幼蟲的經濟閾值為至少約0.5、至少約1、至少約2、至少約3、至少約4。根據上述之Hafez(1998)，一個孢囊可被估計為500個可存活之蟲卵及幼蟲。
下列實例僅用於說明，而非用於限制本揭露內容。
實例1
以黃瓜種子蘇丹(Sultan)變種進行研究，以測定QST2808對抗爪哇根結線蟲(Meloidogyne javanica)的活性。在此研究中，使用含有20克砂和一個以QST2808全基質預先處理之未發芽的種子之50毫升離心管。
在含有75毫升之以8克TSB為底質的謝弗(Schaeffer)氏基質(TSB 8克/升；10%KCl(重量/體積)，10毫升/升；1.2%MgSO47H2O(重量/體積)，10毫升/升；1M Ca(NO3)2，1.0毫升/升；0.010M MnCl2，1.0毫升/升；1mM FeSO4，1.0毫升/升)的250毫升燒瓶中接種QST2808。將經接種之燒瓶在30℃下培養二天，並一邊在~200rpm下搖動。測定光密度，並以所需數量之菌落形成單位(見表2)塗覆種子並乾燥之。
令處理過之種子在溫室中發芽並生長。處理後(DAT)四到五天，在各管中接種100隻根結線蟲之二齡幼蟲。10 DAT時，將幼苗之根癭百分比評為0-4級，結果描述於表1中。
然後，以酸品紅(acid-fuschin)為根染色以觀察線蟲滲 透及發育(見表2)，並在萊卡(Leica)解剖顯微鏡下觀察。在線蟲滲透方面，計算每一根部內之全部線蟲幼蟲數。在線蟲發育方面，計算全部脂肪幼蟲之數量(包括晚二齡幼蟲(J2's)及三齡幼蟲(J3's))。如表1中之詳細描述為線蟲滲透入根部之程度及滲透後之線蟲發育評級。所使用之技術的細節請參閱C.O.Omwega，等人，"A Nondestructive Technique for Screening Bean Germ Plasm for Resistance to Meloidogyne incognita," Plant Disease(1988)72(11)：970-972(其每一項教示內容被具體且全部地以引用方式併入本文中)。
CFU比率為1×103至1×106之間的組別發育程度(脂肪線蟲的總數)並無顯著差異，但與未經處理的對照組及1×107 CFU組顯著不同。滲透數據顯示出類似的，但較不強的趨勢。結癭指數隨著CFUs增加而增加可能是由於根部質量增加。
實例2
以黃瓜種子蘇丹變種進行研究，以測定QST2808對抗爪哇根結線蟲的活性。在此研究中，將以比率為104 CFU之QST2808孢子預先處理過的未發芽之種子接種在32盎司杯子內的砂中。
為了取得孢子在含有75毫升之以8克TSB為底質的謝弗氏基質(TSB 8克/升；10%KCl(重量/體積)，10毫升/升；1.2%MgSO47H2O(重量/體積)，10毫升/升；1M Ca(NO3)2，1.0毫升/升；0.010M MnCl2，1.0毫升/升；1mM FeSO4，1.0毫升/升)的250毫升燒瓶中接種QST2808。將經接種之燒瓶在30℃下培養二天，並一邊在~200rpm下搖動。測量光密度，並以所需數量之菌落形成單位塗覆種子並乾燥之。
將處理過之種子種植在32盎司之盆中，令其在溫室中發芽並生長。在種植後約30天，在每一株植物之土壤中接種約2000隻根結線蟲之二齡幼蟲。接種後4週收穫根部並稱重，評估疾病的嚴重程度，並依結癭程度進行評 級。疾病嚴重程度分為0-3級，其中0=沒有症狀，且3=根腐爛及變色症狀嚴重。結癭程度係使用Bridge,J.及Page,S.J.L.,Tropical Pest Management 26(3)1980 pp.296-298.Roots of QST2808-treated seeds中所描述之方法評級。經QST2808處理過之種子的根看起來比未經處理過的對照組及以其他候選細菌處理過的根來得大且較健康。定量結果-其表明短小芽孢桿菌可促進對線蟲之耐受性-顯示於下列表3中。

Claims (25)

  1. 一種用於防除在植物、植物部分及/或植物生長地點內或上之線蟲的方法，其包含對需要防護該線蟲之植物、植物部分及/或植物生長地點施放有效量之短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)QST2808、短小芽孢桿菌QST2808之突變株或至少一種短小芽孢桿菌QST2808之代謝物。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在施放前先進行確認需要防護該線蟲之植物、植物部分或植物生長地點的步驟。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該確認包含測定該植物生長地點超過線蟲侵染之經濟閾值。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該地點為土壤。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該短小芽孢桿菌QST2808係在種植前施放。
  6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該短小芽孢桿菌QST2808係在種植時施放。
  7. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該短小芽孢桿菌QST2808係在種植後施放。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該短小芽孢桿菌QST2808係以每英畝約4×107至約8×1014cfu之比率施放。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該短小芽孢桿菌QST2808係施放至種子。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該短小芽孢桿菌QST2808為醱酵產物。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該醱酵產物包含短小芽孢桿菌QST2808、代謝物及殘餘之醱酵基質。
  12. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含施放第二殺線蟲劑。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該第二殺線蟲劑為選自下列群組之化學殺線蟲劑：胺基甲酸酯、有機磷酸鹽及彼等之組合。
  14. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該第二殺線蟲劑係與該短小芽孢桿菌QST2808組合施放。
  15. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該第二殺線蟲劑係與該短小芽孢桿菌QST2808輪流施放。
  16. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該第二殺線蟲劑為經配製之市售產品。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該第二殺線蟲劑係以低於該第二殺線蟲劑之產品標籤上所推薦之比率施放，該產品標籤上所推薦之比率係該第二殺線蟲劑單獨作為處理劑時所施放者。
  18. 如申請專利範圍第1至17項中任一項之方法，其中該線蟲為引起根結病之線蟲。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該線蟲來自根結線蟲(Meloidogyne)屬。
  20. 一種組成物，其包含短小芽孢桿菌QST2808及第 二殺線蟲劑。
  21. 如申請專利範圍第20項之組成物，其中該第二殺線蟲劑係選自下列群組：胺基甲酸酯及有機磷酸鹽。
  22. 一種套組，其包含短小芽孢桿菌QST2808及被作為殺線蟲劑之用途的指示說明。
  23. 如申請專利範圍第22項之套組，其中該指示說明指導使用者以每英畝約4×107至約8×1014cfu之比率使用該短小芽孢桿菌QST2808。
  24. 如申請專利範圍第22項之套組，其中該指示說明指導使用者將該短小芽孢桿菌QST2808與化學殺線蟲劑組合使用，並進一步指導使用者以較該化學殺線蟲劑之產品標籤上所推薦之比率為低的比率使用該化學殺線蟲劑。
  25. 一種用於防除在植物、植物部分及/或植物生長地點內或上之線蟲的方法，其包含對需要防護該線蟲之植物、植物部分及/或植物生長地點施放有效量之短小芽孢桿菌、短小芽孢桿菌之突變株或至少一種短小芽孢桿菌之代謝物。
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