JP2014507130A - バチルスのサンドペーパー突然変異体、及び植物の成長増進、植物の健康促進、並びに植物の病害及び害虫の防除に対するその使用法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新規のバチルス株、及び成長を増進させるか、植物の健康を促進するか、並びに植物の病害又は害虫を防除するためにそれを使用する方法に関する。
【選択図】図１４

Description

[0001] 本発明は、細菌突然変異体の分野、及び植物の成長増進、植物の健康促進、並びに植物の病害及び害虫の防除に対するその使用法に関する。
[0002] バチルス属は、特に農業及び動物の栄養分野に無数の使用法を有する多数の内生胞子形成細菌を含んでいる。バチルスの幾つかの株が現在、植物成長促進剤及び／又は害虫及び病害に対する生物的防除剤として使用するために市販されている（例えば、Masaaki Morikawaの、「Beneficial Biofilm Formation by Industrial Bacteria Bacillus subtilis and Related Species」（Journal of Bioscience and Bioengineering (2006) 101(I):1-8）、Kloepper他の、「Induced Systemic Resistance and Promotion of Plant Growth by Bacillus spp.」（Phytopathology (2004) 94(II):1259-1266）を参照されたい）。これらの環境に優しい有機代替物は、植物成長促進剤及びバイオ農薬として有効なために農学者及び園芸学者の間で広く受け入れられている。
[0003] Baccilus subtilis（枯草菌）はグラム陽性土壌細菌であり、植物の根圏に見られることが多い。B. subtilisは、多くの細菌種と同様に、２つの明確な増殖モードを呈することができる。すなわち、自由遊泳性のプランクトン様増殖モードと、細胞の集合体が細胞外マトリクスを分泌して相互及び／又は表面に付着する固着生物膜モードである（Branda他の、「Fruiting Body Formation by Bacillus subtilis」（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98:11621-11626）、Hamon及びLazazzeraの、「The Sporulation Transcription Factor Spo0A is Required for Biofilm Development in Bacillus subtilis」（Mol. Microbiol. (2001)52:847-860））。B. subtilisなどの細菌が生物膜を構築するために使用する経路は極めて多様であり、種内及び異なる種の間で、及び異なる環境条件で非常に変化する（Bais他の、「Biocontrol of Bacillus subtilis Against Infection of Arabidopsis Roots by Pseudomonas syringae is Facilitated by Biofilm Formation and Surfactin Production」（Plant Physiol. (2004)134:307-319）、Lemon他の、「Biofilm Development with an Emphasis on Bacillus subtilis」（(2008) Current Topics in Microbiology and Immunology (2008) 322:1-16)）。B. subtilis及び関連する種の特定の株による生物膜形成が、植物の病原体によって引き起こされる感染の防御に役立つことがあるということが比較的最近認識されている（上述のMorikawa(2006)）。
[0004] 生物膜の形態及び化学組成は種及び株の間で異なる。野生のBacillus subtilis株で生じるムコイドコロニーの形態とγ−ポリグルタミン酸の産生量は、生物膜形成の増進に相互に関連付けられてきたが、その一方でdomesticの（又はラボの）株で生じる平坦で乾燥したコロニーの形態は、生物膜形成の減少と関連付けられている。Stanley, N.及びLazazzera, Bの、「Defining the Genetic Differences Between Wild and Domestic Strains of Bacillus subtilis that Affect Poly-γ-DL-Glutamic Acid Production and Biofilm Formation」（Molecular Microbiology (2005)57(4):1143-1158 at 1145）を参照されたい。Brandaの論文（上記、２００１）は、平坦で小型で乾燥したコロニーのように、横方向に増殖して最終的に相互に融合し、気生構造がない小さいコロニーとなる非ムコイドコロニーの形態を有する生物膜の欠陥について述べている。しかし、Stanleyの論文は、ｓｗｒＡ座に機能損失の変異があり、平坦で乾燥したコロニーを形成して生物膜形成の増進を示した交配種Bacillus subtilis株について述べている。（交配株は、domestic株と、ムコイドコロニーの形態の原因となる野生株からのＤＮＡとの交雑で作成された組合せであった。）本出願人は、ｓｗｒＡ座の機能が損失又は減少した変異を有するバチルス株が、頑強な生物膜を形成する平坦で乾燥したコロニーを生成し、さらに、このような細胞で構成された製剤化された発酵生成物が、植物の健康を増進し、野生型のｓｗｒＡ遺伝子を含む株と比較してより頑強な根コロニー形成につながり、植物の病害及びセンチュウなどの害虫を防除することを発見した。
[0005] 商業的農業及び家庭園芸は両方とも、植物の成長増進、植物の健康促進、植物の害虫及び病害の防除、及び化学的殺センチュウ剤に対する代替物の提供などに使用するために、バチルス株の様々な改良された供給源が使用可能になれば恩恵を受ける。本発明は、このような細菌株に新しいクラス、及び生物膜形成の操作によるそれらの改良された使用方法を提供する。
[0006] 本発明は、遊走能力を損ない、植物の健康促進を増進するｓｗｒＡ遺伝子に突然変異を有する胞子形成細菌を含む組成物を提供する。また、野生型ｓｗｒＡ遺伝子と比較して以下の特徴を有する。特徴とは、平坦で乾燥し、極めてコンパクトで非常にクリスピーな細胞又はコロニーで構成されたサンドペーパー細胞又はコロニーの形態であり、より頑強な根コロニー形成、及び／又は液体培養での早期の対数期における細胞の長鎖形成である。このような突然変異を本明細書ではｓｗｒＡ突然変異と、このようなｓｗｒＡ突然変異を有する細胞はｓｗｒＡ−細胞と呼ぶ。
[0007] 胞子形成細菌の変異体のこのような組成物では、ｓｗｒＡ−細胞は組成物中の細胞全体の少なくとも約３．５％を含み、ｓｗｒＡ−細胞の少なくとも７０％は胞子である。本発明は、ｓｗｒＡ−細胞が組成物中の細胞全体の少なくとも１０％を含む、又は組成物中の細胞全体の少なくとも５０％を含む、又は組成物中の細胞全体の１００％を含むこのような組成物をさらに提供する。本発明は、組成物中のｓｗｒＡ−細胞及び／又は細胞全体の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％が胞子であるこのような組成物をさらに提供する。
[0008] 幾つかの実施形態では、胞子形成細菌はバチルス属に由来する。さらに他の実施形態では、Bacillus subtilisクレード内のバチルス種に由来する（図６参照）。さらに他の実施形態では、種はB. pumilus、B. atrophaeus、B. amyloliquefaciens、B. subtilis及びB. licheniformisからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、バチルス種はBacillus subtilis ＱＳＴ７１３である。
[0009] 本発明はｓｗｒＡ−細胞を含む組成物を提供し、ｓｗｒＡ機能の損失は、その機能を混乱させるか、その機能を妨害するか、又は他の方法でその機能に悪影響を及ぼす何らかの突然変異の結果であることがある。このような突然変異の例には、ｓｗｒＡの開始コドンの少なくとも１つの核酸塩基対の変化、及び／又はｓｗｒＡの少なくとも１つの核酸塩基対の欠失、及び／又はｓｗｒＡの少なくとも１つの核酸塩基対の挿入、及び／又はｓｗｒＡ促進因子又はｓｗｒＡの他のコントロール部位の妨害、及び／又はｓｗｒＡ機能の損失を引き起こす任意の他の遺伝子又は遺伝子型の事象（例えば、トランスポゾン、過剰発現、ドミナントネガティブ突然変異、ＲＮＡｉ、アンチセンス、ノックアウト、ノックインなど）が含まれるが、これらに限定されない。
[0010] 本発明は、ｓｗｒＡオルソログに突然変異を有する胞子形成細菌細胞を含む組成物とその使用に関し、この突然変異は、突然変異を有していない同質遺伝子系統の細菌細胞と比較して細菌細胞の遊走能力を低下させる。一実施形態では、遊走能力は、非液体表面上での増殖によって測定される。
[0011] ｓｗｒＡオルソログに突然変異を有する胞子形成細菌細胞は、Bacillus subtilisクレード内のバチルス種に由来することがある。一実施形態では、胞子形成細菌細胞は野生型である。別の実施形態では、バチルス種類はB. pumilus、B. atrophaeus、B. amyloliquefaciens、B. subtilis及びB. licheniformisからなる群から選択される。
[0012] ｓｗｒＡオルソログに突然変異を有する胞子形成細菌細胞は、突然変異を有していない同質遺伝子系統の細菌細胞と比較して、以下のうち少なくとも１つを含む様々な特徴を有する。すなわち、（ｉ）より頑強な生物膜の形成、（ｉｉ）平坦で乾燥した厚い生物膜、及び（ｉｉｉ）（高度に乱流の環境を生成する）剪断力に応答した液体培養中での長鎖の形成、である。
[0013] 他の実施形態では、より頑強な生物膜は、突然変異を有していない同質遺伝的細胞と比較して以下の特徴のうち１つ又は複数をさらに含む。すなわち、（ｉ）少なくとも約１．５倍大きい直径を有する栄養細胞、（ｉｉ）追加の細胞外被を有する細胞、（ｉｉｉ）透過電子顕微鏡で可視化した場合の大きく白い（電子透過性の）領域、（ｉｖ）図１２、図１３又は図１４に示すＡＱ３０００２の生物膜の外観、及び（ｖ）液体培地中に長鎖を形成する細胞、である。
[0014] 一実施形態では、ｓｗｒＡオルソログは、突然変異を含む細菌細胞と同じバチルス種のｓｗｒＡ野生型遺伝子に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｓｗｒＡオルソログは、突然変異を有する細菌細胞と同じバチルス種のｓｗｒＡ野生型遺伝子に対して少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、又は少なくとも約９９％の同一性を有する。さらに別の実施形態では、ｓｗｒＡオルソログに対して少なくとも約９９％の配列同一性を有する野性型ｓｗｒＡ遺伝子は、突然変異を有する細菌細胞と同じ株に由来する。さらに別の実施形態では、ｓｗｒＡオルソログは配列番号１及び５〜１０で表されるｓｗｒＡヌクレオチド配列の任意の１つに対して少なくとも約９０％の同一性を有する。
[0015] 別の実施形態では、ｓｗｒＡオルソログの突然変異は、配列番号１で表されるｓｗｒＡ遺伝子の２６位〜３４位のうち１つ又は複数に対応する位置、又は配列番号１で表されるｓｗｒＡ遺伝子の１位〜３位のうち１つ又は複数に対応する位置にある。１つの変形では、突然変異は挿入又は欠失である。
[0016] 一実施形態では、上記胞子形成細菌細胞の組成物は、組成物の細菌細胞全体の少なくとも３．５％を含み、及び／又は組成物中の胞子形成細菌細胞の少なくとも約７０％は胞子である。
[0017] 別の実施形態では、本発明は胞子形成細菌ｓｗｒＡ−細胞を含む組成物を含み、ｓｗｒＡ−細胞は組成物中の全細菌細胞の少なくとも３．５％を占め、及び／又は胞子形成細菌細胞の少なくとも約７０％は胞子である。幾つかの実施形態では、ｓｗｒＡの活性はｓｗｒＡ遺伝子の突然変異以外のものによって低下している。ｓｗｒＡの活性は、小分子、薬物、化学物質、化合物、ｓｉＲＮＡ、リボゾーム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｗｒＡ阻害抗体、ｓｗｒＡ阻害ペプチド、アプタマ又は鏡像アプタマなどの様々な作用物質によって低下することがある。一実施形態では、ｓｗｒＡ−細胞中のｓｗｒＡ遺伝子の突然変異は、配列番号１で表されるｓｗｒＡ遺伝子の２６位〜３４位のうち１つ又は複数に対応する位置、又は配列番号１で表されるｓｗｒＡ遺伝子の１位〜３位のうち１つ又は複数に対応する位置にある。１つの変形では、突然変異は挿入又は欠失である。別の態様では、ｓｗｒＡ−細胞はｓｗｒＡ遺伝子のノックアウトの結果である。
[0018] 一実施形態では、本発明の胞子形成細菌細胞は、ｓｗｒＡ遺伝子の突然変異及びその組成物を有するBacillus subtilis ＱＳＴ７１３細菌細胞である。一態様では、Bacillus subtilis ＱＳＴ７１３細菌細胞は開始コドンの少なくとも１つの核酸塩基対の変化、及び／又はｓｗｒＡ遺伝子の少なくとも１つの核酸塩基対の挿入又は欠失を含む。他の態様では、ｓｗｒＡ遺伝子の挿入又は欠失は、配列番号１の２６位〜３４位の位置にある塩基対の１つ又は複数で生じる。さらに別の態様では、Bacillus subtilis ＱＳＴ７１３のｓｗｒＡ−細胞はそれぞれ受託番号NRRL B-50421及びNRRL B-50455として寄託された株ＡＱ３０００２（別名ＱＳＴ３０００２）及び株ＡＱ３０００４（別名ＱＳＴ３０００４）からなる群から選択される。本発明のさらに別の態様では、ｓｗｒＡ遺伝子に突然変異を有するBacillus subtilis ＱＳＴ７１３は、ｅｐｓＣ、ｓｆｐ及びｄｅｇＱの野生型である。別の態様では、突然変異を有するBacillus subtilis ＱＳＴ７１３はこれ以外はBacillus subtilis ＱＳＴ７１３と同質遺伝子系統である。幾つかの実施形態では、突然変異を有するBacillus subtilis ＱＳＴ７１３細胞の組成物は組成物中の細菌細胞全体の少なくとも約３．５％を含む。
[0019] 本発明はそれぞれ受託番号NRRL B-50421及びNRRL B-50455として寄託された株ＡＱ３０００２（別名ＱＳＴ３０００２）及びＡＱ３０００４（別名ＱＳＴ３０００４）からなる群から選択された１つ又は複数のB. subtilis株を含む組成物を提供する。
[0020] 一実施形態では、ｓｗｒＡオルソログに突然変異を有する胞子形成細菌細胞は、Bacillus subtilisクレード内のバチルス種に由来し、野生型ｓｆｐオルソログを含む。別の実施形態では、これらの細菌細胞は、野生型ｄｅｇＱオルソログ及び野生型ｅｐｓＣオルソログをさらに含む。一態様では、ｓｆｐオルソログ、ｄｅｇＱオルソログ及びｅｐｓＣオルソログはそれぞれ、B.pumilus、B. atrophaeus、B. amyloliquefaciens、B. subtilis及びB. licheniformis、B. aerophilus、B. stratosphericus、B. safensis、B. altitudinus、B. vallismortis、B. halotolerans、B. mojavensis、B. sonorensis、及びB. aeriusのいずれか１つからのそれぞれｓｆｐ遺伝子、ｄｅｇＱ遺伝子及びｅｐｓＣ遺伝子に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する。さらに別の態様では、B. subtilis株３６１０、B. amyloliquefaciens株ＦＺＢ４２、B. pumilus SAFR-032、B. lichenformis株１４５８０、又はB. atrophaeus株１９４２のいずれか１つのｓｆｐ遺伝子、ｄｅｇＱ遺伝子及びｅｐｓＣ遺伝子に対して、少なくとも約９０％の配列同一性である。さらに別の態様では、ｓｆｐオルソログは配列番号１１に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有し、ｅｐｓＣオルソログは配列番号１２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有し、ｄｅｇＱオルソログは配列番号１３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する。さらに別の態様では、この段落で説明した配列同一性は少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％である。
[0021] 本発明は、多糖類（デンプン、マルトデキストリン、メチルセルロース、及びタンパク質、例えば、乳漿タンパク質、ペプチド、ガム）、糖類（ラクトース、トレハロース、スクロース）、脂質（レシチン、植物油、鉱物油）、塩（塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム）、及びケイ酸塩（泥、アモルファスシリカ、ヒュームド／沈降シリカ、ケイ酸塩）などの配合不活性物質又は他の配合成分をさらに含む本発明の胞子形成細菌又は組成物のいずれかをさらに提供する。組成物が土壌に施されるような幾つかの実施形態では、本発明の組成物は、土壌への組成物の取り込みを助長する水又は鉱物又は泥炭などの有機材料などの担体を含む。組成物が種子処理に、又は根の浸液として使用されるような幾つかの実施形態では、担体は種子又は根への組成物の付着を助長する結合剤又は固着剤である。組成物が種子処理剤として使用される別の実施形態では、配合成分は着色剤である。他の組成物では、配合成分は保存剤である。
[0022] 本発明は、ｓｗｒＡ−細胞に加えて少なくとも１つの他の活性成分又は作用物質をさらに含む本発明の組成物のいずれかをさらに提供する。このような他の活性成分又は作用物質は、化学物質又は細菌の他の株であってもよい。適切な活性成分又は作用物質の例には、除草剤、殺カビ剤、殺菌剤、殺虫剤、殺センチュウ剤、殺ダニ剤、植物成長調整剤、植物成長刺激剤及び肥料が含まれるが、これらに限定されない。
[0023] 本発明は、ｓｗｒＡ−細胞が組成物中に約１×１０２ｃｆｕ／ｇ〜約１×１０１０ｃｆｕ／ｇ含まれる組成物をさらに提供する。本発明は、ｓｗｒＡ−細胞が少なくとも１×１０６ｃｆｕ／ｇ含まれる、又は少なくとも１×１０７ｃｆｕ／ｇ含まれる、又は少なくとも１×１０８ｃｆｕ／ｇ含まれる、又は少なくとも１×１０９ｃｆｕ／ｇ含まれるこのような組成物をさらに提供する。
[0023] 本発明は、本発明の胞子形成細菌の発酵生成物、及びこのような発酵生成物を含む組成物を含む。一態様では、これらの発酵生成物は胞子形成細菌細胞、その代謝物及び残留発酵ブロスを含む。他の態様では、発酵生成物の胞子形成細菌細胞は大部分が胞子である。別の態様では、発酵生成物を含む組成物は、本明細書に記載するような配合不活性物質及び配合成分をさらに含む。幾つかの実施形態では、濃縮された発酵ブロスを、発酵生成物が大きい胞子になるように、例えば、透析ろ過過程により洗浄して、残留発酵ブロス及び代謝物を除去する。
[0024] また、本発明は、植物の健康を増進する（植物の健康を促進するか、非生物ストレスに対する抵抗力を増強するか、又は植物の活力を改良することによってなど）、及び／又は植物の病害を防除する、及び／又は植物の害虫を防除するために植物を処理する方法を提供し、該方法は、本発明の組成物又は本発明の胞子形成細菌の１つ又は複数を植物に、植物の一部に、及び／又は植物の増殖培地などの植物を囲む位置に施すことを含む。したがって、例えば、本発明は、本発明の組成物を土壌に適用されるような方法をさらに提供する。例えば、組成物は、植物又は植物の一部が土壌に接触する前、接触している間、又は接触した後に適用することができる。他の例として、本発明の方法は、土壌表面灌注、シャンクイン（ｓｈａｎｋｉｎｇ ｉｎ）、注入、化学溶液灌水又は畝間への注入などの適用方法を使用した組成物を適用することを含むが、これらに限定されない。
[0025] 本発明の方法は、任意の植物の部分で使用することができる。このような植物の部分の例には、種子、根、球茎、塊茎、球根、接ぎ穂及び根茎が含まれるが、これらに限定されない。
[0026] 本発明の組成物及び胞子形成細菌は、例えば根瘤、包嚢、損傷及びワセンチュウ、例えばネコブセンチュウ類、シストセンチュウ類、ジャガイモシストセンチュウ類、ネグサレセンチュウ類及びワセンチュウ類などの植物寄生センチュウの防除に有用である。幾つかの実施形態では、標的は、M. incognita（サツマイモネコブセンチュウ）、M. javanica（ジャワネコブセンチュウ）、M. hapla（キタネコブセンチュウ）、及びM. arenaria（ラッカセイネコブセンチュウ）などのネコブセンチュウである。幾つかの実施形態では、症状及び／又はセンチュウが少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少する。
[0027] 別の態様では、本明細書に記載する使用法、方法、ｓｗｒＡオルソログに突然変異を有する胞子形成細菌及び組成物が、未処理の植物、作物、果実、又は野菜と比較して、作物収量を約１０％〜約２０％、約１０％〜約３０％、約１０％〜約４０％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約６０％、又は約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、又は約９０％以上増加させる。さらに別の態様では、本明細書に記載する方法及び組成物が、未処理の植物、作物、果実、又は野菜と比較して、作物収量を約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％増加させる。
[0028] 本発明の組成物を使用して処理することができる代表的な植物には、以下の単子葉植物及び双子葉植物、すなわち球根野菜、穀物（小麦、大麦、米など）、トウモロコシ（メイズ）、柑橘類果実（グレープフルーツ、レモン、及びオレンジなど）、綿及び他の繊維作物、ウリ科、果菜類、葉菜類（セロリ、タマチシャ、チリメンチシャ、及びホウレンソウ）、豆果（大豆、サヤインゲン、ヒヨコマメ、レンズマメ）、脂肪種子穀物、落花生、梨状果（リンゴ及びナシなど）、石果（アーモンド、ペカン、及びクルミなど）、根菜、塊茎菜、球茎菜、タバコ、イチゴ及び他の液果、アブラナ属（ブロッコリ、キャベツなど）、ブドウ、バイオマス生産に使用される植物（ススキ、竹など）、パイナップル、及び顕花植物、花壇用花卉、及び観賞植物（シダ及びギボウシなど）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、バナナ及びコーヒーなどのプランテーション作物、及び森林、公園又は造園に存在する植物などの多年生植物の処理にも使用される。
[0029] 種子処理に使用される場合、本発明の組成物は、種子のサイズに応じて種子１個当たり約１×１０２ｃｆｕ〜約１×１０９ｃｆｕの割合で適用される。幾つかの実施形態では、施用量は種子１個当たり１×１０３ｃｆｕ〜約１×１０７ｃｆｕである。
[0030] 土壌処理に使用される場合、本発明の組成物及び胞子形成細菌細胞は、土壌表面灌注、シャンクイン（ｓｈａｎｋｅｄ−ｉｎ）、注入及び／又は畝間への注入として、又は灌漑用水との混合によって適用することができる。土壌灌注処理は植え付け時、種まき中又は種まき後、又は移植後及び植物が成長する任意の段階で適用することができ、その施用量は１エーカー当たり約４×１０１１ｃｆｕ〜約８×１０１２ｃｆｕである。幾つかの実施形態では、施用量は１エーカー当たり約１×１０１２ｃｆｕ〜約６×１０１２ｃｆｕである。植え付け時に適用される畝間処理の施用量は、１列１０００フィート当たり約２．５×１０１０ｃｆｕ〜約５×１０１１ｃｆｕである。幾つかの実施形態では、施用量は１列１０００フィート当たり約６×１０１０ｃｆｕ〜約４×１０１１ｃｆｕである。散布処理（施用量は低くなるが、頻度が高くなる）及び他のそれほど一般的ではない土壌処理に対する割合の調整方法は、当業者には理解される。
[0031] 本発明の組成物及び胞子形成細菌細胞は、他の化学的及び非化学的添加剤、補助剤及び／又は処理剤と混合することができ、このような処理剤には、化学的及び非化学的殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺センチュウ剤、肥料、栄養剤、ミネラル、オーキシン、成長刺激剤などが含まれるが、これらに限定されない。
[0032] 本発明は、様々な細胞型の混合物から分離されたサンドペーパー細胞の実質的に純粋な培養物及び／又は生物学的に純粋な培養物を提供する。例えば、本発明は、様々な細胞型の混合物が受託番号NRRL B21661として寄託されたＱＳＴ７１３であり、このような実質的に純粋な培養物及び／又は生物学的に純粋な培養物を提供する。本発明は、それぞれ受託番号NRRL B-50421及びNRRL B-50455として寄託されたB. subtilis株ＡＱ３０００２（別名ＱＳＴ３０００２）又はＡＱ３０００４（別名ＱＳＴ３０００４）の実質的に純粋な培養物及び／又は生物学的に純粋な培養物を提供する。
[0033] 本発明は、それぞれ受託番号NRRL B-50421及びNRRL B-50455として寄託されたB. subtilis株ＡＱ３０００２（別名ＱＳＴ３０００２）又はＡＱ３０００４（別名ＱＳＴ３０００４）の生理学的及び形態学的特徴をすべて有するB. subtilis株の実質的に純粋な培養物及び／又は生物学的に純粋な培養物を提供する。
[0034] 本発明は、本発明の培養物のいずれかの実質的に純粋な培養物及び／又は生物学的に純粋な培養物の後代も提供し、ここで培養物は、それぞれ受託番号NRRL B-50421及びNRRL B-50455として寄託されたB. subtilis株ＡＱ３０００２（別名ＱＳＴ３０００２）又はＡＱ３０００４（別名ＱＳＴ３０００４）の生理学的及び形態学的特徴のすべてを有する。
[0035] 本発明は、本発明のｓｗｒＡ−細胞のうち１つ又は複数の実質的に純粋な培養物及び／又は生物学的に純粋な培養物を含む組成物も提供する。
[0036]栄養寒天プレート上で増殖させたＱＳＴ７１３野生型及びＱＳＴ７１３サンドペーパー変異体のコロニー形態の比較を示す。野生型コロニーとは対照的に、サンドペーパー変異体のコロニー形態は高度にコンパクトで高度に疎水性である。 [0037]液体培地での指数増殖期中のＡＱ３０００２のｓｗｒＡ−及びＱＳＴ７１３野生型のｓｗｒＡ＋細胞の画像を示す。 [0038]剪断力を受けた液体培地中のＡＱ３０００２のｓｗｒＡ−（「３０００２」）及びＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋細胞（「７１３」）の画像を示す。上図はピペット先端を培地に挿入していない細胞増殖を４０ｘの倍率で示し、下図はピペット先端を培地に挿入した細胞増殖を１０ｘの倍率で示す。 [0039]SERENADE（登録商標）ASOの代表的な市販バッチでのサンドペーパーコロニーの定量化を示す。 [0040]予測されるｓｗｒＡの転写産物を含む様々なｓｗｒＡゲノムＤＮＡの配列を示す。Bsub_168＝B. subtilis株１６８、Bsub_3610＝B. subtilis株３６１０、ＱＳＴ７１３＝ＱＳＴ７１３野生型、ＡＱ３０００２及びＡＱ３０００４＝本発明の代表的な株、Bamy_FZB42＝B. amyloliquefacients株ＦＺＢ４２、Bpum_SAFR-032＝B. pumilus株SAFR-032、及びBlic_14580＝B. licheniformis株14580. [0041]予測されるｓｗｒＡの転写産物を含む様々なｓｗｒＡゲノムＤＮＡの配列を示す。略語は図５Ａと同じ意味を有し、Batr_1942＝B. atrophaeus株１９４２及びBpum_2808＝B. pumilus株２８０８である。 [0042]予測されたｓｗｒＡの転写産物から得られたその様々なｓｗｒＡタンパク質の配列を示す。略語は図５Ａ及び図５Ｂと同じ意味を有し、Bpum_7061＝B. pumilus 7061である。 [0043]Bacillus subtilisクレード中の種（すなわちB. subtilis及び16S rDNAの比較によって評価されたすべての近縁種）の系統樹で、関係が遠い方の種が樹の根に含まれる。完全なゲノム配列が使用可能である種にはアステリスクの印がある。１つのアステリスク（「＊」）はさらに、その種にｓｗｒＡのオルソログがないことを示し、二重アステリスク（「＊＊」）の印がある種はｓｗｒＡオルソログを含む。B. subtilisクレード中で印がない他の種は、系統学的に近い関係に基づいてｓｗｒＡオルソログを有すると推定されるが、これらの種のゲノム配列データは現在、公的には入手不可能である。 [0044]ＱＳＴ７１３ｓｗｒＡ＋（「ＱＳＴ７１３」）、ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）及びこれらの株に基づく様々な構成の０．７％ＬＢ寒天遊走アッセイプレートの画像を示す。 [0045]ＱＳＴ７１３ｓｗｒＡ＋（「ＱＳＴ７１３」）、ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）及びこれらの株に基づく様々な構成の根コロニー形成の平均レーティングを示し、ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−細胞の野生型ｓｗｒＡで相補すると根コロニー形成の能力が低下することを実際に示している。 [0046]AQ30002_endoPro_swrA_ICE（相補した株）とＱＳＴ７１３ｓｗｒＡ＋（「ＱＳＴ７１３」）との生物膜の類似性、及びAQ30002_pPen_swrA_ICE（部分相補）とＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）との類似性を示すディジタル光学顕微鏡で捕捉した根生物膜画像を示す。 [0047]ポークストック（ｐoｒｋ−ｓｔoｃｋ）培養液中のＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−サンドペーパー型それぞれの２つの複製の３０℃での増殖の結果を表す。 [0048]ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋（「７１３ｗｔ」）及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）培養物それぞれの２つの複製の細胞薄膜頑強性アッセイの結果を表す。 [0049]Bacillus subtilis ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）及びＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋（「ＱＳＴ７１３ｗｔ」）での根コロニー形成の画像を示す。 [0050]Bacillus sublitis ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋（「ＱＳＴ７１３」）及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）の生物膜コーティング根表面の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。 [0051]水、Bacillus subtilis ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋（「ＱＳＴ７１３」）及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「３０００２」）で処理した根の薄い切片及び厚い切片の光学顕微鏡画像を示す。 [0052]ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）、ＱＳＴ７１３（「ＱＳＴ７１３」、SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物である。例えば、実施例３及び図４参照）、又は他のバチルス株で処理したトウモロコシ中の植物成長促進を測定する温室試験の結果を表す。実験生成物に使用するＣＦＵ当量比で６４オンス／エーカーに正規化した施用量で種子処理して２週間後のトウモロコシ苗木を示す。 [0053]ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）、ＱＳＴ７１３（「ＱＳＴ７１３」、SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物である。例えば、実施例３及び図４参照）、又は他のバチルス株で処理した小麦中の植物成長促進を測定する温室試験の結果を表す。実験生成物に使用するＣＦＵ当量比で６４オンス／エーカーに正規化した施用量で、種子灌注で構成された種子処理の２週間後の小麦苗を示す。 [0054]ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）、ＱＳＴ７１３（「ＱＳＴ７１３」、SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物である。例えば、実施例３及び図４参照）、又は大豆系培地を使用して生成した他のバチルス株で処理したトマト中の植物成長促進を測定する温室試験の結果を表す。実験生成物に使用するＣＦＵ当量比で６４オンス／エーカーに正規化した施用量で、種子灌注で構成された種子処理の２週間後のトマト苗木を示す。 [0055]ＡＱ３０００２（「ＡＱ３０００２」）、ＱＳＴ７１３（「ＱＳＴ７１３」、SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物である。例えば、実施例３及び図４参照）、又は大豆系培地を使用して生育した他のバチルス株で処理したトウモロコシの根及び苗条の乾燥重量を測定する温室試験の結果を表す。 [0056]ＡＱ３０００２（「ＡＱ３０００２」）、ＱＳＴ７１３（「ＱＳＴ７１３」、SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物である。例えば、実施例３及び図４参照）、又は大豆系培地を使用して生育した他のバチルス株で処理した小麦の根及び苗条の乾燥重量を測定する温室試験の結果を表す。 [0057]ＡＱ３０００２（「ＡＱ３０００２」）、ＱＳＴ７１３（「ＱＳＴ７１３」、SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物である。例えば、実施例３及び図４参照）、又は大豆系培地を使用して生育した他のバチルス株で処理したトマトの根及び苗条の乾燥重量を測定する温室試験の結果を表す。 [0058]Bacillus subtilis株ＱＳＴ７１３（SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物、例えば、実施例３及び図４参照）（「ＱＳＴ７１３」）又はＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）のみで、又は植物成長刺激剤（ＰＧＳ）との組合せで処理した植物からの処理トマトの収量を測定する現地調査の結果を表す。株は大豆系培地を使用して生育した。試験はカリフォルニア州エスカロンで実施した。「Ｅｘｐ」のラベルがある処理物は代替実験条件を表す。同じ文字の測定値は分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してＰ＝０．０５で統計的に差がない。 [0059]Bacillus subtilis株ＱＳＴ７１３（SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物、例えば、実施例３及び図４参照）（「ＱＳＴ７１３」）又はＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）のみで、又は植物成長刺激剤（ＰＧＳ）との組合せで処理したトウモロコシ苗木を測定する現地調査の倒伏率（トウモロコシの実より下の茎の破損）を表す。株は大豆系培地を使用して生育した。試験はミネソタ州ペインズヴィルで実施した。「Ｅｘｐ」のラベルがある処理物は代替実験条件を表す。同じ文字の測定値は分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してＰ＝０．１０で統計的に差がない。 [0060]植え込み時に畝間に、ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＱＲＤ１５４」）及び細菌接種剤で処理した植物からの大豆の根の画像を示す。 [0061]未処理植物からの大豆の根の画像を示す。 [0062]Bacillus subtilis株ＱＳＴ７１３（SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物、例えば、実施例３及び図４参照）（「ＱＳＴ７１３」）又はＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）のみで、又は植物成長刺激剤（ＰＧＳ）との組合せによるPythiumからのトウモロコシ茎の腐敗の防除を測定する現地調査の結果を表す。試験はミネソタ州ペインズヴィルで実施した。「Ｅｘｐ」のラベルがある処理物は代替実験条件を表す。同じ文字の測定値は分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してＰ＝０．０５で統計的に差がない。 [0063]Pythium ultimum（フハイカビ）及びRhizoctonia solaniによって引き起こされる立ち枯れ病に対するＱＳＴ７１３（SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物、例えば、実施例３及び図４参照）（「ＱＳＴ７１３」）とＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）の活性を比較する温室試験の結果を表す。各棒は４回の測定の平均値を表し、誤差棒は標準偏差を示す。 [0064]温室アッセイで８日間の期間にわたってPhytophthora capsiciによって引き起こされるトウガラシの萎凋病に対するＱＳＴ７１３（SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物、例えば、実施例３及び図４参照）（「ＱＳＴ７１３」）とＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）の活性を示す時間経過を提供する。非感染対照標準（「ＵＩＣ」）と化学的殺菌剤との曲線が重なっていることに留意されたい。 [0065]ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）及びＱＳＴ７１３（SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物、例えば、実施例３及び図４参照）（「ＱＳＴ７１３」）の用量を増加させながら処理したトマト苗木を示す。 [0066]ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）及びＱＳＴ７１３（SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物、例えば、実施例３及び図４参照）（「ＱＳＴ７１３」）の用量を増加させながら処理したトマト苗木の個々の葉の比較である。 [0067]ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）及びＱＳＴ７１３（SERENADE（登録商標）製品に見られるような割合の野生型ｓｗｒＡ＋とサンドペーパーｓｗｒＡ−細胞の混合物、例えば、実施例３及び図４参照）（「ＱＳＴ７１３」）の用量を増加させながら処理したトマト苗木の葉緑素含有量を表す。 [0068]３６１０ＷＴ及び３６１０ｓｗｒＡ−（グラフでは３６１０ｓｗｒＡと表記）で処理した植物の（複製５つの）葉の平均表面積を表す。 [0069]６１０ＷＴ及び３６１０ｓｗｒＡ−（図では３６１０ｓｗｒＡと表示）で処理した植物の葉緑素測定値を表す。結果はランダムに選択したトマトの実生苗５本で最初の本葉の葉緑素レベルの平均値である。 [0070]トウガラシのPhytophtora capsiciに対する６１０ＷＴ及び３６１０ｓｗｒＡ−（グラフでは３６１０ｓｗｒＡと表記）の活性を表す。 [0071]ネコブセンチュウに感染した根のえい瘤形成に対するＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）全ブロス処理の効果を示す。 [0072]ネコブセンチュウに感染した実生苗に対する様々な割合でのＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）での処理の効果を示す。特に、結果は根のえい瘤形成の程度、及びセンチュウの侵入及び発育に対する効果を示す。 [0073]未処理の植物（図ではＵＴＣと表記）と比較して様々なバッチのＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−（「ＡＱ３０００２」）で処理した植物１本当たりのネコブセンチュウの卵を表す。
[0074] 本明細書のすべての出版物、特許及び特許出願は、いかなる図面及び付録も含めて、個々の各出版物又は特許出願が明確かつ個々に参照により組み込むものとすると表示されているのと同じ程度に、参照により組み込むものとする。
[0075] 以下の説明は、本発明の理解に有用となり得る情報を含む。本明細書で提供される情報が先行技術である、又は現在請求されている発明に関連している、又は明確かつ明示的に参照されている出版物のいずれも先行技術であるということは認められない。
[0076] SERENADE（登録商標）製品（米国環境保護局登録番号６９５９２−１２）は、Bacillus subtilisの特許を取得した独特の株（株ＱＳＴ７１３）、及び相乗的に作用して病害の病原菌を破壊し、優れた抗菌活性を提供する多くの異なるリポペプチドを含む。SERENADE（登録商標）製品は、火傷病、ボトリチス、酸敗、サビ病、菌核病、ウドンコ病、細菌性斑点症及び白カビなどの病害に対して野菜、果実、堅果及びつる作物などの植物を保護するために使用される。SERENADE（登録商標）製品は、葉及び／又は土壌処理として適用することができる液体又は乾燥製剤として入手可能である。SERENADE（登録商標）ASO、SERENADE（登録商標）MAX、及びSERENADE（登録商標）SOILを含むSERENADE（登録商標）製品の米国環境保護局マスターラベルのコピーは、National Pesticide Information Retrieval System（ＮＰＩＲＳ（登録商標））のUSEPA/OPP Pesticide Product Label System （ＰＰＬＳ）を通じて公的に入手可能である。
[0077] SERENADE（登録商標）ASO（水性懸濁液−有機物）は、活性成分として１．３４％の乾燥ＱＳＴ７１３、及び９８．６６％の他の成分を含む。SERENADE（登録商標）ASOは最少で１×１０９ｃｆｕ／ｇのＱＳＴ７１３を含むように配合され、ＱＳＴ７１３の最大量は３．３×１０１０ｃｆｕ／ｇになるように決定されている。SERENADE（登録商標）ASOの代替的な商品名には、SERENADE（登録商標）BIOFUNGICIDE、SERENADE（登録商標）SOIL及びSERENADE（登録商標）GARDEN DISEASEがある。さらなる情報については、２０１０年１月４日付のSERENADE（登録商標）ASO、及びSERENADE（登録商標）SOILの米国ＥＰＡマスターラベルを参照されたい。これはそれぞれ、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
[0078] SERENADE（登録商標）MAXは、活性成分として１４．６％の乾燥ＱＳＴ７１３、及び８５．４％の他の成分を含む。SERENADE（登録商標）MAXは、最少で７．３×１０９ｃｆｕ／ｇのＱＳＴ７１３を含むように配合され、ＱＳＴ７１３の最大量は７．９×１０１０ｃｆｕ／ｇになるように決定されている。さらなる情報については、SERENADE（登録商標）MAXの米国ＥＰＡマスターラベルを参照されたい。これは参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
[0079] 野生型Bacillus subtilis ＱＳＴ７１３、その突然変異体、上清、及びそのリポペプチド代謝物、及び植物の病原体及び昆虫を防除するためのその使用方法が、米国特許第６，０６０，０５１号、第６，１０３，２２８号、第６，２９１，４２６号、第６，４１７，１６３号、及び第６，６３８，９１０号に詳細に記載され、これはその教示のすべてがそれぞれ参照により本明細書に明確かつ全体的に組み込むものとする。これらの米国特許では、株をＡＱ７１３と呼び、これはＱＳＴ７１３と同義である。Bacillus subtilis ＱＳＴ７１３は、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約により１９９７年５月７日に受託番号Ｂ２１６６１でＮＲＲＬに寄託されている。本明細書でＱＳＴ７１３に言及した場合、それはＮＲＲＬ受託番号Ｂ２１６６１で寄託されたか、SERENADE（登録商標）製品の生成をシミュレートした条件にてバイオリアクタ内で調製されたSERENADE（登録商標）製品中に存在する状態のBacillus subtilis ＱＳＴ７１３（別名ＡＱ７１３）を指す。
[0080] 以上の特許に対応する米国特許出願第０９／０７４，８７０号を１９９８年に出願したときに、その株は古典的な生理学的、生化学的及び形態学的方法に基づいてBacillus subtilisと称された。それ以来、バチルス種の分類法は、特に遺伝学及び配列テクノロジーの進歩に鑑みて発展し、したがって種の名称は１９９８年に使用された方法ではなく、主にＤＮＡ配列に基づいている。B. amyloliquefaciens FZB42、B. subtilis 168及びＱＳＴ７１３からタンパク質配列を並べた後、B. amyloliquefaciens FZB42に見られるタンパク質の約９５％がＱＳＴ７１３に見られるタンパク質に対して８５％以上の同一性を有する一方、B. subtilis 168のタンパク質は３５％しかＱＳＴ７１３のタンパク質に対して８５％以上の同一性がない。しかし、遺伝学に対する依存度が高まっても、関連する科学文献及び法律文書にはまだ分類法の曖昧さががあり、この１５年間にわたるバチルス分類法の理解が発展したことを反映している。例えば、B. subtilis株FZB24に基づく農薬製品は、ＦＺＢ４２のようにＱＳＴ７１３と近い関係にあるが、米国ＥＰＡの文書ではB. subtilisの変種amyloliquefaciensに分類されている。これらの名称の複雑性により、この特定のバチルス種は、文書によってB. subtilis、B. amyloliquefaciens、及びB. subtilis変種amyloliquefaciensと様々に称されている。したがって、専ら配列の比較及び推論される分類法に基づいて現在予想されるように、B. amyloliquefaciensと変更するのではなく、ＱＳＴ７１３というB. subtilisの名称を使用し続けている。
[0081] 本明細書でさらに詳細に説明するように、本発明の結果、ＱＳＴ７１３の培養物は実際、野生型細胞と、比較的小さいパーセンテージの「サンドペーパー細胞」と出願者らが称した変異細胞型との混合物であることが分かる。したがって、本発明に基づき、SERENADE（登録商標）製品中に見られる、又はバイオリアクタ中で増殖したＱＳＴ７１３細胞中に見られるようなＱＳＴ７１３は、SERENADE（登録商標）製品（例えば、図４参照）に見られるのと同じ又は同様の比率の野生型細胞とサンドペーパー細胞との混合集団で構成されていることが分かる。本明細書で詳細に説明するように、図１に示すように、コロニーの形態に基づいてこの変異体を「サンドペーパー」細胞と呼ぶ。サンドペーパー細胞は、栄養寒天上に、形態学的及び生理学的に非常にコンパクトに見え、疎水性で平坦で乾燥し、非常に「クリスピー」であって、寒天から取り出すことが非常に困難であるコロニーを形成する。細胞接着は、定性的に観察するか、上記のStanleyらに記載されたクリスタルバイオレット染色によって測定することができる。栄養寒天上のこのような顕著なコロニー形態に加えて、サンドペーパー細胞は、図１２、図１３及び図１４の３０００２で処理した根の画像に示すように、根などの表面に密集してコンパクトな生物膜（又はより頑強な生物膜）を形成する。一実施形態では、サンドペーパー細胞は実施例８で説明する通りに試験できるように、細胞薄膜の頑強性が向上している。別の実施形態では、サンドペーパー細胞は、図２に示すように初期対数期中に液体培養中に多少の単細胞及び比較的短い鎖に加えて長鎖を形成するが、液体培養中に凝集せず、生物膜も形成しない。さらに別の実施形態では、サンドペーパー細胞は液体培養中でも剪断力に応答して、生物膜の形成から開始して生物膜発生の増進を示す。さらに別の実施形態では、サンドペーパー細胞は、実施例９で述べ、図１４の３０００２コロニー形成した根の画像で示すように、追加の細胞外被を有する。一実施形態では、観察は、ｓｗｒＡ遺伝子の野生型である同質遺伝子細胞との比較に基づく。別の実施形態では、観察は、遺伝子の野生型である同じ種、又は生物膜形成を必要とするそのオルソログ、すなわちｓｆｐ、ｓｗｒＡ、ｅｐｓＣ及びｄｅｇＱの細胞との比較に基づく。本明細書で使用する「同質遺伝子」という用語は、同じ遺伝子型を有する任意の２つの細胞又は個体（例えば、株）を指す。本発明に基づき、SERENADE（登録商標）製品（例えば、実施例１、図１及び図２参照）中に見られる、又はバイオリアクタ中で増殖したＱＳＴ７１３細胞中に見られるようなＱＳＴ７１３は、SERENADE（登録商標）に見られるのと同じ又は同様の比率の野生型細胞とサンドペーパー細胞との混合集団で構成されていることがこれで分かる（例えば、実施例３及び図４参照）。
[0082] 遊走運動とは、細菌が固体表面上で迅速かつ集団で移動できるようにする活性メカニズムである（J. Henrichsen、「Bacterial Surface Translocation: A Survey and a Classification」（Bacteriol. Rev. (1972) 36:478-503））。バチルスの遊走能力には、幾つかの異なる遺伝子及びオペロンが関連づけられている。Kearns他（「Genes Governing Swarming in Bacillus subtilis and Evidence for a Phase Variation Mechanism Controlling Surface Motility」（Molecular Microbiology (2004) 52(2):357-369））は、B. subtilisのラボラトリの株１６８及び関連するラボラトリの株ＰＹ７９がそれぞれ、遺伝子に彼らがｓｗｒＡと称した遊走運動の障害につながるフレームシフト突然変異を有することを発見した。科学文献におけるｓｗｒＡの代替名にはｙｖｚｄ及びｓｗｒＡＡがある。これら２つのラボラトリ株のｓｗｒＡ突然変異（すなわちｓｗｒＡ−）は、Ａ：Ｔ塩基対がヌクレオチド３４にて８個のＡ：Ｔ塩基対のホモポリマー範囲に挿入されている（ｓｗｒＡヌクレオチド配列の番号付けはすべて、図５の番号付けによる）。この挿入は、フレームシフト突然変異及び切断されたタンパク質を引き起こすことにより、遺伝子の機能を破壊すると予想される。非domestic株３６１０及び遊走能力を取り戻した株で、野生型（機能的、すなわちｓｗｒＡ＋）配列（すなわち挿入がない）が認められた。出願人は、実施例５で詳細に検討するように、ＱＳＴ７１３のサンドペーパー細胞はｓｗｒＡ遺伝子に突然変異を有することを確証した。これらのｓｗｒＡ−細胞が遊走能力を損なっていた。驚くことに、植物又は土壌に適用すると、これらは植物の健康を増進する。
[0083] 他の遺伝子のｓｆｐ、ｅｐｓＣ、ｓｗｒＡ、ｄｅｇＱ及びｒａｐＰと呼ばれるプラスミド遺伝子も、生物膜の形成に関与する。McLoon, A.他の、「Tracing the Domestication of a Biofilm-Forming Bacterium」（Journal of Bacteriology, Apr. 2011 2027-2034）を参照されたい。「１６８」と称されたdomesticのBacillus subtilis株は、平滑な薄いコロニーを有する欠陥的生物膜を形成し、遊走する能力を持たない。細胞株を説明するために本明細書で使用する「domestic」という用語は、ラボラトリ研究に適した株になる特性、例えば、遺伝物質を導入し組み込む高い適格性、栄養要求性、遊走又は細胞薄膜形成をしないことなどのために選択された誘導された突然変異株を指す。対照的に、細菌株を説明するために本明細書で使用する「野生」という用語は、自然から分離され、容易にラボラトリで操作するようには積極的に選択されていない株を指す。McLoonの論文は、株１６８の生物膜形成及び遊走能力を修復するために実施した実験について述べている。最初にｓｆｐ突然変異を、次にｅｐｓＣ突然変異、次にｓｗｒＡ突然変異、そして次にｄｅｇＱ突然変異を修復した。各ステップで生物膜形成を漸進的に回復させ、３６１０と称された野生型Bacillus subtilis株の生物膜形成とほぼ同等にした。最後に、プラスミド上のｒａｐＰ遺伝子を、それ以外は完全に修復した株に挿入し、その結果、３６１０と識別不可能な生物膜形成となった。McLoon他は、２０３２ページで「ｓｆｐ、ｅｐｓＣ及びｓｗｒＡの野生型対立遺伝子を保有する株は、ｓｗｒＡが突然変異である対応する株より生物膜形成が頑強であり、したがってｓｗｒＡが頑強な生物膜形成にも寄与しているとの結論に達した」と述べている。驚くことに、本発明によれば、McLoonの発見とは対照的に、ｓｗｒＡ機能がない株は、野生型ｓｗｒＡを有する親株よりも頑強な生物膜を形成する。McLoon他は、唯一の突然変異の生物膜形成遺伝子がｓｗｒＡである細胞については述べていない。したがって本明細書で述べている生物膜が強化された表現型については述べていない。
[0084] 「野生型」とは、自然界で発生する状態で、及び／又は「野生型」と称されている既知の分離形態で発生する状態で、種の典型的形態の表現型を指す。本明細書で認識される「野生型(wild type)」の同義語には、「野生型(wildtype)」、「野生型(wild-type)」、「＋」及び「ｗｔ」がある。野生型は通常、非標準の「突然変異」又は「変異」対立遺伝子による生成物とは対照的に、１つ又は複数の座にある特定の遺伝子の標準的「正常」対立遺伝子の生成物と概念化される。概して、及び本明細書で使用されるように、特定のバチルス株又は分離株の最も優勢な対立遺伝子（すなわち遺伝子頻度が最も高い対立遺伝子）が野生型とされる。本明細書では「ＱＳＴ７１３野生型」又は「ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋」及びその同義語（例えば、「ＱＳＴ７１３ ｓｗｒＡ＋」、「ＱＳＴ野生型」、「ＱＳＴ７１３ｗｔ」など）は、コード化されたｓｗｒＡタンパク質を発現することができる機能的ｓｗｒＡ遺伝子（すなわちｓｗｒＡ＋）があるB. subtilis ＱＳＴ７１３を指す。したがって、これらの用語は１００％がｓｗｒＡ＋であるクローンの野生型ＱＳＴ７１３細胞を指す。野生型ＱＳ７７１３は、文献で生物膜形成に関係すると識別されている他の遺伝子、すなわちｅｐｓＣ、ｄｅｇＱ及びｓｆｐの野生型でもある（すなわち機能的コピーを有する）。配列番号１１は、野生型ＱＳＴ７１３のｓｆｐ遺伝子のヌクレオチド配列である。配列番号１２は、野生型ＱＳＴ７１３のｅｐｓＣ遺伝子のヌクレオチド配列である。配列番号１３は、野生型ＱＳＴ７１３のｄｅｇＱ遺伝子のヌクレオチド配列である。
[0085] 本明細書に記載する微生物及び特定の株は、他に明記しない限り、すべて自然から切り離され、本明細書に記載する人工的状態で、例えば培養中で、又は発酵などの拡大した製造プロセスにより増殖する。
[0086] 本出願で提供される配列のリストは、図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃにも示すように様々なバチルス種及び株の配列を提供する。以下の表１は配列番号を株と関連づける。すべての配列はヌクレオチド配列であるが、ただし配列番号２はアミノ酸配列である。
[0087] 本発明は、ｓｗｒＡ遺伝子を有する胞子形成細菌と、さらに特段には、コード化ｓｗｒＡタンパク質を発現できない及び／又は機能的ｓｗｒＡタンパク質をコード化できない非機能的ｓｗｒＡ遺伝子をもたらす１つ又は複数の突然変異をｓｗｒＡ遺伝子に有するこのような細菌の変異体に関し、このような突然変異及びこのような突然変異を有する変異遺体を本明細書ではｓｗｒＡ−と呼ぶ。本発明は、ｓｗｒＡ活性がｓｗｒＡ遺伝子の突然変異以外の手段によって低下している胞子形成細菌も含み、その手段とは、例えば、他の点におけるｓｗｒＡ遺伝子の転写の活性、ｓｗｒＡ遺伝子の転写、翻訳後メッセージプロセシング、ｓｗｒＡ ｍＲＮＡの翻訳、および翻訳後タンパク質プロセシングの進行によって、実際のタンパク質活性へと活性化を阻害することである。本開示では、小分子、薬物、化学物質、化合物、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｗｒＡ阻害抗体、ｓｗｒＡ阻害ペプチド、負の優性突然変異、アプタマ又は鏡像アプタマなど、ｓｗｒＡ活性を阻害することができる任意の作用物質又はシステムが想定される。ｓｗｒＡ遺伝子の突然変異以外の手段によってｓｗｒＡ活性が低下している細胞もｓｗｒＡ−と呼ぶ。本発明のｓｗｒＡ−細胞は、野生型ｓｗｒＡ遺伝子がある細胞と比較して、遊走能力が減退し、植物の健康を改良する能力を増進している。幾つかの実施形態では、ｓｗｒＡ−細胞は遊走能力をすべて、又は実質的にすべて喪失している。幾つかの実施形態では、遊走能力は、ｓｗｒＡオルソログに突然変異を有していない同質遺伝子系統の細菌細胞の遊走能力と比較して低下している。幾つかの実施形態では、遊走能力は少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％低下している。遊走能力は、実施例７で説明する方法によって求め、中心に接種した「遊走寒天」プレート上で増殖した細菌の直径を測定することにより、定量的に比較することができる。図７参照。
[0088] 他の実施形態では、以上の特徴を有することに加えて、ｓｗｒＡ−細胞は野生型ｓｗｒＡ遺伝子を有する細胞と比較して、以下の特徴のうち１つ又は複数を有する。すなわち、上述したようなサンドペーパー細胞又はコロニーの形態、根などの表面上に密集してコンパクトな付着性生物膜をすること、及び液体培養の早期対数期中に凝集又は生物膜形成しない細胞の幾つかの長鎖を形成することであり、これは生物膜形成において環境信号に応答する（すなわち固体表面に曝露する）能力を実証している。ｓｗｒＡ−細胞は根などの表面に密集してコンパクトな生物膜を形成し、根などの非液体表面への付着が向上しており、これを本明細書では「より頑強な生物膜」と呼ぶ。一態様では、非液体表面は固体表面であり、他の態様では半固体表面である。根への相対的付着性は、実施例９で説明するように、根が寒天中で成長し、寒天から取り出されて、光学顕微鏡で見た場合に、生物膜の破壊がないことによって分析することができる。別の実施形態では、より頑強な生物膜は、追加の細胞外被及び／又は透過電子顕微鏡で見た場合に大きく白い（電子透過性の）領域を有する細胞を含む。図１４の３０００２の画像を参照されたい。この実施形態の一態様では、より頑強な生物膜の細胞の平均直径は、ｓｗｒＡ突然変異を有していない細胞の平均直径より少なくとも約１．５倍大きい、又は少なくとも約２倍大きい。図１４の３０００２の画像を参照されたい。幾つかの実施形態では、根などの非液体表面上に形成される生物膜の細胞形態は、実施例９に説明する方法で分析される。さらに別の実施形態では、ｓｗｒＡ−細胞は、液体培養中で剪断力に曝露すると、生物膜の発達が増進していることもある。このような剪断力については実施例１で説明する。ｓｗｒＡ−細菌細胞の特徴と比較する際に対照標準細胞として使用する適切な細菌細胞は様々でよい。例えば、一実施形態では、上記の特性の比較は、突然変異を有する細菌細胞と、突然変異を有していない同質遺伝子系統の細菌細胞との間で実行する。別の実施形態では、比較は、突然変異を有する細菌細胞と、突然変異を有さず、生物膜形成遺伝子ｓｆｐ、ｅｐｓＣ及びｄｅｇＱの野生型対立遺伝子も含む同じ種の細菌細胞との間で実行する。
[0089] 幾つかの実施形態では、これらのｓｗｒＡ−胞子形成細菌はバチルス科である。さらに他の実施形態では、これらはバチルス属である。このような実施形態では、ｓｗｒＡ突然変異を有する胞子形成細菌細胞又はバチルスは、（ｉ）以下で規定するように、Bacillus subtilisクレード内に入る、（ｉｉ）ｓｗｒＡオルソログに１つ又は複数の突然変異を有する、及び（ｉｉｉ）遊走能力が減退され、植物の健康増進能力、及び任意選択で以上の段落で説明した他の特徴のうち１つ又は複数を増進することができる。本明細書で使用する「Bacillus subtilisクレード」という用語は、図６で部分的に説明され、完全に配列が決定されて、ｓｗｒＡオルソログを有する可能性が高いと判断された種、及びゲノム配列データが現在入手できないが、系統学的関係が近いことに基づいてｓｗｒＡオルソログを有すると推定される種を含む。さらに、「Bacillus subtilisクレード」という用語は、本明細書で識別されず、相互最適ＢＬＡＳＴヒット法などの当業者に周知の分析によって、ｓｗｒＡオルソログを含むバチルス種を含む。
[0090] 相同配列は、種分化事象によって切り離された場合にオルソロガスとなる。すなわち、種が２つの別個の種に分岐する場合、その結果となる種のうち１つの遺伝子の分岐コピーはオルソロガスであると言われる。オルソログは、相互に類似している別の種の遺伝子である。というのは、最後の共通する祖先の１つの遺伝子からの垂直子孫に由来するからである。２つの類似した遺伝子がオルソロガスであることの最強の証拠は、遺伝子系統の系統学的分析の結果である。１つのクレード内に見られる遺伝子はオルソログであり、共通の祖先の子孫である遺伝子のオルソロガス群を含む。オルソログは同じ機能を有することが多いが、常に有するわけではない。相互最適ＢＬＡＳＴヒット法は、オルソログ対の可能性が高いものを識別するために最も頻繁に使用される方策である。この方法は、２つの種からの２つの類似したタンパク質が相互のプロテオム中に最適ＢＬＡＳＴヒットを相互に生成する場合、それらがオルソログ対であると仮定する。Rivera, M.C.他の、「Genomic Evidence for Two Functionally Distinct Gene Classes」（Proc. Natl. Acad. Sci. USA(95): 6239-44 (1998年5月)）を参照されたい。例えば、出願人の異種間ｓｗｒＡ対分析は、２つの種、すなわちB. amyloliquefaciensとB. pumilusとの間のｓｗｒＡタンパク質の全体的相同率が７０％と低くても、B. subtilis、B. amyloliquefaciens、B. licheniformis、B. atrophaeus及びB. pumilus中のｓｗｒＡが相互最適ＢＬＡＳＴヒットを生成することを明らかにした。
[0091] 一実施形態では、Bacillus subtilisクレードの種は、B. pumilus、B. atrophaeus、B. amyloliquefaciens、B. subtilis及びB. licheniformis、B. aerophilus、B. stratosphericus、B. safensis、B. altitudinus、B. vallismortis、B. halotolerans、B. mojavensis、B. sonorensis、B. aerius、及び（ｉｉ）ｓｗｒＡ遺伝子に１つ又は複数の突然変異があるBacillus subtilis ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋の変異体及び株を含むが、これらに限定されない。
[0092] 本発明のｓｗｒＡ突然変異は、野生型ｓｗｒＡ遺伝子の１つ又は複数の核酸塩基対の挿入、１つ又は複数の核酸塩基対の欠失、開始コドンの変化を含む１つ又は複数の核酸の変化、１つ又は複数のトランスポゾンの挿入、ノックダウン及び／又はノックアウトを含むが、これらに限定されない。当業者には、遺伝子がプロモータなどの調節領域、転写された領域及び他の機能的配列領域を含むことが理解される。
[0093] 胞子形成細菌の集団は、実施例２４で説明するように、自然に発生してｓｗｒＡオルソログに突然変異を有する細胞についてスクリーニングすることができる。あるいは、幾つかの遺伝子及び分子生物学の技術を用いて、転写及び翻訳レベルでのｓｗｒＡの発現を減少させて、遊走能力が低下して頑強な生物獏を形成するｓｗｒＡ−細胞を生成することができる。幾つかの実施形態では、このようなｓｗｒＡ−細胞は、上述した他の特性（多少連鎖形成するが凝集しない、又は液体培養中に生物膜を形成する、及び根生物膜中の細胞形態が変化する）のうち１つ又は複数を有することができる。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ及びリボザイムを工作して、細胞に導入し、ｓｗｒＡの、又はシグマＤ及びシグマＡなどの正の調節因子として作用する他の遺伝子の発現を減少させることができる。これらの転写因子は、ｓｗｒＡプロモータを認識して、それに直接結合することが知られている（Calvio他、「Autoregulation of swrAA and Motility in Bacillus subtilis」（Journal of Bacteriology (2008) 190:5720-5728)）。ｓｗｒＡの負の調節因子を活用して、ｓｗｒＡの発現を減少させることもできる。例えば、ＦｌｇＭ、すなわちシグマＤ特異的抗シグマ因子（Fredrick及びHelmann、「ＦｌｇＭはシグマＤ活性の主要調節因子であり、それが存在しないとｓｉｎＲ突然変異体の運動能が回復する」（Journal of Bacteriology (1996) 178:7010-7013)）を過剰発現させて、ｓｗｒＡの発現を減少させることができる。さらに１つの方策は、アンチモルフ突然変異又は負の優性突然変異を使用することである。ｓｗｒＡは二量体又は多量体として機能することがあるので（Dan Kearns、個人的情報、２０１１）、複数の突然変異及び野生型ｓｗｒＡ単位で構成されたヘテロマｓｗｒＡはもはや機能的でない。ｓｗｒＡの発現を減少させるために使用される遺伝子工学技術の例が、実施例２５に記載されている。
[0094] 本発明により使用した場合、「位置」という用語は、本明細書で描かれた核酸配列中のヌクレオチド、又はアミノ酸配列中のアミノ酸の位置を意味する。「対応する」という用語は、本明細書では位置が先行するヌクレオチド又はアミノ酸の数によって決定されることに限定されないことを示すために使用されている。例えば、欠失することができる本発明による任意のヌクレオチドの位置は、プロモータ及び／又は任意の他の調節配列又は遺伝子を含む５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）などにあるｓｗｒＡ遺伝子の他の場所でヌクレオチドの欠失又は追加があるので、変化することがある。したがって、本明細書で「対応する位置」又はヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の所与の位置に「対応する位置」と言う場合、それは、問題の配列が標準的方法により、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列又は配列番号２（例えば、基準配列）のアミノ酸配列と並んでいる場合、指示された位置に、又は時には配列番号１のヌクレオチド配列又は配列番号２のアミノ酸配列の部分に著しい同一性を呈する位置を指す。例えば、バチルスの様々な種は、ｓｗｒＡ遺伝子及び／又はｓｗｒＡタンパク質のヌクレオチド配列が類似している一方、基準配列に対する同一性はなく、特に、基準配列とは含まれるヌクレオチド又はアミノ酸が異なる、その数が少ない、又は多いことがある。例えば、配列番号１又は２に類似した問題の配列の範囲は、標準的なin silicoアラインメント技術により、確立されたソフトウェアを使用して、例えば、ClustalWを使用してパラメータを「標準」又は「事前設定」に設定し、容易に決定することができる。
[0095] 幾つかの実施形態では、変異体胞子形成細菌のｓｗｒＡ突然変異は、配列番号２で表されたタンパク質のうち以下の保存位置のうちの少なくとも１つに対応するアミノ酸変化を引き起こすヌクレオチドの位置で発生する。すなわち１位〜１７位、１９位〜２０位、２２位、２５位〜２９位、３１位〜３３位、３６位〜３９位、４１位〜４８位、５０位〜５１位、５３位、５６位、５８位、６０位、６１位、６４位〜６５位、６７位〜６９位、７１位〜８６位、８８位、９５位、９７位、９９位〜１１３位及び１１６位である。これらの保存位置は、図５Ｃに示す配列にアステリスクで明示されている。さらに他の実施形態では、突然変異は、タンパク質の以下の保存位置のうち少なくとも１つの変化に対応するアミノ酸変化を引き起こすヌクレオチド位置で発生する。すなわち位置１〜１７、位置７１〜８６及び位置９９〜１１３である。さらに、このような（ｓｗｒＡ突然変異となる）ヌクレオチドの変化は、細胞の遊走能力を減退させる、及び／又は野生型ｓｗｒＡ遺伝子を有する細胞と比較して植物の健康を促進する能力が向上するはずである。幾つかの実施形態では、このような突然変異の結果、上述したように野生型細胞と比較して以下の特徴も生じる。すなわちサンドペーパー細胞の形態、より頑強な根コロニー形成及び／又は液体培養中で凝集しない長鎖の形成である。
[0096] 他の実施形態では、ｓｗｒＡ突然変異は、配列番号１及び５〜１０のいずれか１つの１位〜１００位、１位〜５０位、１位〜４０位又は７位〜４０位に対応する位置で発生する。
[0097] 幾つかの実施形態では、ｓｗｒＡ−細胞は配列番号１のｓｗｒＡ遺伝子に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の相同率を有するｓｗｒＡ遺伝子を有する。特定の実施形態では、配列番号１に対して少なくとも約６０％〜約９５％の配列同一性を有するこのようなｓｗｒＡ−細菌の野生型は、配列番号２に対してオルソロガスであるｓｗｒＡタンパク質を有する。
[0098] 一実施形態では、微生物は配列番号１と規定されたｓｗｒＡ遺伝子の２６位〜３４位（８つのＡ：Ｔ塩基対のホモポリマー範囲）又は１位〜３位（開始コドン）のうち１つ又は複数の対応する位置に突然変異を有する。幾つかの場合、この突然変異は挿入又は欠失である。２６位〜３４位の位置への欠失の一例は、配列番号３に規定された突然変異ｓｗｒＡ遺伝子である。開始コドンが非開始コドンへと突然変異し、翻訳のための非機能的ｓｗｒＡ転写産物を生成する突然変異の一例が、配列番号４に規定されている。
[0099] 別の実施形態では、ｓｗｒＡ−細胞は、同じバチルス種のｓｗｒＡ野生型遺伝子に対して、及び幾つかの実施形態では同じ株のｓｗｒＡ野生型遺伝子に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有するｓｗｒＡ−遺伝子を有する。幾つかの実施形態では、ｓｗｒＡ−細胞は、同じバチルス種のｓｗｒＡ野生型遺伝子に対して配列同一性を有するｓｗｒＡ−遺伝子を有し、このようなバチルス種はBacillus subtilisクレード内に入る。幾つかの実施形態では、バチルス種はpumilus、atrophaeus、amyloliquefaciens、subtilis、licheniformis、aerophilus、stratosphericus、safensis、altitudinus、vallismortis、halotolerans、mojavensis、sonorensis、又はaeriusである。さらに他の実施形態では、ｓｗｒＡ−細胞は配列番号１及び５〜１０に規定された配列のうち１つまたは複数に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有する突然変異ｓｗｒＡ遺伝子を有する。
[0100] 一実施形態では、ｓｗｒＡオルソログに突然変異を有するBacillus subtilisクレード内などの胞子形成細菌細胞は、野生型ｓｆｐオルソログを含む。他の実施形態では、このような胞子形成細菌細胞は野生型ｄｅｇＱ及びｅｐｓＣオルソログも含む。さらに他の実施形態では、上記実施形態のいずれかの胞子形成細菌細胞はBacillus subtilis又はBacillus amyloliquefaciensである。野生型ＱＳＴ７１３からのｓｆｐ、ｅｐｓＣ及びｄｅｇＱ遺伝子は、本明細書ではそれぞれ配列番号１１、１２及び１３として提供される。本明細書で（配列のリスト及び／又は図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃで）ｓｗｒＡヌクレオチド配列が提供されているバチルス種及び株など、他の種からのオルソロガスｓｆｐ、ｅｐｓＣ及びｄｅｇＱ遺伝子は、Genbankを通して、及び以上で引用したMcLoonの論文などの様々な論文で公的に入手可能である。一実施形態では、野生型ｄｅｇＱ、ｅｐｓＣ及びｓｆｐオルソログはB. amyloliquefaciens FZB42、B. pumilus SAFR-032、B. subtilis 3610、B. atrophaeus 1942、及びB. licheniformis 14580のそれぞれｄｅｇＱ、ｅｐｓＣ及びｓｆｐ遺伝子のうち１つに対して少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一態様では、配列同一性を求める際に、ｓｗｒＡオルソログに突然変異を有する胞子形成細菌細胞は上述した株のうちの１つと同じ種である。
[0101] 本発明の特定の組成物におけるｓｗｒＡ−細胞のパーセンテージは、特定の目的及び組成物に使用される適用方法に応じて変化する。本発明の組成物及び方法の細胞全体は、異なる細胞型（例えば、細菌細胞と非細菌細胞の組合せ）を含むか、又は２つ以上の種の細菌細胞を含むか、又は２つ以上のバチルス種のバチルス細胞を含むか、又は２つ以上の異なる遺伝子型又は株のB. subtilis細胞であるか、又は２つ以上の異なる細胞型又は株のB. amyloliquefaciens細胞であるか、又は１つ又は複数の異なるｓｗｒＡ−突然変異を有する細胞であってよい。
[0102] 幾つかの実施形態では、本発明の組成物及び方法の細胞全体におけるｓｗｒＡ−細胞のパーセンテージは、少なくとも３．５％、又は少なくとも３．６％、又は少なくとも３．７％、又は少なくとも３．８％、又は少なくとも３．９％、又は少なくとも４％、又は少なくとも５％、又は少なくとも６％、又は少なくとも７％、又は少なくとも８％、又は少なくとも９％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％になる。本発明の幾つかの実施形態では、特定の組成物に存在するか、又は特定の方法で使用される細胞のすべては、すべてｓｗｒＡ−細胞（すなわち１００％がｓｗｒＡ−の細胞）である。
[0103] 幾つかの実施形態では、本発明の組成物及び方法の細胞全体におけるｓｗｒＡ−細胞のパーセンテージは約３．５％〜約９９．９％になる。別の実施形態では、パーセンテージは約５％〜約９９％になる。別の実施形態では、パーセンテージは約１０％〜約９９％になる。
[0104] 幾つかの実施形態では、本発明の組成物及び方法におけるｓｗｒＡ−細胞の１グラム（「ｇ」）当たりのコロニー形成単位（「ｃｆｕ」）の数は、少なくとも１×１０７ｃｆｕ／ｇ又は少なくとも１×１０８ｃｆｕ／ｇ又は少なくとも１×１０９ｃｆｕ／ｇ又は少なくとも２×１０９ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも３×１０９ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも４×１０９ｃｆｕ／ｇ又は少なくとも５×１０９ｃｆｕ／／ｇ又は少なくとも６×１０９ｃｆｕ／ｇ又は少なくとも７×１０９ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも８×１０１０ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも８．５×１０１０ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも９×１０１０ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも９．５×１０１０ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも１×１０１１ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも２×１０１１ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも３×１０１１ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも４×１０１１ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも５×１０１１ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも６×１０１１ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも７×１０１１ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも８×１０１１ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも９×１０１１ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも１×１０１２ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも１×１０１３ｃｆｕ／ｇ、又は少なくとも１×１０１４ｃｆｕ／ｇになる。
[0105] 他の実施形態では、本発明の組成物及び方法におけるｓｗｒＡ−細胞の総量は、組成物全体におけるｓｗｒＡ−細胞の相対的又は実際の乾燥重量ベースに基づく。
[0106] 幾つかの実施形態では、本発明の組成物及び方法におけるｓｗｒＡ−細胞の総量は、組成物におけるｓｗｒＡ−細胞のｃｆｕ／ｇに基づく。
[0107] また、本発明は、植物に、又は種子、根、根茎、球茎、球根又は塊茎などの植物の部分に投与することによって、又は植物又は植物の部分が成長する元となる土壌などの場所に、上述したバチルス、又はその無細胞製剤、又はその代謝物を含む新規の変異体及び株又は胞子形成細菌のうち１つ又は複数を適用することによって、植物の健康を増進する、植物の成長を増進する、及び／又は害虫及び病害を防除する方法も含む。
[0108] 本明細書で使用する「植物の健康」とは、幾つかの態様のみによって、又は相互の組合せで決定される植物の状態を意味する。植物の状態にとって１つの重要な指標は作物収量である。「作物」及び「果実」とは、収穫後にさらに利用される任意の植物生成物と理解され、例えば、適切な意味での果実、野菜、堅果、穀物、種子、木材（例えば、造林植物の場合）、花（例えば、造園植物、花卉の場合）などであり、すなわち植物によって生成される経済的価値があるものすべてである。植物の状態にとって別の指標は植物の活力である。植物の活力は幾つかの態様でも明白になり、そのうち幾つかは視覚的外観、例えば葉の色、果実の色及び外観、枯れた根出葉の量及び／又は葉身の程度、植物の重量、植物の高さ、植物の倒置（倒伏）の程度、数、分けつ枝の強度及び生産性、穂の長さ、根系の程度、根の強度、根粒形成の程度、特に根粒菌の根粒形成の程度、発芽の時点、出芽、開花、穀物の成熟度及び／又は老化、タンパク質含有量、糖含有量などである。植物の状態にとって別の指標は、生物及び非生物ストレスファクタに対する植物の寛容性又は抵抗力である。
[0109] 本発明によれば、特に農業、造林及び／又は花卉における植物の「収量増加」とは、個々の植物の生成物の収量が、同じ条件で生成されたが、本発明の組成物を適用していない植物の同じ生成物の収量よりも測定可能な量だけ増加しているという意味である。本発明によれば、収量は、適切な対照標準と比較した場合に少なくとも０．５％、又は少なくとも１％、又は少なくとも２％、又は少なくとも４％、又は少なくとも５％、又は少なくとも１０％増加していることが好ましい。
[0110] 別の好ましい実施形態では、本発明は、例えば、農業、造林及び／又は花卉などの植物の収量を増加させる、及び／又はその活力を改良するために、本発明の組成物の使用法を提供する。
[0111] 本発明は、植物の収量を増加させる、及び／又はその活力を改良する方法をさらに提供し、該方法は、植物、植物が成長するか成長が予想される部位（すなわち植物部位）、及び／又は植物が成長する元となる胎芽を、本発明の組成物又は胞子形成細菌で処理することを含む。幾つかの実施形態では、処理した植物部位が成長した１つ又は複数の処理植物は、成長中の植物にとって物理的ストレスがある環境で成長している。このような状態とは、低温（例えば、１５℃以下）、乾燥状態、土壌の低栄養状態（例えば、窒素及び／又はカリウム及び／又はリン酸塩又は他の無機微量栄養素のレベルが低い）、及び／又は土壌の塩分が増加した最適ではない状態などである。本発明によれば、「植物活力の改良」とは特定の穀物の特徴が、同じ条件で生成されたが本発明の組成物を適用していない植物の同じ要素に対して、測定可能又は顕著な量だけ増加又は改良されたという意味である。植物活力の改良は、改良された植物の特性のうち特に以下の特性を特徴とすることができる。すなわち、（ａ）植物の生命力の改良、（ｂ）植物及び／又は植物生成物の品質改良、例えば、タンパク質含有量の増大、（ｃ）視覚的外観の改良、（ｄ）老化の遅れ、（ｅ）根の成長増進及び／又は根系の発達増加（例えば、根の乾燥質量によって決定される）、（ｆ）特に根粒菌における根粒形成の増大、（ｇ）穂の伸張、（ｈ）葉身の拡大、（ｉ）枯れた根出葉の減少、（ｊ）葉緑素含有量の増加、（ｋ）光合成活性期間の延長、（ｌ）植物の林分密度の増加又は改良、（ｍ）植物倒置（倒伏）の減少、（ｎ）植物重量の増加、（ｏ）植物の高さの増加、（ｐ）分けつの増加、（ｑ）分けつ枝の強化及び／又は生産性向上、（ｒ）非生産的分けつ枝の減少、（ｓ）光合成の活性増進及び／又は色素含有量の増大、したがって葉色の緑が濃くなる、（ｔ）発芽の早期化及び／又は改良、（ｕ）出芽の改良及び／又はさらなる均一化及び／又は早期化、（ｖ）苗条成長の増大、（ｗ）開花の早期化、（ｘ）結実の早期化、（ｙ）穀物成熟の早期化、（ｚ）必要な肥料の減少、（ａａ）必要な種子の減少である。
[0112] 本発明の組成物は、例えば、Aphanomyces cochlioides、Cylindrocladium parasiticum、Fusarium avenaceum、Fusarium culmorum、Phytophthora capsici、Phytophthora cinnamomi、Pythium ultimum、Rhizoctonia solani、Sclerotinia sclerotiorum、Sclerotinia minor、Sclerotium rolfsii、Ustilago hordei、Stagonospora nodorum、Aspergillus fumigatus、Verticillium dahliae、Tapesia yallunde、Alternaria alternate及びPenicillium expansumなどの様々な土壌伝播性及び／又は種子伝染性病原体のような植物病原菌などの植物病原体の防除にも有用である。一実施形態では、防除される土壌伝播性病原体はP. capsici、S. rolfsii、及びC. parasiticumである。
[0113] 本発明の組成物は、例えば、Meloidogyne種、Heterodera種、Globodera種、Pratylenchus種及びCriconemella種など、ネコブシスト、病斑及びワセンチュウのような植物寄生センチュウを含む害虫の防除にも有用である。組成物は、Tylenchulus semipenetrans、Trichodorus種、Longidorus種、Rotylenchulus種、Xiphinema種、Belonolaimus種（B. longicaudatusなど）、Criconemoides種、Tylenchorhynchus種、Hoplolaimus種、Rotylenchus種、Helicotylenchus種、Radopholus種（R. citrophilis及びR. similisなど）、Ditylenchus種及び他の植物寄生センチュウの防除にも有用である。幾つかの実施形態では、標的はHeterodera glycines（ダイズシストセンチュウ）、Heterodera schachtii（ビートシストセンチュウ）、Heterodera avenae（シリアルシストセンチュウ）、Meloidogyne incognita（サツマイモ（又はミナミ）ネコブセンチュウ）、Globodera rostochiensis及びGlobodera pallida（ジャガイモシストセンチュウ）などのシストセンチュウである。他の実施形態では、標的はM. incognita（サツマイモネコブセンチュウ）、M. javanica（ジャワネコブセンチュウ）、M. hapla（キタネコブセンチュウ）、及びM . arenaria（ラッカセイネコブセンチュウ）のように、ネコブセンチュウである。
[0114] 本明細書で使用する「防除」という用語は、微生物を死滅させるか、その増殖を阻害するか、又はセンチュウなどの害虫については、殺処分する、数を減少させる、及び／又は成長、摂食又は正常な生理学的発達、ネコブセンチュウの場合は根に侵入して根中で発達する能力などを低減させることを意味する。有効量とは、（ｉ）微生物の増殖、又は（ｉｉ）害虫については害虫の成長、摂食、運動、繁殖能力、又は（ｉｉｉ）特に植物寄生センチュウについては、根への侵入、根中での成熟、及び／又は一般的な正常な生理学的発達及びセンチュウ感染による症状を測定可能なほど減少させることができる量である。幾つかの実施形態では、症状及び／又は植物病原体又はセンチュウなどの害虫は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少する。
[0115] 本発明のバチルスの新規の変異体及び株は、胞子（休眠期である）、生長する細胞（増殖中である）、遷移状態の細胞（増殖段階から萌芽形成段階へと遷移中である）、又はこれらのタイプの細胞全部の組合せの形で本発明の組成物中に存在することができる。幾つかの実施形態では、組成物は主に胞子を含む。幾つかの実施形態では、胞子であるｓｗｒＡ−細胞のパーセンテージは少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％である。
[0116] 本発明のバチルスの新規の変異体及び株の代謝物には、イツリン、スルファクチン、プリパスタチン、ファンギシン及びアグラスタチンなどのリポペプチド、及び抗菌性がある他の化合物が含まれる。ＱＳＴ７１３のリポペプチド代謝物が、米国特許第６，２９１，４２６号及び第６，６３８，９１０号で詳細に説明されている。Marc Ongena及びPhilippe Jacquesの、「Bacillus Lipopeptides: Versatile Weapons for Plant Disease Biocontrol」（Trends in Microbiology (2008年3月1日) Volume 16, Issue 3, 115-125）も参照されたい。
[0117] 本発明の組成物は、米国特許第６，０６０，０５１号に記載されている培地及び他の方法を使用するなど、当技術分野で周知の方法によりバチルスの新規の変異体及び株を培養することによって得ることができる。従来の大規模微生物培養プロセスには、液中発酵、固体発酵、又は液面培養がある。発酵の終了に向かって、栄養分が涸渇するにつれてバチルス細胞が増殖段階から胞子形成段階へと遷移し、したがって発酵の最終生成物は主に胞子、代謝物及び残留発酵培地である。胞子形成はBacillus subtilisなどのバチルス細胞の自然な生活環の一部であり、通常は栄養素の限定に応答して細胞によって開始される。発酵は、バチルスの高レベルのコロニー形成単位を得て、胞子形成を促進するように構成される。発酵の結果生じる培地中の細菌細胞、胞子及び代謝物は、遠心分離、タンジェント流フィルトレーション、デプスフィルトレーション、及び蒸発作用などの従来の産業方法で直接使用するか、又は濃縮することができる。本明細書では発酵ブロス及びブロス濃縮物を両方とも「発酵生成物」と呼ぶ。本発明の組成物は発酵生成物を含む。幾つかの実施形態では、濃縮発酵ブロスを例えば透析ろ過過程により洗浄して、残留発酵ブロス及び代謝物を除去する。
[0118] 発酵ブロス又はブロス濃縮物は、従来の乾燥プロセス又は方法、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、箱形乾燥、流動層乾燥、ドラム乾燥、又は蒸発作用を使用して、担体を追加するか追加しない状態で乾燥することができる。
[0119] その結果となる乾燥生成物は、微粉砕又は顆粒形成などによってさらに処理し、特定の粒子サイズ又は物理的フォーマットを達成することができる。以下で説明する担体は、乾燥後に追加することもできる。
[0120] 本発明のバチルスの新規の変異体及び株の発酵ブロスの無細胞製剤は、発酵ブロスの抽出、遠心分離及び／又はフィルトレーションなどの当技術分野で知られている任意の手段によって得ることができる。いわゆる無細胞製剤は、細胞を欠いていないことがあり、むしろ細胞の除去に使用される技術（例えば、遠心分離の速度）に応じておおよそ無細胞であるか、又は基本的に無細胞であることが当業者には認識される。その結果である無細胞製剤は、乾燥する、及び／又は植物又は植物成長培地に適用する際に補助する成分を配合することができる。発酵ブロスについて上述した濃縮法及び乾燥技術は、無細胞製剤にも適用可能である。
[0121] Bacillus subtilisの代謝物は、米国特許第６，０６０，０５１号に記載された方法により得ることができる。本明細書で使用する「代謝物」という用語は、半分純粋及び純粋又は基本的に純粋な代謝物を、又はBacillus subtilisから分離されていない代謝物を指すことができる。幾つかの実施形態では、無細胞製剤が発酵ブロスの遠心分離によって作成された後、代謝物は、リポペプチドは８００ダルトンと１６００ダルトンの間であるので、分子量のカットオフに基づいて代謝物を約２０００ダルトン未満、約１５００ダルトン未満、約１０００ダルトン未満などの分子量など、異なるフラクションに分類するＬＨ−２０、Ｇ１０、及びＧ１５及びＧ２５を含むセファデックス樹脂などのサイズ排除フィルトレーションによって精製することができる。
[0122] 発酵ブロスの配合のために上述した濃縮方法及び乾燥技術は、代謝物にも適用可能である。
[0123] 本発明の組成物は、有効性、安定性及び使用性能を改良する、及び／又は処理、パッケージング及び最終用途の適用を容易にするために、細胞を含む組成物、無細胞製剤又は代謝物に添加した配合不活性物質を含むことができる。このような配合不活性物質及び成分には、担体、安定剤、栄養素、又は物理的改質剤などが含まれ、これらは個々に、又は組み合わせて添加することができる。幾つかの実施形態では、担体は、水、油、及び他の有機又は有機溶剤などの液体材料、及び鉱物、ポリマー、又は生物学的又は化学的合成によって誘導されるポリマー錯体などの固体材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、担体は種子又は根などの植物部分への組成物の付着を容易にする結合剤又は接着剤である。例えば、Taylor, A.G.他の、「Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments」（Annu. Rev. Phytopathol. 28:321-339 (1990)）を参照されたい。安定剤は凝結防止剤、酸化防止剤、乾燥剤、保護剤又は保存剤を含むことができる。栄養剤は糖、多糖、油、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸及び燐酸塩などの炭素、窒素及びリンの供給源を含むことができる。物理的改質剤は充填剤、湿潤剤、増粘剤、ｐＨ改質剤、レオロジー改質剤、分散剤、補助剤、界面活性剤、凍結防止剤又は着色剤を含むことができる。幾つかの実施形態では、細胞を含む組成物、無細胞製剤又は発酵によって生成された代謝物は、任意の他の配合製剤がない状態で、希釈剤として水があるか、又は水がない状態で直接使用することができる。幾つかの実施形態では、配合不活性物質は発酵ブロスの濃縮後、及び乾燥中及び／又は乾燥後に添加される。
[0124] 幾つかの実施形態では、本発明の組成物は、種子を取るために成長させる作物、景観を生成する作物、及び種子生成のために成長させる作物など、多種多様な農業及び／又は園芸作物の処理に使用される。本発明の組成物を使用して処理することができる代表的な植物には、アブラナ属、球根野菜、穀類、柑橘類、綿、ウリ、結実野菜、葉物野菜、豆果、脂肪種子作物、落花生、仁果、根菜、結節野菜、トウモロコシ野菜、石果、タバコ、イチゴ及び他の液果、及び様々な花卉を含むが、これらに限定されない。
[0125] 本発明の組成物は、葉面散布として、種子／根／塊茎／根茎／球根／球茎／接ぎ穂の処理として、及び／又は土壌処理として投与することができる。種子／根／塊茎／根茎／球根／球茎／接ぎ穂は、植え付け前、植え付け中又は植え付け後に処理することができる。種子処理として使用する場合、本発明の組成物は、種子のサイズに応じて種子１個当たり約１×１０２ｃｆｕ〜約１×１０７ｃｆｕの割合で適用される。幾つかの実施形態では、施用量は種子１個当たり約１×１０３ｃｆｕ〜約１×１０６ｃｆｕである。土壌処理として使用する場合、本発明の組成物は土壌表面灌注、シャンクイン(shanked-in)、注入及び／又は畝間への注入として、又は灌漑水との混合によって適用することができる。植え付け時、植え付け中又は植え付け後、又は移植後及び植物成長の任意の段階で適用することができる土壌灌注処理の施用量は、１エーカー当たり約４×１０１１ｃｆｕ〜約８×１０１２ｃｆｕである。幾つかの実施形態では、施用量は１エーカー当たり約１×１０１２ｃｆｕ〜約６×１０１２ｃｆｕである。幾つかの実施形態では、施用量は１エーカー当たり約６×１０１２ｃｆｕ〜約８×１０１２ｃｆｕである。植え付け時に適用される畦間処理の施用量は、１列１０００フィート当たり約２．５×１０１０ｃｆｕ〜約５×１０１１ｃｆｕである。幾つかの実施形態では、施用量は１列１０００フィート当たり約６×１０１０ｃｆｕ〜約４×１０１１ｃｆｕである。他の実施形態では、施用量は１列１０００フィート当たり約３．５×１０１１ｃｆｕ〜１列１０００フィート当たり約５×１０１１ｃｆｕである。散布処理（施用量は低くなるが、頻度が高くなる）及び他のそれほど一般的ではない土壌処理に対する割合の調整方法は、当業者には理解される。
[0126] 本発明の組成物は、他の化学的及び非化学的添加剤、補助剤及び／又は処理と混合することができ、このような処理剤には、化学的及び非化学的殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺センチュウ剤、肥料、栄養剤、ミネラル、オーキシン、成長刺激剤などが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、本発明の組成物は、殺虫剤、殺ダニ剤、殺センチュウ剤、肥料、栄養剤、ミネラル、オーキシン、成長刺激剤などをさらに含む。他の実施形態では、本発明の組成物は他の処理と輪番で、例えば、噴霧プログラムの一部として適用される。さらに他の実施形態では、本発明の組成物は他の処理と同時に植物に適用される。
[0127] 組成物が植物病害の防除及び／又は植物の健康増進に使用される幾つかの実施形態では、組成物は少なくとも１つの殺カビ剤と混合されるか、それをさらに含むか、それの処理プログラムと同時に、又はその一部として適用される。一般的に使用される殺カビ剤は、ストロビルリン、カルボキサミド、スルファンアニリド、フェニルスルファミド、アゾール、窒素複素環、ジカルボキサミド、フタルイミド、カルバメート、チオカルバメート、ホルムアイジン、抗生物質、芳香族化合物、グアニジン、有機塩素化合物、有機金属、有機リン化合物、ニトロフェニル化合物、硫黄複素環化合物、尿素、無機物、及びその他（例えば、ベンザマクリル、カルボン、植物からの精油抽出物、シダー葉油、ニーム油、クロロピクリン、ＤＢＣＰ、ドラゾキソロン、フェナミノスルフ、メトゾキソロン、オキソリン酸、スピロキサミン、シモキサニル、メトラフェノン、）を含むが、これらに限定されない。プロヘキサジオンカルシウム、チシオフェン、ジタン、クロロタラニル、ジクロロフェン、ジクロラン、ニトロタールイソプロピル、ブロノポール、ジフェニルアミン、ミルジオマイシン、オキシン銅、シフルフェナミド（例えば、Ｎ−（シクロプロピルメトキシイミノ−（６−ジフルオロメトキシ−２，３−ジフルオロフェニル）−メチル）−２−フェニルアセトアミド））、ＵＫ−２Ａ（ストレプトミセス種５１７−０２から分離された抗生物質）、RANMAN（商標）（Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd）、及びBacillus subtilis系生成物、AgraQuest, Inc.からSONATA（登録商標）又はBALLAD（登録商標）として入手可能であるBacillus pumilus QST2808（商標）に基づくようなBacillus subtilis系生成物、Bacillus pumilus系生成物、又はストレプトミセス種ＡＱ４８００（商標）に基づく製品のようなストレプトミセス系生成物を含むが、これらに限定されない微生物系生成物。AQ4800（商標）（AgraQuest）、SONATA（登録商標）及びBALLAD（登録商標）（AgraQuest）の詳細な情報については、米国特許第６，５２４，５７７号、第６，８５２，３１７号、第６，２４５，５５１号、第６，５８６，２３１号、及び第６，６３５，２４５号に見られる。本明細書で引用する特許、特許公報はそれぞれ、その一部である図面／写真を含め、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
[0128] ストロビルリンは、アゾキシストロビン、ジモキシストロビン、エネストロブリン、フルオキサストロビン、クレソキシムメチル、メトミノストロビン、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、ピロキサストロビン、トリフロキシストロビン、オリサストロビン、メチル（２−クロロ−５−［１−（３−メチルベンジルオキシイミノ）−エチル］ベンジル）−カルバメート、メチル（２−クロロ−５−［１−（６−メチルピリジン−２−イルメトキシイミノ）エチル］ベンジル）カルバメート、メチル２−（オルト−（２，５−ジメチルフェニルオキシメチレン）フェニル）−３−メトキシアクリレート、２−（２−（６−（３−クロロ−２−メチルーフェノキシ）−５−フルオロ−ピリミジン−４−イルオキシ）フェニル）−２−メトキシイミノ−Ｎ−メチル−アセトアミド３−メトキシ−２−（２−（Ｎ−（４−メトキシフェニル）−シクロプロパンカルボキシイミドイルスルファニルメチル）−フェニル）−アクリル酸メチルエステルを含むが、これらに限定されない。
[0129] カルボキシアミドは、カルボキシアニリド（例えば、バイキサフェン、ボスカリド、カルボキシン、フェンヘキサミド、フラメトピル、イソピラザム、イソチアニル、メトスルホバックス、オキシカルボキシン、ピラカルボリド、ペンチオピラド、セダキサン（ラセミシス及びトランスアイソマ）、チフルザミド、チアジニル、Ｎ−（４’−ブロモビフェニル−２−イル）−４−ジフルオロメチル−２−メチルチアゾール−５−カルボキサミド、Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−２−イル）−４−ジフルオロメチル−２−メチルチアゾール−５−カルボキサミド、Ｎ−（４’−クロロ−３’−フルオロビフェニル−２−イル）−４−ジフルオロメチル−２−メチルチアゾール−５−カルボキサミド、Ｎ−（３’、４’−ジクロロ−４−フルオロビフェニル−２−イル）−３−ジフルオロメチル−１−メチルピラゾール−４−カルボキサミド、Ｎ−（２−（１，３−ジメチルブチル）−フェニル）−１，３−ジメチル−５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾール，−４−カルボキサミド、Ｎ−（４’−クロロ−３’ ，５−ジフルオロビフェニル−２−イル）−３−ジフルオロメチル−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド、Ｎ−（４’−クロロ−３’５−ジフルオロビフェニル−２−イル）−３−トリフルオロメチル−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド、Ｎ−（３’ ，−４’−ジクロロ−４−フルオロビフェニル−２−イル）−３−ジフルオロメチル−１−メチルピラゾール−４−カルボキサミド、Ｎ−（４’−（３，３−ジメチルブチン−１−イル）−１，１’−ビフェニル−２−イル）−３−ジフルオロメチル−１−メチルピラゾール−４−カルボキサミド、Ｎ−（４’−（３，３−ジフルオロブチン−１−イル）−１，１’−ビフェニル−２−イル）−３−トリフルオロメチル−１−メチルピラゾール−４−カルボキサミド、Ｎ−（４’−（３，３−ジフルオロブチン−１−イル）−１，１’−ビフェニル−２−イル）−３−ジフルオロメチル−１−メチルピラゾール−４−カルボキサミド、Ｎ−（４’−（３，３−ジメチルブチン−１−イル）−１，１’−ビフェニル−２−イル）−３−トリフルオロメチル−１−メチルピラゾール−４−カルボキサミド、２−クロロ−Ｎ−（４’−（３，３−ジメチルブチン−１−イル）−１，１’−ビフェニル−２−イル）−３−ピリジンカルボキサミド、Ｎ−（２−シアノフェニル）−３，４−ジクロロイソチアゾール−５−カルボキサミド、Ｎ−（シス−２−バイシクロプロピル−２−イル−フェニル）−３−ジフルオロメチル−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド、Ｎ−（トランス−２−バイシクロプロピル−２−イルフェニル）−３−ジフルオロメチル−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド、ベナラキシル、メタラキシル、メフェノキサム、オフラセ、及びオキサジキシル）、カルボン酸モルホリド（例えば、ジメトモルフ及びフルモルフ）、ベンズアミド（例えば、ベンゾヒドロキサム酸、フルメトベル、フルオピコリド、フルオピラム、チオキシミド、トリクラミド、ザリラミド、Ｎ−アセトニルベンズアミド、例えば、米国特許第５，３０４，５７２号に記載及び／又は請求されたゾキサミド及び他の関連化合物、及びＮ−（３−エチル−３，５−５−トリメチル−シクロヘキシル）−３−ホルミル−アミノ−２−ヒドロキシベンズアミド）、ベンズアニリド（例えば、ベノダニル、フルトラニル、メベニル、メプロニル、サリチルアニリド、及びテクロフタラム）、フラニリド（例えば、フェンフラム、フララキシル、フルカルバニル、及びメトフロキサム）、フラミド（例えば、シクラフラミド、及びフルメシクロックス）、ニコチンアミド（例えば、２−クロロ−Ｎ−（１，１，３−トリメチル−インダン−４−イル）−ニコチンアミド、Ｎ−（１−（５−ブロモ−３−クロロ−ピリジン−２−イル）エチル）−２，４−ジクロロ−ニコチンアミド、２−アミノ−４メチル−チアゾール−５−カルボキサミド、及びＮ−（（５−ブロモ−３−クロロピリジン−２−イル）−メチル）−２，４−ジクロロ−ニコチンアミド）、スルホンアミド（例えば、Ｎ−（４−クロロ−２−ニトロフェニル）−Ｎ−エチル−４−メチル−ベンゼンスルホンアミド）、ペンチオピラド、イソピラザム、１−メチル−ピラゾール−４−イルカルボキサミド、及び他のカルボキサミド（例えば、クロルアニフォルメタン、カルプロパミド、シフルフェナミド、ジクロシメット、エタボキサム、フェノキサニル、マンジプロパミド、シルチオファム、Ｎ−（２−（４−［３−（４−クロロフェニル）プロプ−２−イニロキシ］−３−メトキシフェニル）エチル）−２−メタンスルフォニルアミノ−３−メチル−ブチルアミド、オキシテトラサイリン、Ｎ−（２−（４−［３−（４−クロロフェニル）プロプ−２−イニロキシ］−３−メトキシフェニル）エチル）−２−エタン−スルフォニルアミノ−３−メチルブチルアミド、Ｎ−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）シクロプロパンカルボン酸アミド）を含むが、これらに限定されない。
[0130] スルファンアニリドはフルスルファミドを含むが、これに限定されない。
[0131] フェニルスルファミドはジクロフアニド及びトリフルアニドを含むが、これらに限定されない。
[0132] アゾールは、トリアゾール（例えば、アザコナゾール、ビテルタノール、ブロムコナゾール、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジニコナゾール、ジニリコナゾール−Ｍ、エニルコナゾール、エポキシコナゾール、エタコナゾール、フェンブコナゾール、フルシラゾール、フルオトリマゾール、フルキンコナゾール、フルトリアホール、ファーコナゾール、シスファーコナゾール、ヘキサコナゾール、イミベンコナゾール、イプコナゾール、メトコナゾール、ミクロブタニル、パルコブトラゾール、ペンコナゾール、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、キンコナゾール、シメコナゾール、テブコナゾール、テトラコナゾール、トリアジメノール、トリアジメホン、トリアズブチル、トリチコナゾール、ウニコナゾール、１−（４−クロロフェニル）−２−（［１，２，４］トリアゾール−１−イル）−シクロヘプタノール、及びアミスルブロム）、イミダゾール（例えば、クリムバゾール、クロトリマゾール、シアゾファミド、フェナパニル、グリオジン、イマザリル、オキスポコナゾール、ペフラゾエート、プロクロラズ、トリアゾキシド、トリフルミゾール、及び２−クロロ−５−（（４−クロロ−２−メチル−５−（２，４，６−トリフルオロフェニル））イミダゾール−１−イル）ピリジン）、ベンズイミダゾール（例えば、ベノミル、カルベンダジム、クロフェナゾール、シペンダゾール、デバカルブ、フベリダゾール、メルカルビニジド、ラベナゾール、及びチアベンダゾール）、アゾロピリミジン（例えば、５−クロロ−７−（４−メチル−ピペリジン−１−イル）−６−（２，４，６−トリフルオロフェニル）−［１，２，４］−トリアゾロ−［１，５ａ］−ピリミジン、６−（３，４−ジクロロフェニル）−５−メチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン、６−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−５−メチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン、５−メチル−６−（３，５，５−トリメチルヘキシル）［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン、５−メチル−６−オクチル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン、５−エチル−６−オクチル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２，７−ジアミン、６−エチル−５−オクチル−１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン、５−エチル−６−オクチル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン、５−エチル−６−（３，５，５−トリメチルヘキシル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン、６−オクチル−５−プロピル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン、５−メトキシメチル−６−オクチル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン、６−オクチル−５−トリフルオロメチル−［１，２，４］−トリアゾロ［１，５−ａ］−ピリミジン−７−イルアミン、５−トリフルオロメチル−６−（３，５，５−トリメチルヘキシル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン、及び２−ブトキシ−６−ヨード−３−プロピルクロメン−４−オン）、及び他のアゾール（例えば、ベンタルロン、エトリジアゾール、及びヒメキサゾール）を含むが、これらに限定されない。
[0133] 窒素複素環は、ピリジン（例えば、ブチオベート、ジピリチオン、フルアジナム、ピリジニトリル、ピリフェノックス、ピロキシクロル、ピロキシフル、２，３，５，６−テトラクロロ−４−メタンスルホニルピリジン、３，４，５−トリクロロ−ピリジン−２，６−ジ−カルボニトリル、及び３−［５−（４−クロロフェニル）−２，３−ジメチルイソキサゾリジン−３−イル］ピリジン）、ピリミジン（例えば、ブピリメート、シプロジニル、ジフルメトリム、ジメチリモール、エチリモール、フェリムゾン、フェナリモル、メパニピリム、ヌアリモール、トリアリモール、及びピリメタニル）、ピペラジン（例えば、トリホリン）、ピペリジン（例えば、フェンプロピジン及びピペラリン）、ピロール
（例えば、フルジオキソニル及びフェンピクロニル）、モルホリン（例えば、アルジモルフ、ベンザモルフ、ドデモルフ、フェンプロピモルフ、及びトリデモルフ）、ニトラピリン、キノリン（例えば、エトキシキン、ハラクリネート、８−硫酸ヒドロキシキノリン、キナセトール及びキノキシフェン）、キノン（例えば、ベンキノックス、クロラニル、ジクロン、及びジチアノン）、キノキサリン（例えば、キノメチオナート、クロルキノックス、及びチオキノックス）、及び他の窒素複素環（例えば、アシベンゾラル−Ｓ−メチル、アニラジン、ジクロメジン、フェンアミドン、フルチアニル、オクチリノン、プロベナゾール、プロキナジド、ピロキロン、チアジフルオール、トリシクラゾール、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（３−ブロモ−６−フルオロ−２−メチルインドール−１−スルホニル）−［１，２，４］トリアゾールスルホンアミド、３−（４−クロロフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオルエチル）−１，２，４−トリアジン−６（１Ｈ）−オン、３−（４−クロロフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオルエチル）−４，５−ジヒドロ−１，２，４−トリアジン−６（１Ｈ）−オン、６−（４−クロロフェニル）−２−（２，２，２−トリフルオルエチル）−１，２，４−トリアジン−３（１Ｈ）−オン、６−（４−クロロフェニル）−２−（２，２，２−トリフルオルエチル］−４，５−ジヒドロ−１，２，４−トリアジン−３（１Ｈ）−オン）を含むが、これらに限定されない。
[0134] ジカルボキシイミドは、クロゾリネート、ジクロゾリン、イプロジオン、イソバレジオン、ミクロゾリン、プロシミドン、ビンクロゾリン、ファモキサドン、及びフルオロイミドを含むが、これらに限定されない。
[0135] フタルイミドは、カプタホール、キャプタン、ジタリムホス、ホルペット、及びトリクロルフェンピムを含むが、これらに限定されない。
[0136] カルバメートは、ジエトフェンカルブ、フルベンチアバリカルブ、イプロバリカルブ、プロパモカルブ、フロファネート、チオファネートメチル３−（４−クロロフェニル）−３−（２−イソプロポキシカルボニルアミノ−３−メチルブチリルアミノ）−プロピオネート、４−フルオロフェニルＮ−（１−（１−（４−シアノフェニル）エタンスルホニル）−ブト−２−イル）カルバメート、及び３−ヨード−２−プロピニルブチルカルバメート（ヨードカルブ）を含むが、これらに限定されない。
[0137] チオカルバメートは、メタスルホカルブ及びプロチオカルブを含むが、これらに限定されない。
[0138] ジチオカルバメートは、アジチラム、カルバモルフ、クフラネブ、クプロバム、ダゾメット、ジスルフラム、フェルバム、マンゼブ、マンネブ、ミルネブ、メチラム、メタム、ナバム、プロピネブ、テコラム、チラム、ジネブ、及びジラムを含むが、これらに限定されない。
[0139] ホルムアミジンは、Ｎ’−（４−（４−クロロ−３−トリフルオロメチル−フェノキシ）−２，５−ジメチルフェニル）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルホルムアミジン、Ｎ’−（４−（４−フルオロ−３−トリフルオロメチルフェノキシ）−２，５−ジメチル−フェニル）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルホルムアミジン、Ｎ’−（２−メチル−５−トリフルオルメチル−４−（３−トリメチル−シラニル−プロポキシ）フェニル）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルホルムアミジン、及びＮ’−（５−ジフルオルメチル−２−メチル−４−（３−トリメチル−シラニルプロポキシ）フェニル）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルホルムアミジンを含むが、これらに限定されない。
[0140] 抗生物質は、アウレオフンギン、ブラスチシジンＳ、グリセオフルビン、カスガマイシン、ナタマイシン、ポリオキシン、ポリオキソリム、ストレプトマイシン、及びバリダマイシンＡを含むが、これらに限定されない。
[0141] 芳香族化合物は、ビフェニル、クロロネブ、及びクレゾールを含むが、これらに限定されない。
[0142] グアニジンは、ドジン、三酢酸イミノクタジン、イミノクタジントリス（アルベシレート）、及び酢酸グアザチンを含むが、これらに限定されない。
[0143] 有機塩素化合物は、ビチオノール、クロロタロニル、フタリド、ヘキサクロロベンゼン、ペンシクロン、ペンタクロロフェノール、ペルクロロシクロヘックス−２−エン−１−オン、及びキントゼン（ＰＣＮＢ）を含むが、これらに限定されない。
[0144] 有機金属は、フェンチン塩、デカフェンチン、及び酸化トリブチルスズを含むが、これらに限定されない。
[0145] 有機リン化合物は、アンプロピルホス、エディフェンホス、フェニトロパン、ホセチル、ホセチルアルミニウム、ヘキシルチオホス、イプロベンホス、ホスジフェン、トリアンホス、ピラゾホス、トルクロホスメチル、リン酸及びその塩を含むが、これらに限定されない。
[0146] ニトロフェニル化合物は、ビナパクリル、クロロジニトロナフタレン、ジクロラン、ジノカップ、ジノブトン、メプチルジノカップ、ジノクトン、ジノペントン、ジノスルホン、ジノテルボン、ＤＮＯＣ、スルトロペン、及びテクナゼン（ＴＣＮＢ）を含むが、これらに限定されない。
[0147] 硫黄複素環化合物は、イソプロチオラン及びジチアノンを含むが、これらに限定されない。
[0148] 尿素は、ペンシクロン及びキナジミドを含むが、これらに限定されない。
[0149] 無機物殺カビ剤は、ボルドー合剤、酢酸銅、水酸化銅、酸化銅、酸塩化銅、塩基性硫酸銅、硫黄、重炭酸ナトリウム、及び重炭酸カリウムを含むが、これらに限定されない。
[0150] 植物の健康増進に組成物を使用する幾つかの実施形態では、組成物は少なくとも１つの肥料、栄養剤、ミネラル、オーキシン、成長刺激剤などと混合されるか、それをさらに含み、以下では植物健康組成物と呼ばれる。
[0151] 植物健康組成物／化合物は、植物の健康を維持及び／又は促進することができる１つ又は複数の天然又は合成化学物質、又は生物学的有機体を含む組成物／化合物である。このような組成物／化合物は、植物の健康、活力、生産性、花及び果実の品質を改良する、及び／又は生物及び／又は非生物ストレッサ／圧力に対する植物の抵抗を刺激、維持、又は増進することができる。
[0152] 従来の植物健康組成物及び／又は化合物は、植物成長調整剤（別名植物成長刺激剤、植物成長調整組成物、植物成長調整物質、植物成長調整剤）及び植物活性剤（別名植物活性化剤、植物相乗因子、害虫駆除剤）を含むが、これらに限定されない。本発明の植物健康組成物は天然又は合成とすることができる。
[0153] 植物成長調整剤は、肥料、除草剤、植物ホルモン、細菌接種剤及びその誘導体を含むが、これらに限定されない。
[0154] 肥料は通常、様々な割合で３つの主要植物栄養素（窒素、リン、カリウムで、略記でＮ−Ｐ−Ｋとして知られる）、又は２次的植物栄養素（カルシウム、硫黄、マグネシウム）、又は植物又は動物の栄養分としての役割がある微量元素（又は微量栄養素）、すなわちホウ素、塩素、マンガン、鉄、亜鉛、銅、モリブデン及び（幾つかの国では）セレンを提供する組成物である。肥料は有機又は無機とすることができる。自然界で発生する有機肥料は、厩肥、ミミズの糞、ピートモス、海草、下水及びグアノを含むが、これらに限定されない。根上の細菌粒によって大気から固定した窒素を、さらに（栄養素可動化によって）土壌のリン要素を通して緑肥として土壌を肥やすために、被覆作物も成長させる。自然界からの加工有機肥料は、（野菜廃棄物からの）コンポスト、（有機肉生産施設からの）血粉及び骨粉、及び海草抽出物（アルギン酸塩その他）を含む。肥料は、植物乾燥物質中の濃度に基づいて多量栄養素と微量栄養素に分類することができる。多量栄養素は比較的大量に消費され、通常は窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、及びカリウム（Ｋ）という主要３成分など、（乾燥物質重量ベースで）植物組織中に整数又は１０分の数パーセント存在する（元素を意図的に混合した場合、Ｎ−Ｐ−Ｋ肥料又は化成肥料として知られる）。多くの微量栄養素があり、質量で５ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲の濃度で必要とされる。植物微量栄養素には、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、ホウ素（Ｂ）、銅（Ｃｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、塩素（Ｃｌ）、及び亜鉛（Ｚｎ）が含まれる。
[0155] 植物ホルモン（別名ファイトホルモン）及びその誘導体にはアブシジン酸、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、ブラシノライド、サリチル酸、ジャスモン酸、植物ペプチドホルモン、ポリアミン、硝酸及びストリゴラクトンが含まれる。
[0156] 植物活性化剤は、生物及び／又は非生物ストレッサ／圧力に対する植物の抵抗を刺激、維持、又は増進することができる天然又は合成物質であり、アシベンゾラル、プロベナゾール、イソチアニル、サリチル酸、アゼライン酸、ヒメキサゾール、ブラシノライド、ホルクロルフェニュロン、ベンゾチアジアゾール（例えば、ACTIGARD（登録商標）50WG）、微生物又は微生物由来の誘導因子を含むが、これらに限定されない。さらなる植物活性化剤が、米国特許第６，８４９，５７６号、第５，９５０，３６１号、第６，８８４，７５９号、第５，５５４，５７６号、第６，１００，０９２号、第６，２０７，８８２号、第６，３５５，８６０号、第５，２４１，２９６号、第６，３６９，２９６号、第５，５２７，７８３号、及び第６，９８７，１３０号で説明されている。
[0157] 微生物、又は微生物由来の化合物及びペプチド／タンパク質（例えば、誘導因子）も、植物活性化剤として使用することができる。非制限的な例示的誘導因子は、分枝βグルカン、キチンオリゴマー、ペクチン分解酵素、酵素活性とは別個の誘導因子活性（例えば、エンドキシラナーゼ、エリシチン、PaNie）、ａｖｒ遺伝子生成物（例えば、ＡＶＲ４、ＡＶＲ９）、ウィルスタンパク質（例えば、ウィルス外被タンパク質、ハーピン）、フラジェリン、タンパク又はペプチド毒素（例えば、ビクトリン）、糖タンパク質、転化酵素の糖ペプチドフラグメント、シリンゴリド、Ｎｏｄファクタ（リポチトオリゴ糖）、ＦＡＣ（脂肪酸アミノ酸結合体）、エルゴステロール、細菌毒素（例えば、コロナチン）。及びスフィンガニン類似体カビ毒（例えば、フモニシンＢ１）である。さらなる誘導因子が、Howe他の、「Plant Immunity to Insect Herbivores」（Annual Review of Plant Biology, 2008, vol. 59, pp.41-66）、Stergiopoulosの、「Fungal Effector Proteins」（Annual Review of Phytopathology, 2009, vol.47, pp.233-263）及びBent他の、「Elicitors, Effectors, and R Genes: The New Paragigm and a Lifetime Supply of Questions」（Annual Review of Plant Biology, 2007, vol.45, pp. 399-436）で説明されている。
[0158] さらなる非制限的な例示的植物健康組成物／化合物が、
で説明されている。本明細書で引用する特許、特許公報はそれぞれ、その一部である図面／写真を含め、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
[0159] 細菌接種剤は、土壌に接種するために往々にして植え付け時に使用される有益な細菌を含む組成物である。このような細菌接種剤は窒素固定細菌又は根粒細菌を含む。Bradyrhizobia japonicumは一般的にダイズ接種に使用され、Bradyrhizobia種（Vigna）又は（Arachis）は落花生接種に使用される。他の根粒菌が他の作物に使用されている。すなわち、Rhizobium leguminosarumはエンドウ、レンズマメ及びマメ及びアルファルファ及びクローバに、Rhizobium loti、Rhizobium leguminosarum及びBradyryizobium種は様々な豆果に使用される。一実施形態では、本発明の組成物は少なくとも１つの細菌接種剤と混合するか、それをさらに含み、土壌又は種子に適用される。別の実施形態では、組成物及び細菌接種剤は植物、植物の部分又は植物の部位に同時に、又は順番に適用される。
[0160] 幾つかの実施形態では、本発明の組成物は殺虫剤と混合するか、それをさらに含むか、それと同時に、又はその噴霧プログラムの一部として適用される。適切な殺虫剤にはネオニコチド殺虫剤、例えば、１−（６−クロロ−３−ピリジルメチル）−Ｎ−ニトロイミダゾリジン−２−イリデンアミン（イミダクロプリド）、３−（６−クロロ−３−ピリジルメチル）−１，３−チアゾリジン−２−イリジンシアンアミド（チアクロプリド）、１−（２−クロロ−１，３−チアゾール−５−イルメチル）−３−メチル−２−ニトログアニジン（クロチアニジン）、ニテンピラン、N.sup.１−［（６−クロロ−３−ピリジル）メチル］−N.sup.２−シアノ−N.sup.１−メチルアセトアミジン（アセタミプリド）、３−（２−クロロ−１，３−チアゾール−５−イルメチル）−５−メチル−１，３，５−オキサジアジナン−４−イリデン（−ニトロ）アミン（チアメトキサム）及び１−メチル−２−ニトロ−３−（テトラヒドロ−３−フリルメチル）グアニジン（ジノテフラン）が含まれる。
[0161] センチュウの防除に組成物が使用される幾つかの実施形態では、組成物は少なくとも１つの他の殺センチュウ剤を含むか、又はそれと混合されるか、又はそれと同時に、又はその処理プログラムの一部として適用される。本明細書で使用する「殺センチュウ剤」という用語は、センチュウを死滅させる、及びセンチュウの成長及び／又は発育を阻害するようなセンチュウ防除剤を含む。第２の殺センチュウ剤は化学的又は生物学的殺センチュウ剤とすることができる。本明細書で使用する「化学的殺センチュウ剤」という用語は、燻蒸剤を含まず、「燻蒸剤」という用語は植え付け前に土壌に適用され、土壌を通して（土壌の空気及び／又は土壌の水中で）拡散し、臭化メチルなどの気体、クロロピクリンなどの揮発性液体、又はダゾメットなどの揮発性固体として適用することができる広範囲の殺虫化学物質を含む。
[0162] 幾つかの実施形態では、化学的又は生物学的殺センチュウ剤は商業的に入手可能な配合生成物であり、本発明の組成物とタンクで混合される。他の実施形態では、化学的又は生物学的殺センチュウ剤は、活性成分が最終的に１つの配合生成物を形成するように、配合前に本発明のバチルス系組成物と混合される。
[0163] このような混合物に使用される化学的殺センチュウ剤はカルバメート、オキシムカルバメート、及び有機リン殺センチュウ剤である。カルバメート殺センチュウ剤にはベノミル、カルボフラン（FURADAN（登録商標））、カルボスルファン、及びクロエトカルブが含まれる。オキシムカルバメートにはアラニカルブ、アルジカルブ（TEMIK（登録商標）、又はSyngentaからのAVICTA（登録商標）Complete Pak種子処理の一部として）、アルドキシカルブ（STANDAK（登録商標））オキサミル（VYDATE（登録商標））、チオジカルブ（Bayer CropScienceからのAERIS（登録商標）種子適用システムの一部）、及びターペートが含まれる。有機リン殺センチュウ剤には、フェンスルホチオン（DANSANIT（登録商標））、エトプロプ（MOCAP（登録商標））、ジアミダホス、フェナミホス、ホスチエタン、ホスファミドン、カズサホス、クロルピリホス、ジクロフェンチオン、ジメトエート、ホスチアゼート、ヘテロホス、イサミドホス、イサゾホス、ホレート、ホスホカルブ、テルブホス、チオナジン、トリアゾホス、イミシアホス、及びメカルホンが含まれる。各化合物の後にある挿入句的な名称は、以上の各化学物質の代表的な商業的組成物である。このような混合物に有用な他の化学的殺センチュウ剤には、スピロテトラマト（MOVENTO（登録商標））、MON37400殺センチュウ剤及びフィプロニルが含まれる。
[0164] 生物学的殺センチュウ剤にはキチンと尿素の混合物と、コンポスト抽出物及び茶（両方とも曝気及び非曝気）と、真菌Myrothecium verrucaria及び／又はその代謝物を含む組成物（DITERA（登録商標）として市販されている）と、P. lilacinusなどの真菌Paecilomycesを含む組成物（例えば、MELOCON（登録商標）又はBIOACT（登録商標）として市販されている）と、P. usagaeを含むこのような細菌を含む細菌（例えば、ECONEM（登録商標）として市販されている）などの細菌Pasteuriaと、Bacillus firmus（フランスのパスツール研究所のthe Collection Nationale de Cultures de Microorganismesに１９９５年５月２９日に寄託され、例えば、VOTIVOとして市販されているCNMC I-1582など）、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus pumilus（No. B-30087として１９９９年１月１４日にNRRLとして寄託された株、及びその突然変異体を含む）、及びBacillus cereus及び以上の細菌のうち１つ又は複数を含む組成物などのバチルス種からの細菌と、Streptomyces lydicus及びこのような細菌（ACTINOVATE（登録商標）として市販されている）及びセンチュウ捕食菌を含む組成物、例えば、No. F-882下でGNC VB 「Vector」微生物コレクション(ノボシビルスク区域のKoltsovo集落)に寄託された株Ｔ−８９などのDuddingtonia flagransなどの殺センチュウ剤Streptomycete種と、Paecilmyces lilacimus、及びArthrobotrys oligosporaが含まれる。また、生物学的殺センチュウ剤には、ニーム植物（その植物からの種子又は油を含む）又はazidirachtinなどに基づく生成物、ニーム種子の２次代謝物、ゴマ油系生成物（DRAGONFIRE（登録商標）など）、カルバクロール、及び植物抽出物に基づく生成物（チリのキラヤ樹から得られるNEMA-Q（登録商標）など）などの植物系殺センチュウ剤も含まれる。生物学的殺センチュウ剤には、Streptomyces avementilisによって生成され、aamectin（abamectin B1a及びB1bの組合せからなる）及びavermectin B2aを含む化合物の科であるメクチン、及び元々Erwinia amylovora中に識別されてharpinEA及びharpinαβを含むハーピンタンパク質など、細菌によって生成される分離化合物も含まれる。
[0165] 本発明のバチルス系統組成物は１つ又は複数の他の化学及び非化学殺カビ剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺センチュウ剤、肥料、栄養剤、ミネラル、オーキシン、成長促進剤及び／又は植物健康製品とは別個に、又はそれと組み合わせて適用することができる。幾つかの実施形態では、ｓｗｒＡ−細胞は少なくとも１つの殺カビ剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺センチュウ剤、肥料、栄養剤、ミネラル、オーキシン、成長刺激剤及び／又は他の植物健康製品と相互配合され、相互配合生成物が植物、植物の部分、又は植物部位に適用される。幾つかの他の実施形態では、本発明の組成物は、殺カビ剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺センチュウ剤、肥料、栄養剤、ミネラル、オーキシン、成長刺激剤及び／又は他の植物健康製品の市販されている組成物とタンクで混合され、植物、植物の部分及び／又は植物部位に適用される。他の実施形態では、本発明の組成物は、殺カビ剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺センチュウ剤、肥料、栄養剤、ミネラル、オーキシン、成長刺激剤及び／又は他の植物健康製品の市販されている組成物を適用する直前又は直後に植物、植物の部分及び／又は植物部位に適用される。他の実施形態では、本発明の組成物は、殺カビ剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺センチュウ剤、肥料、栄養剤、ミネラル、オーキシン、成長刺激剤及び／又は他の植物健康製品の市販されている組成物との輪番で植物、植物の部分及び／又は植物部位に適用される。一例では、本明細書でさらに詳細に検討するように、Bacillus subtilis系の組成物は種子処理として、又は畝間又は灌注処理として適用される。上記実施形態の幾つかの場合、殺カビ剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺センチュウ剤、肥料、栄養剤、ミネラル、オーキシン、成長刺激剤及び／又は他の植物健康製品の市販されている組成物は、このような殺カビ剤、殺虫剤、殺ダニ剤、又は殺センチュウ剤の製品ラベル上に単独処理として推奨される割合より低い割合で適用される。この実施形態の一態様では、殺カビ剤、殺虫剤、殺ダニ剤及び／又は殺センチュウ剤は化学物質である。さらに別の態様では、化学物質は、毒性問題を有する化学物質であり、１つ又は複数の国の関連する政府機関によって「段階的除去」されることもある。
[0166] 他の実施形態では、本発明の組成物は、燻蒸剤の適用後に植物、植物の部分及び／又は植物部位に適用される。燻蒸剤はシャンク注入によって、通常は地下最低８インチ（２０．３ｃｍ）に適用することができる。燻蒸剤の液体製剤は、表面ドリップ化学溶液灌水法で適用し、燻蒸剤を地下８インチ（２０．３ｃｍ）以上の深さに適用することもできる。処理された土層は、燻蒸剤を土壌中に数日間保持するためにビニール防水シートで覆う。これは植え付け前に実行され、受け付ける前に空気を逃がしておく。本明細書に記載するバチルス系組成物は、このように空気を逃がした期間の後、植え付け前、植え付け時又は植え付け後に適用される。幾つかの場合、燻蒸剤は製品ラベル上で推奨される割合より低い割合で適用される。
[0167] 燻蒸殺センチュウ剤などの燻蒸剤には、クロロピクリン（CHLOR-O-PIC（登録商標））、臭化メチル(METH-O-GAS（登録商標）)及びその組合せ（BROM-O-GAS（登録商標）とTERR-O-GAS（登録商標）など）、１，３−ジクロロプロペン（TELONE（登録商標）II、TELORE（登録商標）EC、CURFEW（登録商標））及び１，３−ジクロロプロペンとクロロピクリンとの組合せ（TELONE（登録商標）C-17、TELONE（登録商標）C-35、及びINLINE（登録商標））、ヨウ化メチル（MIDAS（登録商標））などのハロゲン化炭水化物と、ナトリウムメチルジチオカルバメート（VAPAM（登録商標）、SOILPREP（登録商標）、METAM-SODIUM（登録商標））などのメチルイソシアネート遊離促進物質と、１，３−ジクロロプロペンとメチルイソチオシアネートの組合せ（VORLEX（登録商標））と、テトラチオ炭酸ナトリウム（ENZONE（登録商標））及び二硫化ジメチル又はＤＭＤＳ（PALADINO（登録商標））などの二硫化炭素遊離促進物質が含まれる。以上の燻蒸剤それぞれの市販の組成物は、化学名の後のカッコ内で提供されている。
[0168] また、本発明の組成物は、総合的害虫駆除（「ＩＰＭ」）プログラムの一部として適用することもできる。このようなプログラムは、様々な出版物、特に大学の連携公開講座で説明されている。センチュウについては、このようなプログラムは、標的センチュウの宿主となり得ない作物との輪作、栽培及び耕耘の実線、及び移植の使用を含む。例えば、本明細書に記載するバチルス系組成物は、生育期の後にカラシ又は他のセンチュウ抑制作物と一緒に適用することができる。
[0169] 幾つかの実施形態では、植物、植物の部分又は植物部位へと本発明の組成物を適用する前に、処理を必要とする部位を識別する。センチュウ防除のために、このような識別は萎黄病、発育阻害、ネクローシス、又は萎れる（すなわち栄養が欠乏しているように見える）ような植物を目で見た識別を、通常はセンチュウ問題の履歴に関する知識、植物のサンプリング及び／又は土壌のサンプリングと組み合わせて実行することができる。植物サンプリングは、生育期中に、又は最終収穫の直後に実行することができる。植物を土壌から取り出し、その根を検査して、用地内のセンチュウ問題の性質及び程度を求める。ネコブセンチュウの場合、根のえい瘤の重症度は、えい瘤がある根系の割合を測定することによって求める。えい瘤は根から容易に分離されないので、ネコブセンチュウによって引き起こされたえい瘤は、窒素固定土壌細菌の根粒から区別することができる。ネコブセンチュウの土壌生物個体群レベルは根えい瘤の重症度とともに上昇する。幾つかの場合、いかなるレベルの根えい瘤でも検出された場合、それは感受性が高い作物の植え付けに、特にサンプリング区域又はその付近でネコブセンチュウの問題があることを示唆する。シストセンチュウは、植物のサンプリング及びシストを調べる根の精査によっても識別することができる。
[0170] 土壌のサンプリングは、土壌又は根の特定の体積に寄生するセンチュウ及び／又はセンチュウの卵の数を求める手段を提供する。土壌サンプリングは、問題が最初に疑われたとき、最終収穫時、又は新しい作物を植え付ける前の任意のとき、例えば、以前の作物の廃棄前に実施することができる。大学の連携公開講座プログラムは、フロリダ大学、オレゴン州立大学及びネブラスカ−リンカーン大学などの土壌サンプリングサービスを提供する。さらに、このようなプログラムはサンプリングの採集方法のガイドラインを提供する。例えば、収穫後の予測サンプリングの１つの方法で、サンプルは（作物の価値に応じて、作物の価値が高いほどサンプリングするエーカー数を少なくして）５又は１０エーカーにわたる１０〜２０の用地から深さ６インチ（１５．２ｃｍ）〜１０インチ（２５．４ｃｍ）の深さの土壌で規則的なジグザグのパターンにして採集する。定着した植物を試験する方法では、症状があるが枯れたり枯れそうになったりしていない、すなわち分解していない疑わしい植物から、６インチ（１５．２ｃｍ）〜１０インチ（２５．４ｃｍ）の深さの土壌で根及び土壌のサンプルを取り出す。
[0171] 幾つかの実施形態では、識別は、センチュウなどの害虫の経済的閾値、すなわち処理しない場合に予想される経済的損失が処理の費用を超える点に到達しているか否かを決定することを含む。経済的閾値は、作物、地理、気候、植え付けのとき、土壌のタイプ、及び／又は土壌温度に応じて変化する。この主題に関しては多数の論文が発表されており、様々な地域の大学の連携公開講座プログラムからガイドラインが入手可能である。例えば、Robb, J.G.他の、「Factors Affecting the Economic Threshold for Heterodera schachtii Control in Sugar Beet」（Economics of Nematode Control January-June 1992）、Hafez, Saad L.の、「Management of Sugar Beet Nematode」（University of Idaho Current Information Series (CIS) 1071 (1998)、及び「UCIPM Pest Management Guidelines: Tomato」（UC ANR Publication 3470 Nemalodes A. Ploeg, Nematology, UC Riverside (January 2008)）を参照されたい。特定の季節に特定の作物の経済的閾値を決定することについては、十分に当業者の技能に入る。
[0172] 幾つかの実施形態では、土壌サンプリングは、センチュウの寄生により収量が寄生していない土壌の平均値の約８０％、約９０％、又は約９５％になることを明らかにする。
[0173] 幾つかの実施形態では、土壌サンプル１キログラム当たりのネコブ幼若体の経済的閾値は少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約７５０、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、又は少なくとも約６０００である。
[0174] 幾つかの実施形態では、土壌１ｃｍ3当たりのシストセンチュウの卵及び幼生の経済的閾値は少なくとも約０．５、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４である。上記のHafez (1998)によれば、１個のシストは５００個の生存卵及び幼生と概算することができる。
[0175] また、本発明は、Bacillus subtilisクレード内のバチルス種の細胞をスクリーニングし、ｓｗｒＡ遺伝子に突然変異がある細胞を選択し、ｓｗｒＡ−突然変異がある細胞の発酵生成物を生成することにより、植物成長増進細胞生成物を識別及び／又は生成する方法も含む。幾つかの実施形態では、スクリーニングはバチルス種を植え付けること、個々の細菌コロニーを選択すること、各コロニーからＤＮＡを分離すること、及び図５で提供されたｓｗｒＡ配列に基づいてプライマーを使用してｓｗｒＡ遺伝子の配列を決定することを含む。適切なＰＣＲ条件が当業者には知られている。例示的プライマー及びＰＣＲ条件を実施例２４で説明する。
[0176] 幾つかの実施形態では、スクリーニングに先立って細胞を培養して、以下の特徴のうち１つ又は複数を有する細胞を選択する。すなわち、サンドペーパー形態、又は野生型細胞と比較して低い遊走能力である。遊走能力は、実施例７で説明するものと同じ方法で評価することができる。
[0177] 他の実施形態では、選択するステップは、ｓｗｒＡ細胞に突然変異があり、野生型細胞と比較して植物の健康を改良する能力が増進された細胞を選択することも含む。一態様では、これは、発酵生成物を植物、植物の部分及び／又は植物部位に適用することと、植物の成長を、このような発酵生成物が適用されていない基準植物及び／又は突然変異を有していない同質遺伝型細胞からの発酵生成物が適用された基準植物と比較することとを含む。
[0178] さらに他の実施形態では、スクリーニングは、配列番号１の１位〜３位又は２６位〜３４位に対応するｓｗｒＡ遺伝子の突然変異をスクリーニングすることを含む。
[0179] 選択されたｓｗｒＡ−細胞は、様々なｓｗｒＡ突然変異の説明において本明細書で説明した突然変異のいずれかを有することがある。
[0180] また、本発明は、植物成長増進細菌生成物をスクリーニングする方法を含み、該方法は、（ｉ）突然変異の細菌細胞を生成するためにBacillus subtilisクレード内のバチルス種から細菌細胞の野生型ｓｗｒＡ遺伝子を突然変異させることと、（ｉｉ）突然変異細菌細胞を培養して、その特定の細胞形態を特徴付けることと、（ｉｉｉ）寒天などの固体表面で野生型ｓｗｒＡ遺伝子を有するBacillus subtilisクレード内のバチルス種から細菌細胞の個体群を培養することと、（ｉｖ）以上のステップ（ｉｉ）で識別した細胞形態がある細菌細胞を選択することとを含む。幾つかの実施形態では、ｓｗｒＡ突然変異はアンチセンス又はトランスポゾン技術によって生成される。特定の例を実施例２５で提供する。
[0181] 別の実施形態では、本発明は植物成長促進生成物を生成する方法を含み、該方法は、
ａ．ｓｗｒＡ遺伝子又はそのオルソログに突然変異を含む細菌細胞を培養することを含み、突然変異は、固体又は非液体表面上で増殖すると、突然変異を有していない細菌細胞と比較して細胞の遊走能力を低減し、さらに、
ｂ．胞子形成するように突然変異を有する細菌細胞を増殖させることを含む。
[0182] 別の態様では、上記方法は、ステップ（ｂ）からの細菌細胞を乾燥させることをさらに含む。さらに別の態様では、上記方法は、担体又は配合不活性物質を添加することをさらに含む。さらに別の実施形態では、増殖ステップは生物発酵槽中で実施される。幾つかの実施形態では、生物発酵槽は少なくとも２Ｌの容積を有する。
寄託情報
[0183] ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋、ＱＳＴ３０００２（別名ＡＱ３０００２）及びＱＳＴ３０００４（別名ＡＱ３０００４）のサンプルが、米国農務省農業研究事業団のNational Center for Agricultural Utilization Researchにある農業研究事業団微生物株保存機関（1815 North University Street, Peoria, IL 61604）に寄託されている。ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋（２０１０年１０月５日寄託）には、NRRL B-50420という寄託記号が割り当てられている。ＱＳＴ３０００２（２０１０年１０月５日寄託）にはNRRL B-50421という寄託記号が割り当てられている。ＱＳＴ３０００４（２０１０年１２月６日寄託）にはNRRL B-50455という寄託記号が割り当てられている。
[0184] ３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．セクション１１２の権能付与要件を満たし、本発明の細菌株の寄託が３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８０１〜１．８０９に規定された基準に適合することを証明するために、出願人は寄託したBacillus subtilis株ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋、ＱＳＴ３０００２及びＱＳＴ３０００４（ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−５０４２０、Ｂ−５０４２１及びＢ−５０４５５として寄託）に関して、以下の表明をする。
[0185] １．本出願の係属中に、要求に応じて本発明へのアクセスが長官に与えられる。
[0186] ２．本特許の承認後、細菌株は３７ＣＦＲ§§１．８０８に規定された条件により公開される。
[0187] ３．寄託物は、３０年間、又は最後の要求から５年間の期間、又は特許の実施可能期間のうち、いずれか長い方の期間、公的保管庫に維持される。
[0188] ４．寄託時の生物学的材料の生存能力が試験される。
[0189] ５．万一使用不可能になった場合、寄託物は交換される。
[0190] 本出願の係属中に、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４及び３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２により特許商標庁長官によって資格を有すると判断された人に対して本寄託物へのアクセスが与えられる。３７ＣＦＲ１．８０８のパラグラフ（ｂ）に従い、本出願のいずれかの請求項が許可された後、細菌株の公開に関する制約はすべて取り外され、その取り消しは不能である。
[0191] 以下の実施例は、純粋に例示のために与えられ、本発明を限定する目的はない。
＜実施例＞
実施例１−サンドペーパー突然変異体の形態の識別
[0192] サンドペーパー形態を有する最初のBacillus subtilis細胞は、SERENADE（登録商標）の商業的バッチの日常的品質管理（ＱＣ）中に思いがけず識別され、分離された。
[0193] サンドペーパー変異体は、栄養寒天培養プレート上にＱＳＴ７１３野生型細胞とは異なるコロニー形態を呈した。サンドペーパー細胞は、固体培地上に非常にコンパクトな疎水性コロニーを形成した（図１のKeyenceディジタル顕微鏡で撮影したＱＳＴ７１３野生型及びサンドペーパーコロニーの画像を参照）。「サンドペーパー」という名称をこれらの変異体に与えたのは、その表現型がコンパクトで非常に「クリスピー」である平坦で乾燥したコロニーとなり、それが増殖している寒天から取り出すことが非常に困難だった（すなわち非常に付着性のコロニーであった）からである。この最初の発見から、サンドペーパー形態を有する単一株を最初に分離し、さらに特徴付けるために選択した。この株はＡＱ３０００２と称された。
[0194] 固体培地上に独特なコロニー形態を有することに加えて、ＡＱ３０００２は初期の対数期に液体培地中に細胞の長鎖を形成することも観察された。対照的に、ＱＳＴ７１３野生型細胞はこの同じ増殖段階中に短鎖を形成するか、又は単細胞のままであった（図２の顕微鏡画像を比較されたい）。
[0195] ＡＱ３０００２は、高剪断液体培地中での増殖に対して独特の形態反応も呈する。ＡＱ３０００２とＱＳＴ７１３は、振盪した液体培地中で増殖させると非常に類似した形態及び増殖習慣を示すが、チューブに物体（例えば、プラスチックのピペット先端）を入れると、培地中のこの物体の動作によって生じた乱流の増大が、ＡＱ３０００２のみで形態シフトを引き起こし、分裂（連鎖形成）後に生長する細胞が分離することを防ぎ、フィラメントの大きい塊を生成する。この表現型は、８〜９時間増殖した後に培養チューブの顕微鏡観察と直接観察の両方で観察することができる。以下のようにして得られた図３の画像を比較されたい。ＡＱ３０００２及びＱＳＴ７１３のグリセロール培養株を栄養寒天プレート上で一晩増殖させた。各プレートの１つのコロニーを８ｍＬスナップキャップチューブ中の３ｍＬのLuriaブロスに個々に入れ、１ｍＬのＤＮａｓｅのないピペット先端を接種したチューブに入れた。各プレートからの１つのコロニーを、ピペット先端がないチューブ内でも同じ条件で増殖させた。チューブを３７℃にて２６０ｒｐｍで振盪させ、８〜９時間後に光学顕微鏡を使用して増殖を比較した。
[0196] 幾つかのバチルス遺伝子（例えば、ｓｉｎＲ）が、生物膜生成の活性化因子として、又は（突然変異した場合に）構成性の生物膜生産因子として以前に識別されている。Dan Kearns（インディアナ大学）からの個人的情報に基づくと、ｓｉｎＲ突然変異体は液体培地中で増殖した場合に「塊状」になり、これはこの突然変異体が環境シグナルに関係なく常に生物膜を生成しているという概念に合致する。この特性は商業的に発達させるためには望ましくなく、概して、ｓｉｎＲなどの生物膜生産の下流にあるエフェクタ遺伝子は商業的に良好な候補にならないことを示唆する。
[0197] 対照的に、ｓｗｒＡは、バチルス細胞がその環境に対応できるようにする自然の細胞スイッチの一部であるように見える。ｓｗｒＡはこれまで生物膜調整因子と説明されたことがないが、液体培地中の２つの独特の形態学的状態、すなわち単一のプランクトン様細胞又は結合した細胞の鎖の間で細胞をシフトさせる際に役割があることが認識されている（Kearns及びLosickの、「Cell Population Heterogeneity During Growth of Bacillus subtilis」（Genes and Development (2005):19, pp3083-3094））。この報告書と一致して、ｓｗｒＡ突然変異細胞はまだ環境シグナルに応答している。液体培地中で増殖させると、これらの細胞は単細胞又は鎖として増殖するが、凝集したり細胞膜を形成したりしないように見える。根又は固体培地上で増殖させると、これらの細胞が密集してコンパクトな生物膜の生産をオンにすることは予想外である。これは、ｓｗｒＡが、細胞を独特のタイプの生物膜を産生する能力を有するようにシフトさせ、それでも（経路の早期に作用するので）細胞が環境シグナルに応答できるようにする（例えば、液体培地中では非接触増殖し、固体培地上で増殖する場合は生物膜を形成する）という通常の遺伝子スイッチであるという概念に合致する。
実施例２−バイオリアクタ中でのBacillus subtilis ＱＳＴ７１３全ブロスの調製
[0198] バイオリアクタ中で増殖したBacillus subtilis ＱＳＴ７１３の培養物は、サンドペーパー変異細胞を多少小さい割合で含むことが観察された。Bacillus subtilis ＱＳＴ７１３の保存株は、グリセロール溶液の小さいバイアル中で凍結状態にされる。バイオリアクタ中で全ブロスを生成するために、培養株のバイアルを解凍し、内容物をディフコ栄養ブロスなどの適切な培地の殺菌したフラスコに移す。フラスコの培養物は、微生物の増殖を促進する状態で、通常は２５℃と３７℃の間の温度、１００ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍの回転速度で回転振盪装置でインキュベートする。フラスコ中の細胞密度が十分高くなったら、内容物をバイオリアクタ中で殺菌した新しい増殖培地に移す。
[0199] バイオリアクタは、生物の増殖及び活性代謝物の発生を促進させるために、特定の温度、攪拌、ｐＨ及び曝気を制御される。典型的なバイオリアクタの設定には、２５℃と３７℃の間の温度設定、２００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍの攪拌設定、６と８の間のいずれかに維持されるように緩衝されたｐＨ、及び０．２と１．０ＶＶＭの間に設定された曝気が含まれる。細胞増殖及び代謝物生産が終了するのは、通常はインキュベーションが２４〜７２時間以内であり、収量時に培養ブロスを収穫し、次に細胞のカウント及び純度を検定する。これらの試験が終了し、合格した後、ブロスはラボラトリの実験に使用することができる。
[0200] あるいは、保存剤及び他の添加剤（増粘剤及び分散剤など）をバイオリアクタのブロスに混入して、現地試験の実験用の商品をシミュレートすることができる。
実施例３−Bacillus subtilis ＱＳＴ７１３のサンドペーパー突然変異頻度の定量化
[0201] AgraQuest, Inc.（カリフォルニア州デービス）が生産したSERENADE（登録商標）ASOの様々な市販用ロットを希釈し（１／１０Ｅ＋６）、栄養寒天（ＮＡ）で平板培養して個々のコロニーを解像した。サンドペーパー様コロニーは、１６ＳｒＤＮＡ配列決定によって、ＱＳＴ７１３野生型の突然変異体であることが確認された。
[0202] サンドペーパーコロニーの数を、生産されたコロニー総数のパーセンテージとして定量化した。特徴的なコロニー形態を有するサンドペーパーコロニーが、分析したSERENADE（登録商標）ASOの市販用ロット（図４参照）からは０．０％〜１．３％まで、分析したSERENADE（登録商標）MAXの市販用ロットからは０．０％〜３．２％まで変化する頻度で得られた。
[0203] 以上で検討したように、SERENADE（登録商標）MAXのＥＰＡマスターラベルはその商品が１４．６％の乾燥ＱＳＴ７１３を含むことを規定している。SERENADE（登録商標）MAXの市販用サンプルが最大で１４．６％の乾燥ＱＳＴ７１３野生型／サンドペーパーを含んでいる場合、及び最大でその３．２％しかｓｗｒＡ変異体でない場合は、SERENADE（登録商標）MAXの市販用サンプルが最大で（０．１４６×０．０３２）＝０．００４６７２＝０．４６７２％又は０．５％未満の乾燥サンドペーパー変異体（すなわちｓｗｒＡ−）を含む。
[0204] 野生型形態の単一コロニーから誘導したＱＳＴ７１３細胞も、個々のコロニーを得るためにフラスコに入れてLuriaブロス中で一晩増殖させ、希釈して、栄養寒天上で平板培養した。サンドペーパーコロニーを識別し、突然変異頻度は１／１６，０００と計算された。これは他の遺伝子の自然な機能喪失頻度より大きい桁であり、ｓｗｒＡが過剰突然変異相の変異座であるという概念と合致する（D.B. Kearns他の、「Genes Governing Swarming in Bacillus subtilis and Evidence for a Phase Variation Mechanism Controlling Surface Motility」（Molecular Microbiology (2004), 52:357-369））。６つの個別サンドペーパーコロニーからのｓｗｒＡ遺伝子のヌクレオチド配列を配列決定した。６つのコロニーはすべてｓｗｒＡ陰性であることが判明した。したがって、ＱＳＴ７１３ではすべてのサンドペーパーコロニーがｓｗｒＡ陰性であると推論する。
実施例４−市販用バチルス株におけるサンドペーパー様突然変異頻度の定量化
[0205] バチルス株を含む様々な追加の市販用バイオ農薬製品も分析して、サンドペーパー様形態の細胞を識別できるかを判断した。本明細書で使用する「サンドペーパー様」又は「ｓｐ様」とは、寒天栄養剤上で増殖させた場合に、ＱＳＴ７１３サンドペーパー細胞（例えば、図１参照）のコロニー形態と類似したコロニー形態を有する細胞を指す。
[0206] 実施例２で説明したような個別コロニーを解像するために、市販用株を液体培地中で増殖させ、希釈して、栄養寒天（ＮＡ）上で平板培養した。これらの商品におけるサンドペーパー様コロニーの頻度は、０％〜０．７％の間で変化した（表５参照）。
[0207] 非サンドペーパー様コロニーで最も多く観察されたコロニー形態は、以下の通りである。
[0208] Kodiak（登録商標）−光沢があり、中心が隆起して、縁部が波立っている。
[0209] Companion（登録商標）−隆起し、半透明の３Ｄ中心、しわがある縁部。この野生型以外の代替的発現型（すなわち形態）が、大きい塊として観察された。
[0210] Taegro（登録商標）−円形の隆起した表面と粗く凹凸がある縁部。３つのＱＳＴ７１３野生型様コロニーも観察された。
[0211] Rhizovital（登録商標）−台地様、密集して隆起した中心、光沢なし。
[0212] FolioActive（登録商標）−光沢がある隆起した中心と波状の縁部。Kodiak（登録商標）ほど変動がない。２つのＱＳＴ７１３野生型様コロニーも観察された。
[0213] Yield Shield（登録商標）−隆起した中心と平坦な周囲の縁部、周囲の縁部には気泡の小さい輪。４つのＱＳＴ７１３野生型様コロニーも観察された。
[0214] これらの商品のサンドペーパー様変異体全部のｓｗｒＡ遺伝子も分析し、意外にもすべて野生型（ｓｗｒＡ＋）であった。ＱＳＴ７１３以外の細胞では、サンドペーパー形態自体は、ｓｗｒＡ−突然変異及び植物健康改良能力の増進を予測するのに十分ではない。
実施例５−サンドペーパー形態の原因である遺伝子突然変異の識別
[0215] サンドペーパー形態を有するＱＳＴ７１３変異体の複数の分離株の全ゲノムショットガン配列決定を使用して、サンドペーパー表現型の原因である遺伝子突然変異を識別した。ＱＳＴ７１３由来の元のＡＱ３０００２分離株に加えて、サンドペーパー表現型を呈する４つの追加のＱＳＴ７３突然変異体（すなわちＡＱ３０００３、ＡＱ３０００４、ＡＱ３０００５、及びＡＱ３０００６）の配列を決定した。
[0216] Illumina（カリフォルニア州サンディエゴ）によって提供される次世代配列決定テクノロジーを使用して、合計で各分離株のゲノムの約７０ｘ網羅率になる配列読み出しを生成して、基準のＱＳＴ７１３野生型ゲノムと並べた。
[0217] MAQ（Li, H.他の、「Mapping Short DNA Sequencing Reads and Calling Variants Using Mapping Quality Scores」（Genome Res.(2008)18, 1851-1858））及びBWA（Li, H.及びDurbin R.の、「Fast and Accurate Short Read Alignment with Burrows-Wheeler Transform」（Bioinformatics(2009) 25, 1754-1760）などの公開された突然変異ツールを流用して、突然変異の可能性がある箇所を識別した。以下の統計及び生物学に基づく仮説を使用して偽陽性を除外した。
[0218] １．すべての生きたサンドペーパー分離菌（すなわちＡＱ３０００２〜ＡＱ３０００６）が全く同じ位置に同じ突然変異を呈する可能性は非常に低い。
[0219] ２．５つの分離菌が全く同じ突然変異を呈する場合、これは基準ゲノムにおける配列決定エラーに起因する可能性が最も高い。
[0220] ３．サンドペーパー発現型は、１つの遺伝子における単一の突然変異を原因とする可能性が最も高い。
[0221] ４．突然変異はコード化領域にある可能性が高い。
[0222] ５．突然変異はタンパク質に劇的な変化を引き起こす可能性が高い。影響を受けたコドンを終止コドンに変化させた場合、又は開始コドンを非開始コドンに変化させた場合は単一の塩基変化が考慮された。フレームシフト突然変異を引き起こした場合は、挿入及び欠失が考慮された。
[0223] ６．突然変異が基本的遺伝子にある可能性は低い。
[0224] 以上の仮説を分析パイプラインに組み込むことにより、ｓｗｒＡは、サンドペーパー形態を有するＱＳＴ７１３細胞における突然変異の唯一の候補遺伝子と識別された。
[0225] 以上で配列決定したサンドペーパー変異体で識別されたｓｗｒＡ突然変異対立遺伝子はその後、個々の分離菌からのこの領域のSanger配列決定（Sanger, F.他の、「DNA Sequencing with Chain-Terminating Inhibitors」（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74, 5463-5467））によって確認された。代表的なサンドペーパー分離菌ＡＱ３０００２及びＡＱ３０００４から、及びＱＳＴ７１３を含む様々な野生型バチルス株から予測されるｓｗｒＡ転写産物を比較する配列の位置合わせを図５に示す。
[0226] Sangerの再配列決定で、ＱＳＴ７１３のｓｗｒＡ配列が、次世代配列決定によって生成された基準配列と一致したことが確認された。図５は、予測される対象のコード化配列を、バチルス遺伝学の当業者に知られている標準であるBsub_3610のｓｗｒＡの予想されるコード化配列と比較している。
[0227] この分析は、ＡＱ３０００２、ＡＱ３０００３、及びＡＱ３００６がすべてｓｗｒＡに１ｂｐの欠失を含み、その結果、フレームシフト及び未熟終止コドンになり（図５のＡＱ３０００２参照）、ＡＱ３０００４及びＡＱ３０００５ではｓｗｒＡ開始コドンが突然変異して別の（非開始）コドンになる（図５のＡＱ３０００４参照）ことも検証した。
[0228] ｓｗｒＡのオルソログは、バチルス属のうち一握りの種にしか存在しない。ｓｗｒＡ遺伝子を有する可能性が高いBacillus subtilisクレード内の要素を識別するために、密接に関連したバチルス種それぞれからの完全長１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を、ClustalWという複数配列アラインメントプログラムを使用して位置合わせした。次に、ClustalWのアラインメントをPHYLIPフォーマットに変換して、系統樹を生成した（図６参照）。次に公的ゲノムデータベースを照会して、どの種が確認されたｓｗｒＡオルソログ配列を有するかを識別し、これらの種（すなわちB. pumilus、B. atrophaeus、B. amyloliquefaciens、B. subtilis及びB. licheniformis）を図６で二重アステリスクで示した。ｓｗｒＡは、極めて独特なタンパク質であり、この群以外で関連するタンパク質は識別できず、予測される機能もない。バチルス種のこの群（B. subtilisクレード）は１６ＳｒＤＮＡとの比較によって単系であり、ｓｗｒＡ遺伝子はクレードの４つの分岐すべてに存在するので、この遺伝子はこの系統の早期に生じ、群内の全種に存在する可能性が最も高いとの結論に達した。
[0229] Kearns他（「Genes Governing Swarming in Bacillus subtilis and Evidence for a Phase Variation Mechanism Controlling Surface Motility」（Molecular Microbiology (2004) 52(2):357-369））は、開始コドンの可能性があるものを２つ、すなわちＴＴＧ及びＧＴＧを識別した。ＧＴＧはＴＴＧより塩基３５個分上流である。各コドンの別個の突然変異後、突然変異ＴＴＧのみが下流のレポータからの発現を消すことが観察され、これが本当の開始コドンであったとの結論に至った。ｓｗｒＡの翻訳開始コドンの予測に関して、文献に不一致があることに気付いた（例えば、本明細書ではｓｗｒＡ翻訳の開始が、GenBank ID ABV89964.1のBacillus subsp. subtilis株NCIB 3610のｓｗｒＡ遺伝子では７５ｂｐ上流であると予測される（図５）。そこで引用されるZeigler他の２００８年の、「The origins of 168, W23, and Other Bacillus subtilis Legacy Strains」（J. Bacteriol. 190(21):6983-6995）も参照されたい）。さらに、Kearns.他（２００４、同書）で予測される開始コドンは非標準である。したがって、B. subtilisクレードの複数の種で配列の比較分析を実施した。遺伝子構造はB. subtilisクレードなどの密接に関連した種の間で良好に保存されていることが知られているので、この方法で、翻訳開始部位又は重要な遺伝子調節配列の位置など、遺伝子の特徴が強く確認された。
[0230] 本明細書でＱＳＴ７１３野生型、ＦＺＢ４２（B. amyloliquefaciens）、ＡＱ２８０８（B. pumilus）及びB. subtilis subsp. Spizizenii（Genbank ID NC_014479）という株で報告されているＴＴＧ開始コドンから塩基１００個分上流まで比較した。本明細書で報告したＴＴＧ開始コドンの場合以外に、ｓｗｒＡポリペプチドを生成する読み取りフレームを生成する開始コドン、ＡＴＧ又は代替物が他にないことが判明した。細菌遺伝学の当業者に知られているように、不測遺伝子座の１つがｓｗｒＡになるようであるが、多くの不測遺伝子座が代替開始コドンを使用する。例えば、Annu. Rev. Genet.(2006) 40:307-33を参照されたい。したがって、本当の翻訳開始はKearns他が予測したようにＴＴＧコドンにあるとの結論に達した。
実施例６−ＱＳＴ７１３サンドペーパー細胞の連続した継代
[0231] ｓｗｒＡ遺伝子配列に欠失があるＱＳＴ７１３サンドペーパー突然変異体（例えば、ＡＱ３０００２）は、フラスコ内でトリプチケースソイブロス（ＴＢＳ）培地（１７ｇ／Ｌの膵液カゼイン分解物、３ｇ／Ｌの大豆粉のパパイン分解物、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、２．５ｇ／Ｌのリン酸二カリウム、２．５ｇ／Ｌのデキストロース）中で１５継代後も安定していた。フラスコ内で１５回継代した後、サンドペーパー細胞をＮＡで平板培養した場合、ＱＳＴ７１３野生型に関連する細胞は見られなかった。これらの結果は、サンドペーパー突然変異が安定し、いつもの通りに増殖する。
実施例７−ＡＱ３０００２のｓｗｒＡの相補的分析
方法
[0232] ｓｗｒＡ−突然変異が植物成長発現型を増進する原因であることを確認するために、研究を実施した。ｓｗｒＡ遺伝子と、それぞれｓｗｒＡ遺伝子にコード化領域の上流でpPen_swrAと称された３００個のヌクレオチドを加えたもの（すなわち構成プロモータの転写制御下にあるｓｗｒＡ遺伝子）、及びendPro_swrAと称された同等物（すなわち自身のプロモータの転写制御下にあるｓｗｒＡ遺伝子）とを含む２つの構成を、ＱＳＴ７１３ｓｗｒＡ＋ゲノムＤＮＡから、ＤＮＡフラグメントをサブクローニングして、Bacillus subtilis MMB869中に存在する組み込み及び接合エレメント（ＩＣＥ）エレメントと適合するように設計されたプラスミドベクタにするための制限酵素部位を含むプライマーを使用して生成した（Wiep Klaas Smits及びAlan D. Grossmanの、「The Transcriptional Regulator Rok Binds A+T-Rich DNA and Is Involved in Repression of a Mobile Genetic Element in Bacillus subtilis」（PLoS Genetics (2010)6(11):e1001207）、Catherine A. Lee他の、「Identification and Characterization of int (integrase), xis (excisionase) and Chromosomal Attachment Sites of the Integrative and Conjugative Element ICEBsl of Bacillus subtilis」（Molecular Microbiology (2007)66(6):1356-1369）。ｉ）pPen_swrA構成のための構成プロモータによるｓｗｒＡ遺伝子、又はｉｉ）endoPro_swrA構成のための自身のプロモータによるｓｗｒＡ遺伝子のいずれかを含む濃縮した円形プラスミドＤＮＡを、自然の受容性によってドナー株Bacillus subtilis MMB869へと転換した。ＭＭＢ８６９は、B. subtilisの組み込み及び統合エレメント（ＩＣＥ Ｂｓ１）を含み、（上記のSmits及びGrossman参照）、これはプラスミドベクタ中でクローニングされたＤＮＡのバチルス種中への移動を容易にする。これは、バチルスゲノム中の位置と一致する２つの領域中に挿入された所望のＤＮＡ構成との自然の受容性によって生じる。
[0233] 自然の受容性が生じるのを可能にするために、ＭＭＢ８６９細胞をＳＰＣ培地（ＳＰＣ培地：１０ｍＬの１０Ｘ Spizizen、１ｍＬの５０％グルコース、４ｍＬの５％イースト抽出物、２．５ｍＬの１％カザミン酸、１．６ｍＬの２．５ｍｇ／ｍＬトリプトファン、０．５ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ４；１０Ｘ Spizizen塩：２％（ＮＨ４）２ＳＯ４、１４％無水Ｋ２ＨＰＯ４、６％Ｋ２ＨＰＯ４、１％クエン酸三ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、０．２％Ｍｇ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）中で増殖させ、ＳＰＩＩ培地（１０ｍＬの１０Ｘ Spizizen、１ｍＬの５０％グルコース、２ｍＬの５％イースト抽出物、１ｍＬの１％カザミン酸、１．６ｍＬの２．５ｍｇ／ｍＬトリプトファン、１ｍＬの５０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ４）に移し、ペレットにして、再びＳＰＩＩ培地中に懸濁させた。次に、精製したプラスミドＤＮＡを含む少量のＭＥ溶液（０．２００ｍＬの１０Ｘ Spizizen塩、０．０２０ｍＬの２００ｍＭ ＥＧＴＡ、１．７８０ｍＬの無菌脱イオン水）にＭＭＢ８６９細胞を加えた。細胞とＤＮＡの混合物を振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。
[0234] 細胞をＬＢ−カナマイシン寒天プレートで平板培養し、３７℃で一晩増殖させた。ＬＢ−カナマイシンプレートからの幾つかのコロニーをLB-Chloramphenicolプレートにパッチして、ダブルクロスオーバーの事象を介してプラスミドが挿入されていることを確認した。新たに転換したドナーＭＭＢ８６９株を使用してpPen_swrA及びendoPro_swrA構成をそれぞれ接合によってＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−株に移した。pPen_swrA 及びendoPro_swrA ICE構成を含むＭＭＢ８６９ドナー株をＬＢ−カナマイシンプレートで一晩増殖させた。AQ30002_strepR（ストレプトマイシン抵抗性遺伝子を含むＡＱ３０００２）をＬＢ寒天で一晩増殖させた。pPen_swrA及びendoPto_swrA MMB869株の単独コロニーをＬＢ＋カナマイシンに移した。AQ30002_strepRの単独コロニーもＬＢ＋カナマイシンに移した。これら３つの培養物を約１．０のＯＤ６００まで増殖させ、新しいＬＢ中で０．０２のＯＤ６００まで希釈し、３７℃で約１時間増殖させ、ＩＣＥ構成の切除を誘発するようにキシロースを添加し、接合を介してAQ30002_strepRへと転移させた。
[0235] 細胞を３７℃でさらに１時間増殖させ、その時点でこれらの培養物のＯＤ６００は約０．９であった。２．５ｍＬのドナー細胞を２．５ｍＬのAQ30002_strepR細胞と組み合わせ、無菌の膜フィルタ上に真空濾過した。フィルタをフィルタアセンブリから取り外し、滅菌技術を使用してＳＭＳ寒天プレート（合計２５０ｍＬの脱イオン水中に２５ｍｌｓの１０Ｘ Spizizen塩と３．７５ｇの寒天）に移して、３０℃で一晩インキュベートした。５ｍｌｓの１Ｘ Spizizen塩（１０Ｘ Spizizen塩を滅菌脱イオン水で１：１０希釈）でフィルタプレートから洗い流すことにより、細胞を回収した。１００μＬの細胞をＬＢ−カナマイシン／ストレプトマイシンプレートで平板培養し、３７℃で一晩インキュベートして、AQ30002_strepRの接合完了を識別した。残りの細胞溶液を遠心分離でペレット状にし、ＬＢに再懸濁させ、ＬＢ−カナマイシン／ストレプトマイシンで平板培養した。
[0236] ＡＱ３０００２をpPen_swrA構成又はendoPro_swrA構成で相補すると、その結果、サンドペーパー表現型が失われ、粘液様の野生型ＱＳＴ７１３ｓｗｒＡ＋表現型に復帰すると仮定した。コロニー形態に加えて、Joyce E. Patrick及びDaniel B. Kearnsの、「Laboratory Strains of Bacillus subtilis Do Not Exhibit Swarming Motility」（Journal of Bacteriology (2009)191(22):7129-7133）に記載されているように、ｓｗｒＡ遺伝子を加えると、ＡＱ３０００２が遊走アッセイ中で遊走能力を救済するか否かを評価することにより、相補性も確認した。図７を参照されたい。
[0237] 根のコロニー形成も、pPen_swrA構成又はendoPro_swrA構成を含むＡＱ３０００２細胞で測定した。トマトの種子を最初に７０％エタノールで、次に１０％漂白剤で表面滅菌した。次に、種子を滅菌脱イオン水ですすぎ、少量の滅菌水を含むウェル４８個のプレートの別個のウェルに入れた。種子を光（高輝度、８時間照明スケジュールに設定）に当てて室温で発芽させ、５〜７日後に使用した。
[0238] これらの発芽種子の根をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液中の細胞懸濁液に浸漬した。細胞懸濁液の濃度を正規化するために、これは１０Ｅ６ ＣＦＵ／ｍＬを生じる約ＯＤ６００ｎｍのＱＳＴ７１３であるので、０．０１のＯＤ６００ｎｍを使用した。浸漬後、次に各発芽種子を１２ｍＬの滅菌ＭＳ培地（２．２１５ｇ／ＬのMurashige及びSkoog（ＭＳ）塩、１．５％スクロース、１％寒天、ｐＨ５．７）を含む試験管に入れ、光に当てて室温で約１週間増殖させた。根のコロニー形成（根上の生物膜形成）をKeyenceディジタル顕微鏡で目視観測し、０（根のコロニー形成がないことを示す）から３（積極的な根のコロニー形成を示す）までの等級を付けた。各実験で、滅菌水に浸漬した根は負の対照標準の働きをした。
結果
[0239] pPen_swrA細胞のＩＣＥ構成をAQ30002_strepR（AQ30002_pPen_swrA_ICE細胞と称する）に挿入すると、非常に低い頻度で部分的粘液性形態を有する細菌細胞が生成された。確認し、将来実験するために、個々の接合完了体を採集し、個々のＬＢ−カナマイシン／ストレプトマイシンプレートにそれで再び筋をつけた。接合完了体の大部分は、サンドペーパー様形態を保持するか、サンドペーパーと粘液の混合物のように見えた。endoPro_swrA ICE構成をAQ30002_strepR（AQ30002_endoPro_swrA−_ICE細胞と称する）に挿入すると、１００％粘液性形態を有する細菌細胞が生成された。サンドペーパー様コロニーは観察されなかった。確認し、将来実験するために、個々の分離菌を採集し、個々のＬＢ−カナマイシン／ストレプトマイシンプレートにそれで再び筋をつけた。これらの結果はＩＣＥをAQ30015_strepRに挿入した場合、すなわちｓｗｒＡにＡＱ３０００２と同じ遺伝子突然変異があるＱＳＴ７１３から別個に誘導された第２のストレプトマイシン抵抗性株と等しかった（データは示さず）。
[0240] AQ30002_strepR及びAQ30015_strepRが元のｓｗｒＡ突然変異を保持し、pPen_swrA−_ICE及びendoPro_swrA_ICE構築物がｓｗｒＡの野生型を含んでいたことを確認するために、２つの別個の分離菌又は各接合完了実験からゲノムＤＮＡを精製し、内因性ｓｗｒＡ遺伝子座およびswrA_ICE構築物のＰＣＲ増幅を実行した。これらのＰＣＲ産物の配列決定で、内因性ｓｗｒＡ遺伝子座が突然変異であり、swrA_ICE構築物は野生型であることが確認された。
[0241] AQ30002_endoPro_swrA−_ICE細胞の他の特徴付けには、連鎖形成／凝集の程度をＡＱ３０００２と比較するために液体培養中で増殖させること、さらに定性アッセイ及び定量アッセイを使用してこれらの株の遊走能力をＡＱ３０００２と比較することが含まれた。３０℃の１４ｍＬのスナップキャップチューブ中のＬＢ液体培地を２５０ｒｐｍで振盪させて一晩増殖させた場合、AQ30002_endoPro_swrA−_ICE細胞は高度に連鎖形成／凝集したＡＱ３０００２の性質と比較して、曇って半透明に見えた。
[0242] 遊走性を試験するために、０．７％のＬＢ寒天プレートを一晩液体培養し、乾燥して、３７℃で約１０時間インキュベートするというインキュベーションループでインキュベートした。インキュベート後、AQ30002_endoPro_swrA−_ICE細胞は、野生型ＱＳＴ７１３と同様であるが、ＡＱ３０００２細胞とは極めて異なる状態でプレートをほとんど遊走した。AQ30002_endoPro_swrA−_ICE細胞は、ＡＱ３０００２株とは異なり、陽性に遊走する（図７）。AQ30002_endoPro_swrA−_ICE細胞は、定量遊走アッセイでＱＳＴ７１３と同様の速度で遊走する（データは示さず）。AQ30015_endoPro_swrA−_ICE細胞はすべてのアッセイで同様に挙動した（データは示さず）。
[0243] 根コロニー形成アッセイの結果は細胞連鎖形成／凝集及び遊走アッセイの結果と一致した。根コロニー形成アッセイでは、AQ30002_endoPro_swrA−_ICE細胞がトマトの根、さらにＡＱ３０００２又はAQ30002_strepR処理でコロニー形成しなかった（表６及び図８参照）。さらに、レプリカの各セットから最適にコロニー形成した根のサンプルの生物膜を見ると、AQ30002_pPen_swrA_ICE処理の生物膜は、（図９に示すように）ＱＳＴ７１３生物膜に類似しているように見えたAQ30002_endoPro_swrA−_ICE処理よりも、ＡＱ３０００２及びAQ30002_strepRの生物膜に一致しているように見えた。
実施例８−ＡＱ３０００２液体培養物の外被の頑強性
[0244] 液体培地の表面で増殖した細菌の細胞は、外被と呼ばれる多少連続的な膜を形成することがある。この膜は微生物の細胞と分泌された細胞外マトリクスからなる。したがって、外被は液体／空気の界面の生物膜を表す。本明細書でさらに説明するように、外被の頑強性は、外被が破断するか調べるために突くことによって、実験的に確認することができる。
[0245] B. subtilis株ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋のコロニーからのｗｔ１及びｗｔ２と称された２つのレプリカチューブ（すなわち単一のコロニーから増殖した１００％ｓｗｒＡ＋の細胞）と、B. subtilis株ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−のコロニーからのｓｐ１及びｓｐ２と称された２つのレプリカをポークストック培地又はピギー培地（１０ｇ／Ｌのグルコース、８ｇ／Ｌイースト抽出物、８ｇ／Ｌポークストック、ｐＨ８．５）中で対数期半ばまで増殖させた。ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−は、ポークストック培地中で同様の増殖速度を有した（図１０の増殖曲線を参照）。
[0246] ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−は、バイオログ表現型マイクロアレイ技術（カリフォルニア州ヘイワード）で決定して、抗生物質に対する同様の感受性、１５℃〜６５℃の温度範囲における同様の増殖パターン、血液寒天上の同様の増殖、及び同様の代謝プロフィールも有していた（データは提供せず）。
[0247] ２つの株を２０ｍＬのポークストック培地中で２００ｒｐｍ、３０℃で増殖させた。アリコートをウェル２４個のプレートでトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）培地（１７ｇ／Ｌの膵液カゼイン分解物、３ｇ／Ｌの大豆粉のパパイン分解物、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、２．５ｇ／Ｌのリン酸二カリウム、２．５ｇ／Ｌのデキストロース）中で希釈し、研究室の実験台上で室温にて３日間増殖させた。
[0248] 各株のサンプルは両方とも４つの複製ウェルを有し、したがって各株には検査用に合計８つの外被があった。各外被は、ピペット先端がプレートの底部に軽く当たるまで、３回突いた。突いた後も無傷のままであった外被の数を、破断した数と比較した。株は両方とも、ＴＳＢ培地で増殖すると３日後に外被を形成した。ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋によって形成された外被は８枚全部が突いた後に破断したが、ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−が形成した８枚の外被のうち破断したのは４枚のみであった（図１１参照）。
実施例９−根コロニー形成後のＡＱ３０００２生物膜の特徴付け
[0249] トマト種子を７０％エタノール及び１０％漂白剤で表面滅菌し、次に滅菌脱イオン水で濯いだ。
[0250] 滅菌発芽のために、種子を２枚の滅菌フィルタペーパーの間に入れ、滅菌脱イオン水を加えた。プレートをパラフィルムで封止し、室温で７日間（１２時間照明なし／照明ありのスケジュールで）光を当てると、発芽した種子があった。
[0251] これらの発芽種子の根をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液中のＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−又はＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋細胞の懸濁液に浸漬した。細胞懸濁液の濃度を正規化するために、０．００１のＯＤ６００ｍｍを使用した。これが、１０Ｅ６ ＣＦＵ／ｍＬを生成する約ＯＤ６００ｍｍのＱＳＴ７１３であるからである。
[0252] 滅菌増殖及び根コロニー形成を見込むために、浸漬後、次に各発芽種子を１２ｍＬの滅菌ＭＳ培地（２．２１５ｇ／ＬのMurashige及びSkoog（ＭＳ）塩、１．５％スクロース、１％寒天、ｐＨ５．７）を含む試験管に入れ、光に当てて室温で１０日間増殖させた。根のコロニー形成をKeyenceディジタル顕微鏡で目視観測した。
[0253] 水の対照標準にはコロニー形成がなかった。ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ;は先端を含む根全体でコロニー形成し、生物膜は非常に曇っていた。ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−も先端を含む根全体でコロニー形成し、生物膜はＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋よりコンパクトに見え、より密接に根に結合しているようであった（図１２参照）。
[0254] ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋生物膜と比較して、根の表面上のＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−生物膜の密集してコンパクトな性質を検証するために、上述したように追加のサンプルを準備した。光に当てて室温で１週間増殖させた後、ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋又はＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−細胞でコートされた根をエタノール中で脱水し、乾燥させ、金でコートし、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。今回も根表面上のＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−生物膜は、ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋によって形成された生物膜よりも非常にコンパクトなようであった（図１３参照）。この方法は野生型生物膜の拡散性を過小評価していることに留意されたい。この構造は、エタノール脱水中の収縮及び崩壊が非常に大きくなるからである。
[0255] ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋生物膜と比較して、根表面上のＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−生物膜をさらに特徴付けるために、追加の根サンプルに接種し、上述したように増殖させ、以下のように光学顕微鏡で分析した。根を寒天から優しく取り出し、Karnovsky固定剤に１５分間固定させて、エタノールのレベルを１００％まで上げながら脱水した。次にこれを臨界点乾燥し、無水オスミン酸で処理して、樹脂に埋め込んだ。幾つかの樹脂ブロックを厚く切断し、メチルブルーで染色して、固定し、１０〜４０ｘの倍率で顕微鏡で観察した。水の対照標準には根にコロニー形成がなかった。ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋細胞は、薄く低密度の拡散層で根を囲んでいた。明白な生物膜がないことは、野生型生物膜の弱い拡散性の人工産物であり、寒天から取り出した後、又は洗浄及び脱水ステップ中に失われた可能性が高い。対照的に、ＡＱ３０００２細胞は厚い密集した膜で根を囲んでいた。図１４を参照されたい。突然変異体の生物膜が同じ準備条件で根に付着することは、野生型構造よりも物理的にはるかに強靱で、付着性が高いことを実証している。
[0256] 同時に、固定して埋め込んだ他の根サンプルを薄く切断して装着し、透過電子顕微鏡で観察した。水の対照標準はコロニー形成を示さなかったが、ＱＳＴ７１３野生型ｓｗｒＡ＋細胞は教科書のバチルス栄養細胞のように見えた。ＡＱ３０００２細胞は全く異なる形体を示した。ＡＱ３０００２細胞の直径（０．８３μｍ±０．０６６；ｐ＜０．０５；ｎ＝１４；フィッシャー試験）はＱＳＴ７１３細胞の直径（０．５２μｍ±０．０２７；ｎ＝１１）より非常に大きかった。さらに、ＡＱ３０００２細胞ははるかに複雑な形態を示し、細胞の中心には大きい電子透過性（白い）領域があり、追加のコート又は細胞壁のように見えるものがあった。図１４を参照されたい。
実施例１０−トマト、トウモロコシ及び小麦の植物成長促進におけるＡＱ３０００２の活性
[0257] Bacillus subtilis ＱＳＴ７１３（すなわちSERENADE（登録商標）に見られるような野生型細胞とサンドぺーパ細胞の混合物）、ＡＱ３０００２（ｓｗｒＡ−）、ＱＳＴ７１３の別個の遺伝子変異体（７１３変異体）及びBacillus pumilus QST2808（ＡＱ２８０８と同義）それぞれからの全ブロスを種子灌注剤として準備した。リリアブロス（ＬＢ）を含む種子のフラスコに各株を接種し、これらのフラスコを３０℃で一晩増殖させた。翌日、各種子フラスコからのアリコートを大豆系培地に接種し、胞子形成するまで増殖させた。
[0258] 種子灌注の前に、ＣＦＵ／ｍＬに基づいて、全ブロスの最終濃度を市販のSERENADE（登録商標）製品の６４オンス／エーカーの比率まで希釈した。６４オンス／エーカーとは、種子１個当たりのコロニー形成単位数、すなわち２．２×１０８ＣＦＵ／植物１本を指す。本明細書で使用する量は、全ブロスのｃｆｕ／ｍＬに基づいて計算した。
[0259] プラグトレイ（Hummert、カタログ番号１４−３１２８）に種子発芽混合物を充填し、各細胞に１個の種子を植え付けた。「Spring Treat Hybrid」トウモロコシの種子、「Derkwin」小麦の種子、及び「QualiT 21」トマトの種子を使用した。このように、試験には単子葉植物種（すなわちトウモロコシ及び小麦）と双子葉植物種（すなわちトマト）の両方が含まれた。次に、各プラグトレイを２ｍＬの全ブロスサンプルで処理し、未処理の対照標準は２ｍＬの水を受けた。これらのトレイを室温で高輝度照明（約３００アインシュタイン、１６時間照明あり／８時間照明なしのスケジュールに設定）に当たるように配置した。必要に応じて水やりをした。肥料は使用しなかった。
[0260] 種子灌注から２週間後に、トマト、トウモロコシ及び小麦の苗を観察し、植物成長促進形質を調べた。次に、葉及び根の組織を採取し、紙袋に入れて乾燥し、計量した。ＡＱ３０００２で処理した苗は、水で処理した苗よりすべて緑が濃く、高く、全体的に健康なように見えた（図１５、図１６及び図１７参照）。ＡＱ３０００２で処理した苗の組織全部の乾燥重量は、乾燥重量が同じであったトウモロコシの根の一例を除き、未処理の苗からの対応する組織の乾燥重量よりはるかに重かった（図１８、図１９及び図２０参照）。
実施例１１−圃場でのＡＱ３０００２で処理した加工トマトの収量増進
[0261] カリフォルニア州エスカロン近郊、及びカリフォルニア州サンルイスオビスポ近郊で、トマト苗木を加工して２つの別個の圃場試験を実施した。移植時に灌注剤として材料を苗木に適用した。Bacillus subtilis株ＱＳＴ７１３（すなわちSERENADE（登録商標）に見られるような野生型とサンドペーパー様細胞との混合物、図４参照）及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−を、バイオリアクタ内の大豆系培地中で増殖させ、市販のSERENADE（登録商標）ASO製品を模倣するように配合し、商品の３．４クォート／エーカーと同等の濃度で適用した。植物成長刺激剤（ＰＧＳ）を６２５ｍＬ／エーカーで適用し、活性成分メフェノキサムを含むRIDOMIL GOLD（登録商標）SL（Syngenta）を１パイント／エーカーの割合で適用した。ランダム化完全ブロック（ＲＣＢ）法を使用し、処理毎に４回の反復試験をした。各反復試験は約２列×２５フィートで再現した。
[0262] Escalon近郊で実施した試験では、ＡＱ３０００２で処理した苗の販売可能な総収量は、未処理対照標準（ＵＴＣ）よりはるかに多かった（図２１参照）。
[0263] San Luis Obispo近郊で実施した試験では、処理のいずれも未処理対照標準より大量の販売可能な総量を生産しなかった（データは示さず）が、この試験は、苗木のＡＱ３０００２処理で可能な典型的な収量増進を示していないと考えられる。土壌のタイプ及び気候が、トマトを比較的一般に耕作しているカリフォルニアの地域と大幅に異なるSan Luis Obispo区域では、トマトは一般的に栽培されていないからである。また、試験が伝統的なトマト栽培区域とは地理的にずれ、収穫時期が乱れていたことが、疑わしい結果の一因となった。
実施例１２−圃場にてＡＱ３０００２で処理したトウモロコシの苗における倒伏率の低下及び茎腐敗（フハイカビ）発生率の低下
[0264] ミネソタ州ペインズヴィル近郊で、Zea mays indentata（デントコーン）変種のDekalb「ＤＫ２Ｃ２６」苗を使用して圃場試験を実施した。材料は、水で希釈した畝間又はＴ帯処理剤として苗に添加した。植物成長刺激剤（ＰＧＳ）を含むか、又は含まない既定の全ブロス以外、又はいかなる肥料又は他の製品もタンク混合には含めなかった。Bacillus subtilis株ＱＳＴ７１３（すなわちSERENADE（登録商標）に見られるような野生型とサンドペーパー様細胞との混合物、図４参照）及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−を、バイオリアクタ内の大豆系培地中で増殖させ、市販のSERENADE（登録商標）ASO製品を模倣するように配合し、商品の３．４クォート／エーカーと同等の濃度で適用した。植物成長刺激剤（ＰＧＳ）を６２５ｍＬ／エーカーで適用した。ランダム化完全ブロック（ＲＣＢ）法を使用し、処理毎に４回の反復試験片をした。各反復試験は４列×３０フィートで再現した。処理したトウモロコシの苗はいずれも、未処理対照標準と大きく異なる収量ではなかった（データは提供せず）。しかし、ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−で処理したトウモロコシの苗は、ＱＳＴ７１３で処理したもの又は未処理対照標準より倒伏率が大幅に低かった（図２２参照）。さらに、ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−を含む処理はすべて、未処理対照標準（ＵＴＣ）と比較してフハイカビによって引き起こされる茎腐敗の発生率が大幅に低かった（図２５参照）。
[0265] 別の圃場試験では、バイオリアクタ内の大豆系培地中で増殖させ、市販のSERENADE（登録商標）ASO製品を模倣するように配合したＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−を、根粒形成細菌、特にBradyrhizobium japonicumの細菌接種剤とともに、２クォート／エーターの割合で大豆の植え付け時に畝間に添加した。根を含む植物を４カ月後に採取し、未処理サンプルと処理サンプルの根粒形成を比較した。図２３及び図２４の結果を参照されたい。
実施例１３−葉の病害に対するＡＱ３０００２の活性
[0266] 葉の病害に対する処理としては想定されていないが、以下の植物病原体に対する活性を有するか、ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−を観察した。すなわち、Xanthomonas campestris pv. compestris、Colletotrichum orbiculare（キュウリの炭疽病）、Botrytis cinerea（トウガラシの灰色かび病）、Sphaerotheca fuliginea（キュウリのウドンコ病）、Pseudoperonospora cubensis（キュウリのべと病気）、Puccinia recondita（小麦の葉サビ病）、Pseudomonas syringae pv. tomato（トマトの細菌性斑点病）、及びBlumeria graminis f. sp. hordei（大麦のウドンコ病）である（データは提供せず）。
実施例１４−土壌病害に対するＡＱ３０００２の活性
[0267] ＱＳＴ７１３（すなわちSERENADE（登録商標）に見られるような野生型とサンドペーパー様細胞との混合物、図４参照）及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−株を、バイオリアクタ内の大豆系培地中で増殖させ、２０％濃度でPythium ultimum及びRhizoctonia solaniに対して全ブロスを試験した。植物病原体は、「産卵袋」内で２００ｇのバーミキュライト及び６００ｍＬのジャガイモデキストロース（ＰＤ）ブロスを含むFungi Perfectiから準備した。約１週間経ったPythium ultimum又はRhizoctonia solaniの全プレートを袋に接種し、使用する前に１週間増殖させた。
[0268] 種子発芽混合物を、混合物１リットル当たり１００ｍＬの脱イオン水で給湿し、次にRhizoctonia solaniの場合は混合物１リットル当たり８ｇ、Pythium ultimumの場合は６４ｇ／Ｌの割合で接種原を感染させた。次に、接種混合物を２．５インチ（６．３ｃｍ）のポットに入れた。非感染混合物も非感染対象標準（ＵＩＣ）として使用した。感染させ、混合物をポットに入れた後、各処理の各ポットに１０ｍＬの個々の処理剤を灌注した。灌注後、各ポットに目盛りが定められたスコップを使用して約６５個のアブラナ科の実生苗（品種：「Johnny's Broccoli for Sprouting」、カタログ番号２１０８）を植え付けた。ポットを水で飽和させ、高輝度照明の下に配置して、等級付けの前に１週間成長させた。
[0269] 実生苗の定量的発芽数を得ることができるように、各反復試験の個々の実生苗を、処理及び病害毎にカウントした。結果を非感染対照標準（ＵＩＣ）及び感染対照標準（ＩＣ）と比較して、活性を決定した（図２６参照）。特定の病原体を接種した土壌中で出芽し、生存した実生苗の数によって、病害防除を決定した。
[0270] 実施例１１及び１２で説明したように準備したＡＱ３０００２及びＱＳＴ７１３（すなわちSERENADE（登録商標）に見られるように、ほぼ２００：１の比率の野生型とサンドペーパー様細胞との混合物）を使用して圃場試験を実施し、様々な土壌植物病原体に対するその有効性を比較した。落花生及びカリフラワーのRhizoctonia及びレタスのVerticilliumによる萎れ病に関する試験では、病害の防除に関してＡＱ３０００２の性能の方がＱＳＴ７１３より優れているようであった。（詳細な結果は提供せず。）病害の防除に関して、ＡＱ３０００２はすべての試験ではＱＳＴ７１３の性能を上回っていなかった。
[0271] ＡＱ３０００２が別の土壌病害、すなわちSclerotium rolfsiiを防除する能力を試験するために、in vitro実験を実施した。予備試験によると、ＡＱ３０００２はこの病害に対してＱＳＴ７１３（すなわちSERENADE（登録商標）に見られるような野生型とサンドペーパー様細胞との混合物）よりも活性があった。（結果は提供せず。）
実施例１５−Phytophthora capsiciに対するＡＱ３０００２の植物内活性
[0272] ＱＳＴ７１３（すなわちSERENADE（登録商標）に見られるような野生型とサンドペーパー様細胞との混合物、図４参照）及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−株を、バイオリアクタ内の大豆系培地中で増殖させ、２０％濃度でPhytophthora capsiciに対して全ブロスを試験した。Phytophthora capsiciはＶ−８寒天で増殖させ、胞子嚢中の遊走子を滅菌脱イオン水中に放出できるようにした。次に、遊走子の濃度を、接種（植物１本当たり１０ｍＬ）用に２×１０Ｅ４個／ｍＬまで希釈した。
[0273] 鉢植え混合物中に植え付けてから２週間経ったトウガラシ（品種「California Wonder」）にそれぞれ１０ｍＬの全ブロス処理剤を灌注し、翌日Phytophthora capsiciを接種した。トウガラシ苗中の病害の進行及びＱＳＴ７１３又はＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−での処理による保護を監視するために、苗を８日間監視した。アルミニウムトリス（Ｏ−ホスホン酸エチル）を含む化学的殺カビ剤アリエッテも、３．２ｍｇ／ｍＬ及び１．６ｍｇ／ｍＬで試験した。ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−での処理は、ＱＳＴ７１３での処理よりも長期にわたって苗を保護し、生存した苗の総数も多かった（図２７参照）。
実施例１６−ＡＱ３０００２で処理した植物中の葉緑素含有量の増加
[0274] 種子灌注として使用するために、Bacillus subtilis ＱＳＴ７１３（すなわちSERENADE（登録商標）に見られるような野生型とサンドペーパー様細胞との混合物、図４参照）及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−それぞれから、全ブロスを準備した。Luriaブロス（ＬＢ）を含む種子フラスコに接種し、３０℃で一晩増殖させた。翌日、５ｍＬの種子フラスコを大豆系培地に接種した。フラスコは胞子形成が完了するまで増殖した。種子を処理する前に、全ブロスの最終濃縮物をＣＦＵ／ｍＬに基づいて市販のSERENADE（登録商標）製品の４、８、１６、３２、６４及び１２８オンス／エーカーの割合まで希釈した。
[0275] プラグトレイ（Hummert、カタログ番号１４−３１２８）に種子発芽混合物を充填し、各細胞に１個の種子を植え付けた。QualiT 21トマト種子を使用した。次に、各プラグトレイを２ｍＬの全ブロスサンプルで処理し、未処理の対照標準は２ｍＬの水を受けた。これらのトレイを室温で高輝度照明（約３００アインシュタイン、１６時間照明あり／８時間照明なしのスケジュールに設定）に当たるように配置した。必要に応じて水やりをした。肥料は使用しなかった。
[0276] 種子灌注から２週間後に、トマトの苗を観察し、植物成長促進形質を調べた。次に、葉の葉緑素量を定量化し、処理毎にランダムに葉３枚から３つの反復試験用の穴を開けた。葉の円盤を粉砕し、８０％アセトン（ａｑ）で抽出して、ＯＤ６００ｎｍの抽出物を採取した。
[0277] ＱＳＴ７１３及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−の両方の処理は、約１６オンス／エーカーから開始して最大１２８オンス／エーカーまですべて非常に明白な用量反応を有し、その結果、Ｈ２Ｏ対照標準より葉が緑になり、大きくなった。低い方の量（４〜１６オンス／エーカー）では、ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−処理の方がＱＳＴ７１３の対応する処理よりも緑が濃いように見えた。
[0278] ＱＳＴ７１３処理とＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−処理を比較したトマトの苗全体と個々の葉の画像が、それぞれ図２８及び図２９で見られる。目視観察に加えて、ＱＳＴ７１３とＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−全ブロスの割合の間で葉緑素含有量も比較した。統計学的に有意ではないが、ＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−処理で採取した葉は対応する割合のＱＳＴ７１３処理の場合より葉緑素の量が多いという対照的な傾向があった（ただし、３２オンス／エーカーでは両方とも同量の葉緑素を有するようであった）。図３０を参照されたい。
実施例１７−トマト植物成長促進におけるＡＱ３０００２の活性
[0279] 現場種子処理剤として使用するために、Bacillus subtilis ＱＳＴ７１３（すなわちSERENADE（登録商標）に見られるような野生型とサンドペーパー様細胞との混合物、図４参照）及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−それぞれから、全ブロスを準備した。ＮＡプレートから１つのコロニーをもぎ取ることによって、Luriaブロス（ＬＢ）を含む種子フラスコに接種し、これらのフラスコは３０℃及び２００ｒｐｍで振盪させた。翌日、５ｍＬの種子フラスコを培地２に接種した。培地２は５％ペプトン、５％デキストロース、３％イースト抽出物、３％麦芽抽出物、１．５％プロフロ綿実抽出物、１０％大豆粉及び０．５％ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏを含む。
[0280] 種子処理の前に、ＣＦＵ／ｍＬに基づいて、全ブロスの最終濃度を市販のSERENADE（登録商標）製品の６４オンス／エーカーの比率まで希釈した。６４オンス／エーカーとは、種子１個当たりのコロニー形成単位数、すなわち２．２×１０８ＣＦＵ／植物１本を指す。本明細書で使用する量は、全ブロスのｃｆｕ／ｍＬに基づいて計算した。
[0281] プラグトレイ（Hummert、カタログ番号１４−３１２８）に種子発芽混合物を充填し、各細胞に１個の種子を植え付けた。「QualiT 21」トマト種子を使用する。次に、各プラグトレイを２ｍＬの全ブロスサンプルで処理し、未処理の対照標準は２ｍＬの水を受けた。これらのトレイを室温で高輝度照明（約３００アインシュタイン、１６時間照明あり／８時間照明なしのスケジュールに設定）に当たるように配置した。必要に応じて水やりをした。肥料は使用しなかった。
[0282] 種子灌注から２週間後に、トマトの苗を観察し、植物成長促進形質を調べた。ＡＱ３０００２で処理した苗はすべて、水で処理した苗より緑が濃く、高くて、全体的に健康になると仮定した。ＡＱ３０００２で処理した苗の全組織の乾燥重量は、未処理苗の対応する組織より大幅に重くなることも仮定した。しかし、結果は培地２（対照標準として苗に適用）が植物の健康を促進したことを示した。したがって、出願人はこのアッセイから断定的な結論を引き出すことができなかった。
実施例１８−Pythium ultimum及びRhizoctonia solaniに対するＡＱ３０００２の植物内活性
[0283] ＱＳＴ７１３（すなわちSERENADE（登録商標）に見られるような野生型とサンドペーパー様細胞との混合物、図４参照）及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−株を培地２（５％ペプトン、５％デキストロース、３％イースト抽出物、３％麦芽抽出物、１．５％プロフロ綿実抽出物、１０％大豆粉及び０．５％ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）中で増殖させ、全ブロスを２０％全ブロス濃度でPhthium ultimum及びRhizoctonia solaniに対して試験した。植物病原体は、「産卵袋」内で２００ｇのバーミキュライト及び６００ｍＬのジャガイモデキストロース（ＰＤ）ブロスを含むFungi Perfecti（ワシントン州オリンピア）から準備した。約１週間経ったPythium ultimum又はRhizoctonia solaniの全プレートを袋に接種し、使用する前に１週間増殖させた。
[0284] 種子発芽混合物を、混合物１リットル当たり１００ｍＬの脱イオン水で給湿し、次にRhizoctonia solaniの場合は混合物１リットル当たり８ｇ、Pythium ultimumの場合は６４ｇ／Ｌの割合で接種原を感染させ、２．５インチ（６．３ｃｍ）のポットに入れた。非感染混合物も非感染対象標準（ＵＩＣ）として使用した。感染させ、混合物をポットに入れた後、各処理の各ポットに１０ｍＬの個々の処理剤を灌注した。灌注後、各ポットに目盛りが定められたスコップを使用して約６５個のアブラナ科の実生苗（Johnny's Broccoli for Sprouting、カタログ番号２１０８）を植え付けた。ポットを水で飽和させ、高輝度照明の下に配置して、等級付けの前に１週間成長させた。種子を非感染鉢植え混合物の層で覆い、ポットがすべて水で飽和するまで、脱イオン水を溢れさせた穴がないトレイにポットを入れた。ポットを高輝度照明の下に配置して、等級付けの前に１週間成長させた。
[0285] 実生苗の定量的発芽数を得ることができるように、各反復試験の個々の実生苗を各病害の処理毎にカウントした。結果を非感染対照標準（ＵＩＣ）及び感染対照標準（ＩＣ）と比較して、活性を求めた。特定の病原体を接種した土壌中で出芽し、生存した実生苗の数によって、病害防除を求めた。大豆系培地で増殖させた同じ株で以前に見られたように、病害防除に違いはなかった。
実施例１９−Phytophthora capsiciに対するＡＱ３０００２の植物内活性
[0286] ＱＳＴ７１３（すなわちSERENADE（登録商標）に見られるような野生型とサンドペーパー様細胞との混合物、図４参照）及びＡＱ３０００２ｓｗｒＡ−株を、培地２（５％ペプトン、５％デキストロース、３％イースト抽出物、３％麦芽抽出物、１．５％プロフロ綿実抽出物、１０％大豆粉及び０．５％ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）中で増殖させ、２０％濃度でPhytophthora capsiciに対して全ブロスを試験した。Phytophthora capsiciの遊走子をＶ−８寒天で増殖させ、接種（植物１本当たり１０ｍＬ）用に２×１０４個／ｍＬまで希釈した。
[0287] 鉢植え混合物中に２週間経ったトウガラシ（品種「California Wonder」）を植え付け、それぞれ１０ｍＬの全ブロス処理剤を灌注し、翌日Phytophthora capsiciを接種した。１週間後、処理毎にトウガラシの総数から死／非死について等級を付けた。これらの等級を感染対照標準（ＩＣ）及び非感染対照標準と比較した。アルミニウムトリス（Ｏ−ホスホン酸エチル）を含む化学的殺カビ剤アリエッテも、３．２ｍｇ／ｍＬ及び１．６ｍｇ／ｍＬで試験した。
[0288] トウガラシ苗中の病害の進行及びＱＳＴ７１３又はＡＱ３０００２での処理による保護を監視するために、苗を８日間監視した。ＡＱ３０００２での処理はＱＳＴ７１３（すなわちSERENADE（登録商標）に見られるような野生型とサンドペーパー様細胞との混合物）での処理よりも苗を長期間にわたって保護し、生存した苗の総数も多かった（結果は示さず）。
実施例２０−Bacillus subtilis３６１０ＳｗｒＡ−突然変異によるトマトの植物成長促進
[0289] 種子灌注剤として、3610WT Bacillus subtilis（すなわち野生型細胞で、本明細書では３６１０又は３６１０ＷＴと呼ぶ）及び３６１０ｓｗｒＡ−のそれぞれから全ブロスを準備した。3610WT Bacillus subtilisについてはKearns（２００４）に述べられている。３６１０ｓｗｒＡ−突然変異とは、Kearns（２００４）に記載され、３６１０の位置２６〜３４に生じる８つのＡ：Ｔ塩基対の連続範囲に挿入を有するｓｗｒＡ−突然変異を指す。種子フラスコに接種する３日前に、各株を栄養寒天（ＮＡ）上に筋状に並べた。ＮＡプレートから１つのコロニーをもぎ取ることによって、Luriaブロス（ＬＢ）を含む種子フラスコに接種し、これらのフラスコは３０℃及び２００ｒｐｍで振盪させた。翌日、５ｍＬの種子フラスコを大豆系培地に接種した。
[0290] 種子灌注の前に、ＣＦＵ／ｍＬに基づいて、全ブロスの最終濃度を市販のSERENADE（登録商標）製品の６４オンス／エーカーの比率まで希釈した。６４オンス／エーカーとは、種子１個当たりのコロニー形成単位数、すなわち２．２×１０８ＣＦＵ／植物１本を指す。本明細書で使用する量は、全ブロスのｃｆｕ／ｍＬに基づいて計算した。
[0291] プラグトレイ（Hummert、カタログ番号１４−３１２８）にSunshine #3鉢植え混合物（Sun Gro Horticulture）（１時間給湿して滅菌し、次に３日間換気した）を充填し、各細胞に１個の種子を植え付けた。「Spring Treat Hybrid」トウモロコシの種子、「Derkwin」小麦の種子、及び「QualiT 21」トマトの種子を使用した。このように、試験には単子葉植物種（すなわちトウモロコシ及び小麦）と双子葉植物種（すなわちトマト）の両方が含まれた。次に、各プラグトレイを２ｍＬの全ブロスサンプルで処理し、未処理の対照標準は２ｍＬの水を受けた。穴がないトレイを溢れさせ、プラグトレイを内部に配置することにより、プラグトレイに底部から給水した。これらのトレイを室温で高輝度照明（約３００アインシュタイン、１６時間照明あり／８時間照明なしのスケジュールに設定）に当たるように配置した。必要に応じて水やりをした。肥料は使用しなかった。
[0292] 種子灌注から２週間後に、トマトの苗を観察し、植物成長促進形質を調べた。次に、葉の表面積を定量化した。
[0293] ３６１０ＷＴで処理した苗は、水処理した苗より緑が濃くも高くもないように見えた。対照的に、３６１０ｓｗｒＡ−で処理した苗は、３６１０ＷＴで処理した苗より緑が濃く、高いように見えた（データは示さず）。これらの結果は、３６１０ｓｗｒＡ−で処理した苗の葉の表面積を調べることによって、定量的に確認された（図３１）。ランダムに選択したトマトの実生苗５本で最初の本葉の葉緑素測定値の平均値は、３６１０ｓｗｒＡ−で処理した苗の方が葉緑素レベルが高いことを示さなかった（図３２）。
[0294] 小麦及びトウモロコシで同様の実験を実施したことに留意されたい。３６１０ＷＴで処理した苗及び３６１０ｓｗｒＡ−で処理した苗は、定性的観察に基づいて高さ及び色の点は同等であったが、両方とも水処理対照標準より高く、緑が濃かった。しかし、これらのタイプの違いは単子葉植物では（短期間の温室アッセイで）非常に些細であり、したがってこの定性的研究では識別できなかった。
実施例２１−Phytophthora capsiciに対する３６１０ｓｗｒＡ−の植物内活性
[0295] ３６１０ＷＴ及び３６１０ｓｗｒＡ−株を、上述したように大豆系培地のフラスコで増殖させ、全ブロスを２０％濃度でPhytophthora capsiciに対して試験した。Phytophthora capsiciはＶ−８寒天で１〜２週間増殖させた。その終了時に、プレートの外側１／４インチ（０．６４ｃｍ）を切り取り、滅菌ピンセットで廃棄した。プレートは寒天のレベルまで滅菌脱イオン水を溢れさせ、光に当てて２日間室温に放置し、胞子嚢生成を助長した。次に、プレートを１時間半４℃に冷却してから、さらに１時間室温に放置し、胞子嚢中の遊走子を放出させた。ランダムに写真を３枚撮影し、遊走子のカウントを平均することによって、血球計付きの顕微鏡で遊走子の濃度を定量化した。次に、遊走子を接種（植物１本当たり１０ｍＬ）用に２×１０４個／ｍＬまで希釈した。
[0296] 鉢植え混合物中に２週間経ったトウガラシ（品種「California Wonder」）を植え付け、それぞれ１０ｍＬの全ブロス処理剤を灌注し、翌日Phytophthora capsiciを接種した。１週間後、処理毎にトウガラシの総数から死／非死について等級を付けた。苗を８日間監視した。次に、これらの等級を感染対照標準（ＩＣ）及び非感染対照標準と比較した（図３３参照）。アルミニウムトリス（Ｏ−ホスホン酸エチル）を含む化学的殺カビ剤アリエッテも、３．２ｍｇ／ｍＬ及び１．６ｍｇ／ｍＬで試験した。
[0297] ３６１０ｓｗｒＡ−での処理は３６１０での処理よりも苗を長期間にわたって保護し、生存した苗の総数も多かった（図３３参照）。
実施例２２−センチュウに対するＡＱ３０００２の活性
[0298] キュウリ種子品種Sultanで研究を実施し、Melodogyne javania、すなわちネコブセンチュウに対するＡＱ３０００２の活性を明らかにした。２０ｇの砂及び発芽していない種子を１粒含む５０ｍＬの遠心分離管を、様々な割合のＡＱ３０００２の全ブロスで処理した。ＡＱ３０００２の全ブロス培養物を得るために、Luriaブロス（ＬＢ）を含む種子フラスコにＡＱ３０００２を接種し、３０℃で一晩増殖させた。翌日、各種子フラスコからのアリコートを１Ｌの振盪フラスコ中の２００ｍＬの大豆系培地に接種し、胞子形成まで増殖させた。簡潔に言うと、振盪フラスコ培地を３０℃と３２℃の間の温度に維持し、振盪装置を２００ｒｐｍ〜２２０ｒｐｍに設定した。細胞の増殖及び代謝物の生成が停止した接種後約３日で、培養物ブロスを採取した。
[0299] 処理した種子を発芽させ、温室内で生育した。処理の４〜５日後（ＤＡＴ）に、各管に１００個の第２段階幼若ネコブセンチュウを受け付けた。１０ＤＡＴに、実生に０〜４のスケールで根のえい瘤形成率の得点をつけ、それを表４に示す。
[0300] 次に、センチュウの侵入及び発育を観察するために根を酸フスシンで染色し、ライカ解剖顕微鏡で観察した。センチュウの侵入に関しては、各根中のセンチュウ幼若体総数をカウントした。センチュウの発育については、後期第２段階幼若体（Ｊ２）及び第３段階幼若体（Ｊ３）を含む肥満幼若体総数をカウントした。根へのセンチュウの侵入及び侵入後のセンチュウの発育は、表４で詳述するように得点をつけた。使用した技術の詳細については、C.O. Omwega他の、「A Nondestructive Technique for Screening Bean Germ Plasm for Resistance to Meloidogyne incognia」（Plant Disease (1988)72(11):970-972)）を参照されたい。
[0301] 表７．細菌全ブロスのセンチュウ拮抗作用の評定方式。えい瘤形成指数は、根えい瘤形成の割合に基づいた。侵入尺度は、未処理対照標準（ＵＴＣ）中の幼若センチュウの数に対する幼若センチュウの平均総数として計算した。発育尺度は、根の中にいる肥満幼若センチュウ（後期Ｊ２段階／Ｊ３段階）の総数を反映している。
[0302] 図３４は、ＡＱ３０００２全ブロスを適用すると根えい瘤形成が減少することを示す。図３５は、様々な割合のＡＱ３０００２を適用すると、未処理対照標準と比較して、えい瘤形成、侵入及び発育が低下することを示す。データは以上の評定システムに基づいているので、常に用量反応を観察することが可能だとは限らないことに留意されたい。
実施例２３−トマトのネコブセンチュウを防除するＡＱ３０００２の有効性
[0303] ネコブセンチュウ（M. javanica）の卵に対するＡＱ３０００２の有効性を試験するために、トマト種子で別の実験を実施した。様々な時期にバイオリアクタ内でＡＱ３０００２−バッチ１及びＡＱ３０００２−バッチ２を準備した。簡潔に言うと、保存培養のバイアルを解凍し、ディフコ栄養ブロスの滅菌フラスコに移した。次に、フラスコ培養物を２８℃と３２℃の間の温度、２００ｒｐｍ〜２２０ｒｐｍの回転速度の回転振盪装置でインキュベートし、細胞の増殖を促進して、高密度細胞を得て、次に１２Ｌの大豆系増殖培地を２０Ｌのバイオリアクタに加えた。バイオリアクタは、３０℃と３２℃の間の温度設定、５００ｒｐｍから１０００ｒｐｍの攪拌設定、６と８の間に緩衝したｐＨ、及び０．５と１．０ＶＶＭの曝気に設定した。細胞の増殖及び代謝物の生成が停止したインキュベート後約３日で、培養物ブロスを採取した。
[0304] ３週間のトマトの苗を灌注によってＡＱ３０００２で処理した。次に、ポットを温室内で１０日間保管してから、ポット当たり５０００個のネコブセンチュウ（「ＲＫＮ」）を接種した。センチュウ接種から４２日後に苗を採取した。Hussey RS、Barker KRの、「A Comparison of Methods of Collecting Inocula of Meloidogyne spp., Including a New Technique」（Plant Disease Reporter, 1973;57:1025-1028）で詳述されているように、１％のＮａＯＣｌ溶液を使用してトマトの苗の根から卵を採集した。ＡＱ３０００２は、苗１本当たりに観察されたネコブセンチュウ卵の数を減少させた。データは、採点システムではなく卵を直接カウントした結果を表す。未処理サンプル（ＵＴＣ）と比較した結果を図３６に示す。
実施例２４−ｓｗｒＡ−自然突然変異のスクリーニング
[0305] Bacillus subtilisクレード株からのｓｗｒＡ−自然突然変異体のスクリーニングは、以下のように実施することができる。１リットルのフラスコに入れた２５０ｍＬのLuriaブロス（ＬＢ）液体に、適切な寒天プレートからの単一コロニーを接種する。これをオービタルシェーカーにいれて、３０℃、２００ｒｐｍで１６〜２０時間培養する。その結果の培養物を、リン酸緩衝液で１×１０３、１×１０６及び１×１０９に順番に希釈し、１００μＬの各希釈物を適切な寒天プレートで平板培養し、３７℃で１２〜１６時間インキュベートする。１５０〜２００の個別のコロニーを生成した希釈物プレートを４℃の冷蔵庫に移動させ、２４〜４８時間おく。４℃にして２４〜４８時間後、寒天プレート上に強力な白いサンドペーパー様形態があるので、ｓｗｒＡ−分離菌の可能性があるものが識別でき、ｓｗｒＡ＋である分離菌はこの形態を呈さず、往々にして半透明になり、プレート上では見えにくい。
[0306] ｓｗｒＡ−突然変異体の可能性があるものを採集し、ＬＢ中で３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。MoBio Kitとともに提供されるMOBio ultraClean（登録商標）Microbial DNA Isolation Kit遠心分離プロトコルを使用して、ゲノムＤＮＡ分離を実行する。突然変異は、ＰＣＲ及びｓｗｒＡ遺伝子座の配列決定によって同定され、以上で分離されたゲノムＤＮＡ及びＰＣＲは、バチルス種の以下のＰＣＲプライマーリストを使用すると、スクリーニング中の株にとって重要な特定のプライマー又は一般的プライマーが増幅される。
[0307] Bacillus amyloliquefaciens
[0308] BA_swrA_PCRF AAACAATGAAAAAAGCCGTTCTGG
[0309] BA_swrA_PCRR TCCGTGATAATCAAAAGGCC
[0310] Bacillus pumilus
[0311] BP_swrA_PCRF AAAGAATGATCTTCAGCTAC
[0312] BP_swrA_PCRR ATTAAAAACAGACCGACCGC
[0313] Bacillus licheniformis
[0314] BL_swrA_PCRF CATAATGAATAGAATTGACCCG
[0315] BL_swrA_PCRR GAAACCCAGCTTGTCTAA AG
[0316] Bacillus subtilis
[0317] BS_swrA_PCRF AATGAAACTTTTGCAAGTTGCC
[0318] BS_swrA_PCRR AATCGATATTCCGAGTCCAC
[0319] 非同定バチルス株
[0320] Bac_swrA_PCRF ACGCTKTAYAARTGGCTSAC
[0321] Bac_swrA_PCRR TCATCCAKAYCGTVACATTDG
[0322] ＰＣＲプロトコル及びｓｗｒＡ遺伝子座を増幅する反応条件と、３’及び５’ＵＴＲの約１５０のヌクレオチドを以下に示す。
[0323] 反応毎のＰＣＲ反応成分
[0324] 2.5μL gDNA-≦250ng最終
[0325] 5μL GoTAQ5x緩衝液-1X最終
[0326] 1μL GoTAQ MgCl2-1mM最終
[0327] 0.5μL 10mM dNTPs-0.2mM最終
[0328] 0.25μL 0.1nMolフォワードプライマー-1pMol最終
[0329] 0.25μL 0.1nMolリバースプライマー-1pMol最終
[0330] 0.25μL GoTAQ-1X最終
[0331] 15.25μL H2O
[0332] 25μL全反応体積
[0333] 適切なＰＣＲ循環条件を以下に示す
[0334] ９４℃ ２：００分
[0335] ９４℃ ０：３０分
[0336] ５５℃ ０：３０分
[0337] ７２℃ ２：００分
[0338] ２５サイクル
[0339] ７２℃ ５：００分
[0340] ４℃ 無期限
[0341] 適切なＤＮＡ染料及びサイジングラダーを使用し、１％アガロースゲル上でＰＣＲ反応の５％を観察する。ＰＣＲ生成物は、ヌクレオチド約７００個の長さの単独バンドである。２μＬのExoSap-It酵素で配列決定する前に５μＬの増幅ＤＮＡを洗浄する。洗浄した単位複製配列は、サンガ法を使用して正又は逆ＰＣＲプライマーで配列決定する。ClustalW配列アラインメントツール及び同定された任意の核酸の変化、欠損又は挿入を使用して、ｓｗｒＡ遺伝子座の配列を好ましくは同じ種の野生型基準株と比較する。
[0342] ｓｗｒＡ遺伝子座が突然変異すると、コロニー形態が変化する、野生型ｓｗｒＡ＋と比較して液体増殖中の連鎖形成が増進される、遊走バチルスの０．７％寒天上の遊走が喪失する、及び／又はより頑強な根生物膜が形成されることになる。
実施例２５−様々な方法によるｓｗｒＡ−突然変異体の生成
[0343] ｓｗｒＡ＋バチルス株のｓｗｒＡノックダウンのためのアンチセンス構成は、ＰＣＲでＱＳＴ７１３又は他のｓｗｒＡ＋バチルスから誘導したゲノムＤＮＡからのｓｗｒＡコード化領域のリバースコンプリメントを増幅することによって構成することができる。ＰＣＲプライマーは、Bacillus subtilis MMB869中に存在する組み込み及び接合エレメント（ＩＣＥ）エレメントに適合するように設計されて以前に構築されたendoPro_swrAプラスミドベクタに挿入することに適合する制限酵素で設計される（Wiep Klaas Smits 及びAlan D. Grossmanの、「The Transcriptional Regulator Rok Binds A+T-Rich DNA and Is Involved in Repression of a Mobile Genetic Element in Bacillus subtilis」（PLoS Genetics (2010)6(11):e1001207）、Catherine A. Lee他の、「Identification and characterization of int (integrase), xis (excisionase) and chromosomal attachment sites of the integrative and conjugative element ICEBsl of Bacillus subtilis」（Molecular Microbiology (2007)66(6):1356-1369)）。ｓｗｒＡコード化領域はendoPro_swrAプラスミドから制限酵素処理によって挿入され、ｓｗｒＡ遺伝子のリバースコンプリメントは挿入される。ｓｗｒＡアンチセンス構築物は、精製プラスミドＤＮＡの配列決定によって、ＰＣＲが核酸変化を導入しない状態でプラスミドベクタに正確に挿入されたものと確認することができる。実施例７を参照されたい。
[0344] ｓｗｒＡ遺伝子座が突然変異すると、コロニー形態が変化する、野生型ｓｗｒＡ＋と比較して液体増殖中の連鎖形成が増進される、遊走バチルスの０．７％寒天上の遊走が喪失する、及び／又はより頑強な根生物膜が形成されることになる。
[0345] ｓｗｒＡ−突然変異体を生成するために、マリナ系トランスポゾンＴｎＹＬＢ−１（Le Breton, Y.、Mohapatra, N.R.及びW.G. Haldenwang、（２００６）「In Vivo Random Mutagenesis of Bacillus subtilis by use of TnYLB-I, a mariner-Based Transposon」（Appl. Environ. Microbial. 72:327-333)）も使用することができる。ハイマ−１トランスポザーゼが存在するので、マリナは２つの逆挿入（ＩＳ）エレメントにて自身を認識し、切除して、挿入し、ＩＳエレメント間に存在する外因性ＤＮＡがあればすべて保持する。ＴｎＹＬＢは、バチルスと使用する変更マリナトランスポゾンである。組み込み体を迅速に選択するために、カナマイシン抵抗マーカがＩＳエレメント間に挿入される。ＴｎＹＬＢがプラスミドｐＭａｒＡ上に与えられる（上記からLe Breton他、２００６）。ホストバチルスにカナマイシン抵抗性をもたらすことに加えて、挿入はオープンリーディングフレームが破壊されるので、通常は機能喪失の突然変異が生じる。遊走能力の喪失又はサンドペーパー様コロニー形態をスクリーニングし、ｓｗｒＡ遺伝子座へのトランスポゾン挿入を確認することにより、ｓｗｒＡ−突然変異株を生成することができる。
[0346] マリナＩＳエレメント、カナマイシン抵抗性遺伝子、ＩＳエレメントの外側のハイマ１遺伝子をコード化するｐＭａｒＡプラスミド（エレメントがゲノム内で確実に安定するようにする）は、電気穿孔法によってｓｗｒＡ＋バチルス株に導入される。ｐＭａｒＡプラスミドバックボーンは、転位後にｐＭａｒＡプラスミドが確実に失われるために、ｍｌｓ（マクロライド−リンコサミド−ストレプトグラミンＢ）抵抗遺伝子を有する。これは温度感受性の起源を有し、それによってｍｌｓ又はカナマイシンを選択することができる。ｐＭａｒＡプラスミドを含むｓｗｒＡ＋バチルス株を、ローラドラムに入れて３ｍＬのＬＢ＋ｍｌｓ中で一晩室温にて増殖させる。ｐＭａｒＡプラスミドを含むｓｗｒＡ＋バチルス株を、（コロニー形成単位合計を求めるために）ＬＢで、及び（転移体の数を求めるために）ＬＢと２０μｇ／ｍＬのカナマイシンで希釈平板培養し、４５℃で一晩インキュベートする。コロニーを、カナマイシンプレート及びｍｌｓプレートとともにＬＢプレートに再び根付かせる。カナマイシン抵抗性／ｍｌｓ感受性コロニーは、さらなる分析のために保有される。トランスポゾンの可能性があるものをｓｗｒＡ遺伝子座に挿入すると、サンドペーパー様コロニー形態が生じ、０．７％ＬＢ寒天プレート上の遊走能力が低下する。
[0347] 推定されるｓｗｒＡトランスポゾンの挿入を同定した後、逆ＰＣＲ（ｉＰＣＲ）によって挿入の正確な位置を決定する。トランスポゾン突然変異体からのゲノムＤＮＡは、Ｓａｕ３ ＡＩ又はＴａｑＩなどの高頻度制限酵素で分離され、消化処理が行われる。消化処理が行われたＤＮＡは再連結されて円形にしたＤＮＡフラグメントを形成する。トランスポゾンからの１つのＩＳエレメント及び隣接するホストゲノムＤＮＡを含む円形フラグメントは、ＴｎＹＬＢトランスポゾン内でデザインされたプライマーを使用した場合に、ＰＣＲフラグメントを連続的に生成する。
[0348] ｉＰＣＲプライマー：
[0349] 2507 AGGAGGAATTCTACGGAAGTGTTAATTTCATAC
[0350] 2508 TCCATGCTCGAGGAAGAGC
[0351] 2509 ACAGAAAGTCTCGAGATCGTC
[0352] 2510 CTCCTGGATCCTCAATGGCTTTTTGGAAATCAG
[0353] ｉＰＣＲ生成物を精製し、外向きの増幅プライマーで配列決定する。突然変異毎に配列タグを生成し、ｓｗｒＡ遺伝子座に隣接するゲノム配列に吹き付ける。ｓｗｒＡ遺伝子座のゲノムＤＮＡを含むトランスポゾンは、ｓｗｒＡの機能を破壊する可能性が高い。
[0354] 転位によってｓｗｒＡ遺伝子座をノックダウンすると、コロニー形態が変化する、野生型ｓｗｒＡ＋と比較して液体増殖中の連鎖形成が増進される、遊走バチルスの０．７％寒天上の遊走が喪失する、及び／又はより頑強な根生物膜が形成されることになる。
[0355] 他に規定していない限り、本明細書の技術及び科学用語はすべて、本発明の当業者の一般的な理解と同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様又は同等の方法及び材料はいずれも、本発明の実践又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料は本明細書に記載されている。引用されたすべての出版物、特許、及び特許公報はすべて、目的を問わず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
[0356] 本明細書で検討した出版物は、本出願の出願日以前の開示に関してのみ提供される。本明細書の内容はいずれも、本発明が先行する発明によってこのような出版物より前の日付を付ける権利を有していないということを容認するものとは考えられない。
[0357] 特定の実施形態に関して本発明を説明してきたが、さらなる変更が可能であり、一般的に、本発明の原理に従い、当技術分野で知られているか、又は習慣的に実践されているような、さらに本明細書で上述し、添付の特許請求の範囲にもある基本的特徴に適用されるような本開示からの逸脱を含め、本発明のいかなる変形、使用法、又は適応も含むものであることを理解されたい。

Claims (52)

  1. ｓｗｒＡオルソログに突然変異を有する胞子形成細菌細胞を含む組成物であって、前記突然変異が、前記突然変異を有していない同質遺伝子系統の細菌細胞と比較して前記細菌細胞の遊走能力を低下させ、前記細菌細胞の少なくとも約７０％が胞子である組成物。
  2. 前記遊走能力が、非液体表面上の増殖によって測定される、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記突然変異を有する前記胞子形成細菌細胞が、Bacillus subtilisクレード内のバチルス種に由来する、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記突然変異を有する前記胞子形成細菌細胞が、前記組成物中の全細菌細胞の少なくとも３．５％を占める、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記突然変異を有する前記胞子形成細菌細胞が、野生型ｓｆｐオルソログを含む、請求項３に記載の組成物。
  6. 前記突然変異を有する前記胞子形成細菌細胞が、野生型ｄｅｇＱオルソログ及び野生型ｅｐｓＣオルソログをさらに含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記ｓｆｐオルソログ、前記ｄｅｇＱオルソログ及び前記ｅｐｓＣオルソログがそれぞれ、B.subtilis、B. amyloliquefaciens、B. pumilus、B. lichenformis、又はB. atrophaeusのうちいずれか１つのｓｆｐ遺伝子、ｄｅｇＱ遺伝子及びｅｐｓＣ遺伝子に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記少なくとも約９０％の配列同一性が、B. subtilis株３６１０、B. amyloliquefaciens株ＦＺＢ４２、B. pumilus SAFR-032、B. lichenformis株１４５８０、又はB. atrophaeus株１９４２のいずれか１つのｓｆｐ遺伝子、ｄｅｇＱ遺伝子及びｅｐｓＣ遺伝子に対するものである、請求項６に記載の組成物。
  9. 前記突然変異がさらに、前記突然変異を有していない同質遺伝子系統の細菌細胞と比較して、より頑強な生物膜を形成させる、請求項３に記載の組成物。
  10. 前記より頑強な生物膜が、前記突然変異を有していない同質遺伝子系統の細菌細胞の生物膜よりも平坦で乾燥して厚い、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記より頑強な生物膜が、前記突然変異を有していない同質遺伝子系統の細菌の少なくとも約１．５倍大きい直径を有する細胞を含む、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記より頑強な生物膜が、前記突然変異を有していない同質遺伝子系統の細菌と比較して追加の細胞外被を有する細胞を含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記細菌細胞が液体培養中に幾つかの鎖を形成するが、凝集しない、請求項１０に記載の組成物。
  14. 前記ｓｗｒＡオルソログが、前記突然変異を有する前記細菌細胞と同じバチルス種のｓｗｒＡ野生型遺伝子に対して少なくとも約９０％の同一性を有する、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記ｓｗｒＡオルソログが、前記突然変異を有する前記細菌細胞と同じバチルス種のｓｗｒＡ野生型遺伝子に対して少なくとも約９５％の同一性を有する、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記野生型ｓｗｒＡ遺伝子が、前記突然変異を有する前記細菌細胞と同じ株に由来する、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記種がB. pumilus、B. atrophaeus、B. amyloliquefaciens、B. subtilis及びB. licheniformisからなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
  18. 前記種がB. subtilis又はB. amyloliquefaciensである、請求項１８に記載の組成物。
  19. 前記オルソログが、配列番号１及び５〜１０で表されるｓｗｒＡヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の同一性を有する、請求項３に記載の組成物。
  20. 前記突然変異が、配列番号１で表されるｓｗｒＡ遺伝子の２６位〜３４位のうち１つ又は複数に対応する位置に、又は配列番号１で表されるｓｗｒＡ遺伝子の１位〜３位のうち１つ又は複数に対応する位置にある、請求項３に記載の組成物。
  21. 前記突然変異が、挿入又は欠失である、請求項２０に記載の組成物。
  22. 植物の成長を増進するか、又は植物の健康を促進するか、又は植物の病害を防除するために植物を処理する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物を前記植物に、前記植物の一部に、及び／又は前記植物の部位に適用することを含む方法。
  23. 前記方法が、前記組成物を土壌に適用することを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記組成物が、前記植物又は植物の一部が前記土壌に接触する前、接触する間、又は接触した後に適用される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記植物の一部が、種子、根、球茎、塊茎、球根及び根茎からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  26. 胞子形成細菌ｓｗｒＡ−細胞を含む組成物であって、前記組成物の全細菌細胞の少なくとも約７０％が胞子である組成物。
  27. 前記ｓｗｒＡ−細胞が、前記組成物の前記全細菌細胞の少なくとも３．５％を占める、請求項２６に記載の組成物。
  28. ｓｗｒＡオルソログに突然変異を有する胞子形成細菌細胞の使用であって、前記突然変異が、植物の成長を増進する、植物の健康を促進する、又は植物の病害又は害虫を防除するために、前記細菌細胞の遊走能力を低下させる使用。
  29. 前記細菌細胞が、Bacillus subtilisクレード内のバチルス種に由来する、請求項２８に記載の使用。
  30. 前記ｓｗｒＡオルソログが、前記突然変異を有する前記細菌細胞と同じバチルス種の野生型ｓｗｒＡ遺伝子に対して少なくとも約９０％の同一性を有する、請求項２９に記載の使用。
  31. 前記野生型ｓｗｒＡ遺伝子が、前記突然変異を有する前記細菌細胞と同じ株に由来する、請求項３０に記載の使用。
  32. 前記ｓｗｒＡオルソログが、配列番号１及び５〜１０で表されるｓｗｒＡヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の同一性を有する、請求項２８に記載の使用。
  33. 前記種が、B. pumilus、B. atrophaeus、B. amyloliquefaciens、B. subtilis及びB. licheniformisからなる群から選択される、請求項２９に記載の使用。
  34. 前記種が、B. subtilis又はB. amyloliquefaciensである、請求項３３に記載の使用。
  35. 前記突然変異が、配列番号１で表されるｓｗｒＡ遺伝子の２６位〜３４位のうち１つ又は複数に対応する位置で、又は配列番号１で表されるｓｗｒＡ遺伝子の１位〜３位のうち１つ又は複数に対応する位置で生じている、請求項２８に記載の使用。
  36. 受託番号NRRL B-50420として寄託されたBacillus subtilis ＱＳＴ７１３のｓｗｒＡ−細胞。
  37. 開始コドンに少なくとも１つの核酸塩基対の変異、及び／又はｓｗｒＡ遺伝子に少なくとも１つの核酸塩基対の挿入若しくは欠失を含む、請求項３６に記載のｓｗｒＡ−細胞。
  38. 前記ｓｗｒＡ遺伝子の前記挿入又は欠失が、配列番号１の２６位〜３４位にある塩基対の１つ又は複数で生じている、請求項３７に記載のｓｗｒＡ−細胞。
  39. それぞれ受託番号NRRL B-50421及びNRRL B-50455で寄託された株ＡＱ３０００２（別名ＱＳＴ３０００２）及び株ＡＱ３０００４（別名ＱＳＴ３０００４）からなる群から選択される、請求項３６に記載のｓｗｒＡ−細胞。
  40. 請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のｓｗｒＡ−細胞を含む組成物。
  41. 少なくとも１つの担体をさらに含む、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記組成物が、前記ｓｗｒＡ−細胞に加えて少なくとも１つの他の活性成分をさらに含む、請求項４０〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
  43. 前記活性成分が、化学物質又は細菌の別の株である、請求項４２に記載の組成物。
  44. 前記成分が、除草剤、殺カビ剤、殺菌剤、殺虫剤、殺センチュウ剤、殺ダニ剤、植物成長調整剤、植物成長刺激剤及び肥料からなる群から選択される、請求項４２に記載の組成物。
  45. 植物の成長を増進するか、又は植物の健康を促進するか、又は植物の病害を防除するために植物を処理する方法であって、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載のｓｗｒＡ−細胞又は組成物を前記植物に、前記植物の一部に、及び／又は前記植物の部位に適用することを含む方法。
  46. 前記方法が、前記組成物を土壌に適用することを含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記組成物が、前記植物又は植物の一部が前記土壌に接触する前、接触する間、又は接触した後に適用される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記方法が、土壌表面灌、シャンクイン、注入又は畝間への注入からなる群から選択される適用方法で前記組成物を適用することを含む、請求項４６又は４７に記載の方法。
  49. 前記植物の一部が、種子、根、球茎、塊茎、球根及び根茎からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
  50. 前記植物害虫が、植物寄生センチュウである、請求項４５に記載の方法。
  51. 前記植物病害が、土壌伝播性病原体である、請求項４５に記載の方法。
  52. 前記土壌伝播性病原体がAphanomyces cochlioides、Cylindrocladium parasiticum、Fusarium avenaceum、Fussrium culmorum、Phytophthora capsici、Phytophthora cinnamomi、Pythium ultimum、Rhizoctonia solani、Sclerotinia sclerotiorum、Sclerotinia minor、Sclerotium rolfsii、Ustilago hordei、Stagonospora nodorum、Aspergilllus fumigatus、Verticillium dahliae、Tapesia yallunde、Alternaria alternate及びPenicillium expansumからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
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