HU231053B1

HU231053B1 - Rézrezisztens, fengicin hipertermelő Bacillus mojavensis törzs növényi kórokozók elleni védekezésre, alkalmazása és az ezt tartalmazó készítmények

Info

Publication number: HU231053B1
Application number: HU1100498A
Authority: HU
Inventors: László Manczinger; Csaba Vágvölgyi; Enikő Sajben; Árpád Nagy; Zoltán Szőke-Kis; Adrienn Nagy; György Turóczi; András Kovács
Original assignee: Szegedi Tudományegyetem
Priority date: 2011-09-08
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2020-03-30
Also published as: EP2753181A2; ES2702497T3; US9288993B2; WO2013034938A2; HUP1100498A2; WO2013034938A3; EP2753181B1; US20150147296A1

Description

A találmány rövid ismertetése

A találmány tárgyát képezi ege növényi károkozókkal szembeni amagouóta hatás kiváltására szolgáló biológiai anyag, amely tartalmazza a Budapesti Szerződés szerint SICALM (P) B feliŐÖ9 letéti számon letétbe helyezett Bmfofo' mfoítmfe' RŐh mutáns törzset, Λ találmány szerinti b:<.üog-;u anyag antágomsta hatását fold tégláink, előnyőse» paradicsom, paprika, saláta és/vagy káposzta kórokozóival szemben, különösen a kővetkező kórokozókkal szemben felt! ks: ,Xfea.'ít»,wa'íct Ifomfomaar gfogss? és é.fofom'm ««*$»«» növénypatogén baktériumok és Byfofos· Agam®w_f ífeyfefefow fefefom .•l/btmzw .afowfe ó- fwíw sayfovw? nővénypatogén gombák. A találmány tárgyát képezi továbbá a. találmány szerinti biológiai anyagot, és átlőtt esetben réztartalmú peszíieitlet tartalmazó készítmény és eljárás növényi kórokozók elleni védekezésre, valamint a találmány szermti biológiai anyag vagy készítmény alkalmazása zöldségfélék, előnyösen paradicsom, paprika, saláta es./vagy káposzta védelmére.

A találmány hátterének bemutatása

Λζ intenzív zöldségtermesztési technológiák része a hatékony növényvédelem, azonban a fogyasztói piac elvárásai, valamim az éieimisaerinztouság javítására irányuló törekvések szükségessé tették a növényvédő szerek mitümalizálását, biológiai módszerekkel való kiváltását, A zárt terű termesztésben. a. mvarkártevök ellen már megoldott a teljes biológiai védekezés,: azonban a baktérium és gombák ellem biológiai védekezés még nincs megfelelően kidolgozva.

Napiamkbsm a zöldségtermesztés és forgalmazás területén is egyre nagyobb az igény a. növényvédő kémiai szermaradványolen nem tartalmazó biotermékek iránt, A hatékony kérnéd peszdnmek közül egyedül az anorganikus rézkészümények hasanáhta engedélyben: a biotermékek előállítása során. A növénypatogéti mikrobák, között tsz utóbbi években a mzrezisztens mutánsok száma nagymértékben megemelkedett, így már ezekkel Önmagukban nem tehet elég hatékony és megbízható növényvédelmet megvalósítani. Egy lehetséges megoldás ennek a problémának a kezelésére az, hogy integrált tfovényvédelmet valósíúmk meg réztartalmü szerek és hiokontmll készítmények, felhasználásával, Önmagában bfokotmoll készíjmény használatával is lehet védekezni, de ez esetben, a Icgjoíib készítmények esetében is a hatásfok még az 5ö%~ot sem éri el.

A világon jelenleg kapható báktétnim·· és gombíteltenes hiokonírrdl készíttnények többsége egykonjponeaső, antagomata és/vagy parazita-képességekkel rendeikezó baktédamot, illetve gombát tartalmaz. A ífemfe törzseket régóta használják növényvédelmi célokra, főleg növénypatogén gombákkal szemben hatékony készítmények vannak forgalomban. Ehősoxban Av'Ao .ofeámt és AaóAo mvte?Atsteáiüím fámé törzseit tanaim ázzék az eddig forgalomba került, illetve szabadalmazott készítmények, Hatékonyságuk hátterében. elsősorban különféle,. főleg gombák ellen hatékony sejten kívülre szcktetalt pepiid antibiotikumok álmák: smfsctt», tt-urin, fengydn, badllomydn, mycosnbtíin, Újabban. felvetették. azt is, hogy ezt a hatást a patugén mikroba sejtfelár. illetve dtoplazrna membránját honid extracellnláris enzimeknekí ptöteázok, kitmázok, illetve iipázok erősíthetik, Mindemellett több független vizsgálat bizonyította, hogy a kezelt növényekben létrejövő indukált rezisztencia -válasz kis’áhásáétt elsősorban a fengycin felelős a szektetált antibiotikumok közül.

A technika állásának ismertetése

Az IüS20í 0092442 sz. anterilml egyesült államokbeli szabadalmi irat tárgyat olyan eljárások, amelyek képesek kiváltani a növények fertőzésekkel szembeni szisztémás szerzett rezisztenciáját. A módszer alapja Bafenn nemzetségbe tartozó baktéririmokat tartalmazó kompozíció alkalmazása, aminek következtében a növény védelmi fehérjéket termel Az alkalmazott ifeAfeífe a bmfefe o'yö’ovm 203-7-e izoiámma. valamim: a bmfefe mysww lürd izolatuma. A szabadalmi Ixgdcnfesbcn szereplő iW&.>· smmonm' izolátum hátránya, hogy az adott önfefe zmAmmár 203-7 izolátum antibakteriális- szerrel, való együttes alkalmazása nem javasolt, és az izolált törzs nem. rézrezisztcíts, így tehát tézt-artalrnú peszúddekkel történő együttes adása nem érné el a kívánt nóvényvédehm hatást. A szabadalmi bejelentésben a Btefefe· stww®· 203-7 izoláfom továbbá fettgicin hipertermélő tulaj donságokkd sem rendelkezik.

A WO9724433 sz. nemzetközi közzétételi irat tárgyal hiokontroll módszerek és mikroorganizmusok,, amelyek képesek, a növények gombaeredetű betegségeit vikszaszorítani.. A biokontroil célokra alkalíuazható miktoorganizmusok új, endo&a skimbioiikus Ztaüzvémö?' Ámm törzsek. A törzsek alkalmasak hasznos géntennékek növénybe történő bejuttatására is. Az alkalmazott tmfefemy??·· Αλ» törzsek díamptcm rezisztensek A szabadalmi bejelentésben szereplő Kvüm&mA Amw (ATCC55732~ex számon letétbe helyezett) törzsek a 16S rlkNS gensze.kvenc.ia· analízis alapján valójában Baailus nmjavensb· törzsek. A szabadalmi bejelentésben szereplő izotámm. hátránya, hogy nem rendelkezik rézrezisztendiival, ezért réztartálmű peszdcídekkel való együttes adása nagy valószínűséggel nem ajánlott.

A WO9909834 sz. nemzetközi közzétételi irat tárjjvai szántóföldi talai kezelésébe szokták» kompozíciók és módszerek, amelyek alkalmasak a növények fejlődését és az amtás -eredményét is javítani Λ kompozíció alapját peszfedd rezísztens mikeootganizmus törzsek képezik. A kompozícióban szereplő nákmötganizmmok közül egy tömet, vagy azok keverékét alkalmazzák a szántóföldbe juttatva, vagy a növények magvaihoz körve, A kompozícióban szereplő miktoosganizmas-ok. a következők: ,-ΙρίφήϊΑζζ áps/feós? ,&p, lip7R 8'85, .. lyöipztA&ie? írwmeresí ,>:p, K21'R. 887, /IreWra&sy mfeom? oá. .8041R 889, .Ao?.>pótAw ém.®ke.o .op. A41R 879, ,-'ío:ö?üaít®r swétmfe tA. 1 ,SZ 2'132, /fevsfeöovü .>fi, bzeged. 744- O,P. 14, .RtvfeáwasíO /Actimosz vet, MOB24, Kes24, RasAo οΆ/ο var. Rés, 97, íiztöfer oygvöAw var. Rés, .34, RAyAíAo m&te' vas, PolRes. 7, /1 íhféfewr OíVtóü var. ResaO és l^shyllí,)6-Rs-32. A baktérium törzseket különböző növények környezetéből és eltérő talajokból izolálták, majd peszticid. teztsztensé térték azokat, \ szabadalmi bejelentés szerinti megoldás nem a zöldségfélék kártevőt elleni antagmríznmst célozza meg,

Λ WO98219Ó4 sz, nemzetközi közzétételi. itat íárgya olyan egyedi öaAfef .sAPő<· törzs, amelv alka-lmss a névénél mttoeéö gombák és baktériumok nádasém. A referenciában leírt hmrl&s óóféö törzs képes megvédeni a különböző növényeket (gyümölcsöket, zöldségeket) a következő baktériumok és gombák okozta fertőzésektől: ΒΑΆΰ< lómnöw. kféyöpÁüsm. JAvsöraszut, iimóAt x.· .·· —· V

A 1 ΑΑΑηόη. óferAóö. ΙΆϊήΑ, RtAöAzA tfeyféóós' <ü /Atr/vsöem, A törzs alkalmazható '·<. · >.· ' peszticidekkvl együttesen is, azonban hátwiys, hogy nem rendelkezik réz rezisztenciával, ezért réztartalmú pészdcidek alkalmazása, kivárt ez esetben.

A fentiekből látható, hogy a technika állása szerinti megoldások ugyan tartalmaznak olyan növényvédelmi szempontból jelentős baktériumokat, amelyek pesztivídekkel együtt is alkalmazhatók, azonban hárránytik, kogy egyik megoldásban sem szerepel tézrezisztens baktérium törzs alkalmazása, amely lehetővé tenné további rézíartalmü peszticidek alkalmazását a hatékonyabb növényvédelem megvalósítása érdekében, Nagy szükség van továbbá olyan kompozíciókra is, amellyel a rézrezisztens aöyénypatogén mikroorganizmusok ellen hatékonyan fel lehetne venni a küzdelmet. Igény van ezért új növétyypatugén baktérfémok és gombák elleni készítményekre, amely kiküszöböli a technika állásának hiányosságait, különösen a komplikált, soklépéses és köruyezetterhelő növényvédelmi technológiák alkalmazását, fezen igény kielégítésére szisztematikus kutató··fejlesztő munkát folytattunk, amelynek eredményeképp megalkottuk találmányunkat.

<.>

A találmány részletes Ismertetése

DpAétífe

A „kó-ro-ko^ó”, vagy idegen szóval „patngéfe’ a. jelest leírásban alkalmazva olyan víma, baktérium vagy gomba, amely különböző élő szervezeteken élősködő életmódot- él, és a gaadán. vagy annak testében (pl emberen/emberben) megtelepedve és szaporodva betegségei okoz. A Itómkozási képesség mértéke, a pamgenitás, fajon belül is igen változatos lehet.

Az „antagnnkta. hatás” vagy „imiagonixmus” jelen leírásban alkalmasára a mjkroorganizmusók között kialakuló olyasa viszony, amelyben az egyik tg! egyedes a másik: tsj egyedzst elpusztítják, károsítják vagy szaporodásukat gátolják pékiául az általuk termelt vegyületek. (pl. aímbiotíkumok, ex t raczllulá r ss e n zimek) ál tat

A „kártevoirtő” vagy „pesztieid” jelen leírásban alkalmazva olyan növényvédöszerek (vegyszerek, biológiai és egyéb ágensek, és azok keveréket), amelyek alkahn.azásának a célja, a kártevő élőlények: élpuszntása, távoltartása, elriasztása, ártalmatlanítása vagy valamilyen más módon történő korlátozása, ezáltal a növények és termények hatékony védelme. A találmány szerint alkalmazható peszticid kiválasztása egészségügyi és biztonsági szempontok mérlegelése mán, mdofoíatlatt mennyiségit kísérletezés nélkül, a szakember köteles tudásához tartozik.

A „dózixfenm” szakkifejezés jelen leírásban alkalmazva a készítmény formulációjáuak típusát jellemzi, amely a „Pesztieid-iljrmuláeió típusok és nemzetközi kódolási rendszer katalógus” l'ferop-.l,ife Tkemzedtözi Technikai Monográfia, 2, szám, 5, kiadás, 2002) alapján kerül meghatározásra. Ilyen lehet például vizes szuszpenztó, szuszpenzió koneeutrámm, kapszulázott sznszpeuziő, emdzióképző folyékony permerezőszer, granulátum, vízben díszpergálható gtatiulámm, mikrogrtmuiámm, víxoldékony por, nem korlátozva azonban ezekre. A találmány szerint kialakítható dózfeforma kiválasztása indokolatlan memiyiségű. kísérletezés nélkül is a szakember köteles szaktudásához tartozik,

A „réztartahnti. pesaüeátó’ szakkifejezés jelentése olyan liártevőtrtó hatású készítmény, amely hatóanyagként rezet tartalmaz- A téytartaróré. pesztseid szakkifejezés jelentése mncs különösképpen korlátozva, és ennek körébe tartoznak például a következők: rézszullat, rézosákmolát, rézoxid, rézhidtwxid vagy rézoxikloríd. A találmány szerinti réznrrmhnú peszdcid helyes mngváiasztám. a szakember köteles tudásához tartozik, és imiokolailse. mértéké kísérletezés nélkül végrehajtható.

A „segénanyag· szanaifejezés a jelen leírásban nmes i<üiost.öskvppe;i korlátozva, és segédanyagok körébe <.- .· ·< >

taroZnak. íj kó vei k esők;

a) folyékony· ibmmláeió eserén például víz vagy szerves oldószer (például xüoi, metanol, etiléa» ghkol vagy ásvány; olaj), dmpexziő siabiliaámr, feitilztííktív anyag (például kxtó.mn-.dndedl.·'· beuzolóstdíönát, poligülmbéteó etedéit aikál-fenol vagy alkil-anl-szulfonátok), adott esetben v ősz.

b) gramiláris: fíxmuláció esetén monunorélonit, bentoair, fidíszt, keményít;! cellulóz, és. kötőanyag,, .mint például ásványi olaj, polivínü-olkohnl vagy szacharóz,

c) és egyéb, önmagában istnert, szokásos: adalék- és/vagy segédanyag.

A találmány szenet .Asiteztoó segédanyag kiválasztása indokokban. mennyiségi! kísérletezés nélkül is a szakember köteles UKÍásához tartozik.

.< ... .' .·v :· . . ,,' .·.. .-. v i . i ímm.^vy xymmymw_;mf

A találmány megalkotására irányuló szisztematikus kísérleti mnnka. során Meglepetéssel tapasztalaik, hogy IW&f zygámwr R3B mutáns törzs a technika állásához képest a) erősebb atmigmiista hatást fejt ki a kórokozókkal szemben, b) réareziszmnciát hordoz és

e) kórokozókkal szembem indikált rezisztenciát alakít ki növényekben.

Λ fentiek alapján a találmány tárgyát képezi egyrészről egy növényi, kórokozókkal szembeni amagonista hatás ktváitásam szolgáló biológiai anvag, amely tartalmaz a Budapesti Szerződés szermt NCAIM (P) B 1011.189 létén számtm letétbe .»'< wzett ife-záfe .ísxó.ftre.aö RSB omtáns törzset. \ találmány szerin·:; Ifejlóglai anyag amagrmma hatását zöldségfélék, előnyösen, paradicsom, paprika, saláta és/vagy káposzta kórokozóival szemben, különösen a következő kthokíszokkal szemben íejti te n&Áuönfe :ífevaőz?;;vsí.f mfeyas' és ('./í?ísS.:sZv

sfeowfe és 1 ww® «íAXótwry nővénvuarnaén gombák, ·· v Λ <.>

Bár a találmány szeriutí antagonista hatás magynrázamt nem kívánjuk egyetlen elméletre kot'látoant, megállapítható, hogy s találmáöv asscraüi biológiai. anyag különleges, tómkoaókkal szembeni hálását annak köszönheti, hogy egyrészt a növények thizoszfésájában gátolja a kórokozók működését, másrészt egyidejűleg rezisztenciát alaki; ki a védett növényben. a gátolt: kói'okozólíisíi szemben.

Λ találmány tárgyát képezi egy kártevőirtó készítmény, amely ötrtáímazza. a találmány szerinti biológiai anyag egy tenyészetét, adott esetben tartalmaz réztartalmü peszdcidet, előnyösen rézszulültor, rézoxikinolátot, rézosidnt, rézhídroxidot vagy fezoxikleridog és adott esetben, tartalmaz segédanyagot.

A fentieknek megfelelően a találmányunk szerint felhasználható réztatmlmú peszricid nincs különösképpen korlátozva, feltéve, hogy nem pnsziítia el a találmány szerinti biológiai anyagot vagy nem gátolja nemkívánatos mértékben annak működését, és az ilyen alkalmazható téztartalmű peszticldek körébe tartoznak korlá tozás nélkül a következők; rézszulüít, fezorikínolát, rézoxid, rézhairoxid vagy rézoxikkmd. A megfelelő peszticid kiválasztása indokolatlan mennyiségű kísérletezés nélkül is a szakember köteles tudásához tartozik,

A fentieknek: megfelelően a taláhnánynnk szerint felhasználható segédanyag nincs különösképpen korlátozva, feltéve, hogy az nem csökkenti a találmány szerinti biológiai anyag mint hatóanyag vagy biológiai és kémiai ha tóanyag dmmbinárió hatásosságát, és az ily est alfailmazhatö segédanyagok körébe tartanak kóriátozás nélkül a következők;

a) folyékony nrnntdádő esetést példáéi víz vagy szerves oldószer (például sülni, metanol, etilénglikol vagy ásványi olaj}, diszperzió sfabllizátor, felületaktív anyag (például kakium-dodedlbenzoloztüfenát,, poliglikol-éter, etoxilált iüldi-fenol vagy xikil'aril'szulfetnátok), adott esetben vtasz,

b) gmnnláds formuládé esetén montmoriilonif, bemond, feliszt, keményítő, celhrtóz, és kötőanyag, mint például ásványi olaj, polívinii·'alkohol vagy szacharóz, c} és egyéb, önmagában ismert, szokásos adalék·· és/vagy segédanyag,

A megfelelő segédanyag kiválasztása mdókolatian mennyiségé kísérletezés nélkül Is a szakember köteles: tudásához tartozik,

A találmány szerinti készítmény dózlsfbrmája nincs különösképpen korlátozva, feltéve, hogy a dózisíorma alkalmas a találmány szerinti biológiai anyag tsaní hatóanyag yagy az azt tartalmazó, találmány szerinti készítmény meg felelő kgottatására a védendő: növényzethez vagy annak bármely részéhez. Az ilyen allraknazhatő dózis formák körébe tartoznak korlátozás nélkül a kővetkezők: vizes szuszpenzió, szuszpenzíó koneentrámm, kapszulázott szuszpettalő, enmlzióképző folyékony pettnewzószer, granulátum, vízben íliszpergálható gn^nuUtum, nükrogranulámm, vízoldékonv uor. A megfelelő dózisfonna kiválasztása indokolatlan mennyiségű kísérletezés nélkül is a szakember köteles tudásához tartozik.

A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás kórokozók. elleni védekezésre, amely szerint egy találmány szetími biológiai anyagot vagy készítményt egy növényhez, előnyösen· zöldséghez, előnyösebben paradicsomhoz, paprikához, salátához és/vagy káposztához, eljuttatunk. A találmány szerinti biológiai. anyagot vagy készítményt előnyösen a védendő növény magvashoz juttatjuk, gyöké szeléhez fonattuk, szárához juttatjuk, ievélzetehez, virágzatához, lombozatához vagy terméséhez juitatfok. Öntözővizéhez keverjük és/vagy permetezésével juttatjuk ki.

A. találmány tárgyát képezi a találmány szerinti biológiai anyag vagy készítmény alkalmazása növényvédelemre, előnyösen zöldségfélék védelmére, előnyösebben paradicsom, paprika, saláta és káposzta védelmére, továbbá rezisztencia kialakítására növényekben a találmány szerinti kórokozókkal szemben.

Példák

A következőkben kiviteli és hatásosság! példákon keresztül ismertetjük tálálmányimkat, hivatkozással sm alábbiakban felsorolt, mellékeit ábrákra.

Az l, ábra a legszéfesebb spektrumban kiemelkedő antagofosta képességet mutató törzsek réz-ion érzékenységének mérési eredmények

A. 2, ábra szemlélten 20 bakrétimmötzs antagonism aktivitását a rézkoneentráeiő függvényében.

A Ő. ábra gombákkal szembeni anteigtanfetíí aktivitás változása á rézkom:eniráeió függvényében, 20 törzs átlagaA 4. ábra a ibefofo anfomsfo B5 törzs szekmtáií antibiotikum spdurmnának vékonyréregkromatográfiás analízisét mutatja be.

Az 5. ábra a Ifobfor m/nwú· B5 törzs antibiotiformtermelésí kinetikáját mutatja fermemotban.

A 6. ábra a Ifofofo- zííymazm· Bő törzs és a belőle készült rézmziszrens mutánsok extracellúláris proteáz termelő képességét mutatja.

A 7, ábra a limáfot zrfonvesó B5 törzs és a belőle készült rézrezísztens mutánsok íhj-sríAsőwz pofom¹ elleni gátlását mutatja be..

A nm/nFenfov B-5 töriKS izolálása

Vizsgálataink során 82 enrlofita baktériumtörzs és 44 xiirzosz téré bői izolált. baktértörzs satagomsta képességéi teszteltük, smgd kiválasztottuk a 20 legjobb antagoífota képességű, törzsei, amelyek autagomsta képességét réz jdeíüéréhcn vizsgáltuk. A legjobb antagomstámtk bizonyuk 10 rézreziszrens &öte törzs közül a Badllus mojavensis B5 törzs .rendelkezett a legjobb antagomsta képességekkel, ezek közül ía a® K3B séztensaterts mutáns törzs, amely öitaitn'i igényünk· tárgyát képezi.

itawátfö fétAmérüm? ntasM· AnéféAi? a mmrttszrerr .nntórgcA rjbkm^r^&MZ ds ^$keréiM? és? unu^öttArs tesz-m/ése

V z Adásokat elsősorban különféle paradicsom és paprikaüpták gyökérlelsztnéfol és gyökéttörzséből végeztük baktérimnszeletóy· táptalajokon, A domináns tck-pupusoklxO 10-10 törzset izoláltunk minden vizsgák mim» esetében, Tápfemezen történő előzetes -aotagonfémus tesztekkel - amelyeket .EbWswöswr .sfonpre. AA?üZowsrf.< .•t··.·.?.- </.':·.··//..?, .fosfofo illetve /’7>: *öpZv/w^ rvA/mo. 31 é?s/Ad .idwíww. .d/fovvó·/ vöm·? és Ifo'rrfo ·?»</ dk-rt állítottunk be · kiválasztottuk a legjobb aötagonistákat Ezeket: fáj szinten azonosítottuk lúS RNS génjük parciális; szekvenálásával, hogy az esetlegesen nővétiypa.togén£ket kizárjuk s további vizsgálatokból. .A nem növény pa tógép törzsek hatékonyságát további novénypatogén baktériumuk és gombák, ellen is teszteltük. A legjobb antagomstákből 4ü került ót thu itövénvkezelést vizsgálatokba.

Abitdir/töt BáfttórwjfsM ízn/d/rAa év

Különböző zöidxéguövéuyek (petrezselyetisgyökér, sárgarépa, paradicsom, paprika, feltér káposzta, saláta, zöldhagyma, uborka) gyökeréből, illetve terméséből S2 endotlia baktériumtörzset izoláltunk. Ezek antagonista képességét ót táb» autagotüzmus resztben vizsgáltuk a stövénypatogén Jfesytúw ípyypim®, KAysrAw ssévgy .Xvíüáízíwu.<· mzypeúAí pr övéttötfe, Etwafe mtröwm és EíZtrsbwevnpzAp*' törzsekkel szemben. A legjobb anragonistának bizonyult 10 törzsΙΕ-Ζίήίίήίη:, rs/ár&títf, Bs&yíü iAwtyr. StítwtiMa .ftdhp/A/wz és zlAtwtfe öe/úr növénypatogén gnmbálikísl szembeni antagomsta képességét ís íelmértük. Vi-zsgjütuk továbbá a pH hatását a növekedésre: megállapítottuk mely- törzsek képesek |>H.“~-5,5 értéknél növekedni. Ennek a savanyúbb talajokban történő alliíilíuazhínóságuk szeoipuntjáből vau nagy jelentőségé Előzetes téztoleranda vizsgálatot végeztünk a törzsekkel (integrált növényvédelemben való .felhasználás miatt fontos) 25, illetve Sb míkrogtam/ms fiuS(>₄~or tartalmazó tápoklmokkal és megállapítottuk, hopv 71, illetve 4-9 törzs uüvekerlett a vizseált értékeknél. A törzsek mégha tározásához a 15S R.\S gén PCR-val történő íebzaporitását (pnmernk: EubOF és Eub534R) és szekvenálását, majd.

adatbázisokkal való összehasonlítását végeztük el a Mvénypatogén vagy humánparogén törzsek kizárására. A. 82 endofíta baktérium tótól a növény kísérletekhez H) jó -aatágcmists képességű laaktérmmot hasznáimnb.

fetótó fotótóitó«i«f5tweA’

Mintákat vettünk a itveghá.zb<3l, hidnsponilmsan neveit paradicsom növények kőzetgyapotjából, és prtó5,5-te pwtferelt táptalajon izoláltunk .39 baktérium törzset. Ezek antagtmizmusát fA.sum®?

á^W, EegpÁ tómtg, ótómÁX xÁnvfenw, /k&mtó? itató, iÖtótóör tóA^uw/íáz, .Xssá^w&mj' awátAb g? ítósüító és tótóovöm' pAgpv-'Vel szemben vizsgáltuk meg,

A számömldtól származó 10 mintától. .Btó&a· törzsekre szelektív náxiszemd.tó>lálmuk pH“5~ös táptalajon 44 törzset, 28- hidegben is növekedni képes baktérium törzset, valamint P»wm szelektív táptalajon 27 törzset. Ezeket a törzseket Őlátóméi· tóAgm?o?m tó/tó·?.®? ímgö?eüár /w mstóötó és P.<wW>??>a> .ptópmvel szemben vizsgáltuk meg is tó?» anragonizmus tesztekben.

Törzs meghatározást végezüink a 1ÓS RNS génjének PCR-tal történd felszaporításával (primerek EubÖF és Exxb534R)., szekvenálásával és adatbázisokkal való össéehasönlitásávai, a növénspamgén vagy humánpatogén törzsek kizárására, zmt&tósöÁ' etólOÖtásn n Ávemtóá'tóö Áz^ftstógó'

ZjpAfeWorí?törz.vtótó/

Táp talai-hígitásos módszerrel mcghsstározmk a legszélesebb spektrumban kiemelkedő sms.gomsta képességet mutató törzsek réz-tort éméketpségét (2. ábm), Etsután spontán rezisztenciára történő szelekcióval olyan törzseket állítottunk elő, melyek réz ion toleranctája nagyobb, tóm 20Ü gg/ml.

A vizsgálatot 211 előzetesen szelektált törzzsel végeztük; B2, B5, B7, B12, BI4, B19, B3X B4Ü, B52, B60, BTx B85, B198, B2ÖS, B2Ü9, 13212, B215, B2IÖ, 3219, B221, A törzseket pepton táptalajon sutijuk fenn, + 5 %E»n, illetve tartós tárolás céljára ¥DC táptalajon, ugyancsak 4- 5 °Con. A kísérletet pepton táptalajon, illetve tápfolyadékban végeztük, csakúgy, mint a további kísérletek többségét is. A törzsek séztürését 1.0, 20, 40, 100 és 200 ppnt rezet tarraimazó táptalajon teszteimk. ,A rezet rézszuitát old-at fmntájábtm kevertük a táptalajba, 10000 ppm-e$ törzsoldatból kiindulva, a koncentrációt a réz hatóanyagra számítva. A baktériumok foss tenyészetéből Hö/ml szuszpenzibt készítettünk, és ebből 1ÍX1 ul-t szőlész tettunk 9 érmés Petrlcsészékben. Az értékelést 2 - 3 nap ebekével, folyasnatosan végeztük. A tápfeivnöékhan végzett vizsgálat során ugyanilyen koncénttádojó. bakrédmu smiszpenzióból 10 gl t adtunk 10 ml tóphdyadékhoz.· Az értékelést 2 nap múlva optikai demútás mérésed $00 m) végeztük,, illetve Börkcr-kamrával ellenőriztük az eredményeket.· Az inkuhálás minden esetben 22-25 “C-oa, sütétbett történt

Mmd a húsz íörzs növekedett még 200 ppm rézkcncentmciójú. táptalajon, illetve tápközegben ss, a kisebb rézkoncentrádótiál mutatott növekedéshez képest nem volt kimutatható szignifikáns eltérés,

A további vizsgálatok során a táptalaj. rézkoncentrácipíát 400 és 000 ppm-re emeltük. 400 ppm-en a B5, Bt9fe B20B, B210 és B22I már nem mutatott növekedést,.« többi törzs még kis mértékben igen. A 800 ppm-es koncentráció viszont már teljes gátlást eredményezett. Ugyanakkor a 400, majd 000 ppm koí-ccnttöciójú táptalajon történő szélesítéssel mindett törzsből izoiálhxtóak voltak olyan telepek, amelyek ilyen koncentráció mellett is képesek voltak növekedni, és ilyen rézkou.cenöációjű táptalajon folyamatosan fenntarthatnak. Mivel a 400 és különösen a 000 ppm rézkoncentráció már meghaladja azt az értéket, ami a növénykórokozó gombák és baktériumok gátlásához szükséges, illetve .ami a talajokban előford Aat, még -magasabb koncentrációval szemben is toleráns törzsek izolálása nem volt indokolt. A réz-toleráns törzseket 800 ppm rezet tartalmazó táptalajon, 4· 5 'C-on tartjuk fenn.

rrátötvbfevnővvmyAöí'oÁ'özöááix/szímtóen, $ náz ZtaMsa nz

A. ' x, sgs.. inkát a fenti búsa baktérium, törzzsel, a kővetkező nővénykórokozókkal szemben fölyrattuk: .· feí'Víhmvw .nvtifea? (5 törzs)

IkpnöltöíV» fetötöv? (3 tözs) .tötövtöv/ .ttönítötw·?

l'tönr?tör íAyytö>ív>ví é-tö tisgtötö .< Itörs/núí ntösi

Kútöítsösfe .ötáatö

Az·: antagonizmur vizsgálatokat pqytön agaten, Hfetöe a gombák .számára megfelelőbb PDA-n, a. tötöyöfefmj törzsek esetében borsöagaroa és l^sDA-á is elvégeztük, a táptalajt 0, 50, 1Ü0 és 201? ppm rézzel kiegészítve. Az amagonista baktérium törzseket friss 'enyészetből Hinduivá 5 mm átmérőjű, szűrőpapír korong segítségével 9 <:m·>:?'. táptalaj lemez egyik hartKadába, velük szemben.

egy időben, a tápiahificmez másik harmadában a uövénykőrokozó ifodámoí’&ö törzseket hasonló módszerrel, a ^mbákat foss tenyészetből kivágott 5 .Mi átmérőjű micéliumkoron^l oltottuk le. Az mfebálás minden esetben 22 - 25 Adom sötétben történt»

Az értékelést két nap után folyamatosan végeztük, a megfigyelhető gátlást zónák tnétésévei Az eredmények értékeléséhez egy- és kéttéöyezős variancia analízist végeztünk.

Rrédmónyeink szerint a gomba (.foshoz;? és valódi gombák) kórokozókkal szemben mutatott amagonizmusban az antagonista baktérium törzsek .között jelentős eltérések voltak,, de a rezet nem tartalmazó táptalajon. ez a különbség nem vek szignifikáns (p-0,05), Ugyanakkor 50 ppm réz hozzáadásával a különbség tovább nőtt, 100 és 200 ppm pedig szignifikáns .kidönbséget eredményezett az egyes törzsek, között (1 ábra),

A néz hozzáadása kis mértékben fokozta, zz sntagonista aktivitást, de a különbség öt tesztgomba ÍR víAmev, ál .ö'forzöitr^g i. »», K agmmm és fi, vövA átlagában csak 200 ppm tézkontenüációstál volt szignifikáns iá. ábra), Ugyanakkor fontos megjegyezni, hogy ez a koncentráció már jelentős mértékben növelte a tesztgombák növekedését, és ez megnehezítette az eredmények értékelését ts. A B2, Bő, B/, B12, B19, B2.á, B40, 052, BOO, B/5, Bőn, BlOtí, B200, B200, B210 és B221 leld törzseknél ilyen körülmények között egyértelműen erősebb aútagomsta hatás volt megfigyelhető, a kisebb koncentrációk .(50 és 100 ppm) mellett viszont csak a B208, B219 és B231 jeld törzseknél volt megfigyelhető ez a jelenség (2. ábra).

A hint említett öt tesztgomba átlagolt, antagorfoiákkal szembeni érzékenységét tekfove, természetesen jelentős eltérések, voltak, a különbség minden réz koncén-nációnál és réz tté&öl is szignifikáns, A legkevésbé érzékenynek a R vyyyteísís? és a. R, zdw bizonyult., ezeknél a tesztgombáknál a rézkottcentrádó emelése sem fokozta, az érzékenységet. Mérsékelten volt érzékeny az ,_:· 1 ,^/W is, de a 200 pnm-es rézkrmcertttáeiő Itt jelentős érzékenység növekedést adott, A R /Rówív és a vizsgált ál dömfeA törzs érzékenyebb vak, különösen magas jéakoncettteiciö mellett;

A tesztelt növény kötő kozó R baktériumok: reakciója jelentősen, különbözött a kórokozó gombákétól, A 20 antagomsta baktérium hatékonyságában, az 5 R ífoígw törzs átlagát tekintve,, nem volt kimutatható szignifikáns különbség, Hasotóóan nem volt szignifikáns a különbség a különböző R mfoíyd törzsek erzókemséger idomve:. A növénykórókozó gombáknál

II tapasztaltaktól dtéroün, a táptalaj: .növekvó réztanalma egyértelműen csökkentette az antagottísiak hafokonyságát, A. megfigyelt különbség csak 100 és 200 opm rézkoncemmiciónál volt szignifikáns,. (.A uüvénykőrokoaö P. rgAp?? törzsek réz-érzékenysége körülbelül azonos volt a 20 antagomstn baktériuméval: 200 pptmes koncentrációnál meg mmdegyik növekedett, 400 ppmmél már egyik

A vizsgálatba vont ífetösüfe&w törzsek a többi kórokozónál érzékenyebbek voltak a réz ionokra, 100 ppm koncentrációnál már nem mutattak növekedést, ezért a vizsgálatokat csak 50 ppm koncentrációnál végeztük el.. Az xntagonista baktériumok hatékonysága között jelentős különbség volt, » réz jelenléte azonban nem eredményezett szignifikáns változást (hasonlóan, mint a többi, vizsgálatba vont „gomba” esetében, altot 50 ppm rézkoncentrációnál még am volt egyértelmű az autagonista aktivitás változásának a jellege).

A rézio-nok antagouisták hatékonyságára gyakorolt befolyásár tekintve nmgállapímtmk, hogy a további kísérletek szempontjából hasznosítható hatékonyság - fokozás csak a növéttykórokozó gombák vonatkozásában, és csak viszonylag magas (200 ppm) maion koncentrációnál volt megfigyelhető. O ΪΡ.'

Tbrmre^zrő&dz/ dv szítögd/í-Wé AczeAfe./ kAAr/erek ,az AíiÁ'forhtmtöcitseÁAW

A legjobb imtagemistánsk. bizonyult rézrezisztens törzseinkkel termesztóbázi és .szabadföldi kezelés· kísérleteket végeztünk. A kísérletek azt célozták, hogy tisztázzuk sz a&tagomsts baktérium törzsek: riüzoszföta tűréséi: paradicsom, íltetye .paprika (talafos és tahijuéiküli termesztési móddal) ős egyéb zölfoégktdmrákban (káposzta saláta) és fóleg azt a nagyon töúms kérdést, hogy a növény hogyan tűri a baktériummal történő kezelést. A kezelt növények gyöktörzséből történő kvantitatív kitenyésztésekkel azt is tisztáztuk, hogy valón, a baktériumtörzs be tud e jumi a növénybe, meg tud-e endogén módon telepedni anélkül, hogy a növény fejlődését ez hátrányosan befolyásolná. A kísérletek. 20 kiváló A fom anragonlzmus spektrummal rendelkező törzzsel futottak le.

A kezeléseket két időszakban végeztük, kétszer 10 baktériumtörzset felhasználva. A vizsgálandó törzseket (tafe .fosöty nemzetség tagjai) a szükséges töménységre hígítottuk és közveilcuül magvetés után ezzel öntöztük be a szapmitó ládákat, iíL a kőgyapot verőelemei:. lövsbbs viasyáiataínkat már a lombievelcs óalátttáuál végeztük:. Kot időmmtban történt növény

X.> -J·: :<·.>: .5 <

mintavétel, amelyek során a kijelölt ttövűnyegyedeknél megszámoltuk a lomblevelek számát, majd gyökérzet nélkül begyűjtörtük őket és lemértük a friss zökltöm^üket A méréseket paprika és paradátsom növényfajnál elvégeztük, tahjos és kőzetgyapoPxs termesztésben, faelembe véve, a három különböző baktérium koncentrációval való beöltözést, A fejeskáposzta és saláta növényeknél csak talajos mödmi állítottuk be & .lusérleteket Valamennyi kísérletet négyszeres ismétlésben, véletlen bfokk elrendezésben végeztük d,

A legjobbnak 10, a Iktö&r nemzetségbe tartozó törzs teonyult lemtfós'zróóds'/ é« szjtfezddz&íf óeze/és/ M^écfereár Z£ ,4z fodwfoí/t wwmcű! kód&á,·??reszm/ése

Tervezett készítményeink antagonísta baktérium komponemével kapcsolatban fontos elvárás az, •hogy ne csak a győkémemél, hanem hogy- a nővény indukálható rezisztencia mechanizmusának bekapcsolása révén, a -növény földfelem· részénél támadó bátórfom és gombakórokozőkkal szemben is védelmet nyújtom. Paradicsom és paprika növényekkd végeztünk. ilyen kísérleteket. A palánták gyökerét kezeltük az antagonista· baktériumtörzsek szuszpenziójával és az elültetést követően .különböző időínterv-allumók eltelte utón mesterséges- fertőzéseket provokálunk a leveleken a növúnypatogéu bekténumok illetve· gombák sejt valamint konídlum-sznszpenziójával. fezen kívül vizsgáltuk, hogy a kezelt növényekben hogyan. alakul, az indukált rezisztenciában fontos vegyülitek szintje a kontroll -növényekhez viszonyítva,

A .kiemelkedő antagomsta képességű B5 zfetölfo törzsünk képes volt a növény védekezési mechanizmusát (Systendc Aenuimd, Ilesistaace. (ÜAR)) indukálni. A legjobb képességű törzsnek a Ifetötö' .rnyímmtö B5 törzsből 41)0 pg/mi rézszul&t tartalmú táptalajra szélesztve -spontán, megjelent R5B .rézrezísztens mutáns bizonyult fez a törzs -valószínűleg azért rendelkezik széleskörű és kiemelkedő antagomsta képességekkel, mert nagy mennyiségben szekretál egy főleg gcmlbadlenes hatással rendelkező depsipeptíd típusú antibiotikumot, a fengycxnt (lásd 5. ábra} és a hatást szin.ergizm-usban fokozó-, konstitutív kimotripszia típusú proteázt (A ábra) .4 fhícáZhn? kőw <& a óe/Öíe zdázezrW-nea» mtmfosoÁ' non&brxknmA törzseket bed ámítással YEG (0,2¾ glükóz, 0,2¾ élesztőlűvonat, 2¾ baktoagar) táplemczeken mrtotmk fenn,Az antjbfcmkxmrteímelési -vizsgálatokhoz elsősorban mmimál rá-poldatot használtunk megfelelően változtatva az alkalmazott szén- és nítrogénforsást, valamint a két nyomelem (vas és réz) koncentrációját Ez a tápoldar nem tartalmaz, amitoisavakat és pepddeket, mint például egy éiesztőkh-ouat-alapú tápoldai, és így a fermemlébe szeknmik antibiotikum keverékek analízise és tisztítása könnyebben. megoldható.

Az alábbi előzetes termelési tapasztalatok alapján az alább' GG\l tápo'ldatot használmk::

Glükóz	VG
Glmammsav Na só	0,5%
KH..PO,	0d%
k_:;hpo₄	0.1%
MgSO.s x 7K₂P	0,05%
íx.K.J FeSQ. x ~H,O	x/> 1 · í> lü mg/l
(mSí >_: :·; 5H₃O	i mg/1

ml tápnldat került SÖ-mbes Erlenmeyer lombikokba. Letiltás után a tenyésztés otbítéiis rázőgépen történt 6 napig 180 rpm-el 25 X-t®.

A tenyészetek seitdejiintását abszorpdöméréssel 620 mn-nél határoztuk meg. B>a-í.éá's törzsek esetében 0,1 OD érték '10' sejt/ml koncentrációval egyenértékű. Ezután a baktérimmej teker 8000 g-vel 10 percig történő centtifogáUssal kiülepítettük és a felülúszót íőzőpoharakbs vittük át majd a fermentkvek pH~értékér 2-esre állítottuk be 10%-os sósavval (0.4 ml szükséges a 20 ml fermentléhez)·. A csapadékos fermentls veket 5 °C-.on egy éjszakát inkubálmk, hogy a csapadékleválás teljessé váljék. Ezután a csapadékot eenttifogálással kiülepúetmk és 1 ml 06%-m etanolban feloldottuk.

A titozin-tarmhnú anííbíodkumnk mennyiségének mérése az etanolos preparátumokból A fersgycm 2 molekula droztní tartalmaz, a mozin viszont erős elnyelést tómat 280 rnn-néi. Így az antibiotikum preparátumok surfactinon kívüli antibiotikum tartalmú 280 am-es méréssel jól becsülhető. így minden esetben megmértük az előzőleg Ki-szeresre hígított -alkoholos prepamumarnk QD-jét 300 um-nél.

A szekíetált antibiotikúmok yékoiiyíéiegkrttmatógráfiás (TLC) analízise

Előzetes yíssgálmaínkban,. illetve az üjabb törzsek vizsgáim során is a törzsek amíbiutikom spektmmámk. vékouyrétegkrtmmmgráSas analíziséhez elsősorban glutauúnsax'-gfékózos tápuldíitot használtunk, mert a legtöbb törzs esetében ez bíziotmmt megfelelő szintű antibiodkutn hozamot. A B5 törzs fennen hevének TLC analízis eredményeit a 4. ábrán mutatjuk be.

A növénp’éttómí alkalmazás során mndkívtil fontos a megfelelő tápokkt használata a tenyészetek létrehozásánál, Tapasztalatunk szerint smn-denképea a fenti összetételű gliikózos glutamánsavas rápolbaíut célszerű használni, inért: így a tenyészet akit 10-2íix-ára hígítható és még áhfot is a ml-enkénti fengycm koncentráció 10-12 mg/l-es les·» ami a legtöbb nővénypatogén gombánál teljes lÁíIást okoz és elegendő ahhoz, hogy kiváltsa a kezek növényben az indufcUt rezisztencia meehaxtizmusr.

A B, mp/hven.sfe JS5 fefezs· és o őe/nfe Sjöön&m AepzóWtí xnmsínso&

nxxfí^örxfstz ^é/Jess^e

Kfesztőkívonat táptalajon 48 órán át tenyésztettük á törzseket. ,\ B5 törzs és rézreziszteus mutánsainak ftwfe»· ;w/p- re, cövfenV?' zAfegtcmtóre és XüíAoiwvüí gyakorolt:

gátló hatását vizsgáltok, .A táblázatban látható, hogy az RAB rézrezisztens mutáns rendelkezik a legjobb gátló hatással.

G;lil,lsi zóna (mm)
	BA	R1B	R2	R5A	R3B	R4	116
JA'í'rmfoonzrms' sgrmpsre	3,0	2,0	4,ü	3,0		2,0	3,0
CZavz'Aaí.’rer' mAhz'gíjmís.sfe	6,0	2,0	3,0	ő,0	7,0	5,0	4,0
Aborőo'???özr,:í5 -coapesífiá?	7,0	5,0	64)	7,0	7,0	7,0 ........1........	. S,0 i

Vizsgáltuk .a réz-eezisztens B5 törzsek ffeanfezv rgypemtsra gyakorolt .gátlását i:s a szülői törzshöz viszonyítva, A táblázatban látható, hogy ez esetben is az RAB téaiezisztens mntás mnde&estik a legjobb gátló hatással fezért ez a törzs képezi oltalmi igényünk tárgyát.

Gátlást zóna (mm)
	B-5	R1B	R2	R3A	R3B	R4	R6
2^p«saró/.,m ovyypomm	3,5	3,5	3,0	4,0	4,0	3,5	4,5

A találmány ipari a&almszhatösága \ találmány előnye, hogy az izolált ÖíKzAx joaótevor KÖB mutáns törzs erős amagonisra hátast fejt Iti a károkozókkal szemben, emellett fezmzíséteueiát hordoz és képes kiváltani a növényekben a kósökoKÓkkal s»embeni indukált rexssxteaciát. Itoteztsüteus tulajdonsága tévén téstafedmú.

peS'gtkkdfckkei együucseft is alkaknazható, ezáltal integrált növény védelmet valósít meg.

Claims

Szabadalmi igénypontok

l. Növényi kórokozókkal szembeni anfcagonista hatás kiváltására szolgáló biológiai anyag» amely tartalmaz a Budapesti Szerződés szerint NCAIM (P) B 001389 letéti számon letétbe helyezett ΒβίϊΖάζτ R3B mutáns törzset.
2. Az 1. igénypont szerinti biológiai anyag, amely az antagonista hatást zöldségfélék, előnyösen paradicsom, paprika, saláta és/vagy káposzta kórokozóival szemben fejti ki.
3. Az 1~2. igénypontok bármelyike szerinti biológiai anyag, amely az antagonistó hatást a következő kórokozókkal szemben fejti ki: Pjwáwözfcn és Gbíáb&Ar növénypatogén baktériumok és Pyitót® ífefafíyaxíw, PbytopMera Hifafáms, Afarxaria a/tenntán és .hwdriw növénypatogén gombák.
4. Kártevőirtó készítmény, amely tartalmazza az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti biológiai anyag egy tenyészetét, adott esetben tartalmaz réztartalmú peszricidet, előnyösen rézszulfátot, rézoxitónolátot, rézoxidot, rézhidroxidot vagy rézoxikloridot, és adott esetben tartalmaz segédanyagot.
5. A 4. igénypont: szerinti készítmény, amelynek dózisformája vizes szuszpenzió, szuszpenzió koncentrátum, kapszulázott szuszpenzió, emulzióképző folyékony permetezőszer, granulátum, vízben diszpergálható granulátum, mikrogranulátum, vízoldékony por.
6. Eljárás kórokozók elleni védekezésre azzal jellemezve, hogy egy 1-3. igénypontok bármelyike szerinti, biológiai anyagot vagy 4-5. igénypontok szerinti készítményt egy növényhez, előnyösen zöldséghez, előnyösebben paradicsomhoz, paprikához, salátához és/vagy káposztához eljuttatjuk.

ló A e
7. A 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a biológiai anyagot vagy készítményt a védendő növény

a) magvaihoz juttatjuk,

b) gyökérzetéhez juttatjuk,

c) szárához juttatjuk,

d) levélzetéhez, virágzatához, lombozatóhoz vagy terméséhez juttatjuk,

e) öntözővizéhez keverjük és/vagy

SZTNH-100238269

f) permetezésével juttatjuk ki.
8. Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti biológiai anyag vagy a 4-5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása növényvédelemre, előnyösen zöldségfélék védelmére, előnyösebben paradicsom, paprika, saláta és káposzta védelmére, továbbá rezisztencia kialakítására növényekben az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti kórokozókkal szemben.