KR102167148B1 - 파라보에레미아 아디안티콜라 균주를 이용한 식물병 방제용 조성물 - Google Patents

파라보에레미아 아디안티콜라 균주를 이용한 식물병 방제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수탁번호 KACC 83022BP로 기탁된 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주, 이의 배양여액, 상기 배양여액의 분획물, 불큔산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물과 이를 이용한 식물병 방제방법을 제공하기 위한 것으로, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 벼 도열병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 고추 탄저병 등 다양한 식물병에 대하여 우수한 방제효과를 나타내므로 환경친화적인 천연물 살균제의 개발 및 유기농산물 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

파라보에레미아 아디안티콜라 균주를 이용한 식물병 방제용 조성물 {Composition and method for controlling plant diseases using Paraboeremia adianticola }
본 발명은 파라보에레미아 아디안티콜라 SFC20150402-M24 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액, 상기 배양여액의 분획물 또는 불큘산을 이용한 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
과학기술과 산업의 발전에도 불구하고, 현대농업의 가장 큰 숙제는 여전히 식량문제 해결에 있다. 세계 인구는 가파르게 증가하고 있고, 기후 변화로 미래의 안정적인 식량수급에 적신호가 켜진 상황이다. 식물병원균은 농작물에 다양한 병을 일으켜, 작물의 수량을 감소시키는데, 만약 여기에 적절히 대처하지 못하여 식물병이 대발생하게 되면, 1846년 아일랜드 대기근과 같은 심각한 사회문제가 발생할 수 있다. 식물병을 방제하기 위한 주요 수단으로서 화학 농약을 사용해 왔으나, 지나친 화학 농약의 사용은 생태계 교란, 환경오염, 인축독성, 약제저항성 문제 등을 가져왔다. 따라서 화학 농약의 사용을 줄이거나 이를 대체하기 위한 새로운 친환경 식물병 방제수단의 개발이 절실히 요구되어지고 있다. 따라서 식물 추출물이나 미생물, 또는 미생물의 이차대사산물 등의 천연소재가 새로운 식물병 방제제 개발에 적극적으로 이용되고 있다.
특히 페니실리움(Penicillium) 속 곰팡이에서 페니실린(penicillin)을 발견한 이래 지난 몇 년간 곰팡이는 의학적인 가치나 다방면에 있어서의 활용성 덕에 많은 주목을 받아왔으며, 다양한 항균활성 물질들이 곰팡이로부터 분리되었다. 자낭균 페니실리움 그리세오풀범(Penicillium griseofulvum)에서 처음 분리된 그리세오풀빈(griseofulvin)은 양파잿빛곰팡이병균(Botrytis allii)의 정상적인 포자발아를 저해하는 활성으로 식물병 방제제로 주목 받았었고, 페스탈로티옵시스 에이더스타(Pestalotiopsis adusta)가 생산하는 페트탈라클로라이드 A―C는 푸자리움(Fusarium)과 버티실리움(Verticillium) 속 식물병원균에 대하여 항균활성을 가지며, 스타고노스포라 노도럼(Stagonospora nodorum)이 생산하는 (+)-4‘메톡시-(2S)-메틸부틸로페논(methylbutyrophenone), 알터나리올(alternariol), (3R)-(―)-멜레인메틸에스터(mellein methyl ester)는 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)에 대하여 항균활성을 나타내고, 스페롭시스 사피니아(Sphaeropsis sapinea)가 생산하는 (3R,4R)-(―)-4-하이드록시멜레인(hydroxymellein)은 고추탄저병균(Colletotrichum acutatum), 양파흰비단병균(Sclerotium rolfsii), 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea) 등 다양한 식물병원균에 대하여 항균활성을 나타낸다. 이처럼 곰팡이는 다양한 종류의 항균활성 이차대사산물을 생산하기 때문에 새로운 작물보호제를 개발하는데 적극적으로 이용될 수 있다.
Effects of vulculic acid on the activities of defense enzymes of Alternanthera philoxeroides. By Fan, Lan-lan; Jiang, Zi-de; Xiang, Mei-me From Huanan Nongye Daxue Xuebao (2010), 31(3), 28-31.
본 발명의 목적은 수탁번호 KACC 83022BP로 기탁된 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액 또는 상기 배양여액의 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 불큘산을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 CDA배지에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 PDB배지 또는 SDB배지에 접종한 후 5일 내지 12일 동안 18℃ 내지 27℃ 에서 진탕배양하는 단계를 포함하는 불큘산의 대량생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액 또는 상기 배양여액의 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 불큘산을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 균주를 CDA배지에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 배양방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 균주를 PDB배지 또는 SDB배지에 접종한 후 5일 내지 12일 동안 18℃ 내지 27℃ 에서 진탕배양하는 단계를 포함하는 불큘산의 대량생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액, 상기 배양여액의 분획물 또는 불큔산을 함유하는 조성물은 벼 도열병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 고추 탄저병 등 다양한 식물병에 대하여 우수한 방제 효과를 나타내므로, 식물병 방제 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 감자 한천 배지(potato dextrose agar)에 배양한 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주의 균총을 나타낸 사진이다.
도 2는 SFC20150402-M24 균주의 ITS 영역의 염기서열 분석 결과를 바탕으로 작성된 계통수를 나타낸 도이다.
도 3은 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주로부터 항균활성물질 불큘산(vulculic acid)을 분리하는 과정을 나타낸 도이다.
도 4는 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주로부터 분리해낸 항균활성물질 불큘산(vulculic acid)의 식물병 방제 효과를 확인한 사진이다. 좌측부터 무처리구(a), 불큘산 500 μg/ml 처리구(b), 불큘산 1,000 μg/ml 처리구(c), 불큘산 2,000 μg/ml 처리구(d), 트리사이클라졸(tricyclazole) 10 μg/ml 처리구(e)를 나타낸다.
도 5는 배지종류별 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주의 불큘산(vulculic acid) 생산량을 나타낸 도이다.
도 6은 배양기간에 따른 불큘산(vulculic acid) 생산량을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KACC 83022BP로 기탁된 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주를 제공한다.
분류학적 동정을 위해 ITS(interanl transcribed spacer) 염기서열을 바탕으로 분자계통학적 분석을 실시하였다. 상기 균주는 서열번호 1의 ITS(internal transcribed spacer)서열을 가지며, 상기 서열번호를 이용하여 계통도를 작성한 결과 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) CBS 260.92 및 CBS 187.83 균주와 높은 상동성(99.9% 이상)을 나타냈다(도 2). 이러한 분석결과를 바탕으로 SFC20150402-M24 균주를 파라보에레미아 아디안티콜라 SFC20150402-M24 균주로 명명하고, 2019년 2월 13일자로 농업생명공학연구원에 수탁번호 83022로 기탁하였다.
상기 균주는 미역으로부터 분리된 것일 수 있고, 구체적으로 제주도 용두암에서 채취한 미역으로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 균주는 식물병 방제 활성을 가질 수 있다.
본 명세서 중에서 "방제"라고 하는 것은 병이나 해충의 예방, 기피 뿐만 아니라 제거, 사멸의 의미를 포함한다.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 균주의 배양여액 및 상기 배양여액의 부탄올분획물로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
상기 균주는 수탁번호 KACC 83022BP로 기탁된 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주로 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 것일 수 있고, 상기 배양여액은 균주를 배양한 배양액을 물리적으로 여과한 것일 수 있다.
상기 배양여액의 분획물은 상기 배양여액을 에틸아세테이트 또는 부탄올을 용매로 사용하여 분획된 것일 수 있다.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 식물은 벼, 토마토, 보리, 밀 및 고추로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한 활성 물질의 혼합물일 수 있다. 식물병 방제용 조성물은 상기 배양액, 상기 배양여액, 배양여액의 분획물 또는 분획물에서 분리한 활성 물질과 불활성 담체를 혼합하고, 상기 혼합물이 유제, 유액, 유동화제, 습윤성 분말, 과립화 습윤성 분말, 분말제, 과립제 등으로 제형화 될 수 있도록 혼합물에 계면활성제 및 필요한 기타 보조제를 첨가함으로써 제조된다. 상기 언급된 식물병 방제용 조성물은 그 자체로서 또는 다른 불활성 성분을 첨가하여 본 발명은 종자 처리계로도 사용될 수 있다.
제형에서 사용될 수 있는 액체 담체의 예는 물; 알콜, 예로 메탄올 및 에탄올; 케톤, 예로 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예로 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸타프탈렌; 지방족 탄화수소, 예로 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일; 에스테르, 예로 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예로 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예로 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예로 N,N-디메틸 포름 아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예로 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예로 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.
제형에서 사용될 수 있는 고체 담체의 예는 미세 분말 또는 과립 예컨대 광물 예컨대 카올린 점토, 애터펄자이트 점토, 벤토나이트, 몬트모릴로나이트, 애시드 화이트 점토, 필로필라이트, 탈크, 규조토 및 탈사이트; 천연 유기 물질 예컨대 옥수수 잎대 분말 및 월넛 껍질 분말; 합성 유기 물질 예컨대 우레아; 염 예컨대 탄산 칼슘 및 황산 암모늄; 합성 무기 물질 예컨대 합성 수화 산화 규소를 포함하며; 액체 담체로서, 방향족 탄화수소 예컨대 자일렌, 알킬벤젠 및 메틸나프탈렌; 알코올 예컨대 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 케톤 예컨대 아세톤, 시클로헥사논 및 이소포론; 식물성 오일 예컨대 대두유 및 면실유; 석유 지방족 탄화수소, 에스테르, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴 및 물을 포함할 수 있다.
계면활성제의 예는 음이온성 계면활성제 예컨대 알킬 술페이트 에스테르 염, 알킬아릴 술포네이트 염, 디알킬술포숙시네이트 염, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르 포스페이트 에스테르 염, 리그노술포네이트 염 및 나프탈렌 술포네이트 포름알데히드 중축합물; 및 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬폴리옥시프로필렌 블럭 공중합체 및 소르비탄 지방산 에스테르 및 양이온성 계면활성제 예컨대 알킬트리메틸암모늄 염을 포함할 수 있다.
다른 제형 보조제의 예는 수용성 중합체 예컨대 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐피롤리돈, 다당류 예컨대 아라비아 고무, 알길산 및 이의 염, CMC(카르복시메틸-셀룰로오스), 잔탄 고무, 무기 물질 예컨대 알루미늄 마그네슘 실리케이트 및 알루미나 졸(alumina sol), 보존제, 착색제 및 안정화제 예컨대 PAP(산 포스페이트 이소프로필) 및 BHT(부틸하이드록리톨루엔)를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 수탁번호 KACC 83022BP로 기탁된 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주, 이의 배양액, 이의 배양여액 및 상기 배양여액의 분획물로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물병 방제 방법을 제공한다.
상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포일 수 있다.
본 발명의 방제 방법은 식물의 줄기 및 잎의 처리, 식물이 성장하는 장소(예를 들어 토양)의 처리, 종자 멸균/종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.
본 발명의 방제 방법으로의 줄기 및 잎의 처리로서, 특히, 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다. 본 발명의 방제 방법으로의 토양의 처리로서, 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리계의 토양 내로의 살포 (액체 처리계의 관개, 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하)가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow)주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부분, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리, 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다. 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 및 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다. 상기 언급한 토양 처리에서, 유효 성분히 식물에 동시에 적용될 수 있거나, 유효 성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효 성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 예를 들어 관개 시설(관개 튜브, 관개 파이프, 스프링클러 등) 에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배치(water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로 휘발 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로의 종자 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 병충해로부터 보호되도록 종자를 처리하는 방법이며, 이의 특정 예는 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 미리보하하고 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법; 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액, 유동화제 등을 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법; 종자를 특정 기간 동안 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법; 필름 코팅 처리법 및 펠렛 코팅 처리법을 포함한다.
식물, 또는 식물 성장용 토양이 본 발명에 의한 화합물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간, 기후 조건 등에 따라 변화할 수 있다.
유액, 습윤성 분말, 유동화제 등은 통상 물로 희석된 후 처리를 위해 살포된다. 이러한 경우, 유효 성분의 농도는 통상 0.0001 내지 3 중량 %, 바람직하게는 0.0005 내지 1 중량% 의 범위이다. 분말제, 과립제 등은 통상 희석없이 처리에 사용된다.
본 발명의 방제 방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes)일 수 있다.
상기 식물은 벼, 토마토, 보리, 밀. 고추로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 제주도 용두암에서 채취한 미역으로부터 분리한 SFC20150402-M24 균주를 동정하여 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주로 명명하고 농업생명공학연구원에 수탁번호 KACC 83022BP로 기탁하였다(도 1참조).
또한 본 발명자들은 본 발명의 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주의 배양여액을 식물에 처리한 후, 식물에 벼 도열병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추탄저병을 유발하는 식물 병원균을 각각 접종한 결과, 본 발명 균주의 배양여액은 토마토 역병, 벼 도열병, 고추 탄저병, 밀 붉은녹병에 대한 방제 효과를 가짐을 확인하였다(표 1 참조).
또한 본 발명자들은 상기 균주의 배양여액을 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 순차적으로 분획하여 얻은 각 분획물을 식물에 처리한 후, 식물에 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추탄저병을 유발하는 식물 병원균을 각각 접종한 결과, 본 발명의 균주의 배양여액의 분획물은 토마토 역병, 벼 도열병, 고추 탄저병, 밀 붉은녹병에 대한 방제 효과를 가짐을 확인하였다(표 2 참조).
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112019028057961-pat00001
상기 화합물은 불큘산(vulculic acid)이다.
상기 화합물은 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주에서 분리된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes)일 수 있다.
상기 조성물은 식물병 방제 활성을 가질 수 있다.
상기 화합물은 농약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있고, 농약학적으로 허용되는 염 뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 이용하여 식물병 방제 방법을 제공한다.
상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포일 수 있다.
본 발명의 방제 방법은 식물의 줄기 및 잎의 처리, 식물이 성장하는 장소(예를 들어 토양)의 처리, 종자 멸균/종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.
본 발명의 방제 방법으로의 줄기 및 잎의 처리로서, 특히, 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다. 본 발명의 방제 방법으로의 토양의 처리로서, 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리계의 토양 내로의 살포 (액체 처리계의 관개, 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하)가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow)주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부분, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리, 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다. 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 및 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다. 상기 언급한 토양 처리에서, 유효 성분히 식물에 동시에 적용될 수 있거나, 유효 성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효 성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 예를 들어 관개 시설(관개 튜브, 관개 파이프, 스프링클러 등) 에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배치(water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로 휘발 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로의 종자 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 병충해로부터 보호되도록 종자를 처리하는 방법이며, 이의 특정 예는 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법; 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액, 유동화제 등을 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법; 종자를 특정 기간 동안 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법; 필름 코팅 처리법 및 펠렛 코팅 처리법을 포함한다.
식물, 또는 식물 성장용 토양이 본 발명에 의한 화합물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간, 기후 조건 등에 따라 변화할 수 있다.
유액, 습윤성 분말, 유동화제 등은 통상 물로 희석된 후 처리를 위해 살포된다. 이러한 경우, 유효 성분의 농도는 통상 0.0001 내지 3 중량 %, 바람직하게는 0.0005 내지 1 중량% 의 범위이다. 분말제, 과립제 등은 통상 희석없이 처리에 사용된다.
본 발명의 방제 방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes)일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 균주의 배양여액을 부탄올 및 물로 순차적으로 분획하여 얻은 부탄올 분획물로부터 화학식 1로 표시되는 불큘산을 분리하였다(도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 분리한 불큘산을 식물에 처리한 후 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추탄저병을 유발하는 식물 병원균을 유발하는 식물 병원균을 각각 접종한 결과, 본 발명의 불큘산은 벼 도열병, 토마토잿빛곰팡이병, 토마토역병, 무름병에 방제 효과를 가짐을 확인하였다(표 5 및 도 4 참조).
따라서, 본 발명의 불큘산은 식물병 방제에 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24균주를 배지에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 균주의 배양방법을 제공한다.
상기 한천배지는 감자한천배지(PDA; 감자전분 4 g, 포도당 20 g, 한천 15 g, 증류수 1 L), 맥아추출한천배지(MEA; 맥아추출물 30 g, 펩톤 5 g, 한천 15 g, 증류수 1 L), 자펙-독스한천배지(CDA; 설탕 30 g, NaNO3 2 g, K2HPO4 1 g, MgSO4 0.5 g, KCl 0.5 g, FeSO4 0.01 g, 한천 15 g, 증류수 1 L), 사부로오드포도당한천배지(SDA; 포도당 40 g, 펩톤 10 g, 한천 15 g, 증류수 1 L) 및 증류수 대신에 인공해수(ASW; 0.48 M NaCl, 0.01 M KCl, 0.027 M MgCl2, 0.03 M MgSO4, 0.01 M CaCl2, NaHCO3)를 첨가한 PDA+ASW(감자전분 4 g, 포도당 20 g, 한천 15 g, 인공해수 1 L, MEA+ASW(맥아추출물 30 g, 펩톤 5 g, 한천 15 g, 인공해수 1 L), CDA+ASW(설탕 30 g, NaNO3 2 g, K2HPO4 1 g, MgSO4 0.5 g, KCl 0.5 g, FeSO4 0.01 g, 한천 15 g, 인공해수 1 L), SDA+ASW(포도당 40 g, 펩톤 10 g, 한천 15 g, 인공해수 1 L) 배지일 수 있다.
상기 균주의 배양방법에 있어서, 배양온도는 18℃내지 27℃, 구체적으로 19℃내지 26℃, 더 구체적으로 21℃내지 26℃일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양온도를 벗어난 범위에서는 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24균주가 성장하지 못하거나 성장속도가 느릴 수 있다.
또한 본 발명은 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24균주를 PDB(potato dextrose broth) 또는 SDB(Sabouraud dextrose broth)배지에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 불큘산을 대량생산하는 방법을 제공한다.
상기 PDB배지의 조성은 감자전분 4 g, 포도당 20 g, 증류수 1 L일 수 있고, SDB배지의 조성은 포도당 40 g, 펩톤 10 g, 한천 15 g, 증류수 1 L일 수 있다.
상기 불큘산을 대량생산하는 방법에 있어서, 배양 기간은 5일 내지 12일, 구체적으로 6일 내지 11일, 더 구체적으로 7일 내지 10일일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양온도는 18℃내지 27℃, 구체적으로 19℃내지 26℃, 더 구체적으로 20℃내지 25℃가 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> SFC20150402-M24 균주의 분리
제주도 용두암에서 채취한 미역(Undaria pinnatifida) 표면을 인공해수(0.48 M NaCl, 0.01 M KCl, 0.027 M MgCl2, 0.03 M MgSO4, 0.01 M CaCl2, NaHCO3)로 세척하여 불순물을 제거하고, 정사각형의 미역절편(5 ×5 mm)으로 준비하였다. 이를 감자한천배지(potato dextrose agar; PDA; 감자전분 4 g, 포도당 20 g, 한천 15 g, 증류수 1 L)에 올려놓고, 25℃에서 2주 동안 배양하였다. 형성된 균총을 순수 배양하여 원형의 콜로니 형태를 보이며 흰색의 균사를 형성하는 SFC20150402-M24 균주를 분리하였다(도 1). 이후 SFC20150402-M24 균주는 멸균한 20% 글리세롤(glycerol) 수용액에 침지하여 -80℃에 보관하였다.
<실시예 2> SFC20150402-M24 균주의 동정
실시예 1에서 분리한 SFC20150402-M24 균주의 분류학적 동정을 위해 ITS(interanl transcribed spacer) 염기서열을 바탕으로 분자계통학적 분석을 실시하였다. 구체적으로, SFC20150402-M24 균주를 감자 액체 배지(potato dextrose broth)에 접종하여 25℃에서 일주일간 150 rpm으로 진탕배양하였다. AccuPrep DNA 추출 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 배양하여 얻은 균체로부터 유전체 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다.
PCR(polymerase chain reaction)은 정방향 프라이머 ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3', 서열번호 2), 역방향 프라이머 ITS4 (5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3', 서열번호 3)와 Ex Taq polymerase (Takara, Otsu, Japan)를 이용하여 94℃ 5분 1회, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초에서 34회, 72℃에서 7분간 1회 조건에서 진행되었다. 수득한 PCR생성물(product)을 전기영동하고 ll Expin PCR purification kit (GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 정제하고, 염기서열 분석을 위해 시퀀싱 분석 서비스(Macrogen, Daejeon, Korea)에 의뢰하였다. 시퀀싱된 염기서열 결과를 바탕으로 NCBI BLASTn 데이터베이스에 등록된 다른 균주들의 ITS 염기서열과 비교 분석하였다. MAFFT 프로그램으로 염기서열을 정렬한 후 Kimura 2-parameter model과 1,000회의 부트스트랩(bootstrap) 법으로 MEGA 프로그램을 사용하여 계통수(neighbor-joining tree)를 작성하였다.
[서열번호 1]
ACCTGCGGAAGGATCATTACCTAGAGTTTGTGGGCTTTGCTCACTGTCTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACTTACGTTTCCTCGGTGGGCTCGCCCGCCGGTTGGACAATTTAAACCATTTGCAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAACATAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTTGCGCGTAGACTCGCCTTAAAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTTTGCACTCATAACGACGACGTCCAAAAGTACTTTTTACACTCTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAGCGGGAGGAAGGATCA
시퀀싱 결과 서열번호 1의 ITS 염기서열을 얻었다. 상기 서열번호를 이용하여 계통도를 작성한 결과, SFC20150402-M24 균주는 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) CBS 260.92 및 CBS 187.83 균주와 같은 그룹을 형성하였고, 높은 상동성(99.9% 이상)을 나타냈다(도 2). 이러한 분석결과를 바탕으로 SFC20150402-M24 균주를 파라보에레미아 아디안티콜라 SFC20150402-M24 균주로 명명하고, 2019년 2월 13일자로 농업생명공학연구원에 수탁번호 83022로 기탁하였다.
<실시예 3> SFC20150402-M24 균주의 배양여액의 제조
파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주 배양여액의 벼 도열병(병원균: Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(병원균: Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(병원균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(병원균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(병원균: Colletotrichum coccodes)에 대한 식물병 방제 효과를 온실조건에서 평가하였다.
<실험예 1> SFC20150402-M24 균주의 배양여액의 식물 방제 효과 확인
실시예 1에서 분리한 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주를 감자한천배지에서 배양한 다음, 한천배지에 형성된 균총을 코르크보러(cork borer)로 천공하여 균사디스크(직경 8 mm)를 제조하였다. 균사디스크를 감자액체배지에 접종 후 25 ℃에서 1주일 동안 진탕배양(150 rpm)한 균주배양액을 원심분리(10,000 ×g, 20 min)한 후 여과지(또는 거즈)로 걸러서 배양여액을 제조하였다.
구체적으로 배양여액에 0.025% (w/v) 트윈 20(Tween 20)을 전착제로서 첨가하고, 이를 벼, 토마토, 밀, 보리 및 고추 유묘의 엽면에 분무처리하고 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 병원균을 접종하였다. 이 때, 각 식물병 당 4개의 포트를 이용하였고, 각 식물은 지름 4.5 ㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 다음, 종자를 파종하여 25 ±5 ℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배한 것을 이용하였다.
토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 접종 3일 후, 벼 도열병은 접종 5일 후, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병은 접종 7일 후, 벼 잎집무늬마름병은 접종 8일후에 병반면적율(%)을 조사하였고, 고추 탄저병의 경우 습실상에서 2일간 발병시킨 후 25℃의 항온실에 1일간 방치하였고, 접종 3일 후에 병반면적율(%)을 조사하였다. 측정한 각 식물병의 병반면적율을 다음과 같은 식에 대입하여 방제가(%)를 구하였다. 무처리구는 배양여액이 포함되지 않은 0.025%(w/v) 트윈20을 처리한 것이다.
방제가(%) = [1 - (처리구의 병반면적율 / 무처리구의 병반면적율)] ×100
배양여액 병 방제가(%)
RCBa RSB TGM TLB WLR BPM PAN
SFC20150402-M24 94 0 0 91 60 0 83
aRCB, 벼 도열병; RSB, 벼 잎집무늬마름병; TGM, 토마토 잿빛곰팡이병; TLB, 토마토 역병; WLR, 밀 붉은녹병; BPM, 보리 흰가루병; PAN, 고추 탄저병
그 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이, SFC20150402-M24 균주의 배양여액은 벼 도열병, 토마토 역병, 고추 탄저병에 대하여 각각 94%, 91%, 83%의 우수한 방제활성을 보였으며, 밀 붉은녹병에 대해서는 60%의 방제효과를 나타냈다.
<실시예4> SFC20150402-M24 균주 배양여액의 분획물 제조
살균활성을 나타내는 물질의 특성(지용성, 수용성)을 규명하기 위해 용매분획을 수행하였고, 분액여주를 사용하여 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주의 배양여액을 동량의 에틸아세테이트와 혼합하여 분액여두(separatory funnel)에서 진탕시킨 다음 정치시켜 유기용매층을 분리하고, 남은 물층에 다시 동량의 부탄올을 혼합하여 분액여주에서 진탕시킨 다음 정치시켜 유기용매층을 분리하여, 최종적으로 에틸아세테이트층, 부탄올층, 물층을 획득하고, 각각 감압농축하여 건조시켰다.
<실험예 2>SFC20150402-M24 균주 배양여액의 분획물의 식물병 방제효과 확인
상기 실시예4에서 제조한 각 분획물의 벼 도열병(병원균: Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(병원균: Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(병원균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(병원균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(병원균: Colletotrichum coccodes)에 대한 식물병 방제 효과를 온실 조건에서 확인하였다.
구체적으로, 각 분획물을 1,000 μg/ml 또는 3,000 μg/ml의 농도로 준비하고, 분획물의 용해를 위해서 메탄올의 함량을 5%로 첨가한 것을 제외하고, 실험예2와 동일한 방법으로 식물병 방제활성을 평가하였다.
분획물 농도
(μg/ml)		 병 방제가(%)
RCB* RSB TGM TLB WLR BPM PAN
에틸아세테이트층 3,000 21 0 0 13 0 0 5
1,000 0 0 0 0 0 0 0
부탄올층 3,000 93 0 0 94 80 0 0
1,000 56 0 0 93 13 0 0
물층 3,000 0 0 0 0 0 8 0
1,000 0 0 0 0 0 0 0
aRCB, 벼 도열병; RSB, 벼 잎집무늬마름병; TGM, 토마토 잿빛곰팡이병; TLB, 토마토 역병; WLR, 밀 붉은녹병; BPM, 보리 흰가루병; PAN, 고추 탄저병
그 결과, 표 2에서 나타난 바와 같이, 부탄올 분획물을 1,000 μg/ml 농도로 식물에 처리했을 때, 토마토 역병에 대하여 93%의 탁월한 방제효과를 나타냈고, 3,000 μg/ml 농도로 처리했을 때, 벼 도열병, 고추 역병, 밀 붉은녹병에 대하여 각각 93%, 94%, 80%의 우수한 방제효과를 보였다. 에틸아세테이트 분획물과 물 분획물에서는 유의미한 효과가 나타나지 않았고, 분획물을 처리한 벼, 토마토, 밀, 보리, 고추 작물에서 약해는 나타나지 않았다.
<실시예 5> 살균활성 물질의 분리 및 동정
파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주를 감자한천배지에서 배양한 다음, 한천배지에 형성된 균총을 코르크보러로 천공하여 균사디스크(직경 8 mm)를 제조하였다. 감자액체배지(400 ml)를 채운 2 l-삼각플라스크를 면전으로 밀봉하여 멸균한 다음, 균사디스크 20개씩 접종하였다. 접종 후 7일 동안 25 ˚C에서 진탕배양(150 rpm)한 균주배양액(4 l)을 제조하였다.
파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주 배양액을 원심분리(10,000 ×g, 20 min)한 후 여과지(또는 거즈)로 걸러서 배양여액을 제조하고, 배양여액을 동량의 부탄올과 혼합하여 분액여두(separatory funnel)에서 진탕시킨 다음 정치시켜 유기용매층을 분리하고 남은 물층에 다시 동량의 부탄올을 혼합하여 분액여두에서 진탕시킨 다음 정치시켜 얻어진 부탄올층을 감압농축하여 부탄올 분획물(3 g)을 제조하였다. 상기 부탄올 분획물을 Biotage SNAP Ultra C18 컬럼이 조합된 중압액체크로마토그래피(MPLC) 시스템(Biotage)에 로딩하고, 20%-100% 메탄올 수용액을 농도구배조건으로 8 ml/min의 유속으로 용출시켜, 약 300 mg의 화합물 1을 정제하였다(도 3). 화합물 1의 화학구조 결정을 위하여 NMR 분석을 실시하였고, 분리한 화합물 1을 CDCl3(99.96 atom% D; Cambridge Isotope Laboratories)에 녹여 Bruker Avance 500 MHz 핵자기공명장치에서 1H-과 13C-NMR 스펙트럼을 분석하였다.
Position Chemical shift (δ in ppm)
δ C, Type δ H (J in Hz)
1 175.8, CO
2 40.1, CH2 3.65 s
3 126.1, C
4 107.6, CH 6.42 s
5 150.7, C
6 134.1, C
7 147.4, C
8 122.6, C
9 206.4, CO
10 32.3, CH3 2.56 s
11 56.5, CH3 3.86 s
그 결과, 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 화합물 1의 13C-NMR 스펙트럼에서 2개의 카보닐 탄소(δ C 206.4, 175.8), 5개의 쿼터너리 sp2 탄소(δ C 150.7, 147.4, 134.1, 126.1, 122.6), 1개의 메틴 sp2 탄소(δ C 107.6), 1개의 메틸렌 sp3 탄소(δ C 40.1), 2개의 메틸 sp3 탄소(δ C 56.5, 32.3)가 나타났다. 화합물 1의 1H-와 13C-NMR 스펙트럼이 문헌에 보고된 화합물 뷸큘산(vulculic acid)의 NMR 데이터와 정확히 일치함을 확인하고, 화합물 1을 불큘산(vulculic acid)으로 동정하였다.
파라보에레미아(Paraboeremia) 속 균주로부터 불큘산 화합물의 분리는 보고된 바가 없으며, 불큘산의 살균작용을 포함한 식물병 방제효과 또한 보고된 적은 없다.
<실험예 3> 불큘산(vulculic acid)의 in vitro 및 in vivo 살균활성
<3-1> 다양한 식물병원균에 대한 불큘산(vulculic acid)의 최소억제농도
먼저, 식물 병원균으로 식물병원성 곰팡이 배추검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes), 토마토시들음병균(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici), 벼도열병균(Magnaporthe oryzae), 토마토역병균(Phytophthora infestans) 및 식물병원성 세균 호접란세균성갈색점무늬병균(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 과수뿌리혹병균(Agrobacterium tumefaciens), 세균성벼알마름병균(Burkholderia glumae), 고추궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 세균성무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 복숭아세균성구멍병균(Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 풋마름병균(Ralstonia solanacearum)을 준비하였다.
96-웰 플레이트의 100μl 웰에 곰팡이의 경우 포자가 1 ×104 spores/ml 또는 세균의 경우 1 ×103 baceterial cells/ml의 농도로 포함하도록 각각 배양하였다. 실시예 5에서 분리한 화합물 1이 각각 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 31, 63, 125, 250 μg/ml의 농도가 되도록 각 웰에 처리하였다. 이 때 메탄올의 함량은 1% 미만이었고, 1% 메탄올만 첨가한 것을 무처리구로 사용하였고, 항생물질 사이클로헥사마이드(cycloheximide)를 식물병원성 곰팡이에 대한 양성대조군으로 사용하였고, 옥시테트라사이클린(oxytetracycline)을 식물병원성 세균에 대한 양성대조군으로 사용하였다. 2-3일 동안 미생물 생장이 최적인 온도에서 배양한 다음 육안으로 관찰했을 때, 곰팡이의 생장이 완전히 억제되는 농도를 최소억제농도(MIC)로 결정하였다.
시험 미생물 최소억제농도(μg/ml)
불큘산 싸이클로헥시마이드 옥시테트라사이클린
Alternaria brassicicola >200 12.5 nta
Botrytis cinerea 200 100 nt
Colletotrichum coccodes >200 50 nt
Fusarium oxysporum >200 50 nt
Magnaporthe oryzae 6 1.5 nt
Phytophthora infestans 200 0.2 nt
Acidovorax avenae subsp. cattleyae >200 nt 50
Agrobacterium tumefaciens >200 nt 3.1
Burkholderia glumae >200 nt 1.5
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis >200 nt 0.8
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 50 nt 0.8
Xanthomonas arboricola pv. pruni >200 nt 1.5
Pseudomonas syringae pv. actinidiae >200 nt 0.8
Ralstonia solanacearum >200 nt 6.3
ant, not tested.
그 결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이, 불큘산(vulculic acid)은 식물병원성 곰팡이 중 벼도열병균(M. oryzae)의 생장을 6 μg/ml 농도에서 완전히 억제하는 방제활성을 나타냈고, 200 μg/ml 농도에서 토마토잿빛곰팡이병균(B. cinerea)과 토마토역병균(P. infestans)의 생장을 완전히 억제하는 약한 방제활성을 나타냈다. 식물병원성 세균 중 무름병균(Pectobacterium)에 대하여 50 μg/ml 농도에서 억제활성을 나타내었고, 나머지 세균에 대해서는 의미 있는 억제효과를 보이지 않았다.
<3-2> 불큘산(vulculic acid)의 식물병 방제효과
실시예5에서 분리한 불큘산의 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(원인균: Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes)에 대한 vulculic acid의 식물병 방제활성을 온실조건에서 평가하였다.
구체적으로, 불큘산(vulculic acid)을 메탄올에 용해시킨 후 250 μg/ml의 트윈 20 용액을 가하여 최종농도를 500, 1,000, 2,000 μg/ml으로 조절한 것을 제외하고, 실험예2와 동일한 방법으로 식물병 방제활성을 평가하였다. 이 때 모든 시료의 최종 메탄올 농도는 5%로 시험하였고, 무처리구로 5% 메탄올과 250 μg/ml의 트윈 20을 함유하는 용액을 사용하였다.
화합물 농도(μg/ml) 병 방제가 (%)
RCBa RSB TGM TLB WLR BPM PAN
불큘산 2,000 90 0 0 91 43 25 0
1,000 90 0 0 82 33 0 0
500 90 0 0 75 20 0 0
aRCB, 벼 도열병; RSB, 벼 잎집무늬마름병; TGM, 토마토 잿빛곰팡이병; TLB, 토마토 역병; WLR, 밀 붉은녹병; BPM, 보리 흰가루병; PAN, 고추 탄저병
그 결과, 상기 표 5와 도 4에 나타난 바와 같이, 불큘산(vulculic acid)은 500 μg/ml 농도에서 벼 도열병을 90% 방제하는 우수한 활성을 나타냈다. 또한 토마토 역병을 75% 방제하는 활성을 나타냈으며, 식물에 처리한 불큘산(vulculic acid)의 처리양이 증가함에 따라 최대 91%의 방제효과를 나타냈다.
상기 결과는 불큘산(vulculic acid)이 기존의 살균제를 보조하는 용도의 약제 또는 미생물추출물 유래 천연살균제로서 개발될 수 있는 가능성을 보여준다.
<실험예 4> 불큘산(vulculic acid)의 작물에 대한 약해 평가
불큘산(vulculic acid)의 작물에 대한 약해를 평가하기 위하여 불큘산을 2,000 μg/ml 농도로 준비하였다. 이 때 전착제로서 0.025% (w/v) 트윈 20을 첨가하였으며, 불큘산의 용해를 위해서 메탄올의 함량을 5%로 하였다. 벼, 토마토, 밀, 보리 및 고추의 엽면에 분무처리하고 24시간 동안 풍건한 다음 약해를 관찰하였다. 이 때 각 식물병당 4개의 포트를 이용하였고, 각 식물은 지름 4.5 ㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 다음, 종자를 파종하여 25 ±5 ℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배한 것을 이용하였다.
화합물 농도(μg/ml) 약해
벼 토마토 밀 보리 고추
불큘산 2,000 X X X X X
그 결과, 상기 표 6에서 나타난 바와 같이, 불큘산은 2,000 μg/ml 농도로 처리하였을 때 벼, 토마토, 밀, 보리, 고추 작물에 대한 약해는 나타나지 않았다.
<실시예 6> SFC20150402-M24 균주의 생육최적배지와 온도 확인
파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주의 생육최적배지 및 최적온도를 확인하기 위하여 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주를 PDA(감자한천배지)에서 배양한 다음, 한천배지에 형성된 균총을 코르크 보러로 천공하여 균사 디스크(직경 8 mm)를 제조하였다. 직경 8 cm의 한천배지를 준비하고, 정가운데에 균사 디스크를 접종하였다. 이 때, 한천배지는 감자한천배지(PDA; 감자전분 4 g, 포도당 20 g, 한천 15 g, 증류수 1 L), 맥아추출한천배지(MEA; 맥아추출물 30 g, 펩톤 5 g, 한천 15 g, 증류수 1 L), 자펙-독스한천배지(CDA; 설탕 30 g, NaNO3 2 g, K2HPO4 1 g, MgSO4 0.5 g, KCl 0.5 g, FeSO4 0.01 g, 한천 15 g, 증류수 1 L), 사부로오드포도당한천배지(SDA; 포도당 40 g, 펩톤 10 g, 한천 15 g, 증류수 1 L) 및 증류수 대신에 인공해수(ASW; 0.48 M NaCl, 0.01 M KCl, 0.027 M MgCl2, 0.03 M MgSO4, 0.01 M CaCl2, NaHCO3)를 첨가한 PDA+ASW(감자전분 4 g, 포도당 20 g, 한천 15 g, 인공해수 1 L, MEA+ASW(맥아추출물 30 g, 펩톤 5 g, 한천 15 g, 인공해수 1 L), CDA+ASW(설탕 30 g, NaNO3 2 g, K2HPO4 1 g, MgSO4 0.5 g, KCl 0.5 g, FeSO4 0.01 g, 한천 15 g, 인공해수 1 L), SDA+ASW(포도당 40 g, 펩톤 10 g, 한천 15 g, 인공해수 1 L) 배지를 이용하였다. 균사가 접종된 각 배지를 20, 25, 30 및 37℃에서 각각 7일 동안 배양한 후 균총 직경을 측정하였다.
배양배지a 균총 직경(mm)
20˚C 25˚C 30˚C 37˚C
CDA 58 ±7 58 ±7 16 ±2 0
CDA+ASW 36 ±11 51 ±4 26 ±1 0
PDA 22 ±7 23 ±7 9 ±1 0
PDA+ASW 18 ±7 20 ±5 19 ±3 0
MEA 6 ±4 16 ±9 4 ±1 0
MEA+ASW 7 ±3 15 ±6 12 ±3 0
SDA 22 ±16 28 ±9 7 ±2 0
SDA+ASW 9 ±6 28 ±4 12 ±4 0
aCDA, 자펙-독스한천배지; PDA, 감자한천배지; MEA. 맥아추출한천배지; SDA, 사부로오드포도당한천배지; +ASW, 인공해수첨가
그 결과, 상기 표 7에서 나타난 바와 같이, SFC20150402-M24 균주는 25℃에서 균사가 가장 잘 자랐으며, 37℃에서는 거의 생장하지 못하였다. 25℃서 배양한 SFC20150402-M24 균주의 균사 생장을 비교했을 때, CDA 배지에서 가장 잘 자랐고, SDA, PDA, MEA 순으로 잘 자랐으며, 인공해수를 첨가한 배지 보다 인공해수를 넣지 않은 배지에서 잘 자람을 확인하였다.
<실시예 7-1> 불큘산(vulculic acid) 생산을 위한 최적배지 및 최적배양기간 조사
불큘산의 대량생산을 위한 최적배양배지를 확인하기 위하여 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주를 다양한 액체 배지에 접종하여 생산된 불큘산의 함량을 비교하였다.
먼저 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주를 PDA에서 배양한 다음, 한천배지에 형성된 균총을 코르크보러로 천공하여 균사디스크(직경 8 mm)를 제조하였다. 50 ml씩 액체배지를 분주한 250 ml-삼각플라스크를 면전으로 밀봉하여 멸균한 다음, 균사디스크 4개씩 접종하고, 접종 후 7일 동안 25 ℃ 조건에서 진탕배양(150 rpm) 하였다. 이 때 액체배지는 PDB(potato dextrose broth), MEB(malt extract broth), CDB(Czapek-Dox broth), SDB(Sabouraud dextrose broth) 배지를 사용하였다. 증류수 대신에 인공해수(0.48 M NaCl, 0.01 M KCl, 0.027 M MgCl 2 , 0.03 M MgSO4, 0.01 M CaCl2, NaHCO3)를 첨가한 PDB+ASW, MEB+ASW, CDB+ASW 및 SDB+ASW 배지를 이용하였다. SFC20150402-M24 균주 배양액을 원심분리(10,000 ×g, 20 min)한 다음 실린지필터(0.2 μm pore size)로 걸러서 배양여액 시료를 제조하였다. 20 μl의 배양여액을 Pursuit C18 A (250 ×4.6 mm; Varian) 컬럼이 조합된 고성능액체크로마토그래피 시스템(Waters)에 로딩하고, 20%-60% 메탄올수용액(0.1% formic acid, v/v)을 농도구배조건으로 1 ml/min의 유속으로 용출시켜, 254 nm에서 검출되는 불큘산(vulculic aicd) 피크(Rt 11.8 min)의 면적을 측정하였다. 사전에 준비한 불큘산의 검량선을 사용하여 분석된 피크의 면적으로부터 함량을 계산하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주의 배양에 사용한 액체배지 중 PDB 배지와 SDB 배지에서 배양한 여액에서만 불큘산이 검출되고, 나머지 배지에서는 불큘산이 생산되지 않았음을 확인하였다. 인공해수를 넣은 PDB 배지에서 배양한 경우, 1 ml 당 22 μg의 불큘산이 생산되었으나, 인공해수를 넣지 않은 PDB 배지에서 배양한 경우에는 5 배 더 많은 1 ml 당 108 μg의 불큘산이 생산되었다. SFC20150402-M24 균주의 균사생장을 촉진했던 자펙-독스(Czapek-Dox) 배지는 액체배양 조건에서 불큘산을 생산하는데 있어서는 적합하지 않음을 확인하였다.
<실시예 7-2> 불큘산(vulculic acid) 생산을 위한 최적 배양기간 확인
파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주를 접종하여 3, 5, 7, 10, 12, 14일 동안 배양한 것을 제외하고 실시예7-1과 동일한 방법으로 불큘산의 함량을 측정하였다.
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이, SFC20150402-M24 균주의 접종 후 10일 째의 PDB 배양여액에서 가장 많은 양(1 ml 당 180 μg)의 불큘산이 검출되었고, 이후 배양기간이 증가함에 따라 함량이 감소함을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 SFC20150402-M24 균주를 PDB 배지에서 접종 후 10일 동안 25℃ 진탕배양(150 rpm)하는 방법이 불큘산을 생산하기 위한 최적의 조건임을 확인하였다.
농업생명공학연구원 KACC83022 20190213
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Claims (7)

  1. 수탁번호 KACC 83022BP로 기탁된 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주, 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 분획물로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae), 토마토 역병균(Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병균(Puccinia triticina) 및 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물 병원균에 의해 유발된 식물병 방제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양액은 균주를 배양한 배양액 또는 이를 물리적 방법으로 여과한 배양여액인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 물리적 방법은 배양액을 거즈(gauze) 또는 종이필터로 여과시키는 것임을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 에틸 아세테이트 및 부탄올으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용액을 용매로 사용하여 분획된 것임을 특징으로 하는, 식물병 방제용 조성물.
  5. 수탁번호 KACC 83022BP로 기탁된 파라보에레미아 아디안티콜라(Paraboeremia adianticola) SFC20150402-M24 균주, 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 분획물로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae), 토마토 역병균(Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병균(Puccinia triticina) 및 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물 병원균에 의해 유발된 식물병 방제 방법.
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  7. 삭제
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