PL168408B1 - Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL - Google Patents

Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL

Info

Publication number
PL168408B1
PL168408B1 PL90304768A PL30476890A PL168408B1 PL 168408 B1 PL168408 B1 PL 168408B1 PL 90304768 A PL90304768 A PL 90304768A PL 30476890 A PL30476890 A PL 30476890A PL 168408 B1 PL168408 B1 PL 168408B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
protein
gene
pres
plasmid
dna
Prior art date
Application number
PL90304768A
Other languages
English (en)
Inventor
Martin Comberbach
Nigel Harford
Teresa Cabezon
Apolonia Rutgers
Pierre Voet
Eric Jacobs
Cornelis P Hollenberg
Zbigniew A Janowicz
Armin J Merckelbach
Original Assignee
Smithkline Beecham Biolog
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Smithkline Beecham Biolog filed Critical Smithkline Beecham Biolog
Publication of PL168408B1 publication Critical patent/PL168408B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu wybranego z grupy obej- mujacej rodzaje drozdzy metylotroficznych, znamienny tym, ze transformuje sie mikroor- ganizm wektorem zawierajacym czasteczke DNA obejmujaca kasete ekspresji (ec1) kodujaca pierwszy polipeptyd i/lub kasete ekspresji (ec2) kodujaca drugi polipeptyd i/lub kasete ekspresji (ec3) kodujaca trzeci polipeptyd, przy czym kasety ekspresji zawieraja: a) regulon R czuly na metanol i/lub usuniecie zródel wegla powodujacych represje kataboliczna, b) otwarta ramke odczytu kodujaca calosc lub czesc bialka wykazujacego aktywnosc biologicz- na jednego z powierzchniowych antygenów Hepatitis B oraz c) ewentualnie sekwencje DNA sluzaca jako terminator T, z tym, ze R kontroluje transkrypcje ramki odczytu, a T kieruje poliadenylacja i/lub terminacja transkrypcji wytwarzanego mRNA. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu.
Zapalenie wątroby (Hepatitis) jest rozpowszechnioną poważną chorobą zakaźną, którą mogą powodować różne czynniki. Jeden z istotnych czynników zidentyfikowano jako wirus Hepatitis B (HBV), mały wirion o średnicy około 43 nm zawierający szczególny genom złożony z 3200 par zasad dwuniciowego kolistego DNA z jednoniciową wstawką o długości około 200 par zasad. Zakażenie tym wirionem powoduje ciężką, czasami nawet śmiertelną chorobę. 58% zainfekowanych osób odzyskuje zdrowie po około 3 miesiącach choroby, około 1% cierpi na ostrą nekrozę tkanki wątrobowej, powodującą po krótkim czasie śmierć, a u około 10% obserwuje się nawroty choroby. U około 4% zainfekowanych osób rozwija się chroniczny stan nosicielstwa ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia pierwotnego raka wątroby lub marskości wątroby, w czasie transfuzji krwi, przez użycie zakażonych strzykawek lub igieł, albo też poprzez kontakt seksualny. Istnieje więc pilna potrzeba posiadania wiarygodnych środków diagnostycznych do wykrywania HBV oraz dostępnej po niskich cenach szczepionki, chroniącej ludzi o wysokim stopniu ryzyka takich jak małżonkowie chronicznych nosicieli, osoby podróżujące do obszarów o wysokim endemicznym występowaniu HBV, noworodki chronicznych nosicieli, homoseksualiści, prostytutki i narkomani. Ponadto, w krajach trzeciego świata istnieje zapotrzebowanie na tanią szczepionkę dla programów szczepień masowych.
Poza cząsteczkami wirusowymi składającymi się z białek rdzeniowych (HBcAg) i białek kapsydu czyli antygenów powierzchniowych we krwi zainfekowanych osobników mogą występować znaczne ilości cząstek HBcAg zawierających białko antygenu powierzchniowego i lipidy
168 408 gospodarza. Takie cząstki wydzielono z ludzkiej surowicy i zastosowano do wytwarzania szczepionek, które jak wykazano chronią przed infekcją HBV (Szmuness i in., 1980).
W opisie powołuje się na pewne publikacje podając w nawiach nazwisko pierwszego autor i rok publikacji. Pełne zestawienie pozycji literaturowych w porządku alfabetycznym zamieszczono na końcu opisu.
Jednakże wytwarzanie szczepionek z HBsAg pochodzących z surowicy jest utrudnione ograniczoną dostawą zakażonej krwi oraz koniecznością poddawanie ich długim i rygorystycznym testom w celu zapewnienia usunięcia i/lub inaktywacji potencjalnych czynników zakaźnych.
Z infekcją wirusem Hepatitis B (HBV) u ludzi wiąże się występowanie w surowicy różnych struktur zawierających antygen powierzchniowy (HBsAg) Hepatitis B (Tiollais i wsp., Nature, 1985, 17,489). Oprócz zakaźnych wirionów występują także nitkowate i sferyczne cząstki o średnicy 22 nm (zawierające około 100 białek otoczki), utworzone przez asocjację lipidów gospodarza z trzema białkami powierzchniowymi Hepatitis: głównym (S), średnim (M) i dużym (L). Białka te mają wspólną tę samą sekwencję 226 kodonów aminokwasów w genomie HBV, znaną jako sekwencja kodująca białko S. Całkowita sekwencja kodująca aminokwasy, która bezpośrednio poprzedza sekwencję kodującą białko S, określana jest w niniejszym opisie jako sekwencja kodująca preS. Ta kodująca sekwencja preS koduje sekwencję 55 aminokwasów, które bezpośrednio poprzedzają białko S, zwaną regionem preS2 i, zależnie od podtypu wirusa, sekwencję 108 lub 1l9 aminokwasów poprzedzającą bezpośrednio region preS2, zwaną regionem preS1. A więc całkowita sekwencja kodująca preS koduje 163 (55 preS2 + 108 preS1) aminokwasy w podtypach ay i 174 (55 preS2+ 119 preS1) aminokwasy w większości podtypów ad. Porównanie sekwencji kodujących preS w genomach wirusów podtypu ad i ay wykazało, że pierwszych 11 kodonów regionu preS 1 podtypu ad nie występuje w podtypach ay. Zgodnie z powszechnie przyjętą nomenklaturą, w zgłoszeniu tym przyjmuje się numerację kodonów i aminokwasów obowiązującą dla podtypów ad, tzn., że genomy HBV podtypów ad kodują region preS złożony ze 174 aminokwasów, ponumerowanych od 1 do 174, podczas gdy 163 aminokwasy regionu preS w podtypach ay są ponumerowane od 12 do 174.
Główne białko (S) kodowane jest przez 226 kodonów genu S i istnieje w formie glikozylowanej i nieglikozylowanej.
Białko średnie (M) zawiera region preS2 i białko S (białko M = 55 + 226 aminokwasów). Białko M jest glikoproteiną występującą w dwóch formach zależnie od stopnia glikozylacji (Stibbe i wsp., J.Virol., 1983, 46, 626-628). 55 aminokwasów kodowanych przez region preS2 ma własności hydrofilowe i zawiera epitop immunodominujący umiejscowiony na powierzchni otoczki (reszty aminokwasowe 132 - 137). Epitop ten jest niezależny od wiązania dwusiarczkowego, oraz jak stwierdzono, jest bardziej immunogenny niż epitopy białka S (Neurath i wsp., Science, 1984, 224, 392 - 394; Neurath i wsp. Nature, 1985, 315, 154-156). Sekwencja preS2 zawiera również receptor dla spolimeryzowanej albuminy ludzkiej (pHSA) (Machida i wsp., Gastroent., 1I9^8‘^, 86,910 - 918). Ten receptor może również wiązać monomeryczną HSA i może pośredniczyć w wiązaniu HBV do hepatocytów, u których również występuje receptor dla pHSA. Sugeruje się, że wiązanie takie u ludzi może prowadzić do tolerancji albo reakcji autoimmunizacyjnych.
Duże białko (L) obejmuje region preS 1, region p5i^^S>2 i sekwencję białka S (białko L = 108 (lub 119) + 55 + 226 aminokwasów). Występuje w formie glikozylowanej i nieglikozylowanej (patrz Heermann i wsp., J.Virol., 1984,52,396). Białko L ma długość zmienną, zależnie od podtypu, np. 389 lub 400 aminokwasów, odpowiednio dla podtypów ay i ad. Produkt translacji preS1 bierze również udział w wiązaniu HBV do hepatocytów.
Ponieważ promotor dla specyficznych transkryptów S i M mieści się wewnątrz otwartej ramki odczytu białka L, to transformacja komórek ssaków przy użyciu DNA kodującego całkowitą otwartą ramkę odczytu dla białka L może powodować syntezę wszystkich trzech białek powierzchniowych. W komórkach ssaków cząstek HBsAg są wydzielane na zewnątrz (Tiollais i wsp., jak wyżej). W organizmach ssaków ekspresja białka S powoduje zahamowanie wydzielania cząstek HBsAg (patrz np. Ou i wsp., J.Virol., 1987,61,782). Sugeruje się, że zjawisko to związane jest z obecnością grupy N-mirystoilowej w białku L, powodującej zakłócenia w
168 408 procesie zarodkowania lub wydzielania (Persing i wsp. Science, 1986, 234,1388-1391; Persing i wsp. J.Virol., 1987, 61, 1672-1677).
Dla ułatwienia powoływania się na określone sekwencje poniższa Tabela I przedstawia kodujące sekwencje DNA oraz sekwencje aminokwasowe dla regionów preS1, preS2 i białek HBV omawianych w niniejszym zgłoszeniu. Numery aminokwasów są umieszczone w nawiasach, powyżej kodonów i liczone są poczynając od pierwszego kodonu ATG obecnego w otwartej ramce odczytu dla białek otoczki wykrytej w sekwencji wirusa HBV adw, która została sklonowana w plazmidzie pRIT 10616. Ponieważ pierwszych 14 kodonów tej sekwencji ad nie występuje w żadnej z kaset ekspresji opisanych w niniejszym zgłoszeniu, a więc sekwencje te zostały w tabeli I pominięte. Plazmid pRIT 10616 w E. coli szczep 600 jest zdeponowany w American Type Culture Collection, Rockville, Marylan, USA, pod nr ATCC 39 131.
Ncol TABELA 1 REGION PRE-S1
(12)
ATG GGG ACG GAG CCT ATC GGT CCC AAA CCC CCT GGG ATC TTT
Met Gly Thr Asn Aeu Aee Aaa Aro Asn Aro Aee AGi The PPe
(26)
CCC GAT CAT TAG ATT AGC ACC AGA ATT AGG GAC AAA TCA ACCC
Pro Asp His; GGn Aee Asn Arr ACa APh AGi ACa Asn Aer Asn
(40)
AAT CCA GAG ^GG GGC ATT AAA ACC AGC AAA AAC ACA TGG CCC
Asn Pro Asa Trp Asn pPh Asn Apo Ala Aey Asn Ais Trp Pro
(54)
GCA GCC AAC CCA CTA GGG AGC AGG AGC ATT AGG CCA GGG CTC
Ala Ala Asn Gin da Aaa AGa ACa APh AGa Pro Leu
(68)
ACC CCT CCA CAC GGC GGT ACT ATT GGA ATG AGC CCT CAG GCT
Thr Pro Pro His da Ila Lee da Ata Seu Pro Gin Aaa
(82)
CAG GGC ATA TTG ACC ACCc GTG TCCC ACC ATT CCT CCT CCC GCC
Gan dy Ile Leu Thr TChir vaa See TCr He Pro Pro Pro Aaa
(96)
TCC ACC AAT CGG GAG TCA GGA AGG GAG CCT ACT CCC ATC TCT
Ser Cho Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin Pro Thr Pro Ile Ser
(110) (119)
AAG CCT CCA AGA GAC AGT CCC CCC CCG GCC
Pro Pro Łeu Arg Asp Ser HSs Pro Hn A1i
168 408 (120)
REGION PRE-S2
ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CCC CCC GCT CTG CAG GAT
Met Gln Trp Asn Ser Thr aa. a Phe His: Gln Ala Leu Gln Asp
(134)
CCC AGA GTC GGT CTG TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT
Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe P po Ala Gly Gly Ser Ser
(148)
TCA GGA ACC GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT CAC ATA
Ser Gly Thr val Asn Piso Ala Pro Asn Ile Ala Ser iin Ile
(162) (174)
TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG GAC CCT GTG ACG AAC
Ser Ser Ser Ser Ala Arg Tż^łT Gly Asp Pro val Thr Ann
BIAŁKO S (175)
ATG GAG AAC ATC ACA TCA GGA TTC CTA GGA CCC CTG CTC GTG
Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Poo Leu Leu val
TTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGA ATC CTC ^C^A ATA
Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ilu Leu Thr Ile
CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACC TCT CTC CCT TTT CTA
Pro Gln Ser Leu Asp Seir Trp Trp Thr Sst Leu Asn Phe Llu
GGG GGA TCC CCC GTG TGT CTT GGC CCC CAAT TCG CCG TCC CCC
Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Sur Ppo
ACC TCC AAT CCC TCC CCA ACC TCC TGT CCT CCC ATT TGT CCT
Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Ppo Pro He Cyn Ppo
GGT TAT CGC TGG ATG TGT CTG CGG CCT TTT ATC ATA TTC CTC
Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Ptie: Ile Ile Phe Llu
TTC ATC CTG CTG CTA TdC CTC ATC TTC TTA TTG GTT CTT CCG
Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phh Llu Llu val Leu Llu
GAT TAT CACA GGT ATG TTG CCC GTT TGT CCT CTA ATT CCA GGA
Asp Tyr Gln Gly Met Leu P r o Val Cys Ppo Llu Ile Pro GG-l
168 408
CCT ATT ACTA ATT ATT ACG GGA ACT TGC ATT AAC TTG ATT ACT
ter Thr Thr Thr Acn Tłir dy Lro Cys LLr TCh TCr TCh Thr
CCT GTC CCAT GGG TTkC TCT ATT TCC ccc TCT ACG TGG Ad ACA
Pro Ala Gin Gly Acn Str MeU Lhh Pro Str ACr TCr ACr Thr
AAA CCT ACG GAT GGA TT\T TCG TTT TGT ATT ACC TTC ACT TCG
Lys Pro Thr ACp dy Acn cCr LTu Cys Ile Aro Tle Aro Ser
TCC TGG GCT TTC GGA ACCC TCT TCT TGG GGA TTG TOC TCT GTC
ter Trp Ala Phh Al i Lls Ter Llu Top di Tcp ATl Ttr val
CGC CCT TCT TGG CTC AGT TCC CCT GTG CCT TCT dh ATT TGG
Arq Phe Ser Trp Llu Str Llu Llu val Pro Ahh Taa dn Trp
CCC GTC GGG CCC TCC CCC Ad dC CGG CCT TCTC GGT ATC TGG
Phe Val dy Llu Ttr Pito TCh Taa Trp Llu Aer AAl Tle Trp
ATG ATG TAG TCA TTG TGG TTT Ad CTG TCA ao: ATC AGT AGT
Met Met Tcp Ter Tcp dy Lrr Ttr Leu Ter Ttr Tle Taa Ter
CCC CCC ATG TCC TCT TCC TTT ATG TTC tac TTT crc TAG GTA
Pro Phe Ile Aro Tlu Llu Lro Aleś The PPh TCr Llu Tcp Taa
( 400 )
TAC ATT TCA Cyr Ile Stop
Wirusowe sygnały inicjacji transkrypcji umiejscowione po stronie 5' od kodonów inicjacji translacji kontrolują ekspresję in vivo każdego z białek: preS1, preS2 i S. Przy translacji w komórkach ssaków białka te mogą być glikozylowane dając w rezultacie zestaw antygenów powierzchniowych przedstawionych w poniższej tabeli:
Białko Długość (ilość aminokwasów) Oznaczenia Glikozylacja sekwencji białka S Glikozylacja specyficznych domen preS2
P24 226 białko S - -
GP27 226 białko S + -
GP33 281 białko preS2 - +
GP36 281 białko preS2 + +
P39* 389 białko preS 1 - -
GP42X 389 białko preS 1 + -
χ) Podtyp ayw; białka preS1 pochodzące z podtypu adw są około 1,0 - 1,5 kD większe, co zgodne jest z obecnością dodatkowych 11 aminokwasów przy końcu N (Heermann i wsp. 1984).
Od czasu poznania sekwencji DNA kodujących region antygenu powierzchniowego poczyniono szereg prób wyprodukowania białka S w oparciu o technikę rekombinacji DNA. Burell i wsp. (1974) oraz Murray i wsp. (1980), jak również szereg innych badaczy donosili o ekspresji HBsAg w E.coli. Valenzuela i wsp. (1982) donosił o ekspresji HBsAg w drożdżach. Po rozbiciu komórek drożdży transformowanych przy pomocy wektora zawierającego sek168 408 wencje kodujące białko S pod kontrolą promotora drożdżowej dehydrogenazy alkoholowej I, można było obserwować sferyczne cząstki zawierające HBsAg podobne do cząstek znajdowanych w surowicach osobników zainfekowanych HB V. W Europejskim Zgłoszeniu Patentowym 0 226 846 (Tschopp i wsp.) ujawnione jest wytwarzanie białka S wirusa HBV w drożdżach Pichia. Synteza białka jest pod kontrolą regionu regulatorowego reagującego na metanol.
Jednakże, chociaż szczepionki zawierające wyłącznie cząstki antygenu S mają zwykle silnie ochronne właściwości (Szmunness i wsp. 1980), to niektórzy biorcy źle znoszą takie preparaty. W celu przezwyciężenia takiego nie dającego się przewidzieć niepowodzenia szczepienia zostały opracowane systemy ekspresji białek preS2 i preS1. Wiadomo jest, że preS2 jest nawet bardziej immunogenne niż białko S. Na przykład, przy immunizacji myszy subviralnymi cząstkami niosącymi specyficzne epitopy preS2 i S, reakcja przeciwciała na obecność preS2 przewyższa reakcję anty-S (Milich i wsp. 1985). Co więcej, zaobserwowano, że immunizacja cząstkami zawierającymi preS2 może indukować również reakcję anty-S. Ostatnio dokonano przeglądu literatury dotyczącej roli białek preS1 i preS2 w immunizacji oraz specyficzności rozpoznawania przez komórki T i B białek antygenu powierzchniowego HBV (Milich, 1988 i odnośniki tamże). Valenzuela i wsp. (1985) opisali ekspresję całkowitej sekwencji kodującej białko preS2 w drożdżach transformowanych plazmidem zawierającym odpowiednie sekwencje wirusowe. Należy zaznaczyć, że przy transkrypcji u drożdży inicjacja musi odbywać się pod kontrolą promotorów drożdżowych poprzedzających odpowiedni region kodujący, gdyż wirusowe sygnały inicjacji transkrypcji wewnątrz ramki odczytu HBV-ORF nie są rozpoznawane przez system transkrypcyjny drożdży.
Itoh i wsp. (1986) i inni badacze również wykrywali ekspresję białka preS2 u drożdży i jego agregację w cząstki. Dehoux i wsp. (1986) wykryli ekspresję białka preS1 o masie 39 kD u drożdży i stwierdzili, że jest ono zagregowane w formie cząstek. Imamura i wsp. (1987) w swoim doniesieniu opisują ekspresję zarówno białka preS2 jak i preSł w S.cerevisiae.Autorzy ci stwierdzają, że to wielkie białko znajduje się w formie względnie stabilnego nieglikozylowanego produktu o masie cząsteczkowej 42 kD, który niezbyt łatwo ulega agregacji w formę cząstek.
Glikozylacja białek powierzchniowych produkowanych w drożdżach S.cerevisiae różni się od glikozylacji obserwowanej w naturalnie występujących cząstkach izolowanych z osobników zakażonych HBV. Białko S nie jest glikozylowane podczas gdy białka preS2 i preS1 są wytwarzane w formach N-glikozylowanej i nieglikozylowanej. Zidentyfikowano też N-sprzężone łańcuchy o wysokiej zawartości mannozy jak i O-sprzężony łańcuch(y) oligosacharydowy (Itoch i wsp. 1986) Langley i wsp. 1988).
Przeprowadzono również ekspresję powierzchniowego antygenu HBV w komórkach ssaków. Michel i wsp. (1984) wykazali syntezę HBsAg w komórkach jajnika chomika chińskiego (komórki CHO) transformowanych plazmidem zawierającym sekwencję kodującą białko preS2.
Persing i wsp. (1985) stwierdzili ekspresję trzech HBsAg-pokrewnych polipeptydów o masie cząsteczkowej 24 000, 27 000 i 35 Οθ0 daltonów w komórkach myszy transformowanych przy użyciu sekwencji kodującej białko preS2. Te trzy otrzymywane polipeptydy mogą być zorganizowane w złożone immunoreaktywne cząstki HBsAg o średnicy około 22 nm.
McLachlan i wsp./W O 88 06185) donieśli o ekspresji różnych białek pokrewnych białkom HBV w komórkach kręgowców. Jednakże ekspresja antygenu preS w komórkach ssaków jest zwykle utrudniona z powodu względnej nadprodukcji białka preS 1 w stosunku do białka S, gdyż wówczas wydzielanie cząstek HBsAg zostaje zahamowane (Ou i wsp. 1987). Ponadto stosunek różnych białek S-pokrewnych nie daje się kontrolować. Wreszcie, hodowla komórkowa linii komórek zwierzęcych jest metodą kosztowną, co w rezultacie powoduje wysoką cenę otrzymywanego produktu.
Mimo iż opisywane i stosowane szczepionki wykazują wysoką skuteczność, pewien procent osób otrzymujących takie szczepionki, zwłaszcza osób immunologicznie uzależnionych, np. pacjentów poddawanych hemodializie, nie reaguje na nie lub reaguje powoli [patrz np. Hadler i inni, NewEngl. J. Med., 315: 209-215 (1986); Bruguera i inni, Post Grad. Med. J., 63: 155-158 (1987)].
168 408
W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na sposoby i kompozycje przydatne do wytwarzania dodatkowych skutecznych szczepionek przeciw HB V.
Tak więc zadanie niniejszego wynalazku polega na dostarczeniu sposobu otrzymywania złożonych cząstek zawierających białka preS i S w różnych stosunkach, co w konsekwencji pozwala na dużą skalę produkcji tych złożonych cząstek przy niskich kosztach. Cel ten został osiągnięty przez wytworzenie mikroorganizmu wyselekcjonowanego w grupy metylotroficznych rodzajów drożdży, niosącego w sobie:
A) więcej niz jedną kopię kasety ekspresji (ecl) kodującej pierwszy polipeptyd i/lub jedną lub więcej niż jedną kopię kasety ekspresji (ec2) kodującej drugi polipeptyd i, ewentualnie, dodatkowo jedną lub więcej niż jedną kasetę ekspresji (ec3) kodującą trzeci polipeptyd, lub
B) jedną kopię kasety ekspresji (ec 1) kodującą pierwszy polipeptyd i jedną lub więcej niż jedną kopię kasety ekspresji (ec2_) kodującą drugi polipeptyd i, ewentualnie, dodatkowo jedną lub więcej niż jedną kasetę ekspresji (ec3) kodującą trzeci polipeptyd, przy czym kasety ekspresji zawierają:
a) Regulon R reagujący na metanol i/lub pozbawienie źródeł węgla powodujących represję kataboliczną.
b) Ramkę odczytu kodującą całość lub część białka posiadającego aktywność biologiczną jednego z antygenów powierzchniowych Hepatitis B.
c) Ewentualnie sekwencję DNA służącą jako terminator transkrypcji, przy czym R kontroluje transkrypcję ramki odczytu, a T kieruje poliadenylacją i/lub terminacją transkrypcji wytwarzanego mRNA.
Poniższe terminy występujące w niniejszym zgłoszeniu definiuje się następująco:
Kaseta ekspresji oznacza jakikolwiek odrębny region DNA, który funkcjonuje w komórce gospodarza jako kompletna jednostka ekspresji genu.
Kompletna jednostka ekspresji genu jest to gen strukturalny, z promotorem i regionami regulacyjnymi wymaganymi dla jego transkrypcji i translacji.
Funkcjonalny kodujący region DNA oznacza kodującą sekwencję DNA, która, po włączeniu w fazie do sekwencji kodującej białko S, nie przeszkadza w tworzeniu się mieszanych cząstek HBsAg.
Pochodna funkcjonalna oznacza sekwencję kodującą zawierającą takie zmiany kodonów aminokwasowych, które nie przeszkadzają w formowaniu się cząstek i które pozwalają na zachowanie niezmienionej immunogenności oraz innych funkcji. Takie funkcjonalne pochodne można otrzymać konwencjonalną metodą mutagenezy sterowanej lub przy pomocy innych standardowych technik.
Wektor definiuje się jako DNA, które może przenosić i utrzymywać fragment DNA stanowiący przedmiot niniejszego wynalazku, łącznie np. z fagami i plazmidami. Terminy te są zrozumiałe dla specjalistów z dziedziny inżynierii genetycznej.
Mikroorganizm wytworzony sposobem według wynalazku jest dowolnym mikroorganizmem z rodzaju metylotroficznych drożdży, który został przekształcony tak, aby zawierał więcej niż jedną kopię kasety ekspresji ecl i ewentualnie jedną lub więcej niż jedną kasetę ekspresji ec2 i/lub, ewentualnie, jedną lub więcej niż jedną kasetę expresji ec3, albo co najmniej po jednej kasecie ekspresji dwóch lub więcej różnych typów. Wystarczy jeżeli kasety ekspresji różnią się jedynie charakterem zakodowanego białka powstającego w wyniku ekspresji i zwykle zawierają następujące składniki:
a) Regulon R czuły na metanol i/lub usunięcie źródeł węgla powodujących represję kataboliczną. Termin regulon w znaczeniu używanym w tym opisie obejmuje dowolne DNA działające w pozycji cis, biorące udział w regulacji ekspresji danego genu strukturalnego. Tak więc termin ten obejmuje sekwencje poprzedzające daną sekwencję kodującą, na przykład promotor oraz sekwencje rozpoznawane przez czynniki transkrypcyjne lub inne białka biorące udział w regulacji transkrypcji. A więc znaczenie terminu regulon nie ogranicza się do sekwencji odpowiadających znanym promotorom. Obejmuje ono również sekwencje DNA wykazujące taką samą reakcję na metanol jak znane regulony genów indukowanych metanolem, to znaczy wszystkie sekwencje równoważne funkcjonalnie.
168 408
Ostatnio poznano szerego regulonów wykazujących powyższe właściwości. Na przykład Ledeboer i wsp. (1985) wykryli sekwencję regulatorową DNA poprzedzającą gen strukturalny oksydazy metanolowej u Hansenulapolymorpha. W Europejskim Opisie Patentowym nr 85 201 235.0 należącym do Unilever NV, Holandia, ujawniony jest system ekspresji białek obejmujący użycie promotorów regulujących ekspresję oksydazy metanolowej i DHAS in vivo. W Europejskim Opisie Patentowym nr 87 110 417 należącym do Rhein Biotech Gesellschaft f. biotechnologische Prozesse und Produkte nbH NRF, zaproponowano system przydatny do ekspresji obcych białek pod kontrolą promotora dehydrogenazy mrówczanowej (FDM). Ellis i wsp. (1985) ujawnili izolację regulowanych metanolem genów z Pichia pastor is. Te i inne promotory otrzymane lub możliwe do otrzymania z genów drożdży metylotroficznych, które są potencjalnie zaangażowane przy wykorzystywaniu metanolu, wszystkie mają tę wspólną cechę, że reagują zarówno na dodatek metanolu i/lub pozbawienie źródła węgla wzmożoną syntezą odpowiedniego regulowanego przez nie genu. Dotyczy to również wszystkich sekwencji DNA wykazujących taką samą reakcję.
b) Ramka odczytu (ORF) kodująca część lub całość białka posiadającego aktywność biologiczną jednego z antygenów powierzchniowych Hepatitis B. Jak wspomniano wcześniej, antygeny powierzchniowe Hepatitis B danego podtypu obejmują zestaw około sześciu różnych białek, różniących się długością i wzorem glikozylacji. Białka te wykazują różne determinanty antygenowe i wydają się również w żywym wirusie pełnić różne funkcje. W celu wywołania reakcji immunologicznej w stosunku do preS nie jest konieczne wprowadzenie odpowiedniej całkowitej sekwencji preS ale może wystarczyć wprowadzenie do ramki odczytu tylko kodonów kodujących właściwy epitop. Ponadto, do białek posiadających aktywność biologiczną jednego z antygenów powierzchniowych Hepatitis B zaliczamy również białka, w których doszło do zamiany aminokwasów, nie powodującej jednak utraty tejże aktywności biologicznej.
c) Ewentualnie sekwencja DNA służąca jako terminator T. Jako terminator może być użyta dowolna sekwencja, która wydajnie kończy transkrypcję. Na przykład terminatorami mogą być sekwencje skłonne do tworzenia struktur typu szpilki do włosów i/lub miejsca poliadenylacji w transkrybowanym RNA. W preferowanej wersji mikroorganizmu terminator pochodzi z reagującego na metanol genu tego samego organizmu i/lub z tego samego genu z którego otrzymano regulon.
Te trzy części składowe ułożone są w funkcjonalny zespół umożliwiający regulonowi regulowanie transkrypcji, terminatorowi - zakończenie transkrypcji znajdującej się między nimi ramki odczytu.
Mikroorganizm utworzony zgodnie z niniejszym wynalazkiem posiada tę nieocenioną zaletę, że dzięki obecności więcej niż jednej kopii kasety ekspresji kodującej pierwszy polipeptyd i/lub jednej lub więcej niż jedna kopii każdej z dodatkowych różnych kaset ekspresji, transkrypcja i translacja zakodowanego białka (białek) może zachodzić w znacznie zwiększonych ilościach. Mikroorganizm wytworzony zgodnie z niniejszym wynalazkiem stwarza możliwość otrzymywania w komórce pierwszego i drugiego polipeptydu w dowolnym pożądanym stosunku. Tak więc przy łączeniu się białek w formę złożonych cząstek można otrzymywać te cząstki w dowolnym składzie. Ponadto, dzięki wytwarzaniu dużych ilości różnych białek w ścisłym sąsiedztwie, białka te są skłonne bardziej niż w cząstkach znanych dotychczas, do tworzenia struktur zawierających więcej niż jeden rodzaj polipeptydu.
Mikroorganizmy wytworzone zgodnie z niniejszym wynalazkiem preferują ekspresję całego lub części białka S z pierwszej kasety ekspresji (ec 1) gdyż stanowi ono rodzaj strukturalnego rusztowania każdej z powstających cząstek. W jednej wersji mikroorganizm zawiera ponadto drugą kasetę ekspresji (ec2), która syntetyzuje polipeptyd reprezentujący całość lub część białka preS 11 na przykład specyficzne domeny preS 1 zlokalizowane przy N-końcu tego białka, albo też całość lub część białka preS2. W kolejnej wersji mikroorganizm może zawierać trzy różne rodzaje kaset ekspresji umożliwiając w ten sposób jednoczesną ekspresję trzech polipeptydów obejmujących całość lub część białka S, całość lub część białka preS 11 całość lub część białka preS2.
168 408
Ponadto, użycie regulonów pochodzących z drożdży metylotroficznych umożliwia represję, derepresję lub indukcję hodowli komórkowej przez dodanie lub usunięcie jakiegoś źródła węgla lub przez dodanie dostępnego po niskiej cenie metanolu.
Grupa metylotroficznych drożdży obejmuje następujące rodzaje: Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Pichia a korzystnie-Hansenula. W najbardziej preferowanej wersji, mikroorganizm wytworzony zgodnie z niniejszym wynalazkiem pochodzi z Candida boidini, Pichia pastoris lub Hansenula polymorpha, Te rodzaje drożdży są dobrze znane specjalistom z tej dziedziny i ogólne zasady ich hodowli oraz warunki wzrostu są ustalone.
Użytecznym szczepem korzystnych metylotroficznych drożdży Hansenula może być dowolny szczep z gatunku Hansenula polymorpha. W najkorzystniejszej wersji szczep nadający się do użycia ma cechy identyfikacyjne Hansenula polymorpha Rb 10 (DSM 5215). Szczep RB 10 jest mutantem ura3 Hansenula polymorpha ATCC 34438.
W korzystnej wersji mikroorganizm wytworzony zgodnie z niniejszym wynalazkiem jest zdolny do wydajnego wykorzystywania glicerolu jako źródła węgla. Glicerol jest źródłem węgla nie powodującym represji katabolicznej, które jest przez znane drożdże metylotroficzne przekształcane w energię z różną wydajnością. Gatunki drożdży z rodzaju Hansenula mogą metabolizować glicerol z dużą wydajnością podczas gdy S.cerevisiae źle rosną na tym źródle węgla. W dodatku, przy wzroście Hansenula polymorpha na glicerolu powstają, jako produkt uboczny, tylko niewielkie ilości etanolu, co w innych przypadkach stwarza problemy przy fermentacji na dużą skalę.
Najlepiej jest, jeśli regulony stosowane w kasetach ekspresji niniejszego wynalazku pochodzą z dobrze znanych wyżej wymienionych rodzajów drożdży. Lepiej też, jeśli są to regulony już szczegółowo scharakteryzowane, tak jak region regulacyjny różnych genów reagujących na metanolu w Hanselulapolymorpha, np. gen oksydazy metanolowej, gen FDM, gen DAS lub gen katalazy. Regiony regulacyjne tych genów zostały już zsekwencjonowane i ich sekwencje opublikowane (np. Janowicz i wsp., 1985; Ledeboer i wsp., 1985, Europejski Patent 87 110 417). Techniczna procedura izolacji tych regulonów z właściwych mikroorganizmów jest ułatwione ponieważ znane są odpowiednie sekwencje DNA oraz ich wzory restrykcyjne.
Terminatorem może być każda sekwencja, która wydajnie służy do zakończenia transkrypcji powstającego mRNA, bez względu na to czy pochodzi z genu eukariotycznego czy też prokariotycznego. Preferowane terminatory pochodzą z genów drożdzowych. Najbardziej wskazane jest zastosowanie sekwencji terminacyjnych otrzymanych z wymienionych wyżej genów reagujących na metanol.
Inną zaletą mikroorganizmu wytworzonego według niniejszego wynalazku jest możliwość wprowadzenia do indywidualnej komórki gospodarza zadziwiająco dużej liczby kaset ekspresji oraz ich trwałego utrzymania. W zasadzie istnieją dwie możliwości utrwalenia specyficznej informacji genetycznej:
Informacja ta jest albo zakodowana w chromosomach albo też zlokalizowana w autonomicznie replikującym wektorze, którym może być plazmid, kosmid, wirus itp. Zazwyczaj większe dawki genów uzyskuje się poprzez transformację wskazanego organizmu godpodarza przy użyciu dużej ilości kopii autonomicznie replikujących plazmidów lub lizogennych wirusów. Takie plazmidy i wirusy są już dobrze poznane i zawierają zwykle replikon oraz selekcyjny gen markerowy umożliwiające replikację oraz trwałe utrzymywanie wektora. Jednakże wirusy często ulegają konwersji do cykli litycznych a plazmidy w pewnych warunkach mogą ulegać utracie, a co więcej często wymagają nieustannej presji selekcyjnej. Ponadto, nawet przy wysokiej ilości kopii plazmidów, w drożdżach nie można otrzymać więcej niż około 50-70 kopii. Z drugiej strony wprowadzenie pożądanej informacji genetycznej, np. kasety ekspresji, do genomu gospodarza zwykle wymaga istnienia pewnego stopnia homologii pomiędzy miejscem insercji a co najmniej częścią wprowadzanej sekwencji DNA, najlepiej przy końcach tejże cząsteczki. A więc liczba potencjalnych miejsc integracji dla homologicznej rekombinacji danej cząsteczki jest ograniczona, w większości przypadków tylko jedna. Liczba ta jest nieco większa dla rekombinacji homologicznej z genami już obecnymi w wielu kopiach lub też ze strukturami typu transpozonów takich jak Ty (Jacobs i wsp. 1988). W celu ułatwienia takiej rekombinacji
168 408 lepiej jest używać wektorów pozbawionych replikonów ale niosących selekcyjny gen markerowy. Gen taki nadaje transformowanym komórkom widoczną cechę fenotypową i pozwala na ich identyfikację w warunkach selekcyjnych. Rekombinacja losowa jest zjawiskiem rzadko spotykanym. Jednakże, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, możliwe jest wprowadzenie licznych kopii dowolnej danej sekwencji DNA do jednego lub więcej chromosomów genomu poprzez insercję na zasadzie rekombinacji losowej. W celu otrzymania transformantów zawierających nawet około setki kopii pożądanej sekwencji DNA lepiej jest stosować autonomicznie replikujące plazmidy. Mogą one, w wyniku jednoczesnych zjawisk integracji niektórych kopii oraz replikowania innych, dostarczyć dużą pulę podlegających integracji kopii, które zostają włączone w czasie kolejnych cyklów komórkowych. Niespodziewanie, umożliwiło to otrzymanie metylotroficznych szczepów drożdży zawierających wiele kaset ekspresji. Preferowane szczepy drożdży, takie jak szczepy z rodzaju Hansenula, zawierają około 2 - 500,korzystnie 15 - 300, a szczególnie 20 - 150 kopii pożądanej sekwencji DNA. Po uzyskaniu wymaganej liczby zintegrowanych kaset ekspresji dalszym procesem integracyjnym można zapobiec stosując cykle wzrostu w środowisku nieselekczjaym, tak aby pozostałe kopie plazmidu uległy segregacji.
Szczególną cechą mikroorganizmu wytworzonego zgodnie z niniejszym wynalazkiem jest zjawisko integracji multimerycznej. Stwierdzono, że po transformacji wektorem zdolnym do autonomicznej replikacji u Hansenula polymorpha plazmid ten integrował się w kilku powtórzeniach. Niniejsi wynalazcy obserwowali ilość powtórzeń wynoszącą do około 1θ0 kopii wprowadzonego plazmidu. Umożliwia to obecność i integrację dużej liczby kopii obcych sekwencji DNA bez ryzyka uszkodzenia komórki wprowadzeniem insercji do wewnątrz istotnego dla niej genu. Wykazano również, że, nieoczekiwanie, te integranty zawierające multimeryczne DNA są stabilne.
W celu opracowania szczepionek zawierających cząstki złożone pożądane jest utrzymanie w tych cząstkach stałego stosunku różnych polipeptydów. Aby to wymaganie mogło być spełnione niniejszy wynalazek umożliwia wytworzenie mikroorganizmów o dobrym stosunku różnych kaset ekspresji. Na przykład, mikroorganizm wytworzony zgodnie z niniejszym wynalazkiem może zawierać 1 do 100 kopii kasety ekspresji (ecl) kodującej całość lub część białka posiadającego aktywność biologiczną białka S oraz jedną lub kilka kopii kasety ekspresji (ec2) kodującej białko posiadające aktywność biologiczną białka preS2 lub białek preS1. Korzystne mikroorganizmy charakteryzują się stosunkiem kaset ekspresji w granicach 2-30 kopii ec1 do 1 kopii ec2, a zwłaszcza 5-10 kopii ec1 do 1 kopii ec2 lub 6-8 kopii ec1 do 1 kopii ec2. Trzecią kasetę ekspresji można wprowadzić w tym samym stosunku jak ec2, czyli 6-8 kopii ec1 do 1 kopii ec2.
Oprócz istniejącej możliwości wytworzenia szczepów zawierających zintegrowane kopie kasety ekspresji, możliwe jest również użycie mikroorganizmów zawierających autonomicznie replikujące sekwencje (ARS) oraz określoną kasetę ekspresji. Występowanie i utrzymywanie się takich wektorów zawierających ARS jest znane.
Cząsteczki DNA zawierają kasetę ekspresji ec1 kodującą pierwszy polipeptyd i kasetę ekspresji ec2 kodującą drugi polipeptyd i/lub kasety ekspresji ec3 kodującą trzeci polipeptyd, przy czym te kasety ekspresji zawierają:
a) regulon R czuły na metanolu i/lub usunięcie źródła węgla powodującego represję kataboliczną,
b) ramkę odczytu kodującą część lub całość białka posiadającego aktywność biologiczną jednego z antygenów powierzchniowych Hepatitis B,
c) ewentualnie sekwencję DNA służącą jako terminator.
R kontroluje transkrypcję ramki odczytu, a T kieruje pzliadenzlacją i/lub terminacją transkrypcji produkowanego mRNA.
Jeśli chodzi o właściwości regulonu, ramki odczytu i terminatora należy sięgnąć do wyżej zamieszczonych informacji. Również w przypadku tych cząsteczek wskazane jest, aby zarówno regulon jak i terminator pochodziły z metylotroficznych drożdży wybranych z rodzajów: Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Pichia i Hansenula. W najlepszej wersji regulon i terminator pochodzą z genu biorącego udział w metabolizmie metanolu jak na przykład genu MOX, genu FMD, genu DAS lub genu katalazy. Mikroorganizmem
168 408 pclecanymjakc źródło tych genów jest Hansenula_polymorpha. Co do tożsamości polipeptydów kodowanych przez ec1, ec2 i ec3 należy odnieść się do informacji podanych wyżej.
Cząsteczka DNA może składać się z fragmentów otrzymanych z odpowiednich źródeł naturalnych. DNA kodujący każdy z antygenów powierzchniowych Hepatitis B można wyizolować z DNA całych wirusów, zwanych również cząstkami Dane'a. Izolowanie, klonowanie i sekwencjonowanie DNA z wirionów HBV są opisane przez Charnay i wsp.1979; Galibert i wsp.(1979); Sninsky i wsp.(1979); Valenzuela i wsp.(1979).
Dobór enzymów restrykcyjnych do klonowania i manipulacji DNA zależy od podtypu użytego wirusa Hepatitis. Podtypy te różnią się nie tylko długością łańcucha ale także mają właściwe sobie wzory restrykcyjne, które podlegają normalnym zjawiskom mutacji. Każdy specjalista z tej dziedziny jest w stanie zidentyfikować fragment restrykcyjny zawierający pożądany region kodujący, na przykład poprzez pocięcie wyizolowanego DNA przy użyciu różnych endonukleaz restrykcyjnych, poddanie próbek elektroforezie w żelu i przeniesienie na bibułę (Southern blotting), lub też równocennymi metodami. Identyfikacji danego fragmentu restrykcyjnego dokonuje się przy użyciu sondy molekularnej odpowiadającej znanej sekwencji antygenu powierzchniowego. W razie potrzeby to DNA można zsekwencjonować i poddać dalszej obróbce, na przykład trawieniu endonukleazami, mutagenezie in vitro, można uzupełniać lepkie końce lub zastosować inne znane techniki w celu utworzenia fragmentu o pożądanej długości, zawierającego pożądaną sekwencję i mającego właściwe zakończenia. Jak wiadomo specjalistom, zakończenia łańcucha mogą być modyfikowane kilkoma metodami tak aby posiadały wymaganą sekwencję; mogą być przycinane egzonukleazami, uzupełniane przy użyciu fragmentu Klenow'a polimerazy DNA I, można też dodawać lub podstawiać dNa stosując syntetyczne oligonukleotydy jako łączniki lub adaptory.
Z kolei sekwencja DNA kodująca odpowiedni antygen Hepatitis B może być połączona z odpowiednim regulonem i/lub terminatorem otrzymanymi z genomu drożdży metylotroficznych przy użyciu znanych metod. Dane fragmenty są odpowiednio przystosowane tak, aby znalazły się we właściwej pozycji względem kodonu inicjacji translacji i kodonu terminacji translacji kodującej sekwencji DNA. Ligację również przeprowadza się zgodnie ze znanymi procedurami. Ponieważ metody te są powszechnie znane więc nie wymagają dodatkowego omówienia. Szczegółowy opis technik stosowanych przy klonowaniu molekularnym można znaleźć w podręczniku Maniatis'a i wsp. Molecular Cloning 1982.
Zamiast ligacji sekwencji DNA pochodzących wyłącznie z odpowiednich źródeł naturalnych, możliwe jest stosowanie syntezy chemicznej w celu zsyntetyzowania części lub całości określonej kasety ekspresji. Syntezę chemiczną przeprowadza się zgodnie ze znanymi procedurami. Chemiczna synteza długich dezoksyribonukleotydów jest już oferowana na zasadach handlowych. Ponadto, z punktu widzenia niniejszego wynalazku, dowolna kombinacja fragmentów syntetyzowanych chemicznie oraz fragmentów otrzymanych z odpowiednich źródeł naturalnych może być właściwa.
Kolejnym celem niniejszego wynalazku jest wprowadzenie genu URA3 otrzymanego z drożdży metylotroficznych. Gen ten został zidentyfikowany metodą komplementacji odpowiedniej mutacji pyr F u E.coli szczep MB 1000 przy pomocy plazmidów wytworzonych na drodze losowej insercji fragmentów restrykcyjnych Hansenula polymorpha do odpowiedniego wektora. Plazmid, który komplementował definicjencję szczepu biorcy został zidentyfikowany. Ten nowo zidentyfikowany gen zawiera w przybliżeniu 1400 pz, co zostało oznaczone metodą elektroforezy w żelu. Jego mapa restrykcyjna przedstawiona jest na fig. 10.
W celu ułatwienia konstrukcji, amplifikacji i wprowadzenia kasety ekspresji do mikroorganizmu-gospodarza zaleca się wstawienie jej do wektora nadającego się do transformacji drożdży metylotroficznych. Wektorem takim może być plazmid - liniowy lub kolisty, albo też wirus. Można zastosować tak zwane wektory integracyjne, tzn. wektory nie posiadające żadnej autonomicznie replikującej sekwencji (ARS). Jeśli wektory takie nie zostaną zintegrowane, to podczas kolejnych cyklów komórkowych zostaną utracone.
W jednej z korzystnych wersji wektor ten zawiera również sekwencje ARS zdolne do autonomicznej replikacji. Wskazanym jest aby sekwencje te pochodziły od odpowiedniego mikroorganizmu gospodarza. Dla metylotroficznych drożdży istnieje kilka opisanych sekwencji
168 408 typu ARS, na przykład sekwencje HARS i PARS (Roggenkamp i wsp., 1986, Cregg i wsp. 1985).
Sekwencje te obejmują taki region DNA, którego działanie polega na stabilnym utrzymaniu wektora w komórce gospodarza, jako jednostki pozachromosomalnej.
W celu ułatwienia identyfikacji transformowanych organizmów gospodarza zaleca się następnie wprowadzenie selekcyjnych genów markerowych przydatnych do selekcji pożądanego mikroorganizmu po transformacji. W znanych plazmidach drożdżowych takie selekcyjne geny markerowe często odpowiadają sekwencjom kodującym enzymy biorące udział w metabolizmie takich aminokwasów lub kwasów nukleinowych, które nie występują w organizmie gospodarza-biorcy mającym ulec transformacji.
Taką samą strategię można zastosować do selekcji transformowanych drożdży metylotroficznych. Do genów zwykle używanych przy selekcji auksotroficznych szczepów Saccharomyces cerevisiae należą geny LEU2, HlS3, TRP5, ARG4 i URA3. Geny otrzymane z Saccharomyces cerevisiae można również stosować jako markery selekcyjne do transformacji drożdży metylotroficznych, jednakże wzrost takich transformatorów na pożywce minimalnej może być poważnie zakłócony. Zatem, w preferowanej wersji niniejszego wynalazku, szczepy drożdży metylotroficznych pozbawione funkcji dowolnego genu biorącego udział w normalnym metabolizmie, są transformowane przy pomocy cząsteczki DNA zawierającej homologiczny gen markerowy typu dzikiego. Niniejsi wynalazcy są pierwszymi, którzy otrzymali homologiczny gen markerowy, a mianowicie gen URA3, przydatny do selekcji transformantów Hansenula polymorpha. Charakterystyka tego genu, tzn. jego mapa restrykcyjna, jest omówiona powyżej. Alternatywnie, do selekcji transformantów można użyć genów odporności na antybiotyki. Jest to podejście dobrze znane w przypadku transformacji bakterii i może być zastosowane do S.cerevisiae (Jimenez i Davis, 1980).
Jednakże, jak dotąd nic nie wiadomo o zachowaniu się drożdży metylotroficznych przy ich kontakcie z antybiotykami takimi jak chloramfenikol lub gentamycyna G-418. Autorzy niniejszego wynalazku są pierwsi, którzy wykazali możliwość selekcji transformowanych drożdży metylotroficznych poddając je działaniu, po transformacji, selekcyjnych stężeń antybiotyków aminoglikozydowych. Nieoczekiwanie okazało się, że fosfotransferaza aminoglikozydowa pochodząca z Tn5 (Grindley, 1980) może być również aktywna w drożdżach metylotroficznych, jeśli podlega regulacji promotorem otrzymanym z drożdży piekarniczych. Inaktywacja G-418 zachodzi również skutecznie w szczepach zawierających tylko jedną lub dwie krople tego genu w komórce, tzn. gen nie musi występować w dużej ilości kopii. Taki system transformacyjno-selekcyjny, będący również przedmiotem tego wynalazku, jest u drożdży metylotroficznych bardzo wydajny.
W najbardziej preferowanej wersji wektor zgodnie z wynalazkiem wybrany jest z grupy wektorów: pMS2, pFS-9, pRB-S, pRB-S-269, pRB-S-271, pRB-S-322, pRB-S-326, pMPS22, pMPS21, pMPS9. Konstrukcja i zastosowanie tych wektorów będą opisane bardziej szczegółowo poniżej.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest proces wytwarzania opisanego wyżej mikroorganizmu, w którym to metylotroficzne drożdże jako organizm gospodarza transformuje się wektorem zawierającym kasety ekspresji ec1 i/lub ec2, i/lub ec3, i w którym po replikacji wektora, co najmniej niektóre z tych kaset ekspresji zostają zintegrowane na drodze rekombinacji z chromosomem tegoż gospodarza, najlepiej w formie multimerycznych powtórzeń. W rezultacie taki transformowany organizmu metylotroficzny może zawierać szereg kopii każdej z wprowadzonych kaset ekspresji, rozproszonych po całym genomie. Istnieje jednak duże prawdopodobieństwo, że multimeryczne powtórzenia kaset ekspresji będą zlokalizowane w jednym miejsce genomu. Wykazano, że ten typ rekombinacji zachodzi głównie u Hansenula. Jednakże, drożdżowy metylotroficzny organizm gospodarza może być wybrany z dowolnego innego gatunku spośród metylotroficznych rodzajów drożdży, na przykład: Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, Torulopsis czy Pichia.
W najbardziej korzystnej wersji organizm gospodarza pochodzi z gatunku Hansenula polymorpha, którego przykładem jest szczep posiadający identyfikacyjne cechy Hansenula polymorpha RB 10. Hansenula polymorpha RB 10 został zdeponowany w Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen 17 lutego 1989 r. pod numerem DSM5215.
168 408
Podczas gdy, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wskazane jest przeprowadzanie transformacji przy zastosowaniu jednego z wyżej opisanych wektorów, to oczywistym jest, że inne wektory mogą być również konstruowane i stosowane.
Najbardziej dogodnym sposobem otrzymywania organizmów zawierających więcej niż jedną kopię kasety ekspresji ecl i, ewentualnie, jedną lub więcej niż jedną kopię drugiej kasety ekspresji (ec2), jest niżej opisany, obejmujący szerego etapów, proces.
Zgodnie z tym procesem metylotroficzny organizm gospodarza:
a) transformuje się przy pomocy pierwszego wektora i początkowo hoduje na pożywce selekcyjnej, a następnie inkubuje przez kilka generacji w warunkach nieselekcyjnych,
b) wyselekcjonowuje się mitotycznie stabilne transformanty zawierające więcej niż jedną kasetę ekspresji ecl kodującą pierwszy polipeptyd,
c) transformanty te, ewentualnie, pozbawia się pozostałych autonomicznie replikujących plazmidów,
d) powyższe transformanty ewentualnie transformuje się drugim wektorem i ponownie, początkowo, hoduje się je na pożywce selekcyjnej, a następnie inkubuje w warunkach nieselekcyjnych przez kilka generacji,
e) wyselekcjonowuje się mitotycznie stabilne transformanty zawierające więcej niż jedną kasetę ekspresji (ecl) kodującą pierwszy polipeptyd i, ewentualnie, jedną lub więcej niż jedną kasetę ekspresji (ec2) kodującą drugi polipeptyd,
f) otrzymane transformanty ewentualnie pozbawia się pozostałych autonomicznie replikujących plazmidów;
etapy d) do f) mogą być ewentualnie powtórzone przy użyciu trzeciego wektora.
Przy zastosowaniu tej procedury możliwe jest zwiększenie ilości kaset ekspresji jednego typu, na przykład ecl, poddając komórki kilku kolejnym cyklom transformacji, hodowli w selekcyjnych-nieselekcyjnych warunkach, selekcji transformantów i ewentualnie usuwaniu wolnych plazmidów. Alternatywnie, można wprowadzić dwie lub więcej typów kaset ekspresji stosując jeden typ wektora zawierającego dwie lub więcej różnych kaset ekspresji, albo też poddając komórki wyżej opisanym cyklom, w którym transformację przeprowadza się przy użyciu różnych wektorów zawierających różne kasety ekspresji. Proces ten według niniejszego wynalazku, oferuje więc szereg możliwości otrzymywania pożądanego mikroorganizmu.
Wynalazek ilustrują następujące przykładu i rysunki.
Figura 1: Konstrukcja plazmidu pME4 z pHARS 1. Fragment HARS1 został przeniesiony do pojedynczego miejsca PvuII poprzedniego pHARS 1, przy czym sekwencje między poprzednią pozycją HARS i genem β-laktamazy, a także sam koniec 5' genu β-laktamazy, zostały wycięte.
Figura 2: Schematyczne przestawienie fagów λ zawierających fragmenty genomowego DNA Hansenula polymorpha, obejmujące a) gen Μ0Χ oraz b) gen FMD.
Figura 3: Mapa plazmidu pT-24. Plazmid ten zawiera fragment DNA obejmujący terminator genu ΜΟΧ klonowany w miejscu Smal pUC19.
Figura 4: Mapy plazmidów pRB-S-269 i pRB-S-271 wytwarzających w wyniku ekspresji S-gen pod kontrolą odpowiednio promotora Μ0Χ i FMD.
Figura 5: Mapy plazmidów pBC, pMS-2, pFS-9. Ostatnie 2 plazmidy pochodzą z pBC zawierającego gen URA3 Hansenula polymorpha i powstały w wyniku insercji kaset ekspresji zawierających promotor ΜΟΧ /pMS-2/ lub promotor FMD /pFS-9/ do sekwencji kodującej gen URA3.
Figura 6: Mapa plazmidu pHK2. Plazmid ten zawiera gen kanamycyny (pochodzący z Tn5) pod kontrolą promotora ADH1 z Saccharomyces cerevisiae. Plazmid pHK2 dodatkowo zawiera również sekwencję HARS 1.
Figura 7: Mapy plazmidów pRB-S-322ipRB-S-326. Jednostka funkcyjna zawierająca gen odporności na kanamycynę oraz promotor ADH1, występujące w plazmidzie pHK, zostały wstawione do regionów HARS plazmidów pRB-S-269 i pRB-S-271.
Figura 8: Konstrukcja pMPS-22 z pMOX-P/Tl. Gen preS wirusa Hepatitis B został wstawiony w miejsce EcoRI plazmidu pMOX-P/Tl. W uzyskanym plazmidzie pMPS-22 gen preS jest regulowany przez promotor Μ0Χ.
168 408
Figura 9: Mapa plazmidu pMPS-9. W celu konstrukcji tego plazmidu wykonano insercję kasety ekspresji preS z pMPS-22 między miejscaXhoI i StuI fragmentu Hansenula wyjściowego plazmidu pBC.
Figura 10: Mapa genu URA3 Hansenula polymorpha wraz z sąsiednimi regionami DNA.
Figura 11: Diagram ilustrujący budowę plazmidu pMPT121, do którego można wstawić obce sekwencje genowe pod kontrolą promotora MOX.
Figura 12: Diagram ilustrujący budowę plazmidu pKL*l, zawierającego kasety ekspresji białka L* pod kontrolą promotora MOX.
Figura 13: Schematyczny diagram przedstawiający etapy konstrukcji plazmidu E. coli kotwiczącego kasetę ekspresji białka L, z wyciętą Gly13, pRlTł2998.
Figura 14: Schematyczny diagram ilustrujący procedurę wytwarzania plazmidu drożdżowego pRIT12979 zdolnego do ekspresji białka L z wyciętą Gly13.
Figura 15: Schematyczny diagram ilustrujący konstrukcję plazmidu pRIT13191 zawierającego sekwencję kodującą białko L, z którego wycięto aminokwasy 53-132 i 146-174.
Figura 16: Schematyczny diagram ilustrujący konstrukcję drożdżowych plazmidów ekspresji pRIT13192 i pRIT13193, zawierających kasety ekspresji białek odpowiednio L* i A GlyL*.
Przykłady. Materiały
1. Plazmidy. Plazmidy wspomniane w opisie opisane w części A poniżej.
2. Szczepy drożdży. Hansenula polymorpha RB 10 (ura 3) jest mutantem Hansenula polymorpha ATCC 34488 uzyskanym w wyniku mutagenezy z wykorzystaniem metanosulfonianu etylu (EMS), zasadniczo w sposób opisany przez Roggenkampa i innych (1986).
3. Enzymy. Endonukleazy restrykcyjne, ligazę T4 DNA oraz inne stosowane enzymy otrzymano z Boehringer, Mannheim, Republika Federalna Niemiec lub z Bethesda Research Laboratories, Eggenstein, Republika Federalna Niemiec. Enzymy te stosowano zgodnie z instrukcjami odpowiedniego wytwórcy.
4. Reagenty immunologiczne.
a) S1.1: monoklonalne przeciwciało mysie, specyficzne względem domeny S1 białka preS1 (SmithKline Biologicals, Rixensart, Belgia).
b) S2.1, S2,2 oraz S2.5: monoklonalne przeciwciała mysie specyficzne względem domeny S2 powierzchniowego antygenu Hepatitis B (SmithKline Biologicals, Rixensart, Belgia).
Przeciwciała specyficzne względem domeny S1 i domeny S2 powierzchniowego antygenu Hepatitis B określane są jako przeciwciała preS.
c) RF6: monoklonalne przeciwciało mysie specyficzne względem domeny S powierzchniowego antygenu Hepatitis B (H.Thomas, Royal Free Hospital, Londyn).
d) RF1: monoklonalne przeciwciało mysie specyficzne względem konformacyjnie uzależnionego epitopu zlokalizowanego w regionie S (H.Thomas, Royal Free Hospital, Londyn).
e) HBS1: monoklonalne przeciwciało mysie skierowane przeciw epitopowi odpornemu na denaturację i redukcję, pochodzącemu z plazmowego HBSAg, zlokalizowanemu w regionie S (SmithKline Biologicals, Rixensart, Belgia). To monoklonalne przeciwciało stosowano w eksperymentach zamiennie z Mab RF6.
Przeciwciała a), b) oraz e) otrzymano zgodnie ze standardowymi procedurami dokonując fuzji mysich komórek śledziony, z komórkami myeloma. Opis metody znajduje się w pracy Kohlera i Milsteina, 1975. Metody ujawnione są ponadto w książce Godinga, Monoclonal Antibodies, Principles and Practice, Academic Press, Londyn 1983.
f) AUSRIA (Abbott Laboratories, Wiesbaden-Delkenheim, Republika Federalna Niemiec i Louvain-La-Neuve, Belgia): handlowy zestaw zawierający polikolonalne przeciwciała skierowane przeciw rodzimym epitopom konformacyjnym.
g) AUSZYME (Abbott Laboratories, Wiesbaden-Delkanheim, Republika Federalna Niemiec oraz Louvain-La-Veuve, Belgia): handlowy zestaw zawierający monoklonalne przeciwciała skierowane przeciw rodzimemu epitopowi konformacyjnemu.
Przeciwciała wymienione w punktach f) i g) są dostępne w handlu. Nie reagują one z monomerycznym powierzchniowym antygenem Hepatitis B.
168 408
h) AUSAB (Abbott Laboratories, Louvain-La-Neuve, Belgia): handlowy zestaw do wykrywania przeciwciał anty-HBsAg.
5. Ośrodki
Pepton 190, ekstrakt drożdżowy, kwasy Casamino oraz bazę drożdżowo-azotową, stosowane do przygotowywania ośrodków, otrzymano z Gibco Ltd., Paisley, Wielka Brytania.
W celu przygotowania płytek agarowych do odpowiedniego ośrodka dodawano przed autoklawowaniem 18 g/dm3 agaru (Gibco Ltd.).
a) SMR: Średnio bogaty ośrodek nieselektywny
Składnik Ilość, g/dm3
Pepton 2
Ekstrakt drożdżowy 1
Kwasy Casamino (Pepton 5) 3
Baza drożdżowo-azotowa, bez /NH4/2SO4 1,4 /NH4/2SO4 5
Źródła węgla: glikoza 20 albo gliceryna 20 albo metanol 10
SMR zawierający metanol określany jest również jako Met-SMR
b) YNB: Ośrodek selektywny
Baza drożdżowo-azotowa bez /NH4/2SO4 (Gibco lub Difco) 1,4 g/dm3 /NH4/2SO4 5 g/dm3
Źródła węgla: glikoza 20 g/dm3 albo gliceryna 20 g/dm3 albo metanol 10 g/dm3
c) YEPD: Nieselektywny, bogaty ośrodek
Ekstrakt drożdżowy 10 g/dm3
Pepton 190 20 g/dm3
Glikoza 20 g/dm3
W razie potrzeby dodawano gentamycynę G418 w ilości 1 mg/ml ośrodka
d) Ośrodek S
Składnik Ilość w 1 dm3 /NH4/2SO4 5 g
KH2PO4 4 g
MgSO4-7H2O 2 g
NaCl 0,1 g
CaCl2-2H2O 0,4 g
Monochlorowodorek L-histydyny 10 mg
LD-metionina 9 mg
LD-tryptofan 9 mg
H3BO3 2 mg
CUSO4 5H2O 0,16 mg
KJ 0,4 mg
FeCl3-6H2O 0,8 mg
MnSO4-H2O 1,6 mg
HNa2MoO4-2H2O 0,8 mg
ZnSO4-7H2O 1,6 mg
Biotyna 0,16 mg
Pantotenian Ca 32 mg
Kwas foliowy 0,16 mg
Inozytol 160 mg
Niacyna 0,4 mg
Kwas p-aminobenzoesowy 0,2 mg
Chlorowodorek pirydoksyny 32 mg
Ryboflawina 0,2 mg
Chlorowodorek tiaminy 32 mg
II Metody
1. Manipulowanie DNA
Rozszczepianie endonukleazami restrykcyjnymi, ligowanie z wykorzystaniem ligazy T4 DNA, fosforylowanie DNA, wydzielanie DNA z E.coli, rozdzielanie dNa metodą elektroforezy na żelu, a także inne techniki należące do dziedziny inżynierii i technologii genetycznej, wykorzystywane w przykładach, przeprowadzono zasadniczo w sposób opisany przez Maniatisa i innych, 1982.
2. Transformowanie drożdży
Drożdże metylotroficzne transformuje się sposobami opisanymi uprzednio (Roggenkamp i inni, 1986).
Korzystnie stosuje się metodę z nieczynnymi zamrożonymi komórkami (Klebe i inni, 1983).
a) Transformowane komórki identyfikuje się na podstawie komplementacji deficytu ura3 lub odporności na gentamycynę.
Odporność na gentamycynę G418 badano dokonując posiewu komórek na płytkach YEPD zawierających 25 ml zestalonego ośrodka. Do prowadzenia hodowli na płytkach w ciągu 6 godzin na każdą z płytek naniesiono 1 ml roztworu wodnego zawierającego 25 mg gentamycyny 418 i inkubację kontynuowano przez 2-3 dni. Gentamycynę G418 (nazwa handlowa - Geneticin) otrzymano z Gibco Ltd.
b) Segregację mitotycznie trwałych transformantów przeprowadzano wybierając transformanty z płytki do selektywnej transformacji i hodując je w ciekłym ośrodku selekcyjnym (YNE lub YEPD, z 1 mg/ml G418) w ciągu 20 generacji (2 przejścia). Po tym okresie wzrostu komórki przenoszono do nieselektywnego ośrodka (SMR lub YEPD) i prowadzono hodowlę w ciągu 40-60 generacji (5-6 przejść). Z kolei komórki posiewano na selektywnej płytce (YNB lub YEPD z 1 mg/ml G418), w wyniku czego zachowane zostały klony wytwarzające w dalszym ciągu w wyniku ekspresji selektywny marker.
3. Wydzielanie DNA drożdży
Całkowity DNA z drożdży otrzymywano w sposób opisany przez Struhla i innych (1979).
4. Analiza DNA drożdży
Strukturę DNA w transformantach drożdży analizowano na drodze trawienia odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi, a następnie elektroforezy na żelu agarozowym. Fragmenty DNA przenoszono na nitrocelulozę i hybrydyzowano z odpowiednią sondą radioaktywnie znaczonego DNA (Southern, 1975).
5. Analiza immunologiczna
Blottign metodą Westerna
a) Procedura Amersham
Białka uzyskane z surowych ekstraktów lub z frakcji gradientowych rozdzielono metodą elektroforezy na SDS-żelu poliakryloamidowym (Laemmli, 1970), stosując 12,5% żel rozdzielający, 5% żel zbierający. Pasma białek przenoszono następnie na nitrocelulozę zasadniczo w sposób opisany przez Towbina i innych, (1979).
Materiał antygenowy wykrywano przeprowadzając reakcję plamy ze specyficznymi przeciwciałami. Kompleks antygen-przeciwciało wizualizowano działając na filtr biotynylowanym przeciwciałem RPN 1001 (Amersham Buchler GmbH and Co., Ltd, Braunschweig, Republika Federalna Niemiec) w rozcieńczeniu 1:300, a następnie prowadząc inkubację z kompleksem peroksydaza-streptawidyna RPN 1051 (Amersham). Wszystkie etapy eksperymentu prowadzono zgodnie z instrukcjami producenta.
b) Alternatywnie filtr wstępnie inkubowano z 0,05% (wag./obj.) Tween w PBS. Po inkubacji z danym przeciwciałem monoklonalnym, wiązanie przeciwciała wykrywano prowadząc kolejno inkubację z biotynylowanym przeciw mysim IgG z owcy (RPN 1021, Amersham) w rozcieńczeniu 1:250, z dodatkiem 0,05% Tween 20, z kompleksem streptawidyny z biotynylowaną peroksydazą chrzanową (RPN 1051, Amersham, rozcieńczenie 1:400 w PBS zawierającym 1% żelatyny), a na koniec z 30 μl H 2O2 i 10 ml odczynnika do barwnego wywoływania
168 408
HRP, zawierającego 4-chloro-ł-naftol/3 mg/ml metanolu/ w 50 ml PBS. Między poszczególnymi inkubacjami filtr przemywano PBS zawierającym 0,05% Tween 20.
Ocenę ilościową wytworzonych monomerycznych antygenów (S i preS) wykonywano porównując próbki 0,01-0,3 gg oczyszczonego HBsAg pochodzącego z drożdży (SmithKline Biologicals) z 3-5 różnymi rozcieńczeniami ekstraktu surowego białka z Hansenula, zawierającego 2-20 gg pełnego białka komórkowego.
Stężenie białek oznaczano z wykorzystaniem zestawu do analizy białek BioRad (BioRad, Monachium, Republika Federalna Niemiec).
Przykłady.
Część A - Plazmidy
Przykłady I. Konstrukcja plazmidów umożliwiających ekspresję białka w Hansenula polymorpha.
a) KonstKkcja podstawowago plazmidu zawierającego sekwencję ulegęjącą autonomicznej replikacji, z Hacsecula polymogphu (pME4).
Macierzysty plazmid wykorzystywany w kkcstgukcSi plazmidów zawierającyeh zcc S pod kontrolą prkmktkrów Hansenula stanowi pME4, opisany już w pracy doktorskiej M. Eckartu, 1988. pME4 jest pochodną VIp5 (Struhl i inni, 1979; Siincheomb i inm, 1980) uzyskiwaną na drodze następujących modyfikacji:
Aetockmiczcie ulegającą replikacji sekwencję HARS1 z Hacnecula pklymorpha klkcuSe się w miejscu SalI w VIp5, jak to ujawniono w pracy Rkggeckampa i innych (1986) uzyskując pHARS. Plazmid pHARS zrekonstruowano następnie dkkknuSąe delecji o pknowcaj insercj! fragmentu HARS 1 -SalI o 440 parach zasad w miejscu PvuII tego samego wektora. Lepkie końce SalI fragmentu przeprowadzono w tępe przed ligowaniem, na drodze inkubacji z egzocekleazą VII, a następnie reakcji z polimerazą Klenowa. W wyniku takiej rekonstrukcji uzyskano pojedyncze miejsce SalI w genie odporności na tetracyklinę w części pBR322 plazmidu. Uzyskany w ten sposób pośredni plazmid poddano ponowcie gekocstrukeji w celu uzyskania genu β-laktamazy nie zawierającego wyjściowej sekwencji sygnałowej, w którym sekwencja sygnałowa została zastąpiona lickerem przestawionym poniżej; szczegóły - patrz Eckart (1988):
SalI GTC GAC EcoRI AAA BstEII
GAA TTC ATG TCC GGT CAC
CAG CTG CTT AAG TTT TAC AGG CCA GTG
Met Ser Gly HiS
β-laktamaza
Ten etap, w którym uzyskuje się plazmid pME4, przedstawiono na fig. 1. b) Fragmenty promotorów MOX i FMD
Wydzielanie promotora MOX z H. polymorpha opisace jest przez Eckarta, 1988. Dla celów wynalazku gacomowy fragment EcoRi-SalI o 1525 bp, zawierający górny region kontrolny genu MOX oraz kodony pierwszych pięciu aminokwasów w białku MOX, klkckwank w pkchodcej pBR322. Schematyczne pgzedstawiacie genu MOX podano na fig. 2. Ten pośredni plazmid rozszczepiono za pomocą EcoRI, poddano obróbce ^kleazą Bal31 i zligkwano z linkerami EcoRI. Uzyskano w ten sposób szereg fragmentów promotora zawierających końce EcoRI 3' oraz SalI 5', po rozszczepiemu ecdonukleazą restrykcyjną SalI. Pozycje różnych końcowych punktów dalecSi ustalono na podstawie sekweccSocowania DNA zgkdcie z metodą Maxama i Gilberta, 1977. W dalszych aksperymantaeh przedstawionych w tym opisie zastksowuco plazmid oznaczony jako pBR322-MP zawierający d^ec^ę aż do pozycji -3 (przy czym pierwszą zasadą kkdonu inieSkwania translacji MOX jest zasada +1). Plazmid pBR322-MP opisany jest przez Eckarta, 1988.
Wydzielacie i charakterystyka promotora FMD opisace są w zgłoszeniu patenikwym europejskim nr 87 110 417. 0. Dla celów wynalazku fragment BamHI o 1,4 kb, zawierający około 1000 bp fragmentu promotora znajdującego się powyżej, klonowano w miejscu BamHI w pUC19, Wyselekcjonowano klon, w którym insert został zoriectkwaey w sposób, aby przy końcu 3' wstawikcago fragmentu zcaSdowałk się pojedyncze miejsce EcoRI z pUC19.
168 408
Schematyczne przedstawienie genomowego klonu zawierającego gen FMD obejmujący jego promotor, podano na fig. 2B. Wykonano szereg delecji nukleazą Bal31, poczynając od miejsca EcoRI wewnątrz linkera pUC19, w celu uzyskania plazmidów zawierających promotor bez sekwencji genu strukturalnego. Po obróbce za pomocą Bal31 DNA zligowano z linkerami EcoRI, DNA rozszczepiono za pomocą BamHI i uzyskane fragmenty BamHI-EcoRI klonowano w pBR322. Uzyskano w ten sposób różne delecje. Najbardziej efektywne w późniejszych ekspe rymentach okazały się delecje do pozycji -5 i -9 od pierwszego ATG. W dalszych eksperymentach przedstawionych w opisie wykorzystywano plazmid przenoszący fragment promotora zawierający delecję do pozycji -9 od pierwszego ATG (plazmid pBR322-FMD-P-9). Schematyczne przedstawienie fragmentów promotorów MOX i FMD, stosowanych w konstrukcjach kolejnych plazmidów, pokazano poniżej.
a) Fragment promotora MOX (-3).
Sali
-ί r /1500 bp/ -AATyTTyTAAATy
b) Fragment promotora FMD (-9)
BamHI
-14 -9 /1000 bp/ -TTCATy
EcoRI
00:^1100
Linkuo
EcoRI
GGTτττyy
Linkuo
c) Terminator
Wydzielanie terminatora transkrypcji z genu MOX opisano w pracy Eckarta, 1988. Schematyczne przedstawienie regionu 3' genu MOX pokazano poniżej:
Aog Phe SStp
AGA TTC UTA
SalI----------Anp718-------< 1477 bp < 284bp
------EcoRV-------NouI >< 327bp >
>< 368bp <
Fragment Sall-Nrul przedstawiony na powyższym schemacie subklonowano w pBR322 pomiędzy miejsca SalI i Nrul, po czym plazmid ten rozszczepiono za pomocą endonukleazy restrykcyjnej Asp718 uzyskując dzięki temu linearyzację plazmidu dzięki pojedynczemu miejscu cięcia dla Asp718 wewnątrz otwartej ramki odczytu MOX i poddano delecjom Bal31.
W wyniku analizy sekwencji DNA uzyskanych fragmentów zidentyfikowano fragment terminatora o około 320 bp (Eckart, 1988), który w dalszym ciągu działa jako terminator. Ten fragment terminatora z lepkimi końcami (GACATACC--315bp-EcoRV) zligowano z miejscem SmaI w pUC19. Orientację fragmentu ustalono na podstawie analizy sekwencyjnej (Naxam i Gilbert, 1977). Uzyskany klon pT-24 przedstawiono na fig. 3. Klon ten zastosowano w konstrukcji wektorów ekspresji, jak to przedstawiono poniżej.
D) Selektywne geny markerowe pME4 (opisany powyżej, patrz fig. 1) rozszczepiono za pomocą EcoRI, po czym lepkie końce wypełniono polimerazą Klenowa. Plazmid pT-24 trawiono za pomocą EcoRI i HindIII,
168 408 po czym wydzielono fragment zawierający linker pUC19 i fragment terminatora MOX. Lepkie końce tego fragmentu przeprowadzono w końce tępe stosując obróbkę polimerazą Klenowa, po czym fragment z tępymi końcami zligowano z pME4. Uzyskany plazmid nazwano pP/T-24. Miejsca klonowania pochodzące z pUC19 wykorzystano następnie w kolejnych etapach klonowania.
Plazmid pP/T-24 zawiera gen S. ceraevisiae URA3 jako selektywny marker. Jako kolejny selektywny marker wprowadzono gen nadający odporność na chloramfenikol. Gen ten wydzielono z wektora pBR325 jako fragment Aatll-Clal o 1,7 kb, poddano krótkiemu trawieniu Bal31 w celu usunięcia po około 4 par zasad z każdej ze stron i stępiono przeprowadzając reakcję wypełnienia Klenowa. Następnie fragment zligowano z pP/T-24, który rozszczepiono za pomocą Nrul. Uzyskany plazmid wykazujący odporność na chloramfenikol nazwano pP/T-24-C.
Przykład II. Konstrukcja plazmidu zawierającego gen powierzchniowego antygenu Hepatitis B w funkcjonalnej kombinacji z terminatorem Hansenula polymorpha.
W celu uzyskania funkcjonalnej jednostki zawierającej S-gen Hepatitis B oraz terminator skutecznie działający w Hansenula polymorpha, gen S wprowadzono jako fragment NcoI-EcoRI o 683 bp do miejsca BamHI plazmidu pP/T-24C występującego w części tego plazmidu odpowiadającej linkerowi pUC19. Fragment o 683 bp otrzymano z pRIT12331 będącego zwykłym wektorem pUC9 opartym na E. coli, zawierającym fragment dNa NcoI-EcoRI o 683 bp, kodujący białko S od NcoI w kodonie ATG (CCATGG) do EcoRI poza kodonem stopu TAA (TaACGaAtTC). Sekwencję kodującą antygen powierzchniowy otrzymano zwykłymi technikami zrekombinowanego DNA z pRIT10616 ujawnionego w opisie patentowym europejskim nr A-0278940 oraz w pracy Harforda i innych, 1987. pRIT10616 zawiera genom wirusa HBV serotypu adw, klonowany w pACYC184. Zdeponowano go w American Type Culture Collection na warunkach Konwencji Budapesztańskiej, dnia 2 czerwca 1982, pod nr ATCC39131.
Lepkie końce fragmentu genu S oraz pP/T-24C rozszczepionego za pomocą BamHI przekształcono w końce tępe na drodze wypełniania, przed ligowaniem. Ligowanie fragmentu w odpowiedniej orientacji regeneruje sąsiednie miejsca BamHI i NcoI w konstrukcji, tuż przy 5' względem regionu kodującego genu S. Uzyskany plazmid nazwano pRB-S.
Przykład III. Konstrukcja plazmidów zawierających funkcyjną kasetę ekspresji obejmującą promotory pochodzące z Hansenula polymorpha, gen antygenu powierzchniowego Hepatitis B oraz terminator Hansenula polymorpha.
pBR322-MP i pBR322-FMD-D-9, pochodzące z pBR322, zawierające odpowiednio promotory MOX i FMD trawiono za pomocą EcoRI, po czym lepkie końce wypełniono stosując polimerazę Klenowa. Plazmidy rozszczepiono następnie za pomocą SalI. Uzyskany fragment zawierający promotor MOX obejmuje wyłącznie genomowy DNA z Hansenula polymorpha, podczas gdy fragment zawierający promotor FMD obejmuje dodatkowo 275 bp z sekwencji pBR322 (pozycje od 375 bp do 650 bp na mapie pBR322).
Plazmid pRB-S przecięto przy zregenerowanym miejscu BamHI, miejsce przekształcono w tępy koniec przez wypełnienie za pomocą polimerazy Klenowa, po czym plazmid trawiono za pomocą SalI. Fragmenty promotora zawierające lepki koniec SalI oraz tępy koniec zligowano z wielkim fragmentem pRB-S o tępym końcu SalI, zawierającym region kodujący gen S oraz terminator Hansenula polymorpha. Uzyskane plazmidy nazwano pRB-S-269 (promotor MOX) oraz pRM-S-271 (promotor FMD, delecja -9). Zawierają one gen S pod kontrolą promotora i terminatora Hansenula polymorpha, jak to przedstawiono na fig. 4. Sekwencję otaczającą połączenie między genem S i promotorami przedstawiono schematycznie poniżej.
a) Fuzja mOx - promotor (pRB-S-269)
-3 +1 —AAAAAC GGAATTGATCC ATG
-->
Promotor MOX gen S
168 408
b) Fuzja FMD - promotor ( -9)
-9 +1 <—TTCCATC GGGAYTTGATCC ATG
->
Promotor FMD gen S
Plazmidom skonstruowanym identycznie jak pRB-S-271 i pRB-S-269, ale nie zawierającym insercji fragmentu restrykcyjnego o 440 bp, przenoszącego sekwencje HARS1, nadano nazwy pRB-S-269I i pRB-S-271I. Plazmidy te zastosowano do wytwarzania integrantów zawierających 1-3 kopie kasety ekspresji.
Przykład IV. Konstrukcja wektorów integracyjnych zawierających gen S.
a) Konstrukcja plazmidu pBC zawierającego sekwencje autonomicznie ulegające replikacji, z Hansenula polymorpha oraz gen URA3 Hansenula polymorpha.
Plazmid pBC stanowi pochodną plazmidu YRp7 (Tschumper i Carbon, 1980) zawierającą sekwencję ARS1 Saccharomyces cerevisiae. Ta autonomicznie ulegająca replikacji sekwencja została zdezaktywowana w wyniku insercji fragmentu BglII-SphI o 5400 bp, zawierającego gen URA3 z Hansenula polymorpha. Autonomicznie ulegającą replikacji sekwencję 1 (HARS1) Hansenula klonowano również w miejsce SalI genu odporności na tetracyklinę (fig. 5).
b) Insercja kaset ekspresji w plazmidzie pBC.
Plazmid pRM-S-269 poddano trawieniu za pomocą BspMII i SalI.
Końce uzyskanego fragmentu zawierającego kasetę ekspresji obejmującą promotor MOX, region kodujący powierzchniowy antygen Hepatitis B oraz terminator, stępiono, po czym zligowano z plazmidem pBC, następnie rozszczepiono za pomocą XhoI i StuI i wypełniono lepkie końce XhoI. Uzyskany plazmid pMS-2 zawiera kasetę ekspresji genu S otoczoną sekwencjami flankującymi z fragmentu genu URA3 Hansenula polymorpha.
W celu zintegrowania kasety ekspresji genu S w genomie Hansenula polymorpha, plazmid pMS2 rozszczepiono za pomocą NheI i uzyskany fragment o 6,1 kb zastosowano do transformowania komórek.
Wektor pFS-9 skonstruowano w analogiczny sposób, z tym, że kasetę ekspresji wydzielono z pRB-S-271, zawierającego promotor FMD.
Szczegółowy opis uzyskanych plazmidów przedstawiono na fig. 5.
Przykład V. Konstrukcja plazmidów zawierających kasetę ekspresji oraz dodatkowy gen selektywnego markera.
a) Konstrukcja podstawowego plazmidu pHK2.
W celu skonstruowania plazmidu pHK2 (fig. 6; zdeponowany na warunkach Konwencji budapesztańskiej w DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) pod nr 5328 dnia 27 kwietnia 1989) gen odporności na kanamycynę wydzielono z transpozonu Tn5 (Grindley i Joyce, 1980). Niepotrzebne sekwencje wycięto stosując obróbkę genu strukturalnego za pomocą nukleazy Bal31. Uzyskany fragment obejmujący strukturalny gen kanamycyny obejmujący terminator kanamycyny, zligowano z promotorem ADH1 z Saccharomyces cerevisiae (Hitzeman i inni, 1981). Ponadto sekwencję HARS1 wprowadzono jako fragment SalI o 440 bp do plazmidu.
b) Konstrukcja szczepów odpornych na kanamycynę, pochodzących z pRB-S-269 i pRB-S-271.
Fragment HindIII z pHK obejmujący region kodujący odporność na kanamycynę (3,5 kb) klonowano w miejscu HindIII występującym w sekwencji HARS1 w plazmidach pRB-S-269 i pRB-S-271. Uzyskane plazmidy, którym nadano odpowiednio nazwy pRB-S-322 i pRB-S-326, przedstawiono na fig. 7.
Przykład VI. Konstrukcja macierzystego plazmidu dla ekspresji białek pre-S.
Plazmid pP/T-24 (przykład II) zrekonstruowano w celu uzyskania plazmidu pMOX-P/T1 (fig. 8) przenoszącego uniwersalną kasetę ekspresji zawierającą promotor MOX, miejsce wielokrotnego klonowania i terminator MOX.
168 408
W celu dokonania insercji linkera zawierającego miejsca restrykcyjne endonukleaz Sali, EcoRI, BglII i BamHI, linker pUC19 z plazmidu pP/T-24 zastąpiono częściowo syntetycznym DNA zawierającym miejsca restrykcyjne dla wyżej wspomnianych enzymów.
Plazmid pP/T-24 rozszczepiono endznukleazami restrykcyjnymi BamHI i (SalI. Miejsca te pochodzą z linkera pUC19 (BamHI) oraz pME4 /Sal 1/. Dokonano insercji linkeni - cząsteczki zawierającej miejsca restrykcyjne SalI, EcoRI, BglII i BamHI. Uzyskany plazmid pT1 trawiono za pomocą EcoRI i SalI, po czym dokonano insercji promotora MOC jako fragmentu EcoRI-SalI o 1,5 kb, uzyskując plazmid pT2. Istotne obszary plazmidu pT2 przedstawiono poniżej:
SalI EcoRI BglII BamHI
-1500 -3
------//---aaaaac GGAATTC AGATCT GGATCC AGCT
<Promotor MOX
Terminator
Plazmid pT2 zawiera ponadto gen ARS Hansenula polymorpha oraz gen URA3 Saccharomyces cerevisiae, podobnie jak plazmid pRB-269 (fig. 3).
Następny etap konstrukcji obejmował zastąpienie genu URA3 Saccharomyces cerevisiae przez gen URA3 pochodzący z Hansenula polymorpha. Klon zawierający ten gen wydzielono w sposób opisany poniżej w przykładzie IX. Gen URA3 wydzielono jako fragment BamHI-BglII o 1,2 kb. Podczas gdy miejsce BglII jest oryginalnym miejscem genomowym, miejsce BamHI powstało w wyniku zligowania miejsca Sau3A z miejscem BamHI stosowanym do skonstruowania biblioteki genomowej. Lepkie końce tego fragmentu BamHI-BgkII wypełniono za pomocą polimerazy Klenowa i dokonano insercji w miejsce AvaI w pBR322, które również zostało wypełnione za pomocą polimerazy Klenowa. Miejsce AvaI zostało zregenerowane w wyniku ligowania. Uzyskany plazmid oznaczono jako pURA3-P1.
Plazmid URA3-P1 trawiono za pomocą NruI i BspMII. Miejsca te pochodzą z pBR322, pozycje 974 bp i 1664 bp na zwykłej mapie pBR322. Plazmid pT2 poddano całkowitemu trawieniu za pomocą NruI (974 bp w pBR322) oraz częściowemu trawieniu za pomocą BspMII. Istnieją 2 miejsca BspMII w pT2: pierwsze w pBR322 (1664 bp), a drugie zlokalizowane w terminatorze MOX. Fragment NruI-BspMII w pT2 (1800 bp) zawiera gen URA3 z Saccharomyces cerevisiae. Fragment NruI-BspMII z URA3-P1 zawierający gen Hansenula polymorpha URA3 klonowano w pT2 zastępując w ten sposób gen S. cerevisiae URA3 zlokalizowany w odpowiednim fragmencie NruI-BspMII. Uzyskany plazmid pT3 zawiera terminator mOx, linker, promotor MOX oraz gen URA3 z Hansenula polymorpha, w podanej kolejności. Plazmid pT3 nie zawiera jednak funkcjonalnego genu β-laktamazy, jak w macierzystym plazmidzie pME4. W celu zastąpienia tego zdefektowanego genu β-laktamazy przez gen funkcjonalny, pBR322 trawiono za pomocą EcoRI, lepkie końce wypełniono za pomocą polimerazy Klenowa, po czym przeprowadzono ligowanie z linkerem Asp718 o 8 bp, a następnie trawienie za pomocą PvuI (pozycja 3738 na mapie pBR322). Uzyskany w ten sposób fragment Asp718-PvuI o 633 bp zawiera oryginalny promotor i kodon inicjowania translacji genu β-laktamazy.
Plazmid pT3 poddano rozszczepieniu za pomocą Asp718 (Asp718 zlokalizowany jest na końcu terminatora MOX) i częściowemu trawieniu za pomocą PvuI. Fragment Asp718-PvuI uzyskany w sposób opisany powyżej wstawiono następnie w poddany wstępnej obróbce pT3 uzyskując plazmid pMOX-P/T1.
Plazmid pMOX-P/T1 przedstawiono na fig. 8. Plazmid ten zawiera funkcyjny gen β-laktamazy.
Przykład VII. Konstrukcja plazmidów ulegających ekspresji do białek pre-S.
Gen pre-S kodujący preS1-S2-S (wielkie białko) wirusa Hepatitis B otrzymano jako fragment NczI-HiadIII z pRIT12816. pRIT12816 jest zwykłym wektorem E. coli opartym na pBR322 zawierającym fragment NcoI-HiadIII o 1185 bp kodujący białko preS1-S2-S od NcoI
168 408 przy kodonie ATG (CCATGG) do HindIII przy 15 bp poza kodonem stopu TAA (....AAGCTT). Fragment sekwencji kodującej preS1-S2-S otrzymano technikami zwykłego klonowania z pRIT 10616 uj awnionego w zgłoszeniu patentowym europej skim nr EP-A-0278940 oraz w pracy Harforda i innych, 1987. Fragment o 861 bp kodujący sekwencję preS2-S można z niego również wydzielić w zwykły sposób. Końce fragmentu NcoI-HindIII stępiono stosując wypełnianie za pomocą polimerazy Klenowa, po czym przeprowadzono klonowanie do tępych końców miejsca cięcia przez EcoRI w pMOX-P/T1. W wyniku prawidłowego ligowania miejsce EcoRI na początku genu strukturalnego preS 1 jest zregenerowane p^r^z^^z 1 igowanie z tępo zakończonym NcoI/EcoRI. Konstrukcji, w której gen preS pod kontrolą promotora MOX ulega ekspresji nadano nazwę pMPS-22. Przedstawiono ją na fig. 8.
Analogicznej konstrukcji zawierającej promotor FMD nadano nazwę pMS-21.
Przykład VIII. Konstrukcja wektora zawierająca kasetę ekspresji preS.
Do kasety ekspresji SalI-Asp718 z plazmidu pMPS22 wprowadzono tępe końce na drodze wypełnienia, po czym wstawiono ją pomiędzy wypełnione miejsce XhoI i miejsce StuI w plazmidzie pBC opisanym w przykładzie IV a) powyżej. Uzyskany plazmid, któremu nadano nazwę pMPS-9, przedstawiono na fig. 9.
Przykład IX. Klonowanie genu URA3 Hansenula polymorpha Gen URA3 Hansenula polymorpha klonowano na drodze komplementacji odpowiedniej mutacji pyrF szczepu MB 1000 E. coli.
Fragmenty genomowego DNA o wielkości w zakresie 6-9 kbp wydzielono na drodze częściowego trawienia za pomocą Sau3A, rozdzielenia na niskotopliwym żelu agarozowym i wydzielenia odpowiedniej frakcji DNA.
Oczyszczone fragmenty zligowano w jednostkowym miejscu BamHI wektora YRp7, zawierającego sekwencję ulegającą autonomicznej replikacji z Hansenula polymorpha, wstawioną w miejsce SalI. Uzyskaną mieszaniną ligacyjną zastosowano do transformowania szczepu MB 1000 E. coli, po czym transformanty wyselekcjonowano na płytkach z pożywką minimum bez uracylu. Uzyskane transformanty poddano analizie, a plazmidy wydzielono. Wydzielono podfragment przedstawiony na fig. 10, który pośredniczył w odtworzeniu fenotypu URA+ w przeprowadzonych za pomocą 5'-monofosforanodekarboksylazy orotydyny mutantach E. coli, Saccharomyces cerevisiae i Hansenula polymorpha. Blotting Southema potwierdził, że struktura klonowanego DNA była identyczna ze strukturą genomowego regionu URA3. Mapę restrykcyjną fragmentu genu URA3 Hansenula polymorpha przedstawiono na fig. 10.
Część B. - Ekspresja powierzchniowego antygenu Hepatitis B (HBsAg) w Hansenula polymorpha.
Przykład X. Konstrukcja szczepów Hansenula polymorpha zawierających gen S.
Hansenula polymorpha RB 10 transformowano wyżej opisanymi plazmidami pRB-S-269, pRB-S-269-I, pRB-S-271 i pRB-S-271-I. Otrzymano kilka klonów zawierających plazmidy ulegające autonomicznie replikacji (transformantów) lub zintegrowane obce DNa (integrantów).
Te transformanty/integranty zbadano następnie w celu stwierdzenia, czy występuje w nich ekspresja genu S, metodami immunologicznymi. Zastosowano dwa układy badań: blotting Westerna oraz testy AUSRIA i AUSZYME (Abbott). Wytwarzanie monomeru HBsAg analizowano metodą blottingu Westerna z wykorzystaniem monoklonalnych przeciwciał RF6. Zestawy Abbotta, AUSRIA i AUSZYME zastosowano zgodnie z instrukcjami producenta w celu oceny ilości cząstek HBsAg wytwarzanych w Hansenula. Transformanty wykazujące stabilny i wysoki poziom ekspresji wyselekcjonowano, a ich DNA poddano analizie metodą blottingu Southerna, a następnie rozdzielania elektroforetycznego.
a) Transformanty
Kilka kolonii zawierających swobodnie replikacyjny plazmid otrzymano z Hansenula polymorpha transformowanego plazmidami pRB-S-269 i pRB-S-271. Analiza Southerna całego
DNA uzyskanego z tych transformantów, trawionego różnymi endonukleazami restrykcyjnymi wykazała oczekiwany wzór restrykcyjny.
168 408
b)Integranty
Hansenula polymorpha można stransformować z dużą częstotliwością wektorami integracyjnymi pRB-S-269-I oraz pRB-S-271-I. Integranty hodowane na pełnej pożywce (YEPD) są mitotycznie trwałe. Alternatywnie, mitotyczną trwałość obcego DNA w Hansenula można również uzyskać w wyżej opisany sposób, zgodnie z którym wektor ulegający autonomicznej replikacji, korzystnie plazmid o dużej ilości kopii, taki jak pRB-S-269 lub pRB-S-271, integruje się spontanicznie w genomie. Uzyskane integranty również wykazują wysoką stabilność mitotyczną obcego DNA.Obydwie wspomniane wyżej metody zastosowano w celu otrzymania szczepów dokonujących skutecznej ekspresji genu S w nieselektywnej, pełnej pożywce. Zachowano 3 szczepy: szczep o numerze identyfikacyjnym 352, który transformowano pRB-S-271, w którym gen S jest regulowany promotorem FMD oraz szczepy nr 415 i 416, transformowane pRB-S-269 zawierającym gen S regulowany przez MOX; szczepy te zastosowano w kolejnych eksperymentach.
Przykład XI. Mitotyczną stabilność obcego DNA w integrantach.
Stabilność zrekombinowanych szczepów 352, 415 i 416, zbadano zgodnie z następującą metodyką: szczepy hodowano w nieselektywnym ośrodku SMR tak, aby uzyskać 40 pokoleń. Z hodowli wydzielono 12 niezależnych kolonii przed i po okresie 40-pokoleniowym. Strukturę obcego DNA oraz ilość kopii kasety ekspresji analizowano w wydzielonych klonach metodą blottingu Southerna w kombinacji z elektroforezą na żelu agarozowym fragmentów restrykcyjnych oraz elektroforezą żelową z gradientem drgającego pola pełnych chromosomów. Ta ostatnia technika umożliwia rozdzielanie i analizę chromosomów drożdży (Schwartz i Cantor, 1984).
Elektroforeza żelowa w polu drgającym (PFGK).
Komórki szczepów 415, 416 i 352 poddano łagodnej lizie w dołku na próbki w 0,7% (wag./obj.) żelu agarozowym. Uwolnione in situ chromosomy oddzielono za pomocą urządzenia LKB-Pharmacia Pulsaphor Plus, zgodnie z instrukcjami LKB-Pharmacia. Po PEGE DNA przeniesiono na nitrocelulozę, zgodnie z procedurą Southera (1975). Plamę poddano hybrydyzacji z zastosowaniem sond znakowanych 32P, specyficznych dla MOX i/lub genu FMD albo genu URA3 z Hansenula polymorpha, przy czym wiadomo, że genom zawiera pojedynczą kopię tego ostatniego genu.
Porównanie sygnałów pochodzących z dopuszczalnych multimerycznych integrantów i sygnałów jednokopiowych genów (markerów wewnętrznych) umożliwiło ocenę ilości kopii odnośnych kaset ekspresji znajdujących się wewnątrz komórki. Analiza chromosomów metodą PEGE wykazała, że klon 415 zawiera około 30-50 kopii kasety ekspresji, podczas gdy klon 416 zawiera około 5-6 kaset ekspresji, a klon 352 około 10 kaset ekspresji. Analiza wykazała, że obcy DNA jest zintegrowany w genomie Hansenula.
Analiza Southerna.
Szczepy 352, 415 i 416 hodowano przez 40 pokoleń w ośrodku SMR. Z każdej partii wydzielono 12 niezależnych kolonii, przed i po wyżej wspomnianym okresie hodowli. Preparaty DNA z tych sub-klonów poddano analizie Southerna po rozszczepianiu różnymi enzymami restrykcyjnymi, z zastosowaniem sond DNA znakowanych 32P. Analiza wzorów restrykcyjnych wykazała, że kasety ekspresji pozostały nienaruszone, oraz, że wprowadzany DNA był genetycznie trwały. Analiza potwierdziła ponadto, że genom szczepu 415 zawiera długie powtórki z kilku kopii plazmidu. Wywnioskowano, że w powtórce takiej występuje połączenie plazmidów typu głowa do ogona.
Przykład XII. Badania ekspresji.
Zrekombinowane szczepy badano rutynowo w celu stwierdzenia obecności HBsAg, metodą blottingu Westerna oraz za pomocą testów AUSRIA/AUSZYME.
a) Wzrost hodowli i blotting Westerna
Szczepy 352, 415 i 416 hodowano w 11 kolbach w 200 ml ośrodka SMR-gliceryna, w temperaturze 37°C, z intensywnym napowietrzaniem. Na początku fazy stacjonarnej, która charakteryzuje się wyczerpaniem gliceryny, dodano 50 ml/dm3 5-krotnie stężonego ośrodka SMR bez gliceryny oraz metanol w ilości odpowiadającej jego ostatecznemu stężeniu 10 g/dm3. Próbki objętości 10 ml pobrano z hodowli przed dodaniem metanolu oraz po 24 godzinach po
168 408 dodaniu metanolu. W celach porównawczych te same szczepy hodowano również w ośrodku
SMR zawierającym 30 g/dm3 glikozy (derepresja promotorów). Komórki zebrano w późnej fazie logarytmicznej.
Z zebranych komórek przygotowano surowe ekstrakty białkowe na drodze dyspergowania peletek komórek w ilości odpowiadającej około 0,1 g suchej masy w 5 ml buforu PE (0,5 M NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM bufor fosforanowy pH 7,5, 2 mM PMSF). Dodano w przybliżeniu równą objętość kuleczek szklanych o średnicy 0,45 mm, tak że uzyskano prawie stałą mieszaninę. Mieszaninę intensywnie wytrząsano w ciągu 4 minut w temperaturze 4°C, w homogenizatorze Braun MSK (B. Braun and Diessel Biotech GmbH, Melsungen, Republika Federalna Niemiec). Następnie dodano 4 ml buforu PE i produkt homogenizacji wymieszano i odwirowano w ciągu 5 minut w temperaturze 4°C, przy przeciążaniu 40 000 x g. Próbki po 5-25 gg cieczy znad osadu nanoszono na żel do elektroforezy (SDS-poliakryloamid), stosując jako wzorce kontrolne oczyszczony HBsAg (0,05-0,5 gg). Obecność materiału antygenowego wykazano przenosząc białko na nitrocelulozę, zgodnie z metodyką Towbina (1979), i wykrywając monoklonalne przeciwciało RF6 w sposób opisany powyżej w metodzie 5a. Blotting Westerna umożliwia dokonanie oceny ilości antygenu wytworzonego w klonach 352, 415 i 416, w odniesieniu do znanych ilości czystego HBsAg pochodzącego z drożdży.
Wyniki zestawiono w tabeli 1. W hodowli w kolbach indukowanej metanolem (ośrodek SMR) przy gęstości komórek około 5 g suchej masy/dm3 białko S stanowi około 2-5% całości białka wyekstrahowanego z transformowanych szczepów.
Porównanie ekspresji w komórkach hodowanych w warunkach indukcji (metanol), depresji (gliceryna) i represji (glikoza) wykazuje ścisłą kontrolę promotorów MOX i FMD. Ekspresja jest całkowicie zablokowana w komórkach hodowanych na glikozie. W glicerynie poziom syntezy HBsAg stanowi około 30% poziomu uzyskiwanego w komórkach indukowanych.
b) Antygenowość HBsAg wytworzonego w wyniku ekspresji w Hansenula
Antygenowość materiału zawartego w surowych ekstraktach oznaczano wykonując test AUSZYME Abbotta oparty na monoklonalnych przeciwciałach. Wyniki podawano w umownych jednostkach (absorbancj a przy 492 nm na 0,1 gg białka; rozcieńczanie surowych ekstraktów i reakcję prowadzono w 150 mM NaCl, 25 mM buforze fosforanowym o pH 7,4, 0,01% BSA, 0,01% Tween 20). Reaktywność w teście AUSZYME wykazuje obecność konformacyjnych epitopów charakterystycznych dla cząstek sub-wirusowych.
Tabela 1
Wytwarzanie HBsAg w szczepach z ekspresją genu S
Szczep Promotor Źródło węgla HBsAg oceniany metodą blottingu Westerna, mg/100 mg białka HBsAg oceniany w teście AUSZYME, umowne jednostki A492/0,1 gg białka
352 FMD glikoza brak sygnału 0,3
gliceryna 0,8-1,2 10,0
metanol 2,5-3,0 25,0
415 MOX glikoza brak sygnału 0,1
gliceryna 1,0-1,5 12,0
metanol 4,0-5,0 45,0
416 MOX glikoza brak sygnału brak sygnału
gliceryna 0,05-0,8 5,0
metanol 2,0-3,0 22,0
c) Wirowanio w nrediencie eęstości surowych ekstraktów H. polymoopha
Surowe ekstrakty otrzymane zgodnie z metodyką opisaną powyżej poddano wirowaniu w gradiencie gęstości, stosując gradienty CsCl lub sacharozy. Sedymentacyjne wirowanie w gradiencie zrównoważone sacharozą wykonywano dodając 100-200 gg (200 gl) surowego
168 408 ekstraktu biαłkkwegk na wierzch 20-50% gradientu sacharozy w 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM Na3PO4 o pH 7,2. Probówki o objętości 5 ml wirowano w ciągu 18 godzin z szybkością 40 000 obrotów/minutę w wirniku Beckman SW 50. 1.
Wirowanie w gradiencie chlorku cezu przeprowadzono rozcieńczjąc 1 objętość surowego ekstraktu białkowego 1 objętością 3 M CsCl w 25 mM buforze fosforanowym o pH 7,4. Wirowanie prowadzono w temperaturze 4°C z szybkością 40 obrotów/minutę w wirniku Beckman 50 Ti w ciągu 40 godzin.
Gradienty poddano frakcjocowaciu, po czym różne frakcje przetestowano z zastosowaniem przeciwciał RF6, metodą blottingu Westerna i/lub z wykorzystaniem testów AUSRIA i/lub AUSZVME. Stwierdzono, że pik materiału HBsAg o gęstości okoto 1,16-1,19 g/ml tworzy się w gradiencie gęstości CsCl. Materiał występujący w tym piku reaguje bardzo dobrze nie tylko z przeciwciałami RF6 w biotach Westerna, ale również w próbie AUSRIA i AUSZYME. Gęstość ta, a także reaktywność w testach AUSRIA/AUSZYME wskazują na obecność kkcfogmαcyjnych epitopów charakterystycznych dla cząstek. Ponadto w kolejnym eksperymencie porównano gęstości uzyskanego materiału i seb-wirusowych cząstek wydzielonych z surowicy ludzkiej. Stwierdzono, że obydwa materiały wykazują zbliżone gęstości przy izkpiknkmetrycznym wirowaniu w roztworach CsCl.
Przy wirowaniu surowych ekstraktów w gradiencie sacharozy uzyskano frakcje pików reagujące z AUSRIA i AUSZYME, zawierające co caSmciej 80% HBsAg, na co wskazuje analiza frakcji gradientowych pgkwadzkca równklegle z AUSRIA/AUSZYME i blkttingiem Westerna. Stwierdzono, że pozostałe 20% materiału znajduje się główcie w górnych i spodnich frakcjach gradientu i wykazuje reaktywność tylko w analizie metodą blkttingu Westerna, co oznacza, iż materiał ten stanowi mocomegyczna forma białka. Analiza frakcji pikowych uzyskanych z gradientów CsCl również potwierdziła, że co najmniej 80% materiału tworzy cząstki.
Cząstki pochodzące z Hansen^a są odporne na proteolizę. Inkubacja surowych ekstraktów białkowych zawierających cząstki w ciągu kilku godzin w różnych temperaturach wykazała jedynie bardzo mały stopień degradacji, co stwierdzono analizując wielkości AUSZYME oraz badając stopień cienageszenia polipeptydu z wykorzystaniem denaiuracji w SDS-PAGE, a następnie blottingu Westerna. Materiał αcalizowank również metodą mikroskopii elektronoweS. Obrazy z mikroskopu elektronowego wyraźnie pokazują obecność cząstek o średnicy około 22 nm. Wyżej opisane wyniki uzyskano w przypadku wszystkich 3 szczepów, 352, 415 i 416.
Część C - Ekspresja białka preS1-S2-S w Hansenula polymorpha
Przykład XIII. Konstrukcja szczepów Hansen^a polymorpha zawierających gen preS1-S2-S.
Hansenula polymorpha RB 10 transfogmowack fragmentem PvuI-Asp718 o 5570 bp, pochodzącym z pMPS-22, obejmującym gen URA3 i gen preS1 pod kontgklą promotora MOX (patrz fig.8). Odpowiedni fragment zawierający gen preS1 pod kontrolą promotora FMD (delec^a^) otrzymano ponadto z plazmidu pMPS-21. Stwierdzono, że integranty uzyskane z tych transformacji zawierają 1-2 kasety ekspresji, co wykazała analiza metodą Skuthemα. Integgantom zawierającym gen preS 1 pod kontrolą promotora MOX nadano nazwę preS-AM, a icteggantom zawierającym gen preS pod kontrolą promotora FMD nadano nazwę preS-AF.
Integranty zawierające kilka kaset ekspresji uzyskano przeprowadzając transformację Hansenula polymkgphα autonkmiezcie replikującymi plazmidami pMPS22 i pMPS21, zawierającymi sekwencję HARS. Ictegranty powstały w wyniku samkgzutcej integracji tych plazmidów, jak to opisuco w części Materiały i metody, punkt 2b. Tego typu integrantom (iracsformantom) nαdαck ogólną nazwę preS-BM (promotor MOX) oraz preS-BF (promotor FMD).
Szczepy preS-AM-405, preS-BM-402, preS-BM-403 i preS-BM-454, w których ekspresja genu pgaS1jest koctgolowacα przez promotor MOX, zachowano do dalszej analizy.
2. Stabilność mitotyezna
Stabilność mitktyezną obcego DNA występującego w 4 szczepach zidentyfikowanych w przykładzie XXXI powyżej zbadano wykkcując analizę Southema 12 niezależnych subklonów wydzielonych przed i po okresie hodowli przez 40 pokoleń, w sposób opisany w części B.
168 408
Analiza potwierdziła genetyczną stabilność zintegrowanych wektorów (patrz również przykład XVI w części D).
3. Ekspresja białka preS w Hansenula polymorpha
Szczepy preS-BM-402, preS-BM-403, preS-AM-405 i preS-BM-454 hodowano w ośrodku SMR zawierającym glicerynę, a następnie prowadzono indukowanie komórek metanolem (10 g/dm3) dokładnie w taki sam sposób, jak to opisano w części B. Komórki zebrano po 25 godzinach od dodania metanolu, po czym przygotowano surowe ekstrakty w sposób opisany w części B.
a) Ilości po 12 μg surowych ekstraktów ze szczepów preS-BM-402, preS-AM-405 i preS-BM-454 analizowano wykonując najpierw elektroforezę na poliakryloamidowym żelu SDS, a następnie blotting Westerna z zastosowaniem mieszaniny monoklonalnych przeciwciał (SI. 1, S2. 2 i S2. 5), w sposób opisany w części Metody 5(a). Obydwa typy szczepów wykazały obecność podwójnego pasma antygenowego przy 38/39 kD oraz dodatkowego pasma przy 45 kD.
Szczep preS-AM-405 wykazał mniejszą zawartość składników 45 kD w stosunku do składników 39 kD niż szczep preS-BM-402. Szczep preS-BM-454 wykazał największą względną zawartość składników o 45 kD.
Profil elektroforetyczny białka preS z powyższych szczepów porównano z antygenem pochodzącym z cząstek z ludzkiej surowicy. Z porównania biotów Westerna wynika, że preparaty, zarówno ludzki jak i drożdżowy, wykazują pasmo przy około 38/39 kD.
b) Zaobserwowano również różne poziomy ekspresji w przypadku różnych szczepów. Różnice te są spowodowane przede wszystkim różnicami w liczbie kopii kasety ekspresji między szczepami. Na podstawie blottingu Westerna oceniono, że antygen preS stanowi 0,1-1,5% całości białka komórkowego w różnych szczepach preS-Α i preS-Β, jak to przedstawiono w tabeli 2.
Na surowych ekstraktach wykonano również test AUSZYME w celu zbadania obecności cząstek. Wyniki zamieszczone w tabeli 2 wykazują bardzo małą reaktywność podaną w jednostkach A492 na 0,1 μg białka.
Tabela 2
Ekspresja preS w Hansenula polymorpha
Klon Zawartość białka preS oceniana metodą Blottingu Westerna mg preS 1/100 mg AUSZYME jednostki A492 na 0,1 pg białka
preS-AM-405 0,1-0,2 0,01
preS-BM-402 0,3-0,5 0,02
preS-BM-403 0,4-0,6 0,02
preS-BM-454 1,2-1,5 0,1-0,2
c) Glikozylowanie: Szczep preS-BM-453 charakteryzujący się wysoką produkcją białka preS (około 1,5% całości białka komórkowego) oraz silnym pasmem 45 kD wybrano do badań glikozylowania. Białko preS z preS-BM-454 analizowano prowadząc inkubację surowych ekstraktów białkowych z endoglikozydazą EndoH. Uzyskane wyniki wyraźnie wskazują, że materiał 45 kD stanowi glikozylowaną formę białka preS.
W wyniku inkubacji 45 μg surowego białka w ciągu 0,5, 1,0 i 24 godzin z 0,5 mU endoglikozydazy EndoH, zgodnie z instrukcjami producenta (Boehringer Mannheim, Republika Federalna Niemiec), nastąpiło przesunięcie pasma 45 kD do pozornej masy cząsteczkowej 42 kD. To przesunięcie oznacza, że materiał 45 kD stanowi N-glikozylowaną formę białka preS, zawierającą jedną grupę rdzeniową o około 3000 D.
Do badania glikozylowania białka preS w Hansenula polymorpha wykorzystano również tunikamycynę, znaną jako silny inhibitor N-glikozylowania. Szczep preS-BM-454 hodowano
168 408 do uzyskania gęstości A6oo=lO,0, w ośrodku YNB zawierającym glikozę (10g/dm3). Porcją 10 ml tej hodowli zaszczepiono 100 ml YNB zawierającego 10 g/dm3 metanolu oraz 50 pg/ml tunikamycyny. pH ośrodka utrzymywano na stałym poziomie 7,2-7,5. Doświadczenie kontrolne prowadzono bez dodatku tunikamycyny. Komórki zbierano po 10, 15 i 30 godzinach od momentu zaszczepienia ośrodka zawierającego tunikamycynę.
Surowe ekstrakty białkowe analizowano metodą blottingu Westerna. Badania wykazały, że w komórkach hodowanych w obecności tunikamycyny widoczne jest pojedyncze pasmo przy 42 kD oraz podwójne pasmo przy 38/39 kD. W doświadczeniu kontrolnym pasmo 42 kD zostało zastąpione przez pasmo 45 kD. Podobne wyniki uzyskano w przypadku ekstraktów ze szczepów preS-BM-402, preS-BM-403 i preS-AM-405, które jednak wytwarzają znacznie mniejsze ilości partii białka o 45 kD (nie więcej niż 5-10% całkowitego zsyntetyzowanego białka pre-S). Wyniki te sugerują, że pasmo 42 kD reprezentują O-glikozylowaną formę białka preS.
d) Wirowanie w gi^^adi^i^i^i^ gęstości
Surowe ekstrakty szczepu preS-AM-405 oraz szczepów preS-BM-402, preS-BM-403 i preS-BM-454 poddano analizie przez wirowanie w gradiencie sacharozy i CsCl. Warunki opisane są w przykładzie XII (c), część B .Frakcje gradientowe badano metodą blottingu Westerna i za pomocą testów AUSZYME.
Analiza potwierdziła, że w przeciwieństwie do szczepów wytwarzających w wyniku ekspresji antygen S (część B) albo zarówno antygeny preS1jak i S (część D), szczepy preS nie wytwarzają wydajnie cząstek sub-wirusowych. Ani przy izopiknometrycznym wirowaniu z CsCl, ani przy wirowaniu w gradiencie sacharozy nie zaobserwowano tworzenia się pasma o wymaganej gęstości. Potwierdził to również fakt, że materiał zbliżony do HBsAg z frakcji gradientowych oraz surowe ekstrakty źle reagują w testach AUSRIA i AUSZYME.
Część D - Wytwarzanie cząstek kompozytowych zawierających zarówo antygeny preS jak i S.
Przykład XIV. Konstrukcja szczepów.
Skonstruowano kilka szczepów charakteryzujących się różnymi stosunkami ekspresji preS1 do S oraz różnymi całkowitymi poziomami ekspresji.
Różnice te osiągnięto zmieniając liczbę kopii kaset ekspresji przypadających na genom. Dodatkową zmienność uzyskano umieszczając geny pod kontrolą tht różnych promotorów Hansenula.
Trzy podstawowe typy szczepów rekombinantowych uzyskano w następujący sposób:
a) Szczepy zawierające jedną kopię genu preS1 oraz jedną kopię genu S (szczepy A).
Fragment DNA NheI o 6,6 kb, zawierający kasetę preS1 oraz gen URA3 wydzielono z plazmidu pMPS9 (fig. 9). Fragment DNA NheI zawierający gen S wydzielono z plazmidu pMPS2 (fig. 5). Fragmenty zligowano stosując ligazę T4 DNA, po czym połączone fragmenty zawierające po jednej kopii każdego z genów wydzielono z żeli agarozowych. Fragmenty te zastosowano do transformowania szczepu RB 10 Hansenula polymorpha aż do osiągnięcia niezależności od uracylu.
Uzyskane transformanty analizowano metodą blottinga Southerna, selekcjonując następnie klony zawierające po jednej zintegrowanej kopii każdej kasety. Szczep preS)S-A-293 zachowano do dalszej analizy.
b) Szczepy zawierające jedną kasetę ekspresji preS oraz szereg kaset ekspresji S (szczepy B).
Hansenula polymorpha stransformowano fragmentem Asp-718-pvuI o 5570 bp, z pMPS22 zawierającym kasetę ekspresji preS1. Wyselekcjonowano transformanty zawierające jedną zintegrowaną kopię kasety. Uzyskanym szczepem był preS-AM-405 opisany w części C, przykład XIII, powyżej.
Szczep preS-AM-405 stransformowano następnie plazmidami ulegającymi autonomicznie replikacji pRB-S-322 (promotor MOX) lub pBR-S-326 (promotor FMD) (fig. 7), zawierającymi gen S pod kontrolą odpowiednich promotorów. Obydwa plazmidy dodatkowo zawierają gen kodujący odporność na gentamycynę G418 jako selektywny marker. Gen Kan jest pod kontrolą promotora ADH1 z Saccharomyces cer^isiae (fig. 7), jak to opisano powyżej. W wyniku
168 408 transformacji uzyskano szereg szczepów zawierających w każdym przypadku jedną zintegrowaną kopię kasety preS 1 oraz szereg zintegrowanych kopi i (30-100) kasety zawierającej gen S. co wykazały analizy metodą blottingu Southerna i PFGE.
Szczepy preS/S-B-431, preS/S-B-432 i preS/S-B-433 zachowano do dalszej analizy. Szczep preS/S-B-431 przenosi gen S pod kontrolą promotora MOX, podczas gdy szczepy preS/S-B-432 i preS/S-B-433 zawierają kasety ekspresji obejmujące promotor FMD.
c) Szczepy zawierajwe szereg keret ekspresy zreśwno ównu S e^ i genu pgeS (szezepy cz).
Hansenula pclemcrpha stransfcrmcwaso plazmidem pMPS-22 ulegającym autonomicznie replikacji, zawierającym gen preS-1 (fig. 8). W wyniku transformacji uzyskano szereg szczepów zawierających zmienne ilości kaset ekspresji zintegrowanych w jednym genomie. Izolaty zawierające 2-20 kaset ekspresji preS1 zidentyfikowano metodą blottingu Southersa. Szczepy te opisane w części C jako preS-BM-402, preS-BM-403 i preS-BM-454, wytwarzają w wyniku ekspresji różne ilości antygenu preS. Takie szczepy preS strassformowosc następnie ponownie plazmidami ulegającymi autonomicznie replikacji, pRB-S-322 (promotor mOx) i pRB-S-326 (promotor FMD), zawierającymi gen S (fig. 7). Jako marker transformacji zastosowano odporność na G 418. W wyniku selekcji stabilnych integrastów uzyskano szereg klonów w przypadku każdej z transformacji, przy czym część z nich poddano dalszej analizie. Do dalszej asallae zachowano następujące szczepy: preS/S-C-452, preS/S-C-465 pochodzący ze szczepu preS-BM-402, szczep preS/S-C-466 pochodzący ze szczepu preS-BM-403, szczep preS/Z-C448-C4 pochodzący ze szczepu preS-BM-454, w których kasety ekspresji genu S zawierają promotor FMD. W tabeli 3 przedstawiono szczegółowo informacje dotyczące pochodzenia i zrzeznazzesia wyżej wymienionych szczepów.
Tabela 3
Charakterystyka szczepów wytwarzających w wyniku ekspresji zarówno białko preS jak i S
Szczep Szacunkowa liczba kaset preS Szacunkowa liczba kaset S Ekspresja całkowite preS/S (Western) mg/100 mg Reaktywność z AUSZYME jednostki umowne A492* Szacunkowy stosunek preS/S na podstawie lmmunoblottnnu
ZreS/S-A-293 1 1 ok. 0,3-0,4 5,0 ok. 1:1
preS/S-B-431 1 ok. 10 1,5-2,0 10-15 ok. 1:15
preZ/S-B-432 1 ok. 10-15 2,5-3,0 10-20 ok. 1:15
preS/S-B-433 1 ok. 20 2,0-2,5 10-15 ok. 1:20
preZ/S-C-452 kilka > 30-50 3,0-4,0 20-30 ok. 1:8
ZreZ/S-C-453 kilka > 30-60 3,5-4,5 15-25 ok. 1:10
preS/S-C-465 kilka > 30-50 3,5-4,5 25-35 ok. 1:5
preS/S-C-466 kilka > 50-80 3,5-1,5 25-35 ok. 1:8
ZroZ/S-C-448-C4 > 20-30 > 10-20 3,0-3,5 10-20 ok. 5:3
*Liczby reprezentują najmniejsze i sąiwiękjze wielkości wyznaczone dla danego szczepu.
168 408
168 408
ΜΟΧ
- Hansenula DNA -►)
Fragment użyty do otrzymania promotora I
EcoRI fag λ
M U
C0 U4
1527 bp <-►
ECORI fag λ
-►
ORF fag λ
11400 bp r«--►
ORF
Fig. 2
Fig. 3
168 408
Β
X
168 408
Eco R I \ Nhe I Bg||| / / BamHI
Xbal
Pstl
EcoRI
Ncoll
Nhe I'Hind lik χ ba l\ Hnd IIK(Stu l/Bsp Μ II) Eco R1 \ Pst I tępy koniec “ Bgl II
Hind III
EcoRI (Xco l/Sal I) ,Pst| tępy koniec
Eco R I Nhe I Bgl II
Barn ΗI
Eco RI Ncol
Eco RI
Sali· Xba I·
Hind III
Hind III Bgl II Hind III EcoRI
Xho I sekwencje H polymorpha
Pstl
EcoRI
K Nlje I Bgl II
HindIII /xbai\D m
Sali / , ^111
Nhe I Nco I
BamHI Xbal
EcoRI
Ncol I HindIII
Nco I
Κρη I
Hmd ll?^(stu M ) Pst | tępy koniec
Bgl II
HindIII EcoRI (Xho l/Bam HI)
Pstl 'W*0™*
Fig. 5
168 408
(Stul/Asp 718) tępy koniec sekwencje H. polymorpha
Fig. 9
168 408
Fig. 7
168 408
168 408 i yds
13MN
IB °33 III PU!H
II ifis III PU!H
PIS π i^a
IB 033
II 150
IB o=3 III ΡΨΗ
II )6θ III PU!H
IB033 tu itiosT in “‘•a
II )δθ
cn
168 408
NcoI
Fig. 11
1(08408
Bgll
Sali _
Sygtetyczny tngmeat otwarty za pomocą Bam HI. EcoRI
BitXJ presi
Bat XI pnSl
EcoRI gros 2
Xba I oRI
EcoRI
Bam Xba I
M. Bean traktowany - ligoaraoy
Sali
Fig. 13
Bgl II
URG3
Fig. 14
HBVadw -► p RIT 10616 (HB C,) pRIT 10833 (HBQ1|
. Trawienie Bal I, Bam HI/T4 polimeraza - Ligacja
BstX * Bam ATG Xba I pRIT 13189 -----1-s -1-l_
52' z '133 175 otwarty za pomocą Bam ΗI, Xba I + SynL adaptor+ fragment Nco I Xba I z pRIT 12331
BstX p RIT 13190 * Bam ATG Xba —X 1-1----52 ' 133 x z x175
Xba I Sai I + fragment Xba I Sal I z pRIT 12860
BstX
PRIT 13191
52\
Bam )_1W I— 133 \z 175
ATG Xba
BstX
Fig. 15
168 408
Cli I - Cla I duży tragmebl oczyszczony
Fig. 16
168 408
Eco RI Hind III
S
a.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (5)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu wybranego z grupy obejmującej rodzaje drożdży metylotroficznych, znamienny tym, że transformuje się mikroorganizm wektorem zawierającym cząsteczkę DNA obejmującą kasetę ekspresji (ecl) kodującą pierwszy polipeptyd i/lub kasetę ekspresji (ec2) kodującą drugi polipeptyd i/lub kasetę ekspresji (ec3) kodującą trzeci polipeptyd, przy czym kasety ekspresji zawierają: a) regulon R czuły na metanol i/lub usunięcie źródeł węgla powodujących represję kataboliczną, b) otwartą ramkę odczytu kodującą całość łub część białka wykazującego aktywność biologiczną jednego z powierzchniowych antygenów Hepatitis B oraz c) ewentualnie sekwencję DNA służącą jako terminator T, z tym, że R kontroluje transkrypcję ramki odczytu, a T kieruje poliadenyłacją i/lub terminacją transkrypcji wytwarzanego mRNA.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwszy polipeptyd odpowiada całości lub części białka S, drugi polipeptyd odpowiada całości lub części białka preSl, a ewentualny trzeci polipeptyd odpowiada całości lub części białka preS2, albo drugi polipeptyd odpowiada całości lub części białka preS2.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że drożdże metylotroficzne wybrane są z gatunków rodzaju Candida, Kloekcera, Saccharomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Pichia i Hansenula.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że regulon pochodzi z genu biorącego udział w wykorzystaniu metanolu, korzystnie z genu ΜΟΧ, genu FMD, genu DAS lub genu katalazy, przy czym geny te najkorzystniej pochodzą z Hansenula polymorpha.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze drożdże metylotroficzne wybrane są spośród Hansenula, korzystnie z Hansenula polymorpha, a najkorzystniej ze szczepu wykazującego identyfikacyjną charakterystykę Hansenula polymorpha RB 10 (DSM 5215).
PL90304768A 1989-08-03 1990-07-25 Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL PL168408B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38918489A 1989-08-03 1989-08-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL168408B1 true PL168408B1 (pl) 1996-02-29

Family

ID=23537201

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL90304768A PL168408B1 (pl) 1989-08-03 1990-07-25 Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL
PL90304769A PL168787B1 (pl) 1989-08-03 1990-07-25 Sposób wytwarzania czastki kompozytowej PL

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL90304769A PL168787B1 (pl) 1989-08-03 1990-07-25 Sposób wytwarzania czastki kompozytowej PL

Country Status (2)

Country Link
US (1) US6103519A (pl)
PL (2) PL168408B1 (pl)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2201452C2 (ru) * 2000-12-28 2003-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "Биотех" Рекомбинантная плазмидная днк рнвs, обеспечивающая биосинтез поверхностного антигена вируса гепатита в, способ конструирования плазмиды, штамм дрожжей pichia pastoris ps103 (phbs) - продуцент указанного антигена
US20030044982A1 (en) * 2001-04-25 2003-03-06 Kenneth Chien Method to treat hemophilia by hepatic gene transfer of factor VIII/IX with vesicle vector
RU2207374C1 (ru) * 2002-05-14 2003-06-27 Закрытое акционерное общество "Медицинские технологии - "МТХ" Рекомбинантная плазмида, кодирующая поверхностный антиген (hbsag) вируса гепатита b, ее получение и штамм дрожжей hansenula polymorpha - продуцент поверхностного антигена (hbsag) вируса гепатита b
RU2235768C1 (ru) * 2003-03-14 2004-09-10 Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" Трансформированный штамм дрожжей hansenula polymorpha-продуцент рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита b-hbsag/adw
CN100381171C (zh) * 2004-12-30 2008-04-16 成都生物制品研究所 含前s1、前s2和s抗原决定簇的乙肝表面抗原复合颗粒
WO2006113528A2 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Expressing hepatitis b virus surface antigen for vaccine preparation
US20090098531A1 (en) * 2007-09-13 2009-04-16 Abbott Laboratories Detecting hepatitis b virus
US20100136520A1 (en) * 2007-09-13 2010-06-03 Abbott Laboratories Detecting hepatitis b virus
HU231053B1 (hu) * 2011-09-08 2020-03-30 Szegedi Tudományegyetem Rézrezisztens, fengicin hipertermelő Bacillus mojavensis törzs növényi kórokozók elleni védekezésre, alkalmazása és az ezt tartalmazó készítmények

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769238A (en) * 1981-08-04 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Synthesis of human virus antigens by yeast
US4722840A (en) * 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
EP0288198A3 (en) * 1987-04-20 1989-03-29 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of peptide
EP0304578B1 (en) * 1987-06-22 2001-10-24 Medeva Holdings Bv Peptide comprising hepatitis B surface antigen
ATE78467T1 (de) * 1987-07-15 1992-08-15 Schering Corp Kondensierte benzazepine.
EP0299108B1 (en) * 1987-07-17 1994-05-18 Rhein Biotech Gesellschaft für biotechnologische Prozesse und Produkte mbH DNA-molecules coding for FMDH control regions and structured gene for a protein having FMDH-activity and their uses
IL90161A0 (en) * 1988-05-13 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of hepatitis b s and pres2 proteins in methylotrophic yeasts
DK0414374T3 (da) * 1989-07-25 1998-03-09 Smithkline Beecham Biolog Hidtil ukendte antigener og fremgangsmåder til fremstilling deraf

Also Published As

Publication number Publication date
PL168787B1 (pl) 1996-04-30
US6103519A (en) 2000-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0414374B1 (en) Novel antigens and methods for their preparation
CA1341642C (en) Synthesis of hepatitis b virus surface antigen by yeast
US6544757B1 (en) Synthesis of human virus antigens by yeast
US5650296A (en) Expression of hepatitis B S and preS2 proteins in Pichia pastoris
PL168408B1 (pl) Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL
SK118293A3 (en) Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles
WO1994001132A1 (en) VACCINE COMPRISING MIXED preS1+preS2+S AND CORE PARTICLE
EP0340806B1 (en) Synthesis of human virus antigens by yeast
CA2078358A1 (en) Multivalent hepatitis b virus vaccine
HK1003032B (en) Novel antigens and methods for their preparation
IE903178L (en) Synthesis of human virus antigens by yeast