PL168787B1 - Sposób wytwarzania czastki kompozytowej PL - Google Patents

Sposób wytwarzania czastki kompozytowej PL

Info

Publication number
PL168787B1
PL168787B1 PL90304769A PL30476990A PL168787B1 PL 168787 B1 PL168787 B1 PL 168787B1 PL 90304769 A PL90304769 A PL 90304769A PL 30476990 A PL30476990 A PL 30476990A PL 168787 B1 PL168787 B1 PL 168787B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
protein
pres
gene
expression
plasmid
Prior art date
Application number
PL90304769A
Other languages
English (en)
Inventor
Martin Comberbach
Nigel Harford
Teresa Cabezon
Apolonia Rutgers
Pierre Voet
Eric Jacobs
Cornelis P Hollenberg
Zbigniew A Janowicz
Armin J Merckelbach
Original Assignee
Smithkline Beecham Biolog
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Smithkline Beecham Biolog filed Critical Smithkline Beecham Biolog
Publication of PL168787B1 publication Critical patent/PL168787B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Abstract

1 . Sposób wytwarzania czastki kompozytowej zawierajacej co najmniej dwa polipep­ tydy odpowiadajace calosci lub czesci bialka o aktywnosci antygenu powierzchniowego Hepatitis B, znamienny tym, ze hoduje sie w odpowiednim podlozu, w warunkach, w których zachodzi synteza bialka, szczep drozdzy metylotroficznych stransformowany wektorem zawierajacym czasteczke DNA obejmujaca kasete ekspresji (ec 1) kodujaca pierwszy polipep­ tyd i/lub kasete ekspresji (ec2) kodujaca drugi polipeptyd i/lub kasete ekspresji (ec3) kodujaca trzeci polipeptyd, przy czym kasety ekspresji zawieraja: a) regulon R czuly na metanol i/lub usuniecie zródel wegla powodujacych represje kataboliczna, b) otwarta ramke odczytu kodujaca calosc lub czesc bialka wykazujacego aktywnosc biologiczna jednego z po­ wierzchniowych antygenów Hepatitis B oraz c) ewentualnie sekwencje DNA sluzaca jako terminator T, z tym, ze R kontroluje transkrypcje ramki odczytu, a T kieruje poliadenyiacja i/lub terminacja transkrypcji wytwarzanego mRJSIA. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania cząstki kompozytowej zawierającej co najmniej dwa polipeptydy odpowiadające całości lub części białka o aktywności biologicznej powierzchniowego antygenu Hepatitis B.
Zapalenie wątroby (Hepatitis) jest rozpowszechnioną poważną chorobą zakaźną, którą mogą powodować różne czynniki. Jeden z istotnych czynników zidentyfikowano jako wirus Hepatitis B (HBV), mały wirion o średnicy około 43 nm zawierający szczególny genom złożony z 3200 par zasad dwuniciowego kolistego DNA z jednoniciową wstawką o długości około 200 par zasad. Zakażenie tym wirionem powoduje ciężką, czasami, nawet śmiertelną chorobę. 58% zainfekowanych osób odzyskuje zdrowie po około 3 miesiącach choroby, około 1% cierpi na ostrą nekrozę tkanki wątrobowej, powodującą po krótkim czasie śmierć, a u około 10%o obserwuje się nawroty choroby. U około 4% zainfekowanych osób rozwija się chroniczny stan nosicielstwa ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia pierwotnego raka wątroby lub marskości wątroby.
Zakażenie może nastąpić w czasie transfuzji krwi, przez użycie zakażonych strzykawek lub igieł, albo też poprzez kontakt seksualny. Istnieje więc pilna potrzeba posiadania wiarygodnych środków diagnostycznych do wykrywania HBV oraz dostępnej po niskich cenach szczepionki, chroniącej ludzi o wysokim stopniu ryzyka takich jak małżonkowie chronicznych nosicieli, osoby podróżujące do obszarów o wysokim endemicznym występowaniu HBV, noworodki chronicznych nosicieli, homoseksualiści, prostytutki i narkomani. Ponadto, w krajach
168 787 trzeciego świata istnieje zapotrzebowanie na tanią szczepionkę dla programów szczepień masowych.
Poza cząstkami wirusowymi składającymi się z białek rdzeniowych (HBcAg) i białek kapsydu czyli antygenów powierzchniowych we krwi zaitekowanych osobników mogą występować znaczne ilości cząstek HBsAg zawierających białko antygenu powierzchniowego i lipidy gospodarza. Takie cząstki wydzielono z ludzkiej surowicy i zastosowano do wytwarzania szczepionek, które jak wykazano chronią przed infekcją HBV (Szmuness i in., 1980).
W opisie powołuje się na pewne publikacje podając w nawiasach nazwisko pierwszego autora i rok publikacji. Pełne zestawienie pozycji literaturowych w porządku alfabetycznym zamieszczono na końcu opisu.
Jednakże wytwarzanie szczepionek z HBsAg pochodzących z surowicy jest utrudnione ograniczoną dostawą zakażonej krwi oraz koniecznością poddawania ich długim i rygorystycznym testom w celu zapewnienia usunięcia i/lub inaktywacji potencjalnych czynników zakażonych.
Z infekcją wirusem Hepatitis B (HBV) u ludzi wiąże się występowanie w surowicy różnych struktur zawieraiacych antygen powierzchniowy (HBsAg) Hepatitis B (Tiollais i wsn. Nature 1985, 17, 489). Oprócz zakaźnych wirionów występują także nitkowate i sferyczne cząstki o średnicy 22 nm (zawierające około 100 białek otoczki), utworzone przez asocjację lipidów gospodarza z trzema białkami powierzchniowymi Hepatitis: głównym (S), średnim (M) i dużym (L). Białka te mają wspólną tę samą sekwencję 226 kodonów aminokwasów w genomie HBV, znaną jako sekwencję kodującą białko S. Całkowita sekwencja kodująca aminokwasy, która bezpośrednio poprzedza sekwencję kodującą białko S, określana jest w mniejszym opisie jatko sekwencję kodującą preS. Ta kodująca sekwencja preS koduje sekwencję 55 aminokwasów, które bezpośrednio poprzedzają białko S, zwaną regionem preS21, zależnie od podtypu wirusa, sekwencję 108 lub 119 aminokwasów poprzedzającą bezpośrednio region preS2, zwaną regionem preSl. A więc całkowita sekwencja kodująca preS koduje 163 (55 preS2 + 108 preS1) aminokwasy w podtypach ay i 175 (55 preS2 + 119 preS 1) aminokwasy w większości podtypów ad. Porównanie sekwencji kodujących preS w genomach wirusów podtypu ad i ay wykazało, że pierwszych 11 kodów regionu preS1 podtypu ad nie występuje w podtypach ay. Zgodnie z powszechnie przyjętą nomenklaturą, w zgłoszeniu tym przyjmuje się numerację kodów i aminokwasów obowiązującą dla podtypów ad; tzn., że genomy HBV podtypów ad kodują region preS złożony ze 174 aminokwasów, ponumerowanych od 1 do 174, podczas gdy 163 aminokwasy regionu preS w podtypach ay są ponumerowane od 12 do 174.
Główne białko (S) kodowane jest przez 226 kodonów genu S 1 istnieje w formie glikozylowanej i nieglikozylowanej.
Białko średnie (M) zawiera region preS2 i białko S (białko M = 55 + 226 aminokwasów). Białko M jest glikoproteiną występującą w dwóch formach zależnie od stopnia glikozylacji (Stibbe i wsp., J.Virol., 1983,46, 626-628). 55 aminokwasów kodowanych przez region preS2 ma własności hydrofilowe i zawiera epitop immunodominujący umiejscowiony na powierzchni otoczki (reszty aminokwasowe 132 - 137). Epitop ten jest niezależny od wiązania dwusiarczkowego oraz, jak stwierdzono, jest bardziej immunogenny niż epitopy białka S (Neurath i wsp., Science, 1984, 224, 392 - 394; Neurath i wsp. Nature, 1985, 315, 154-156). Sekwencja preS2 zawiera również receptor dla społimeryzowanej albuminy ludzkiej (pHSA) (Machida i wsp., Gastroent., 1984, 86, 910-918). Ten receptor może również wiązać monomeryczną HSA i może pośredniczyć w wiązaniu HBV do hepatocydów, u których również występuje receptor dla pHSA. Sugeruje się, że wiązanie takie u ludzi może prowadzić do tolerancji albo reakcji autoimmunizacyjnych.
Duże białko (L) obejmuje region preS 1, region preS2 i sekwencję białka S (białko L = 108 (lub 119) + 55 + 226 aminokwasów). Występuje w formie glikozylowanej i nieglikozylowanej (patrz Heermann i wsp., J. Virol., 1984, 52, 396). Białko L ma długość zmienną, zależnie od podtypu, np. 389 lub 400 aminokwasów, odpowiednio dla podtypów ay i ad. Produkt translacji preS 1 bierze również udział w wiązaniu HBV do hepatocytów.
Ponieważ promotor dla specyficznych transkryptów S i M mieści się wewnątrz otwartej ramki odczytu białka L, to transformacja komórek ssaków przy użyciu DNA kodującego
168 787 całkowitą otwartą ramkę odczytu dlabiałkaL może powodować syntezę wszystkich trzećh laia-łek powierzchniowych. W komórkach ssaków cząstki HBsAg są wydzielana na zewnątrz (Tiollais wsp.. jak wyżej). W organizmach ssaków ekspresja białka S powoduje zahamowanie wydzielania cząstek HBsAg (patrz np; ‘Ou i wsp., J.Virol., 1987, 61, 782). Sugeruje się, że zjawisko to związane jest’ z obecnością grupy N-mirystoilowej w białku L, powodującej zakłócenia w procesie zarodkowania lub wydzielania (Persing i wsp. Science, 1986, 24, 1388-1391; Persing i wsp. J.Virol., 1987, 61, 1672-1677).
Dla ułatwienia powoływania się na określone sekwencje poniższa tabela 1 przedstawia kodujące sekwencje DNA oraz sekwencje aminoewasowe dla regionów preS1, preS2 i białek HBV omawianych w mniejszym zgłoszeniu. Numery aminokwasów są umieszczone w nawiasach, powyżej kodonów i liczone są poczynając od pierwszego kodonu ATG obecnego w otwartej ramce odczytu dla białek otoczki wykrytej w sekwencji wirusa HBV adw, która została sklonowana w plazmidzie pRIT 10616. Ponieważ pierwszych 14 kodonów tej sekwencji ad me występuje w żadnej z kaset ekspresji opisanych w niniejszym zgłoszeniu, więc sekwencje te zostały w tabeli 1 pominięte. Plazmid pRlT 10616 w £.co/i 600 jest zdeponowany w Amerieay Type Culture collżcioy, Rockville, Maryland, USA, pod nr. ATCC 39 131.
TABELA 1
REGION PRE-S1
NcoI (12)
ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG GGA TTC TTT Met Gly Thr Asn Leu Ser aal Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe (26)
CCC GAT CAT GCA TTT GAC CCC GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAA
Pro Asp His Gin Tlu Asp Pro TAa Phe Gil AAa Am T^it Am (40)
AAT CCA GAG TTG TAC TTC Ad CCC ATC AAG GAC CCA TGG CCC
Asn Pro Asp Tto Asp Phe Am Pro Ile Lys Asp Hss Trp Pro (54)
GCA GCC AACCCA GTA GGA GTG GGA GCA TTC GGG CCA GGG CCC Ala Ala Asn G Gs Tal Gly Val Gly Ala Ptie Gly P^Gly Lli (68)
ACC CCC CCA CCA GGC GGG ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT
Thr Pro Pro H Ss Gly Gly 11e Leu Gly Trp Ser Pro Gin AAl (82)
CAG GGC ATA TTT ACC CTC GTG TC A ACA ATT CCT CCT CCT GGC
Gin Gly IIi Llu Thr Chr val Ser Thr Ile Pro Pro Pro AALl
168 787
(96)
TCC ACC AAT GgG CAG TCA GGA AGG CAG CCl ACT ccC ATC TCT
Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser
(110) (119)
CCA CCT CTA AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC
Pro Pro Leu Arg Asp Ser Hls Pro Gin Ala
REGION PRE-S2 (120)
ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA GCT CTG CAG GAT
Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gin Asp
(134)
CCC AGA GTC AGG GGT CTG TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT
Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser
(148)
TCA GGA ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT CAC ATA
Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser Hls Ile
(162) (174)
TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG GAC CCT GTG ACG AAC
Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn
BIAŁKO S (175)
ATG GAG AAC ATC ACC TCA GGA TTC CTA GGA ccc CCT CCT GTG
Met Glu Asn 11 €5 Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Lee LLe Val
TTA CAG GCG <^<G<G TTT TTC TTG TTG ACA AG A ATC CCT CAC ATA
Leu Gin Ala Gly Phh Phe Leu Leu Thr Ar^ U£ Leu W He
168 787
CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTC AAT TTT CTA
Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phu Leu
GGG GGA TCA CCC GTG TGT CTT GGC CAA AAT1 TCG CC\G TCC CCC.
Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gin Asn Ser Gln Ser Ppo
ACC TCC AAT CAC TCA CCA ACC TCC TGT CCT· car ATT TGT CCT
Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro
GGT TAT CGC TGG ATG TGT CTG CGG CGT ttt ATC ATA TTC CTC
Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu
TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TTC TTA ATT GTT CCT GCT
Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu ulu vva Leu Glu
GAT TAT CAA GGT ATG TTG CCC GTT TGT CCC ąTA AAT CCC GGG
ASP Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu He; Ppo GGy
TCA ACA ACA ACC AAT ACG GGA CCA TGC AAA ACC TGC ACG ACT
Ser Thr Thr Thr Asn Thr Gly Pro Cys Lye Thr Cys TI^io TtllO
CCT GCT CAA GGC AAC TCT ATG TTT CCC TCTc TGT TGC TGT ACA
Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr
AAA CCT ACG GAT GGA AAT TGC ACC TGT ATI? CCC ATC CCA TCG
Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser
TCC TGG GCT TTC GCA AAA TAC CTA TGG GACA TGG CGCC TCA GTC
Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser val
CGT TTC TCT TGG CTC AGT TTA CTA GTG CCA ttt GTT CAG TGG
Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp
TTC GTA GGG CTT TCC CCC ACT GTT TGG CTT? TCA GCT ATA TGG
Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp
ATG ATG TGG TAT TGG GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATC GTG AGT
Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Ty r Ser Ile val Ser
CCC TTT ATA CCG CTG TTA CCA ATT TTC ttt TGT CTC TGG GT.
Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cvs Leu Tro w.
( 400 )
TAC ATT TAA Tyr Ile Stoc
168 787
Wirusowe sygnały inicjacji transkrypcji umiejscowione po stronie 5’ od kodonów inicjacji translacji kontrolują ekspresję in vivo każdego z białek: preS1, preS2 i S. Przy translacji w komórkach ssaków białka te mogą być glikozylowane dając w rezultacie zestaw antygenów powierzchniowych przedstawionych w poniższej tabeli:
Białko Długość (ilość aminokwasów) Oznaczenia Ghkozylacja sekwencji białka S Glikozylacja specyficznych domen preS2
P24 GP27 GP33 GP36 * P39 GP42* 226 226 281 281 389 389 białko S białko S białko preS2 białko preS2 białko preS 1 białko preSl 1 ; > + > + ' + + +
co zgodne jest z obecnością dodatkowych 11 aminokwasów przy końcu N (Heermann i wsp 1984)
Od czasu poznania sekwencji DNA kodujących region antygenu powierzchniowego poczyniono szereg prób wyprodukowania białka S w oparciu o technikę rekombinacji DNA. Burell i wsp. (1974) oraz Murray i wsp. (1980), jak również szereg innych badaczy donosili o ekspresji HBsAg w E.coli. Valenzuela i wsp. (1982) donosił o ekspresji HBsAg w drożdżach. Po rozbiciu komórek drożdży transformowanych przy pomocy wektora zawierającego sekwencje kodujące białko S pod kontrolą promotora drożdżowej dehydrogenazy alkoholowej I, można było obserwować sferyczne cząstki zawierające HBsAg podobne do cząstek znajdowanych w surowicach osobników zainfekowanych HB V. W Europejskim Zgłoszeniu Patentowych 0 226 846 (Tschopp i wsp.) ujawnione jest wytwarzanie białka S wirusa HBV w drożdżach Pichia. Synteza białka jest pod kontrolą regionu regulatorowego reagującego na metanol.
Jednakże, chociaż szczepionki zawierające wyłącznie cząstki antygenu S mają zwykle silnie ochronne właściwości (Szmuness i wsp. 1980), to niektórzy biorcy źle znoszą takie preparaty. W celu przezwyciężenia takiego nie dającego się przewidzieć niepowodzenia szczepienia zostały opracowane systemy ekspresji białek preS2 i preS 1. Wiadomo jest, ze preS2 jest nawet bardziej immunogenne niż białko S. Na przykład, przy immunizacji myszy subviralnymi cząstkami niosącymi specyficzne epitopy preS2 i S, reakcja przeciwciała na obecność preS2 przewyższa reakcję anty-S(Milich i wsp. 1985). Co więcej, zaobserwowano, że immunizacja cząstkami zawierającymi preS2 może indukować również reakcję anty-S. Ostatnio dokonano przeglądu literatury dotyczącej roli białek preS1 i preS2 w immunizacji oraz specyficzności rozpoznawania przez komórki T i B białek antygenu powierzchniowego HBV (Milich, 1988 i odnośniki tamże). Valenzuela i wsp. (1985) opisali ekspresję całkowitej sekwencji kodującej białko preS2 w drożdżach transformowanych plazmidem zawierającym odpowiednie sekwencje wirusowe. Należy zaznaczyć, że przy transkrypcji u drożdży inicjacja musi odbywać się pod kontrolą promotorów drożdżowych poprzedzających odpowiedni region kodujący, gdyż wirusowe sygnały inicjacji transkrypcji wewnątrz ramki odczytu HBV-ORF nie są rozpoznawane przez system transkrypcyjny drożdży.
Itoh i wsp. (1986) i inni badacze również wykrywali ekspresję białka preS2 u drożdży i jego agregację w cząstki. Dehoux i wsp. (1986) wykryli ekspresję białka preS1 o masie 39 kD u drożdży i stwierdzili, że jest ono zagregowane w formie cząstek. Imamura i wsp. (1987) w swoim doniesieniu opisują ekspresję zarówno białka preS2 jak i preS 1 w S.cerevisiae. Autorzy ci stwierdzają, że to wielkie białko znajduje się w formie względnie stabilnego meglikozylowanego produktu o masie cząsteczkowej 42 kD, który niezbyt łatwo ulega agregacji w formę cząstek.
Glikozylacja białek powierzchniowych produkowanych w drożdżach S.cerewsiae różni się od glikozylacji obserwowanej w naturalnie występujących cząstkach izolowanych z osobników zakażonych HBV. Białko S nie jest glikozylowane podczas gdy białka preS2 i preS1 są
168 787 wytwarzane w formach N-glikozylowanej i nieglikozylowanej. Zidentyfikowano też N-sprzęzone łańcuchy o wysokiej zawartości mannozy jak i O-sprzężony łańcuchy) oligosacharydowy (Ttnr.h i Avsn 1986) Lanelev i wsd. 1988).
V - i S S X '
Przeprowadzono również ekspresję powierzchniowego antygenu HBV w komórkach ssaków. Michel i wsp. (1984) wykazali syntezę HBSAg w komórkach jajnika chomika chińskiego (komórki CHO) transformowanych plazmidem zawierającym sekwencję kodującą białko preS2. Persing i wsp. (1985) sł^iwie^(^:z.i]i ekspresję trzech HBsAg-pokrewnych polipeptydów o masie cząsteczkowej 24 000, 27 000 i 35 000 daltonów w komórkach myszy transformowanych przy użyciu sekwencji kodującej białko preS2. Te trzy otrzymywane polipeptydy mogą być uorganizowane w złożone immunoreaktywne cząstki HBsAg o średnicy około 22 nm.
McLachlan i wsp.(WO 88 06185) donieśli o ekspresji różnych białek pokrewnych białkom HBV w komórkach kręgowców. Jednakże ekspresja antygenu preS w komórkach ssaków jest zwykle utrudniona z powodu względnej nadprodukcji białka preS 1 w stosunku do białka S, gdyż wówczas wydzielanie cząstek HBsAg zostaje zahamowane (Ou i wsp. 1987). Ponadto stosunek różnych białek S-pokrewnych nie daje się kontrolować. Wreszcie, hodowla komórkowa linii komórek zwierzęcych jest metodą kosztowną, co w rezultacie powoduje wysoką cenę otrzymywanego produktu.
Mimo, iż opisywane i stosowane szczepionki wykazują wysoką skuteczność, pewien procent osób otrzymujących takie szczepionki, zwłaszcza osób o upośledzonej odporności, np. pacjentów poddawanych hemodializie, nie reaguje na nie lub reaguje powoli (patrz np. Hadler i in., New Engl. J.Med. 315; 209-215 (1986); Bruguera i in., Post Grad. Med. J., 63:155-158.
W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na sposoby i kompozycje przydatne do wytwarzania dodatkowych skutecznych szczepionek przeciw HBV.
Tak więc celem niniejszego wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania kompozytowych cząstek białkowych, z których można wytwarzać skuteczne szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby B. Cząstki takie zawierają białka preS i S w różnych stosunkach i można je wytwarzać na dużą skalę przy niskich kosztach.
Sposób według wynalazku polega na tym, że hoduje się w odpowiednim podłożu, w warunkach, w których zachodzi synteza białka, szczep drożdży metylotroficznych stransformowany wektorem zawierającym cząsteczkę DNA obejmującą kasetę ekspresji (ecl) kodującą pierwszy polipeptyd i/łub kasetę ekspresji (ec2) kodującą drugi polipeptyd i/lub kasetę ekspresji (ec3) kodującą trzeci polipeptyd, przy czym kasety ekspresji zawierają: a) regulon R czuły na metanol i/lub usunięcie źródeł węgla powodujących represję kataboliczną, b) otwartą ramkę odczytu kodującą całość lub część białka wykazującego aktywność biologiczną jednego z powierzchniowych antygenów Hepatitis B oraz c) ewentualnie sekwencję DNA służącą jako terminator T, z tym, że R kontroluje transkrypcję ramki odczytu, a T kieruje poliadenylacją i/lub tenminacją transkrypcji wytwarzanego mRNA.
Poniższe terminy występujące w niniejszym zgłoszeniu definiuje się następująco:
Kaseta ekspresji oznaczajakikolwiek odrębny region DNA, który funkcjonuje w komórce gospodarza jako kompletna jednostka ekspresji genu.
Kompletna jednostka ekspresji genu jest to gen strukturalny, z promotorem i regionami regulacyjnymi wymaganymi dla jego transkrypcji i translacji.
Funkcjonalny kodujący region DNA oznacza kodującą sekwencję DNA, która, po włączeniu w fazie do sekwencji kodującej białko S, nie przeszkadza w tworzeniu się mieszanych cząstek HBsAg.
Pochodna funkcjonalna: oznacza sekwencję kodującą zawierającą takie zmiany kodonów aminokwasowych, które me przekszkadzają w formowaniu się cząstek i które pozwalają na zachowanie niezmienionej immunogenności oraz innych funkcji. Takie funkcjonalne pochodne można otrzymać konwencjonalną metodą mutagenezy sterowanej lub przy pomocy innych standardowych technik.
Wektor definiuje się jako DNA, który może przenosić i utrzymywać fragment DNA, w tym np. fagi i plazmidy. Terminy te są zrozumiałe dla specjalistów z dziedziny inżynierii genetycznej.
168 787
Mikroorganizmem stosowanym w sposobie według wynalazku może być dowolny mikroorganizm z rodzaju metylotroficznych drożdży, który został przekształcony tak, aby zawierał więcej niż jedna kopię kasety ekspresji ecl i ewentualnie jedną lub więcej niż jedną kasetę ekspresji ec2 i/lub, ewentualnie, jedną lub więcej niżjedną kasetę ekspresji ec3, albo co najmniej po jednej kasecie ekspresji dwóch lub więcej różnych typów. Wystarczy, jeżeli kasety ekspresji różnią się jedynie charakterem zakodowanego białka powstającego w wyniku ekspresji i zwykle zawierają następujące składniki:
a) Regulon R czuły na metanol i/lub usunięcie źródeł węgla powodujących represję kataboliczną. Termin regulon w znaczeniu używanym w tym opisie obejmuje dowolne DNA działające w pozycji cis, biorąc udział w regulacji ekspresji danego genu strukturalnego. Tak więc, termin ten obejmuje sekwencje poprzedzające daną sekwencję kodującą, na przykład promotor oraz sekwencje rozpoznawane przez czynniki transkrypcyjne lub inne białka biorące udział w regulacji transkrypcji. A więc znaczenie terminu regulon nie ogranicza się do sekwencji odpowiadających znanym promotorom. Obejmuje ono również sekwencje DNA wykazujące taką samą reakcję na metanol jak znane regulony genów-’ indukowanych metanolem, Lo znaczy wszystkie sekwencje równoważne funkcjonalnie.
Ostatnio poznano szereg regulonów wykazujących powyższe właściwości. Na przykład Ledeboer i wsp. (1985) wykryli sekwencję regulatorową DNA poprzedzającą gen strukturalny oksydazy metanolowej u Hansenula polymorpha. W Europejskim Opisie Patentowym nr 85 201 235.0 należącym do Unilever NV, Holandia, ujawniony jest system ekspresji białek obejmujący użycie promotorów regulujących ekspresję oksydazy metanolowej i DHAS in vivo. W Europejskim Opisie Patentowym nr 87 110 417 należącym do Rhein Biotech Gesellschaft f.biotechnologische Prozesse und Produkte mbH NRF, zaproponowano system przydatny do ekspresji obcych białek pod kontrolą promotora dehydrogenazy mrówczanowej (FMD). Ellis i wsp. (1985) ujawnili izolację regulowanych metanolem genów z Pichia pastom. Te i inne promotory otrzymane lub możliwe do otrzymania z genów drożdży metylotroficznych, które są potencjalnie zaangażowane przy wykorzystywaniu metanolu, wszystkie mają tę wspólną cechę, że reagują zarówno na dodatek metanolu i/lub pozbawienia źródła węgla wzmożoną syntezą odpowiedniego regulowanego przez nie genu. Dotyczy to również wszystkich sekwencji DNA wykazujących taką samą reakcję.
b) Ramka odczytu (ORF) kodująca część lub całość białka posiadającego aktywność biologiczną jednego z antygenów powierzchniowych Hepatitis B. Jak wspomniano wcześniej, antygeny powierzchniowe Hepatitis B danego podtypu obejmują zestaw około sześciu różnych białek, różniących się długością i wzorem glikozylacji. Białka te wykazują różne determinanty antygenowe i wydają się również w żywym wirusie pełnić różne funkcje. W celu.wywołania reakcji immunologicznej w stosunku do preS nie jest konieczne wprowadzenie odpowiedniej całkowitej sekwencji preS, ale może wystarczyć wprowadzenie do ramki odczytu tylko kodów kodujących właściwy epitop. Ponadto, do białek posiadających aktywność biologiczną jednego z antygenów powierzchniowych Hepatitis B zaliczamy również białka, w których doszło do zmiany aminokwasów, nie powodującej jednak utraty tejże aktywności biologicznej.
c) Ewentualnie-sekwencjaDNA służącajako terminator T. Jako terminator może być użyta dowolna sekwencja, która wydajnie kończy transkrypcję. Na przykład terminatorami mogą być sekwencje skłonne do tworzenia struktur typu szpilki do włosów i/lub miejsca poliadenylacji w transkrybowanym RNA. W preferowanej wersji mikroorganizmu terminator pochodzi z reagującego na metanol genu tego samego organizmu i/lub z tego samego genu, z którego otrzymano regulon.
Te trzy części składowe ułożone są w funkcjonalny zespół umożliwiający regułonowi regulowanie transkrypcji, terminatorowi - zakończenie transkrypcji znajdującej się między nimi ramki odczytu.
Mikroorganizm stosowany w sposobie według wynalazku posiada tę nieocenioną zaletę, że dzięki obecności więcej niż jednej kopii kasety ekspesji kodującej pierwszy polipeptyd i/lub jednej lub więcej niż jedna kopii każdej z dodatkowych różnych kaset ekspresji, transkrypcja i translacja zakodowanego białka (białek) może zachodzić w znacznie zwiększonych ilościach. Mikroorganizm taki stwarza możliwość otrzymywania w komórce pierwszego i drugiego
168 787 polleżptyOu w dowolnym pożądanym stosunku. Tak więc przy łączeniu się białek w formę złożonych cząstek można otrzymywać cząstki o dowolnym składzie. Ponadto, dzięki wytwarzaniu dużych ilości różnych białek w ścisłym sąsiedztwie, białka te są skłonne bardziej niż w cząstkach znanych dotychezas, do tworzenia struktur zawierających więcej niz jeden rodzaj polil^ept^zOu.
W mikroorganizmach stosowanych w sposobie według wynalazku korzystnie zachodzi ekspresja całego lub części białka S z pierwszej kasety ekspresji (ec 1), gdyż stanowi ono rodzaj strukturalny rusztowania każdej z powstających cząstek. W jednej wersji mikroorganizm zawiera ponadto drugą kasetę ekspresji (ec2), która syntetyzuje polipżptyO reprezentujący całość lub część białka preS 1, na przykład specyficzne domeny preS 1 zlokalizowane przy N-końcu tego białka, albo też całość lub część białka preS2. W kolejnej wersji, mikroorganizm może zawierać trzy różne rodzaje kaset ekspresji umożliwiając w ten sposób jednoczesną ekspresję trzech eollpeptzOów obejmujących całość lub część białka S, całość lub część białka preS 1 i całość lub część białka preS2.
Ponadto, użycie regulonów pochodzących z drożdży metylotroflceyzch umożliwia represję, Oerepresję lub indukcję hodowli komórkowej przez dodanie lub usunięcie jakiegoś źródła węgla lub przez dodanie dostępnego po niskiej cenie metanolu.
Grupa metylotroficzyych drożdży obejmuje następujące rodzaje: Cwndidw, Swcchwrpmyeżć, Rhodoiorula, Pichiw, a korzystnie Hansen^a. Korzystnie, mikroorganizm stosowany w sposobie według wynalazku pochodzi z CwnOidw boidini, Pichiwpastoris lub Hansen^a po/zmorehw. Te rodzaje drożdży są dobrze znane specjalistom z tej dziedziny i ogólne zasady ich hodowli oraz warunki wzrostu są ustalone.
Użytecznym szczepem korzystnych mztylotrofleznych drożdży Hwyćżyu/w może być Ss:cezp z gatunku Hansen^a eolzmorehw. W najkorzystniejszej wersji szczep nadający się do użycia ma cechy identyfikacyjne Hans^^ulw po/zmoreha Rb 10 (DSM 5215). Szczep RB 10 jest mutantem urw3 Hansen^a eolzmoφhw ATCC 34438.
W korzystnej wersji mikroorganizm stosowany w sposobie według wynalazku jest zdolny 0o wydajnego wykorzystywania gliceryny jako źródła węgla. Gliceryn a jest źródłem węgla nie powodującym represji katαholiczyej, które jest przez znane drożdże metylotrofieeye erz.zksetałcane w energię z różną wydajnością. Gatunki drożdży z rodzaju Hansn/rwla mogą metabolizować glicerynę z dużą wydajnością podczas gdy S.eżrżvlći'wż źle rosną na tym źródle węgla. W dodatku, przy wzroście Hαysżnu/w eolymorehw na glicerynie powstają, jako produkt uboczny, tylko niewielkie ilości etanolu, co w innych przypadkach stwarza problemy przy fermentacji na dużą skalę.
Najlepiej jest, jeśli regulony stosowane w kasetach ekspresji mniejszego wynalazku pochodzą z dobrze znanych wyżej wymienionych rodzajów drożdży. Lepiej też, jeśli są to regulony już szczegółowo schrakteryzowaye, tak jak region regulacyjny różnych genów reagujących na metanol w Hαyćeyu/w eolzmorphw, np. gen oksydazy metanolowej, gen FMD, gen DAS lub gen katalwzy. Regiony regulacyjne tych genów zostały już zszkweycjonowayz i ich sekwencje opublikowane (np. Jayowiez i wsp., 1985; Le0ehozr i wsp., 1985, Europejski Patent 87 110 417). Techniczna procedura izolacji tych regulonów z właściwych mikroorganizmów jest ułatwiona, ponieważ znane są odpowiednie sekwencje DNA oraz ich wzory restrykcyjne.
Terminatorem może być każda sekwencja, która wydajnie służy 0o zakończenia transkrypcji powstającego mRNA, bez względu na to czy pochodzi z genu eukariotycznego czy tez prokariotyżeyego. Preferowane terminatory pochodzą z genów drożdżowych. Najbardziej wskazane jest zastosowanie sekO''eyeJi termiyαcyjyzeh otrzymanych z wymienionych wyżej genów reagujących na metanol.
Inną zaletą mikroorganizmu stosowanego w sposobie według wynalazku jest możliwość wprowadzenia do indywidualnej komórki gospodarza zadziwiająco dużej liczby kaset ekspresji oraz ich trwałego utrzymania. W zasadzie istnieją dwie możliwości utrwalenia specyficznej informacji genetycznej:
Informacja ta jest albo zakodowana w chromosomach albo tez zlokalizowana w autonomicznie replikującym wektorze, którym może być plazmid, kosmid, wirus itp. Zazwyczaj większe dawki genów uzyskuje się poprzez transformację wskazanego organizmu gospodarza
168 787 przy użyciu dużej ilości kopii autonomicznie replikujących plazmidów lub lizogennych wirusów. Takie plazmidy i wirusy sąjuż dobrze poznane i zawierają zwykle replikon oraz selekcyjny gen markerowy umożliwiające replikację oraz trwałe utrzymywanie wektora. Jednakże wirusy często ulegają konwersji do cykli litycznych a plazmidy w pewnych warunkach mogą ulegać utracie, a co więcej często wymagają nieustannej presji selekcyjnej.
Ponadto, nawet przy wysokiej ilości kopii plazmidów, w drożdżach nie można otrzymać więcej niż około 50-70 kopii. Z drugiej strony wprowadzenie pożądanej informacji genetycznej, np. kasety ekspresji, do genomu gospodarza zwykle wymaga istnienia pewnego stopnia homologii pomiędzy miejscem insercji, a co najmniej częścią wprowadzanej sekwencji DNA, najlepiej przy końcach tejże cząsteczki. A więc liczba potencjalnych miejsc integracji dla homologicznej rekombinacji danej cząsteczki jest ograniczona, w większości przypadków tylko jedna. Liczba ta jest nieco większa dla rekombinacji homologicznej z genami już obecnymi w wielu kopiach lub też ze strukturami typu transpozonów takich jak Ty (Jacobs i wsp. 1988). W celu ułatwienia takiej rekombinacji lepiej jest używać wektorów pozbawionych replikonów ale niosących selekcyjny gen markerowy. Gen taki nadaje transformowanym komórkom widoczną cechę fenotypową i pozwala na ich identyfikację w warunkach selekcyjnych. Rekombinacja losowa jest zjawiskiem rzadko spotykanym. Jednakże, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, możliwejest wprowadzenie licznych kopii dowolnej danej sekwencci DNA do jednego lub więcej chromosomów genomu poprzez insercję na zasadzie rekombinacji losowej. W celu otrzymania transformantów zawierających nawet około setki kopii pożądanej ste-kwiencji DNA lepiej jest stosować autonomicznie replikujące plazmidy. Mogą one, w wyniku jednoczesnych zjawisk integracji niektórych kopii oraz replikowania innych, dostarczyć dużą pulę podlegających integracji kopii, które zostają włączone w czasie kolejnych cyklów komórkowych. Niespodziewanie, umożliwiło to otrzymanie metylotroficznych szczepów drożdży zawierających wiele kaset ekspresji. Preferowane szczepy drożdży, takie jak szczepy z rodzaju Hansernda zawierają około 2-500, korzystnie 15-300, a szczególnie korzystnie 20-150 kopii pożądanej sekwencji DNA. Po uzyskaniu wymaganej liczby zintegrowanych kaset ekspresji dalszym procesom integracyjnym można zapobiec stosując cykle wzrostu w środowisku nieselekcyjnym, tak aby pozostałe kopie plazmidu uległy ekspresji.
Szczególną cechą mikroorganizmu stosowanego w sposobie według wynalazku jest zjawisko integracji multimerycznej. Stwierdzono, że po transfo^^^ma^rji wektorem zdolnym do autonomicznej replikacji w Hansenula polymorpha plazmid ten integrował się w kilku powtórzeniach. Niniejsi wynalazcy obserwowali ilość powtórzeń wynoszącą do około 100 kopii wprowadzonego plazmidu. Umożliwia to obecność i integrację dużej liczby kopii obcych DNA bez ryzyka uszkodzenia komórki wprowadzeniem insercji do wewnątrz istotnego dla niej genu. Wykazano również, że, nieoczekiwanie, te integranty zawierające multimeryczne DNA są stabilne.
W celu opracowania szczepionek zawierających cząstki złożone pożądanejest utrzymanie w cząstkach stałego stosunku różnych polipeptydów. Sposób według wynalazku pozwala na wytworzenie takich cząstek dzięki zastosowaniu mikroorganizmów o dobrym stosunku różnych kaset ekspresji. Na przykład, mikroorganizm stosowany w sposobie według wynalazku może zawierać 1 do 100 kopii kaset ekspresji (ecl) kodującej całość lub część białka posiadającego aktywność biologiczną białka S orazjedną lub kilka ko^^i kasety ekspresji (ec2) kodującej białko posiadające aktywność biologiczną białka preS2 lub białka preS1. Korzystne mikroorganizmy charakteryzują się stosunkiem kaset ekspresji w granicach 2-30 kopii ecl do 1 kopii ec2, a zwłaszcza 5-10 kopii ecl do 1 kopii ec2 lub 6-8 ecl do 1 kopii ec2. Trzecią kasetę ekspresji można wprowadzić w tym samym stosunku jak ec2, czyli 6-8 kopii eel do 1 kopii ec3.
Oprócz szczepów zawierających zintegrowane kopie kaset ekspresji, można też stosować mikroorganizmy zawierające autonomicznie replikujące sekwencje (ARS) oraz określoną kasetę ekspresji. Występowanie i utrzymywanie się takich wektorów zawierających ARS jest znane.
Korzystnie regulon jak i terminator pochodzą z metylotroficznych drożdży wybranych z rodzajów: Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, To^ulopsis, Pichia, i /7a«.se'nz.d«. Najkorzystniej regulon i terminator pochodzą z genu biorącego udział w metabolizmie metanolu
168 787 jak na przykład genu MOX, genu FMD, genu DAS lub genu katalazy. Mikroorganizmem polecanym jako źródło tych genów jest Hansenula pn/y/morpha.
Cząsteczka, która wchodzi w skład wektora transformującego drożdże może składać sie z fragmentów otrzymanych z odpowiednich źródeł naturalnych. DNA kodujące każdy z antygenów powierzchniowych Hepatitis B można wyizolować z DNA całych wirusów, zwanych również cząstkami Dane’a. Izolowanie, klonowanie i sekwencjonowanie DNA z wirionów HBV są opisane przez Chamay i wsp. 1979; Galibert i wsp. (1979); Sninsky i wsp. (1979); Valenzuela i wsp., (1979).
Dobór enzymów restrykcyjnych do klonowania i manipulacji DNA zależy od podtypu użytego wirusa Hepatitis. Podtypy te różnią się nie tylko długością łańcucha, ale także mają właściwe sobie wzorce restrykcyjne, które podlegają normalnym zjawiskom mutacji. Każdy specjalista z tej dziedziny jest w stanie zidentyfikować fragment restrykcyjny zawierający pożądany region kodujący, na przykład poprzez pocięcie wyizolowanego dNa przy użyciu różnych endonukleaz restrykcyjnych, poddanie próbek elektroforezie w żelu i przeniesienie na bibułę (Southern blotting), lub też równocennych metod. Identyfikacji danego fragmentu restrykcyjnego dokonuje się przy użyciu sondy molekularnej odpowiadającej znanej sekwencji antygenu powierzchniowego. W razie potrzeby to DNA można zsekwencjonować i poddać dalszej obróbce, na przykład trawieniu endonukleazami, mutagenezie in viiro, można uzupełnić lepkie końce lub zastosować inne znane techniki w celu utworzenia fragmentu o pożądanej długości, zawierającego pożądaną sekwencję i mającego właściwe zakończenia. Jak wiadomo specjalistom, zakończenia łańcucha mogą być modyfikowane kilkoma metodami tak aby posiadały wymaganą sekwencję; mogą być przycinane egzonukleazami, uzupełniane przy użyciu fragmentu Klenow’a polimerazy dNa I, można też dodawać lub podstawiać DNA stosując syntetyczne oligonukleotydy jako łączniki lub adaptory.
Z kolei sekwencja DNA kodująca odpowiedni antygen Hepatitis B może być połączona z odpowiednim regulonem i/lub terminatorem otrzymanymi z genomu drożdży metylotroficznych przy użyciu znanych metod. Dane fragmenty są odpowiednio przystosowane tak, aby znalazły się we właściwej pozycji względem kodonu inicjacji translacji i kodonu terminacji translacji kodującej sekwencji DNA. Ligację również przeprowadza się zgodnie ze znanymi procedurami. Ponieważ metody te są powszechnie znane więc nie wymagają dodatkowego omówienia. Szczegółowy opis technik stosowanych przy klonowaniu molekularnym można znaleźć w podręczniku Maniatis’a i wsp. Molecular Cloning 1982.
Zamiast ligacji sekwencji DNA pochodzących wyłącznie z odpowiednich źródeł naturalnych, możliwe jest stosowanie syntezy chemicznej w celu zsyntetyzowania części lub całości określonej kasety ekspresji. Syntezę chemiczną przeprowadza się zgodnie ze znanymi procedurami. Chemiczna synteza długich dezoksyribonukleotydów jest już oferowana na zasadach handlowych. Ponadto, z punktu widzenia niniejszego wynalazku, dowolna kombinacja fragmentów syntetyzowanych chemicznie oraz fragmentów otrzymanych z odpowiednich źródeł naturalnych może być właściwa.
W celu ułatwienia konstrukcji, amplifikacji i wprowadzenia kasety ekspre.sji do mikroorganizmu-gospodarza zaleca się wstawienie jej do wektora nadającego się do transformacji drożdży metylotroficznych. Wektorem takim może być plazmid - liniowy lub kolisty, albo też wirus. Można zastosować tak zwane wektory integracyjne, tzn. wektory nie posiadające żadnej autonomicznie replikującej sekwencji (ARS). Jeśli wektory takie nie zostaną zintegrowane, to podczas kolejnych cyklów komórkowych zostaną utracone.
W jednej z korzystnych wersji wektor ten zawiera również sekwencje ARS zdolne do autonomicznej replikacji. Wskazanym jest, aby sekwencje te pochodziły od odpowiedniego mikroorganizmu gospodarza. Dla metylotroficznych drożdży istnieje kilka opisanych typu ARS, na przykład sekwencje HARS i PARS (Roggenkamp i wsp., 1986, Cregg i wsp. 1985). Sekwencje te obejmują taki region DNA, którego działanie polega na stabilnym utrzymaniu wektora w komórce gospodarza, jako jednostki pozachromosomalnej.
W celu ułatwienia identyfikacji transformowanych organizmów gospodarza zaleca się wprowadzenie selekcyjnych genów markerowych przydatnych do selekcji pożądanego mikroorganizmu po transformacji. W znanych plazmidach drożdżowych takie selekcyjne geny m.ar168 787 kerowe często odpowiadają sekwencjom kodującym enzymy biorące udział w metabolizmie takich aminokwasów lub kwasów nukleinowych, które nie występują w organizmie gospodarza-biorcy mającym ulec transformacji.
Taką samą stir^iicugię można zastosować do selekcji transformowanych drożdży metylotroficznych. Do genów zwykle używanych przy selekcji auksotroficznych szczepów Saccharomyces cerenzsiae należą geny LEU2, HIS3, TRP5, ARG4 i URA3. Geny otrzymane z Sacchar^om^yces cerew’s'zae można również stosować jako markery selekcyjne do transformacji drożdży metylotroficznych, jednakże wzrost takich transformantów na pożywce minimalnej może być poważnie zakłócony. Zatem, w preferowanej wersji niniejszego wynalazku, szczepy drożdży metylotroficznych pozbawione funkcji dowolnego genu biorącego udział w normalnym metabolizmie, są transformowane przy pomocy cząsteczki DNA zawierającej homologiczny gen markerowy typu dzikiego. Niniejsi wynalazcy są pierwszymi, którzy otrzymali homologiczny gen markerowy, a mianowicie gen URA3, przydatny do selekcji transformantów Hansenula poZymorpha. Charakterystyka tego genu, tzn. jego mapa restrykcyjna, jest omówiona powyżej. Alternatywnie, do selekcji transformantów można uzyć genów odporności na antybiotyki. Jest to podejście dobize znane w przypadku transformacji bakterii i może byc zastosowane do
S.cerevAiae (Jimenez i Davis, 1980).
Jednakże, jak dotąd nic nie wiadomo o zachowaniu się drożdży metylotroficznych przy ich kontakcie z antybiotykami takimi jak chloramfenikol lub gentamycyna G-418. Autorzy niniejszego wynalazku są pierwsi, którzy wykazali możliwość selekcji transformowanych drożdży metylotroficznych poddając je działaniu, po transformacji, selekcyjnych stężeń antybiotyków aminoglikozydowych. Nieoczekiwanie okazało się, że fosfotransferaza aminoglikozydowa pochodząca z Tn5 (Grindley, 1980) może być również aktywna w drożdżach metylotrofieżnych, jeśli podlega regulacji promotorem otrzymanym z drożdży piekarniczych. Inaktywacja G-418 zachodzi również skutecznie w szczepach zawierających tylko jedną lub dwie kopie tego genu w komórce, tzn. gen nie musi występować w dużej ilości kopii. Taki system transformaeyjno-selekcyjny jest u drożdży metylotrofieznych bardzo wydajny.
W najbardziej korzystnej wersji wektor wybrany jest z grupy wektorów: pMS2, pFS-9, pRB-S, pRB-S-269, pRB-S-271, pRB-S-322, pRB-S-326, pMPS22, pMPS21, pMPS9. Konstrukcja i zastosowanie tych wektorów będą opisane bardziej szczegółowo poniżej.
Proces wytwarzania opisanego wyżej mikroorganizmu, polega na tym, że metylotroficżne drożdże jako organizm gospodarza transformuje się wektorem zawierającym kasety ekspresji ec l i/lub ec2, i/lub ec3, przy czym po replikacji wektora, co najmniej część z tych kaset ekspresji zostaje zintegrowana na drodze rekombinacji z chromosomem gospodarza, korzystnie w formie multimerycznych powtórzeń. W rezultacie taki transformowany organizm metylotroficzny może zawierać szereg kopii każdej z wprowadzonych kaset ekspresji, rozproszonych po całym genomie. Istnieje jednak duże prawdopodobieństwo, że multimeryczne powtórzenia kaset ekspresji będą zlokalizowane w jednym miejscu genomu. Wykazano, ze ten typ rekombinacji zachodzi głównie u Hansenula. Jednakże, drożdżowy metylotroficżny organizm gospodarza może być wybrany z dowolnego innego gatunku z pośród metylotrofieznyeh rodzajów drożdży, na przykład: Candida, K/oeckera, Sacchar^omyces, Rhodotorula, Torulopsis czy Pichia.
W najkorzystniejszym rozwiązaniu organizm gospodarza pochodzi z gatunku Hansenula poz^ymorpha, którego przykładem jest szczep posiadający identyfikacyjne cechy Hansenula po/ymorpha RB 10. Hansenula po^wo^ha RB 10 został zdeponowany w Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen 17 lutego 1989 r. pod numerem DSM5215
Podczas gdy, zgodnie z niniejszym wynalazku, wskazane jest przeprowadzenie transformacji przy zastosowaniu jednego z wyżej opisanych wektorów, to oczywistym jest, że inne wektory mogą być również konstruowane i stosowane.
Najbardziej dogodnym sposobem otrzymywania organizmów zawierających więcej niż jedną kopię kasety ekspresji ecl i, ewentualnie, jedną lub więcej niż jedną kopię drugiej kasety ekspesji (ec2), jest niżej opisany, obejmujący szereg etapów, proces. Zgodnie z tym procesem metylotrofieżny organizm gospodarza:
a) transformuje się przy pomocy pierwszego wektora i początkowo hoduje na pożywce ^di^lki^^^jnej, a następnie inkubuje przez kilka generacji w warunkach nieselekcyjnych,
168 787
b) wyselekcjonowuje się mitotyczme stabilne transformanty zawierające więcej niż jedną kasetę ekspresji ecl kodującą pierwszy polipeptyd, c) transformanty te, ewentualnie, pozbawia się pozostałych autonomicznie replikujących plazmidów, d) powyższe transformanty ewentualnie transformuje się drugim wektorem i ponownie, początkowo, hoduje się je na pożywce selekcyjnej, a następnie inkubuje w warunkach nieselekcyjnych przez kilka generacji, e) wyselekcjonowuje się mitotycznie stabilne transformanty zawierające więcej niżjedną kasetę ekspresji (ec 1) kodującą pierwszy polipeptyd i, ewentualnie, jedną lub więcej niż jedną kasetę ekspresji (ec2) kodującą drugi polipeptyd, f) otrzymane transformanty ewentualnie pozbawia się pozostałych autonomicznie replikujących plazmidów; etapy d) do f) mogą być ewentualnie powtórzone przy użyciu trzeciego wektora.
Przy zastosowaniu tej procedury możliwe jest zwiększenie ilości kaset ekspresji jednego typu, na przykład ec1, poddając komórki kilku kolejnym cyklom transformacji, hodowli w selekcyjnych-nieselekcyjnych warunkach, selekcji transformantów i ewentualnie usuwaniu wolnych plazmidów. Alternatywnie, można wprowadzić dwa lub więcej typów kaset ekspresji stosując jeden typ wektora zawierającego dwie lub więcej różnych kaset ekspresji, albo też poddając komorki wyżej opisanym cyklom, w których transformację przeprowadza się przy użyciu różnych wektorów zawierających różne kasety ekspresji. Proces ten oferuje więc szereg możliwości otrzymywania pożądanego mikroorganizmu.
Cząstka kompozytowa wytwarzana sposobem według wynalazku zawiera co najmniej dwa polipeptydy odpowiadające całości lub części białka wykazującego aktywność biologiczną jednego z powierzchniowych antygenów hepatitis B, przy czym cząstki te przedstawiają co najmniej dwie antygenowe detenminanty zapewniane przez białko S, białko preS2 lub białko preS1, a ponadto cząstki te zawierają ewentualnie rodzime specyficzne lipidy. W zasadzie w skład cząstek wchodzi przede wszystkim białko wykazujące charakterystykę antygenową białka S, które stanowi również około 80-90%? występujących w naturze cząstek o średnicy 20 nm. Cząstki kompozytowe mogą ponadto zawierać jakiekolwiek białko wykazujące antygenowość domen właściwych dla białka preS1, to znaczy peptydy odpowiadające co najmniej części N-końcowych 108 (lub 119) aminokwasów białka preS1, albo/i jakiekolwiek wykazujące antygenowość domen właściwych dla białka preS2, to znaczy peptydy odpowiadające co najmniej części 55 aminokwasów domeny właściwej dlapreS2.
Obecność dwóch lub więcej różnych białek wykazujących aktywność biologiczną powierzchniowych antygenów hepatitis B w jednej cząstce stwarza nowe podejście do wytwarzania szczepionki przeciw hepatitis B, pochodzenia drożdżowego. Cząstki lub agregaty pochodzenia drożdżowego otrzymywane do tej pory zawierają wyłącznie albo białko S, albo białko preS2 albo białko preS1, to znaczy jedno z trzech możliwych białek. Jakkolwiek Valenzuela i inni (1985) oraz Itoh i inni (1986) wykazali, że białko preS2 łączy się w cząstki, to, jak doniesiono, białko preS 1 tworzy albo mieszaninę drobnych cząstek (o średnicy 2 lub 3 nm), albo polidy spersyjną populację dużych agregatów, o średnicy 15-:50 nm (Kniskern i inni, 1988; Imamura i inni, 1987).
Rutgers i inni (1988) donieśli, że na cząstkach lub agregatach białka preS2 i białka preS1 epitopy kodujące białko S są zamaskowane, tak że cząstki te wykazują mniejszą reaktywność w próbie AUSRIA. Może to mieć niekorzystny wpływ na reakcję odpornościową w odniesieniu do białka S, gdy cząstki złożone z jednorodnego białka preS wykorzystuje się jako immunogeny w celu wytworzenia szczepionek.
Wynalazek dostarcza po raz pierwszy cząstek kompozytowych zawierających więcej niż jeden rodzaj powierzchniowego antygenu hepatitis B. Przez analogię z cząstkami zawierającymi tylko jedno białko, wytworzonymi w S.cerevisiae, cząstki wytworzone sposobem według wynalazku zazwyczaj zawierają także rodzime specyficzne lipidy.
Zgodnie z korzystnym rozwiązaniem cząstki kompozytowe wytworzone sposobem według wynalazku zawierają ponad 1% białka preS1, przy czym, resztę białka stanowi białko S oraz ewentualnie pewna ilość białka preS2. Korzystnie jednak cząstki zawierają 1-50/^, a zwłaszcza 1-12151% białka preS 1, a resztę jak wyżej. Zgodnie ze szczególnie korzystnymi rozwiązaniami stosunek białka preS 1 do białka S wynosi od 1:1 do 1: 100, korzystnie 1 :2, 1:8 lub 1:15.
168 787
Cząstkami wytwarzane sposobem według wynalazku są przynajmniej częściowo glikozylowane. Część białek preS 1 w drożdżach met^lot^<^:fizycznych jest glikozylowa, na co wskazuje wykrycie pasm o masach cząsteczkowych 45 kD, 38 kD i 39 kD. Dla specjalistów oczywiście jest, że ilość i wielkość postaci białka preS! wykryta na podstawie immunoblottingu może wykazywać pewne oczywiste wahania. Wykrycie pasm 45, 38 i 39kD będzie zależało między innymi od ich rozdzielczości w czasie elektroforezy na żelu poliakryloamidowym, oddziaływania z innymi białkami drożdżowymi oraz wahaniami w skuteczności procedur stosowanych w immunoblottingu. Ponadto wybrany sposób preparowania ekstraktów surowych komórek oraz konkretny skład buforu wykorzystywanego w ekstrakcji może również wpłynąć na wykrycie konkretnych pasm. Względne proporcje trzech postaci również ulegają wahaniom w zależności od warunków hodowli. Zatem szacunki mas cząsteczkowych zależą od zmiennych doświadczalnych, a także od wzorów stosowanych do kalibracji. Nie zaobserwowano glikozylowania białka S.
Kompozytowe cząstki opisane powyżej dogodnie wytwarza się prowadząc hodowlę szczepu drożdży metylotroficznych wytworzonych jak opisano powyżej w odpowiednim ośrodku hodowli. Stosując regulowany układ ekspresji regulować można syntezę składników cząstek tak, aby uniknąć ekspresji zakłócającej wzrost komórek. I tak przy dowolnej pożądanej gęstości komórek synteza białka kontrolowana regulonem metanolowym, może ulec depresji, co umożliwi ekspresję białka heterologicznego. W wyniku skoordynowanej ekspresji różnych typów powierzchniowych antygenów Hepatitis B w bliskim sąsiedztwie, następuje tworzenie się cząstek. Cząstki te można wydzielić z hodowli znanymi sposobami, np. na drodze izopiknicznego wirowania, chromatograficznie oraz innymi znanymi sposobami.
Ten sam sposób można również zastosować w celu uzyskania cząstek lub agregatów zawierającychjedyme jeden rodzaj powierzchniowego antygenu, jeśli zastosuje się odpowiednie szczepy.
Zgodnie z korzystnym rozwiązaniem synteza białka kierowana przez kasetę ekspresji rozpoczyna się przy wyczerpywaniu się represyjnych źródeł węgla. W komórkach poddanych uprzednio represji katabolicznej ekspresja rozpoczyna się przy rozcieńczaniu środka re^pre^s^nującego. Działanie derepresyjne można dodatkowo zwiększyć dodając metanol, co wywołuje indukcję regułonu wrażliwego na metanol. Dodatek metanolu powoduje nawet 10-krotne zwiększenie białka heterologicznego.
Zgodnie z korzystnym rozwiązaniem ośrodek hodowli zawiera glicerynę jako źródło węgla. Gliceryna stanowi źródło węgla wywierającego minimalne katabolitowe działanie represjonujące. Stężenia gliceryny do około 0,3% nie powodują represji. Z tego względu przy stosowaniu ośrodka hodowli zawierającego glicerynę nie ma potrzeby całkowitego usuwania tego źródła węgla przed dodaniem (ewentualnym) metanolu.
Według wynalazku fermentację szczepów drożdży metylotroficznych prowadzi się w temperaturze 30-40oC w ośrodku przy pH 3-7, korzystnie 4-6. Przykłady ośrodków podano poniżej.
Kompozytowa cząstka opisana powyżej, wytworzona sposobem według wynalazku służy do wytwarzania szczepionki przeciw wirusowi Hepatitis B.
Szczepionka może zawierać dodatkowe substancje, np. sole, stabilizatory, środki pomocnicze i/lub inne fizjologicznie dopuszczalne dodatki. Szczepionka zawierająca kompozytowe cząstki powoduje powstawanie przeciwciał skierowanych przeciw co najmniej dwóm spośród możliwych determinat powierzchniowych antygenów Hepatitis B. Ze względu na obecność domen preSł-speeyficznych i pre^-ssiecyficznych nawet osobnicy, którzy nie reagują na dostępne szczepionki, mogą być chronieni przed infekcją Hepatitis B. W zasadzie szczepionka zawierająca cząstkę wytworzoną sposobem według wynalazku wywołuje szerszą reakcję immunologiczną niż znane szczepionki, a ponadto może być wytwarzana taniej ze względu na dużą ilość ekspresji przypadających na komórkę oraz dużą gęstość komórek.
Stwierdzono, że wynalazek znajduje również zastosowanie przy opracowaniu zestawu do badań. Stosując kompozycję zawierającą kompozytowe cząstki wytworzone sposobem według wynalazku można śledzić powstawanie kompleksów immunologicznych utworzonych między przeciwciałami zarażonego osobnika i tymi cząstkami. Zestaw do badań wymaga ponadto
168 787 stosowania środka wykrywającego, np. kozich/ przeciw-łudzkich przeciwciał IgG, znaczonych dowolnym znanym sposobem. Przeciwciało, które może oczywiście pochodzić od dowolnego innpsn ssaka może być np. sprzężone z enzymem lub może bvć znaczone radioaktywnie. abv —7------ - y - - χ A u 4 umożliwić detekcję. Zaletą-zestawu do badań reagującego na przeciwciała przeciw specyficznym domenom preS1 i preS2 jest możliwość wczesnego wykrycia infekcji HBV, gdyż przeciwciała anty-preS1 i antv-PrcS2 pojawiają się przed przeciwciałami anty-S przy infekcji HBV u ludzi (Petit i inni, 1986). W związku z tym zestaw do badań zawierający cząstki wytworzone sposobem według wynalazku stanowi dogodny środek do wczesnego wykrywania tej silnie zakaźnej choroby.
Jest zrozumiałe, że wszystkie opisane szczepionki podawać można w odpowiedni sposób, np. podskórnie, dożylnie lub domięśniowo. Ilość immunogenu w każdej dawce szczepionki dobiera nadzorujący lekarz, biorąc pod uwagę wiek pacjenta, jego wagę, płeć, ogólny stan fizyczny itp. Ilość wywołująca reakcję odpornościową u pacjenta bez widocznych niekorzystnych efektów ubocznych może zmieniać się w zależności od stosowanego immunogenu oraz ewentualnej obecności dodatków. Zazwyczaj oczekuje się, że każda dawka powinna- zawierać
1-1000 J.g białka, a korzystnie 1-200 pg. Dawki początkowe można ewentualnie zwiększyć w razie potrzeby.
Sposób leczenia lub zapobiegania infekcji Hepatitis B u ludzi polega na podawaniu pacjentowi wymagającemu tego wywołującej ochronę dawki szczepionki według wynalazku.
Wynalazek ilustrują następujące przykłady i rysunki.
Figura. 1: Konstrukcja plazmidu pME4 z pHARS 1. Fragment HARS 1 został przeniesiony do pojedynczego miejsca PvuII poprzedniego pHARS 1, przy czym sekwencje między poprzednią pozycją HARS i genem β-laktamazy, a także sam koniec 5’ genu β-laktamazy, zostały wycięte.
Figura. 2: Schematyczne przedstawienie fagów X zawierających fragmenty genomowego DNA Hansenula polymorpha, obejmujące a) gen MOX oraz b) gen FMD.
Figura. 3: Mapa plazmidu pT-24. Plazmid ten zawiera fragment DNA obejmujący terminator genu MOX klonowy w miejscu Smal pUC19.
Figura. 4: Mapy plazmidów pRB-S-269 i pRB-S-271 wytwarzających w wyniku ekspresji S-gen pod kontrolą odpowiednio promotora MOX i FMD.
Figura. 5: Mapy plazmidów pBC, pMS-2, pFS-9. Ostatnie 2 plazmidy pochodzą z pBC zawierającego gen URA3 Hansenula polymorpha i powstały w wyniku insercji kaset ekspresji zawierających promotor MOX (pMS-2) lub promotor FMD (pFS-9) do sekwencji kodującej gen URA3.
Figura. 6: Mapa plazmidu pHK2. Plazmid ten zawiera gen kanamycyny (pochodzący z Tn5) pod kontrolą promotora ADH1 z Saccharomyces cerevisiae. Plazmid pHK2 dodatkowo zawiera również sekwencję HARS1.
Figura. 7: Mapy plazmidów pRB-S-322 i pRB-S-326. Jednostka funkcyjna zawierająca gen odporności na kanamycynę oraz promotor ADH1, występujące w plazmidzie pHK, zostały wstawione do regionów HARS plazmidów pRB-S-269 i pRB-S-271.
Figura. 8: Konstrukcja pMPS-22 z pMOX-P/Tl. Gen preS wirusa Hepatitis B został wstawiony w miejsce EcoRI plazmidu pMOX-P/T 1. W uzyskanym plazmidzie pMPS-22 gen preS jest regulowany przez promotor MOX.
l plazmidu pNFPS -9. W celu konstrukcji tego plaz^rndu wykonano insercję kasety ekspresji preS z pMPS-22 między miejsca Xhol i Stul fragmentu Hansenula wyjściowego plazmidu pBC.
Figura. 10: Mapa genu URA3 Hansenula polymorpha wraz z sąsiednimi regionami DNA. Figura. 11: Diagram ilustrujący budowę plazmidu pMPT121, do którego można wstawić obce sekwencje genowe pod kontrolą promotora MOX.
Figura. 12: Diagram ilustrujący budowę plazmidu pKL*l, zawierającego kasety ekspresji białka L* pod kontrolą promotora MOX.
Figura 13: Schematyczny diagram przedstawiający etapy konstrukcji plazmidu E. coli kotwiczącego kasetę ekspresji białka L, z wyciętą Gly 13, pRIT 12998.
'U« rrt Ί*·/-. Λ·
Figura. 9: iYLdp<
168 787
Figura. 14: Schematyczny diagram ilustrujący procedurę wytwarzania plazmidu Orożdżowego pRIT12979 zdolnego do ekspresji białka L z wyciętą Glyl3.
Figura. 15:Schematyczny diagram ilustrujący konstrukcję plazmidu pRIT13191 zawierającego sekwencję kodującą białko L. z którego wycięto aminokwasz 53-132 i 146-174. ~ '
Figura. 16: Schematyczny diagram ilustrujący konstrukcję drożdżowego plazmidu ekspresji pRIT13192 i pRIT13193, zawierających kasety ekspresji białek odpowiednio L i Δ GlyL .
Materiały
1. Plazmidy
Plazmidy wspomniane w opisie opisane są w części A poniżej
2. Szczepy drożdży
Hansenula polzmoreCa RB 10 (ura 3) jest mutantem Hansen^a polzmorpha ATCC 34488 uzyskanym w wyniku mutagenezy z wykorzystaniem metanosulfoyiayu etylu (EMS), zasadniczo w sposób opisany przez Roggenkampa i innych (1986).
Eydoyueleazz restrykcyjne, ligazę T4 DNA oraz inne stosowane enzymy otrzymano z Boehringer, Mannheim, Republika Federalna Niemiec lub z Bethesda RzseareC Laboratories, Eggenstein, Republika Federalna Niemiec. Enzymy te stosowano zgodnie z instrukcjami odpowiedniego wytwórcy.
4. Reagenty immunologiczne
a) S1. 1: monoklonalne przeciwciało mysie, specyficzne względem domeny S1 białka preSl (SmithKliye Biologicals, RiKensart, Belgia)
b) S2.1, S2.2 oraz S2.5: monoklonalne przeciwciała mysie specyficzne względem domeny S2 powierzchniowego antygenu ’ Hepat^ B (SmithOne Biologicals, Rixensart, Belgia).
Przeciwciała specyficzne względem domeny S1 i domeny S2 powierzchniowego antygenu Hepatitis B określane są jako przeciwciała preS.
c) RF6: monoklonalne przeciwciało mysie specyficzne względem domeny S powierzchniowego antygenu Hepatitis B (^Thomas, Royal Free Hospital, Londyn)
d) RF1: monoklonalnz przeciwciało mysie specyficzne względem konformacyjnie uzależnionego epitopu zlokalizowanego w regionie S (H.Thomas, Royal Free Hospital, Londyn).
< e) HBS1: monoklonalnz przeciwciało mysie skierowane przeciw zpltppowl odpornemu na denaturację i redukcję, pochoOeączmu z plazmowego HBSAg, zlokalizowanemu w regionie S (SmithKline Biologicals, RiKensart, Belgia). To moyokloyalyz przeciwciało stosowano w eksperymentach zamiennie z Mab RF6.
Przeciwciała a), b) oraz z) otrzymano zgodnie ze standardowymi procedurami dokonując fuzji mysich komórek śledsioyz, z komórkami mzż]oma. Opis metody znajduje się w pracy Kohlera i Milsteina. 1975. Metody ujawnione są ponadto w książce Godinga, Moyoclonal Aytibodizs; Principles and Praetlcż. Aeademic Press, Londyn 1983.
f) AUSRlA (Ahbott Laboratories, WizsbaOey-Delkenhżim. Republika Federalna Niemiec,i . LoUvain-La-Neuve. Belgia): handlowy zestaw zawierający pollkolonalye erzżciwclała skierowane przeciw rodzimym epitopom konformaezJyzm.
g) AUSZYME (Δbhott Laboratories, Wiesbaden-Republika Federalna Niemiec oraz Louvain-La-Vzuve, Belgia): handlowy zestaw zawierający monoklonalye przeciwciała skierowane przeciw rodzimemu z^itoepwi koyformaezjyemu.
Przeciwciała wymienione w punktach f) i g) są dostępne w handlu. Nie reagują one z monomerzczyzm powierzchniowym antygenem Hepatitis B.
h) AUSAB (Ahbott Laboratories, Louvam-La-Neuve. Belgia): handlowy zestaw do wykrywania przeciwciał anty-IlBsAg.
5. Ośrodki
Pepton 190, ekstrakt drożdżowy, kwasy Casamino oraz bazę drozdżowo-azotową, stosowane do przygotowywania ośrodków, otrzymano z Gibco Ltd., Paisley, Wielka Brytania.
168 787
W celu przygotowania płytek agarowych do odpowiedniego ośrodka dodawano przed autoklawowaniem 18 g/dm’ agaru (Gibco Ltd.).
a) SMR: Średnio bogaty ośrodek nieselektywny
Składnik Dość, g/dm3
Pepton 2
Ekstrakt drożdżowy 1
Kasy Casamino (Pepton 5) 3
Baza drozdżowo-azotowa, bez (NH4)2SO4 1,4 (NH4)2S^4 5
Źródła węgla: glikoza 20 albo gliceryna 20 albo metanol 10
SMR zawierający metanol określany jest również jako Met-SMR
b) YNB: Ośrodek selektywny
Baza drożdżowo-azotowa bez (NHabSCL 1,4 g/dm3 (Gibco lub Difco) (NH4)2SO4 5 g/dm’
Źródła węgla: glikoza 20 g/dm3 albo gliceryna 20 g/dm3 albo metanol 10 g/dm3
c) YEPD: Nieselektywny, bogaty ośrodek
Ekstrakt drożdżowy 10 g/dm?
Pepton 190 20 g/dm?'
Glikoza 20 g/dm3
W razie potrzeby dodawano gentamycynę G418 w ilości 1 mg/ml ośrodka
d) Ośrodek S
Składnik Ilość w 1 dm3 (NH4)2S04 5 g
KH2PO4 4 g
MgS04-7H20 2 g
NaCl 0,1 g
CaCl-2H20 0,4 g
Monochlorowodorek L-histydyny 10 mg
LD-metionina 9 mg
LD-tryptofan 9 mg
H3BO3 2 mg
CuS04 -5H20 0,16 mg
KJ 0,4 mg
FeCb -6H20 0,8 mg
MnSO4 H20 1,6 mg
Na2MoO4 -2H20 0,8 mg
ZnSO4-7H2O 1,6 mg
Biotyna 0,16 mg
Pantotenian Ca 32 mg
Kwas foliowy 0,16 mg
Inozytol 160 mg
Niacyna 0,4 mg
Kwas p-aminobenzoesowy 0,2 mg
Chlorowodorek pirydoksyny 32 mg
Ryboflawina 0,2 mg
Chlorowodorek tiaminy 32 mg
168 787
II Metody
1. Manipulowanie DNA
Rozszczepianie endonukleazami resttykcyjnymi,ligowanie z wykorzystaniem ligazyT4 DNA, fosforylowanie DNA, wydzielanie DNA z E.coli, rozdzielanie dNa metodą elektroforezy na żelu, a także inne te<^lmiki należące do dziedziny inżynierii i te<^l^^n^>l^ogii genetycznej, wykorzystywane w przykładach, przeprowadzono zasadniczo w sposób opisany przez Maniatisa i innych, 1982.
2. Transformowanie drożdży
Drożdże metylotroficzne transformuje się sposobami opisanymi uprzednio (Roggenkamp i inni, 1986).
Korzystnie stosuje się metodę z nieczynnymi zamrożonymi komórkami (Klebe i inni, 1983).
a) Transformowane komórki identyfikuje się na na podstawie kompłementacji deficytu ura3 lub odporności na gentamycynę.
Odporność na gentamycynę G418 badano dokonując posiewu komórek na płytkach YEPD zawierających 25 ml zestalonego ośrodka. Do prowadzenia hodowli na płytkach w ciągu 6 godzin na każdą z płytek naniesiono 1 ml roztworu wodnego zawierającego 25 mg gentamycyny 418 i inkubację kontynuowano przez 2-3 dni. Gentamycynę G418 (nazwa handlowa Geneticin) otrzymano z Gibco Ltd.
b) Segregację mitotycznie trwałych transformantów przeprowadzano wybierając transformanty z płytki do selektywnej transformacji i hodując je w ciekłym ośrodku (YNE lub YEPD, Z 1 mg/ml G418) w ciągu 20 generacji (2 przejścia). Po tym okresie wzrostu komórki przenoszono do nieselektywnego ośrodka (SMR lub YEPD) i prowadzono hodowlę w ciągu 40-60 generacji (5-6 przejść). Z kolei komórki posiewano na selektywnej płytce (YNB lub YEPD z 1 mg/ml G 418), w wyniku czego zachowane zostały klony wytwarzające w dalszym ciągu w wyniku ekspresji selektywny marker.
3. Wydzielanie DNA drożdży
Całkowity DNA z drożdży otrzymywano w sposób opisany przez Struhla i innych (1979).
4. Analiza DNA drożdży
Strukturę DNA w transformantach drożdży analizowano na drodze trawienia odpowiednimi endonukleazami restry kcyynymi, a następnie elektroforezy na żelu agarozowym. Fragmenty DNA przenoszono na nitrocelulozę i hybrydyzowano z odpowiednią sondą radioaktywnie znaczonego DNA (Southern, 1975).
5. Analiza immunologiczna
Blotting metodą Westerna
a) Procedura Amersham
Białka uzyskane z surowych ekstraktów lub z frakcji gradientowych rozdzielano metodą elektroforezy naSDS-żelupollakryloamidowym (Laemmli, 1970), stosując 11,5%o żelu rozdzielający, 5% żel zbierający. Pasma białek przenoszono następnie na nitrocelulozę zasadniczo w sposób opisany przez Towbina i innych, (1979).
Materiał antygenowy wykrywano przeprowadzając reakcję plamy ze specy ficz.nymi przeciwciałami. Kompleks antygen-przeccwciało wizualizowano działając na filtr biotynylowanym przeciwciałem rPn 1001 (Amersham Buchler GmbH and Co., Ltd, Braunschweig, Republika Federalna Niemiec) w rozcieńczeniu 1:300, a następnie prowadząc inkubację z kompleksem peroksydaza-streptawidyna RPN 1051 (Amersham). Wszystkie etapy eksperymentu prowadzono zgodnie z instrukcjami producenta.
b) Alternatywnie filtr wstępnie inkubowano z 0,05% (wag./obj.) Tween w PBS. Po inkubacji z danym przeciwciałem monoklonalnym, wiązanie przeciwciała wykrywano prowadząc kolejno inkubację z biotynylowanym przeciw mysim IgG z owcy (RPN 1021, Amersham) w rozcieńczeniu 1:250, z dodatkiem 0,05% Tween 20, z kompleksem streptawidyny z biotynylowaną peroksydazą chrzanową (RPN 1051, Amersham, rozcieńczenie 1:400 w PBS zawierającym 1% żelatyny), a na koniec z 30 μl H2O2 i 10 ml odczynnika do barwnego wywoływania HRP, zawierającego 4-chloro-1-naftol (3 mg/ml metanolu) w 50 ml PBS. Między poszczególnymi inkubacjami filtr przemywano PBS zawierającym 0,05% Tween 20.
168 787
Ocenę ilościową wytworzonych monolitycznych antygenów (S i preS) wykonywano porównując próbki 0,01-0,3 (Łg oczyszczonego HBsAg pochodzącego z drożdży (SmithKline Biologieals) z 3-5 różnymi rożeieńezeniami ekstraktu surowego białka z Hansćnula, zawierającego 2-20 ' μg pełnego białka komórkowego.
Stężenie białek oznaczano z wykorzystaniem zestawu do analizy białek BioRad (BioRad, Monachium, Republika Federalna Niemiec).
Przykłady.
Część A - Plazmidy
Przykład I. Konstrukcja plazmidów umożliwiających ekspresję białka w Hansenula polymorpha
a) Konstrukcjn poustawpwegaplazmiou zaiwieraj zcegosekwencjęklegającą ^^i^cjncml·cznej replikacji, z Hansenula po/ymoruha (pME4).
Macierzysty plazmid wykorzystywany w konstrukcji plazmidów zawierających gen S pod kontrolą promotorów Hansenula stanowi pME4, opisany już w pracy doktorskiej M.Eckarta, 1988. pME4 jest pochodną YTp5 (Slruhl i inni, 1979; Stinchcomb i inni, 1980) uzyskiwaną na drodze następujących modyfikacji:
Autonomicznie ulegającą replikacji sekwencję HARS1 z Hanen^^^la polymorpha klonuje się w miejscu Sali w YIp5, jak to ujawniono w pracy Roggenkampa i innych (1986) uzyskując pHARS. Plazmid pHARS żreSonstrąowano następnie dokonując dęlecji i ponownej insercji fragmentu HARS 1 - all o 440 parach zasad w miejscu PvuII tego samego wektora. Lepkie końce Sali fragmentu przeprowadzono w tępe przed ligowaniem, na drodze inkubacji z ęgżonąkleazą VII, a następnie reakcji z polimerażk Klenowa. W wyniku takiej rekonstrukcji uzyskano pojedyncze miejsce Sali w genie odporności na tetracyklinę w części pBR322 plazmidu. Uzyskany w ten sposób pośredni plazmid poddano ponownie rekonstrukcji w celu uzyskania genu nie zawierającego wyjściowej sekwencji sygnałowej, w którym sekwencja sygnałowa została zastąpiona linkerem przedstawionym poniżej; szczegóły patrz Eckart (1988):
Sali EcoRI BstEII
GTC GAC GAA TTC AAA ATG TCC GGT CAC
CAG CTG CTT AAG ttt TAC AGG CCA GTG
Met Ser Gly HiS
P-laktamaza
Ten etap, w którym uzyskuje się plazmid pME4, przedstawiono na fig. 1.
b) Fragmenty promotorów MOX i FMD
Wydzie/anie promotora MOX z H. polymorpha opisane jest przez Eckarta, 1988. Dla celów wynalazku genomowy fragment Eco Rl-Sall o 1525 bp, zawierający górny region kontrolny genu MOX oraz kodony pierwszych pięciu aminokwasów w białku MOX, klonowano w pochodnej pBR322. Schematyczne przedstawienie genu MOX podano na fig.2. Ten pośredni plazmid rozszczepiono za pomocą EcoRI, poddano obróbce nukleazą Bal31 i żligowano z linkerami EcoRI. Uzyskano w ten sposób szereg fragmentów promotora zawięrajkeyeh końce EcoRI 3’ oraz Sali 5’, po rozszczepieniu ęndonukleazą restrykcyjną Sali. Pozycje różnych końcowych punktów dęleeji ustalono na podstawie sekwencjonowania DNA zgodnie z metodą Maxama i Gilberta, 1977. W dalszych eksperymentach przedstawionych w tym opisie zastosowano plazmid oznaczony jako pBR322-MP zawierający delecję aż do pozycji -3 (przy czym pierwszą zasadą kodonu inicjowania translacji MOX jest zasada +1). Plazmid pBR322-MP opisany jest przez Eckarta, 1988.
Wydzielanie i charakterystyka promotora FMD opisane są w zgłoszeniu patentowym europejskim nr 87 110 417.0. Dla celów wynalazku fragment BamHI o 1,4 kb, żawięrąjkcy około 1000bp fragmentu promotora znajdującego się powyżej, klonowano w miejscu BamHI w
168 787 pUC19. Wyselekcjonowano klon, w którym insert został zorientowany w taki sposób, aby przy końcu 3’ wstawionego fragmentu znajdowało się pojedyncze miejsce EcoRI z pUC19. Schematyczne przedstawienie genomowego klonu zawierającego gen FMD obejmujący jego promotor, podano na fig.2B. Wykonano szereg delecji nukleazą Ba!31, poczynając od miejsca EcoRI wewnątrz linkera pUC 19, w celu uzyskania plazmidów zawierających promotor'bez sekwencji genu strukturalnego. Po obróbce za pomocą Bal31 DN zligowano z linkerami EcoRI, DNA rozszczepiono za pomocą BamHI i uzyskane fragmenty BamHI-EcoRI klonowano w pBR322. Uzyskano w ten sposób różne dalece. Najbardziej efektywne w późniejszych eksperymentach okazały się delejce do pozycji -5 i -9 od pierwszego ATG. W dalszych eksperymentach przedstawionych w opisie wykorzystywano plazmid przenoszący fragment promotora zawierający dclejcę do pozycji -9 od pierwszego ATG (plazmid pBR322-FMD-P-9). Schematyczne przedstawienie fragmentów promotorów MOX i FMD, stosowanych w konstrukcjach kolejnych plazmidów, pokazano poniżej.
a) Fragment promotora MOX (-3)
Sali
-15 -3 /1500 bp/ -AAACTACAAAAAC
b) Fragment promotora FMD /-9/
BamHI
-14 -9 /1000 bp/ -TTCATC
EcoRI
GGAATTCC
Linker
EcoRI
GGAATTCC
Linker
c) Terminator
Wydzielanie terminatora transkrypcji z genu MOX opisano w pracy Eckarta, 1988. Schematyczne przedstawienie regionu 3’ genu MOX pokazano poniżej:
Arg Phe Stop
AGA TTC TAA
Sali----------Asp718
EcoRV-------Nrul < 1477 bp < 284bp >< 327bp >
><
68bp
168 787
Fragment Sall-Nruł przedstawiony na powyższym schemacie subklonowano w pBR 322 pomiędzy miejsca Sali i NruI, po czym plazmid ten rozszczepiono za pomocą endonukleazy restrykcyjnej Asp718 uzyskując dzięki temu linearyzację plazmidu dzięki pojedynczemu miejscu cięcia dla Asp 718 wewnątrz otwartej ramki odczytu MOX i poddano deiecjom Bal31
W wyniku analizy sekwencji DNA uzyskanych fragmentów zidentyfikowano fragment terminatora o około 320 bp (Eckart, 1988), który w dalszym ciągu działa jako terminator.
Ten fragment terminatora z lepkimi końcami (GACATACC—315bp-EcoRV) zligowano z miejscem Smal w pUC19. Orientację fragmentu ustalono na podstawie analizy sekwencyjnej /Naxam i Gilbert, 1977). Uzyskany klon pT-24 przedstawiono na fig. 3. Klon ten zastosowano w konstrukcji wektorów ekspresji, jak to przedstawiono poniżej.
d) Selektywne geny markerowe pME 4 (opisany powyżej, patrz fig. 1) rozszczepiono za pomocą EcoRI, po czym lepkie końce wypełniono polimerazą Klenowa.
Plazmid pT-24 trawiono za pomocą EcoRI i Hindlll, po czym wydzielono fragment zawierający linker pUC19 i fragment terminatora MOX. Lepkie końce tego fragmentu przeprowadzono w końce tępe stosując obróbkę polimerazą Klenowa, po czym fragment z tępymi końcami zligowano z pME4. Uzyskany plazmid nazwano pP/T24. Miejsca klonowania pochodzące z pUC19 wykorzystano następnie w kolejnych etapach klonowania.
Plazmid pP/T-24 zawiera gen S.cerevisiae URA3 jako selektywny marker. Jako kolejny selektywny marker wprowadzono gen nadający odporność na chloramfenikol. Gen ten wydzielono z wektora pBR325 jako fragment AatlI-ClaI o 1,7 kb, poddano krótkiemu trawieniu Bal31 w celu usunięcia po około 4 par zasad z każdej ze stron i stępiono przeprowadzając reakcję wypełnienia Klenowa. Następnie fragment zligowano z pP/T-24, który rozszczepiono za pomocą NruI. Uzyskany plazmid wykazujący odporność na chloramfenikol nazwano pP/T-24C.
Przykład II. Konstrukcja plazmidu zawierającego gen powierzchniowego antygenu Hepatitis B w funkcjonalnej kombinacji z terminatorem Hansenula polymorpha.
W celu uzyskania funkcjonalnej jednostki zawierającej S-gen Hepatitis B oraz terminator skutecznie działający w Hansenula polymorpha, gen S wprowadzono jako fragment Ncol-EcoRI o 683 bp do miejsca BamHI plazmidu pP/T-24C występującego w części tego plazmidu odpowiadającej linkerowi pUC19. Fragment o 683 bp otrzymano z pRIT2331 będącego zwykłym wektorem pUC9 opartym na E. coli, zawierającym fragment dNa Ncol-EcoRI o 683 bp, kodujący białko S od NcoI w kodonie ATG /CCAtGg/ do EcoRI poza kodonem stopu TAA /TAACGA ATTCA Sekwencję kodującą antygen powierzchniowy otrzymano zwykłymi technikami zrekombinowanego DNa z pRIT10616 ujawnionego w opisie patentowym europejskim nr A-0278940, oraz w pracy Harforda i innych, 1987. pRIT10616 zawiera genom wirusa HBV serotypu adw, klonowany w pACYC 184. Zdeponowano go w American Type Culture Collection na warunkach Konwencji Budapesztańskiej, dnia 2 czerwca 1982, pod nr ATCC39131.
Lepkie końce fragmentu genu S oraz pP/T-24C rozszczepionego za pomocą BamHI przekształcono w końce tępe na drodze wypełniania, przed ligowaniem. Ligowanie fragmentu w odpowiedniej orientacji regeneruje sąsiednie miejsca BamHI i Ncol w konstrukcji, tuż przy 5' względem regionu kodującego genu S. Uzyskany plazmid nazwano pRB-S.
Przykład III. Konstrukcja plazmidów zawierających funkcyjną kasetę ekspresji obejmującą promotory pochodzące z Hansenula polymorpha, gen antygenu powierzchniowego Hepatitis B oraz terminator Hansenula polymorpha.
pBR.322-MP i pBR 322-FMD-D-9, pochodzące z pBR.322, zawierające odpowiednio promotory MOX i FMD trawiono za pomocą EcoRI, po czym lepkie końce wypełniono stosując polimerazę Klenowa. Plazmidy rozszczepiono następnie za pomocą Sali. Uzyskany fragment zawierający promotor MOX obejmuje wyłącznie genomowy DNA z Hansenula polymorpha, podczas gdy fragment zawierający promotor FMD obejmuje dodatkowo 275 bp z sekwencji pBR.322 (pozycje od 375 bp do 650 bp na mapie pBR.322).
Plazmid pRB-S przecięto przy zregenerowanym miejscu BamHI, miejsce przekształcono w tępy koniec przez wypełnienie za pomocą polimerazy polimerazą Klenowa, po czym plazmid trawiono za pomocą Sali. Fragmenty promotora zawierające lepki koniec Sali oraz tępy koniec zligowano z wielkim fragmentem pRB-S o tępym końcu Sali, zawierającym region kodujący
168 787 gen S oraz terminator Hansenula polymorpha. Uzyskane plazmidy nazwano pRB-S-269 (promotor MOX) oraz pRB-S-271 (promotor FMD, delecja -9). Zawierają one gen S pod kontrolą promotora i terminatora Hansenula polymorpha, jak to przedstawiono na fig. 4. Sekwencję otaczającą połączenie między genem S i promotorami przedstawiono schematycznie poniżej.
a) Fuzja MOX - promotor (pRB-S-269)
-3 +1 —AAAAAC GGGATTGATCC ATG
->
Promotor MOX gen S
b) Fuzja FMD - promotor (-9)
-9 +1 <—TTCCATC GGAA.TTGATCC ATG
Promotor FMD gen S
Plazmidem skonstruowanym identycznie jak pRB-S-271 i pRB-S-269, ale nie zawierającym insercji fragmentu restrykcyjnego o 440 bp, przenoszącego sekwencje HARS1, nadano nazwy pRB-S-269I i pRB-S-27 II. Plazmidy te zastosowano do wytwarzania mtegrantów zawierających 1-3 kopie kasety ekspresji.
Przykład IV. Konstrukcja wektorów integracyjnych zawierających gen S.
a) Konstrukcja plazmidu pBC zawierającego sekwencje autonomicznie ulegające replikacji, z Hansenula Polymorpha oraz gen URA3 Hansenula polymorpha.
Plazmid pBC stanowi pochodną plazmidu VRp7 (Tschumper i Carbon, 1980) zawierającą sekwencję ARS1 Saccharomyces cerevisiae. Ta autonomicznie ulegająca replikacji sekwencja została zdezaktywowana w wyniku insercji fragmentu Bglll-Sphl o 5400 bp, zawierającego gen URA3 z Hansenula polymorpha. Autonomicznie ulegającą replikacji sekwencję 1 (HARS1) Hansenula klonowano również w miejsce Sali genu odporności na tetracyklinę (fig. 5).
b) Insercja kaset ekspresji w plazmidzie pBC
Plazmid pRB-S-269 poddano trawieniu za pomocą BspMII i SaII.
Końce uzyskanego fragmentu zawierającego kasetę ekspresji obejmującą promotor MOX, region kodujący powierzchniowy antygen Hepatitis B oraz terminator, stępiono, po czym zligowano z plazmidem pBC, następnie rozszczepiono za pomocą Xhol i Stul i wypełniono lepkie końce Xhol. Uzyskany plazmid p.MS-2 zawiera kasetę ekspresji genu S otoczoną sekwencjami flankującymi z fragmentu genu URA3 Hansenula polymorpha.
W celu zintegrowania kasety ekspresji genu S w genomie Hansenula polymorpha, plazmid pMS2 rozszczepiono za pomocą Nhel i uzyskany fragment o 6,1 kb zastosowano do transformowania komórek.
Wektor pFS-9 skonstruowano w analogiczny sposób, z tym że kasetę ekspresji wydzielono z pRB-S-271, zawierającego promotor FMD.
Szczegółowy opis uzyskanych plazmidów przedstawiono na fig. 5.
Przykład V. Konstrukcja plazmidów zawierających kasetę ekspresji oraz dodatkowy gen selektywnego markera
168 787
a) Konstrukcja podstawowego plazmidu pHK2.
W celu skonstruowania plazmidu pHK2 (fig. 6; zdeponowany na warunkach Konwencji budapesztańskiej w DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganisemen und Zellkulturen GmbH) pod nr 5328 dnia 27 kwietnia 1989) gen odporności na kanamycynę wydzielono z transpozonu Tn5 (Griendley i Joyce, 1980). Niepotrzebne sekwencje wycięto stosując obróbkę genu strukturalnego za pomocą nukleazy Bal31. Uzyskany fragment obejmujący strukturalny gen kanamycyny obejmujący terminator kanamycyny, zligowano z promotorem ADH1 z Saccharomyces cerevisiae (Hitzeman i inni, 1981). Ponadto sekwencję HARS1 wprowadzono jako fragment Sali o 440bp do plazmidu.
b) Konstrukcja szczepów odpornych na kanamycynę, pochodzących z pRB-S-269 i pRB-S-271.
Fragment HindIII z pHK obejmujący region kodujący odporność na kanamycynę (3,5 kb) klonowano w miejscu HindIII występującym w sekwencji HARS1 w plazmidach pRB-S-269 i pRB-S-271. Uzyskane plazmidy, którym nadano odpowiednio nazwy pRB-S-322 i pRB-S-326, przedstawiono na fig. 7.
Przykład VI. Konstrukcja macierzystego plazmidu dla ekspresji białek pre-S.
Plazmid pP/T-24 (przykład II) zrekonstruowano w celu uzyskania plazmidu pMOX-P/Tl (fig.8) przenoszącego uniwersalną kasetę ekspresji zawierającą promotor MOX, miejsce wielokrotnego klonowania i terminator MOX.
W celu dokonania insercji linkera zawierającego miejsca restrykcyjne endonukleaz Sali, EcoRI, BgIII i BamHI, linker pUC19 z plazmidu pP/T-24 zastąpiono częściowo syntetycznym DNA zawierającym miejsca restrykcyjne dla wyżej wspomnianych enzymów.
Plazmid pP/T-24 rozszczepiono endonuldeazami rest^^r^l^^ę^j^^mi BamHI i SalI. Miejsca te pochodzą z linkera pUC 19 (BamHI) oraz z pME4 (S all). Dokonano insercj i linkera - cząsteczki zawierającej miejsca restt^kcyjne Sali, EcoRI, Bgllll i BamHI. Uzyskany plazmid pTl trawiono za pomocą EcoRI i Sall, po czym dokonano insercji promotora MOC jako fragmentu EcoRI-Sall o 1,5 kb, uzyskując plazmid pT2. Istotne obszary plazmidu pT2 przedstawiono poniżej:
Sali -1500 -3 EcoRI Bglll BamHI
------//---AAAAAC GGAATTC AGATCT GGATCC AGCT----
<-
Promotor MOX Terminator
Plazmid pT2 zawiera ponadto gen ARS Hansenula polymorpha oraz gen URA3 Saccharomyces cerevisiae, podobnie jak plazmid pRB-269 (fig. 3).
Następny etap konstrukcji obejmował zastąpienie genu URA3 Saccharomyces cerevisiae przez gen URA3 pochodzący z Hansenula polymorpha. Klon zawierający ten gen wydzielono w sposób opisany poniżej w przykładzie IX. Gen URA3 wydzielonojako fragment BamHI-Bg 1II o 1,2 kb. Podczas gdy miejsce BgIII jest oryginalnym miejscem genomowym, miejsce BamHI powstało w wyniku zligowania miejsca Sau3A z miejscem BamHI stosowanym do skonstruowania biblioteki genomowej. Lepkie końce tego fragmentu BamHI-Bgill wypełniono za pomocą polimerazy Klenowa i dokonano insercji w miejsce Aval w pBR322, które również zostało wypełnione za pomocą polimerazy Klenowa. Miejsce Aval zostało zregenerowane w wyniku ligowania. Uzyskany plazmid oznaczono jako pURA3-Pl.
Plazmid URA3-P1 trawiono za pomocą Nrul i BspMII. Miejsca te pochodzą z pBR322, pozycje 974 bp i 1664 bp na zwykłej mapie pBR.322. Plazmid pT2 poddano całkowitemu trawieniu za pomocą Nrul (974 bp w pBR322) oraz częściowemu trawieniu za pomocą BspMII. Istnieją 2 miejsca BspMII w pT2: pierwsze w pBR322 (1664 bp), a drugie zlokalizowane w
168 787 terminatorze MOX. Fragment Nrąl·BspMl·I w pT2 (1800 bp) zawiera gen URA3 z Saccharomyces ^ην^Ι^. Fragment NruI-BspMII z URA3-P1 zawierający gen Hansen^a uolymorpha URA3 klonowano w pT2 zastępując w ten sposób gen S. cerevisiae URA3 zlokalizowany w odpowiednim fragmencie NruI-BspMII. Uzyskany plazmid pT3 zawiera terminator mOx, linker, promotor MOX oraz gen URA3 z Hansenula po/ymorpha, w podanej kolejności. Plazmid pT3 nie zawiera jednak funkcjonalnego genu β-lίiktamaży. jak w macierzystym plazmidzie pME4. W co/u zastąpienia tego zdefektowanego genu β-laktamazy przez gen funkcjonalny, pBR322 trawiono za pomocą EcoRI, lepkie końce wypełnione za pomocą polimerazy Klenowa, po czym przeprowadzono /igowanio z /inkerem Asp718 o 8 bp, a następnie trawienie za pomocą Pvul (pozycja 3738 na mapie pBR322). Uzyskany w ten sposób fragment Asp718-Pvul o 633 bp zawiera oryginalny promotor i kodon inicjowania translacji genu β-iaasamazy.
Plazmid pT3 poddano rozszczepieniu za pomocą Asp718 (Asp718 z/okalizowany jest na końcu terminatora MOX) i częściowemu trawieniu za pomocą Pvul. Fragment Asp718-Pvul uzyskany w sposób opisany powyżej wstawiono następnie w poddany wstępnej obróbce pT3 uzyskując plazmid pMOX-P/fl.
riaZiinu pmuA-r/1 i piZ/CuatavViuilu na ug. o. ridZmiG lcii Zhwjcia luiiKcyjny gen p-idktamazy.
Przykład VII. Konstrukcja plazmidów ą/egajkeych ekspresji do białek pre-S.
Gen pre-S kodujący białko preS 1-S2-S (wielkie białko) wirusa Hopatitis B otrzymanojako fragment Nco/^-HindIII z pRIT12816. pRIT12816 jest zwykłym wektorem E. coli opartym na pBR322 zawierającym fragment Ncol-Hindni o 1185 bp kodujący białko preSl-S2-S od Ncol przy kodonie ATG (CCATGG) do HindIII przy 15 bp poza kodonem stopu TAA (...AAGCTT). Fragment sekwencji kodującej preS1-S2-S otrzymano technikami zwykłego klonowania z pRIT 10616 ujawnionego w zgłoszeniu patentowym europejskim nr EP-A-0278940 oraz w pracy Harforda i innych, 1987. Fragment o 861 bp kodujący sekwencję preS2-S można z niego również wydzielić w zwykły sposób. Końce fragmentu Ncol-HindIII stępiono stosując wypełnianie za pomocą pollmerazy K/enowa, po czym przeprowadzono klonowanie do tępych końców miejsca cięcia przez EcoRI w pMOX-P/Tl. W wyniku prawidłowego ligowania miejsce EcoRT na początku genu strukturalnego preS1 jest zregenerowane przez llgowanle z tępo zakończonym Ncol/EcoRI. Konstrukcji, w której gen preS pod kontrolą promotora MOX ulega ekspresji nadano nazwę pMPS-22. Przedstawiono ją na fig. 8.
,-·. Analogicznej konstrukcji zawierającej promotor FMD nadano nazwę pMPS-21.
Przykład VIII. Konstrukcja wektora zawierająca kasetę ekspresji preS.
Do kasety ekspresji Sa/EAspY 18 z plazmidu pMPS22 wprowadzono tępe końce na drodze wypełnienia, po czym wstawiono ją pomiędzy wypełnione miejsce Xhol i miejsce Stul w plazmidzie pBC opisanym w przykładzie IV a) powyżej. Uzyskany plazmid, któremu nadano nazwę pM.PS-9, przedstawiono na fig. 9.
Przykład IX. Klonowanie genu URA3 Hansenula polymorpha.
Gen URA3 z Hansmu/a polymorpha klonowano na drodze Somplementacji odpowiedniej mutacji pyrF szczepu MB 1)00 E. coli.
Fragmenty genomowego DNA o wielkości w zakresie 6-9 kbp wydzielono na drodze częściowego trawienia za pomocą Sau3A, rozdzielenia na niskotopllwym żelu agarozowym i wydzielenia odpowiedniej frakcji DNA.
Oczyszczone fragmenty zligowano w jednostkowym miejscu BamHI wektora YRp7, zawierającego sekwencję ulegającą auton.omieżnęj replikacji z Hansenula polymoruha, wstawioną w miejsce S Ali. Uzyskaną mieszaniną ligacyjną zastosowano do transformowania szczepu MB 1000 E.coli, po czym transformanty wyselekcjonowano na płytkach z pożywką minimum bez uracylu. Uzyskane transformanty poddano analizie, a plazmidy wydzielono. Wydzielono uodfragmcnt przedstawiony na fig. 10, który pośredniczył w odtworzeniu fenotypu URA+ w przeprowadzonych za pomocą 5’-m0nol'osj'oranodeSarboSsy/azy orotydyny mutantach E-coli, Saceharomycos ^ην^Ι^ i Hansenula polymoruha. B/ottlng Southerna potwierdził, że struktura klonowanego DNA była identyczna ze strukturą genomowego regionu URA3. Mapę restrykcyjną fragmentu genu URA3 Hansenula polymorpha przedstawiono na fig. 10.
168 787
Część B
Ekspresja powierzchniowego antygenu Hepwhihis B (HBsAg) w Hansen^a polymorpCa.
Przykład X. Konstrukcja szczepów Hayszyula. polzmoreha eαwizrająezch gen S.
Hansen^a polzmorpha RB 10 transformowano wyżej opisanymi plazmidami pRB-S-269, pRB-S-269-Ι, pRB--S-271 i pRB-S-271-I. Otrzymano kilka klonów zawierających plazmidy ulegające autonomicznie replikacji (traysformaytów) lub zintegrowane obce dNa (integrantów).
Tz traysformaytz/iytżgraytz zbadano następnie w celu stwierdzenia, czy występuje w nich ekspresja genu S, metodami immunologicznymi. Zastosowano dwa układy badań: blotting Westerna oraz testy AUSRIA i AUSZYME (Abbiott). Wytwarzanie monomeru HBsAg analizowano metodą blottingu Westzrna z wykorzystaniem moyokloyalyzeh przeci wciał RF6. Zestawy A^otta AUSRIA i AUSZYME 'zastosowano zgodnie z instrukcjami producenta w czlu ^ζιζ ilości cząstek HBsAg wytwarzanych w Hansenula. Transformanty wykazujące stabilny i wysoki poziom ekspresji wyselekcjonowano, a ich DNA poddano analizie metodą blottingu Southzrna, a następnie rozdzielania e,lektrofρrztzceyego.
a) Transformanty
Kilka kolonii zawierających swobodnie replikujący plazmid otrzymano z Hansz-nula polzmorpha transformowanego plazmidami pRB-S-269 i pRB-S-271. Analiza Southerna całego DNA uzyskanego z tych tran^^^^:^^^(5w, trawionego różnymi zndonuklzazami rzstrykcySnymi wskazała oczekiwany wzór restrykcyjny.
b) Intzgranty
Hansznula polymoreha można stran-sformować z dużą częstością wektorami integracyjnymi pRB-S-269-1 oraz pRB-S-271-1. Intzgranty hodowane na pełnej pożywce (YEPD) są mitotycznie trwałe. Alternatywnie, mltotyeeyą trwałość obcego dNa w Hanszi-iula można również uzyskać w wyżej opisany sposób, zgodnie z którym wektor ulegający autonomicznej replikacji, korzystnie plazmid o dużzj ilości koeli. taki jak pRB-S-269 lub pRB-S-271, integruje się spontanicznie w genomiz. Uzyskane intzgranty również wykazują wysoką stabilność mitotyczną obcego DNA.
Obydwie wspomniane wyżej metody zastosowano w celu otrzymania szczepów dokonujących skutecznej ekspresji genu S w yizselektzwnej. pełnej pożywce. Zachowano 3 szczepy: szczep o numerze identyfikaczjyzm 352, który transformowano pRB-S-271, w którym gen S jzst regulowany' promotorem FMd oraz szczepy nr 415 i 416, transformowane pRB-S-269 zawierającym gen S regulowany preze MOX; szczepy te zastosowano w kolejnych eksperymentach.
Przykład XI. Mitotsczną stabilność obcego DNA w intzgraytacC
Stabilność zrekombinowanzeh szczepów 352, 415 i 416, zbadano zgodnie z następującą metodyką: szczepy hodowano w nieszlzktywyym ośrodku SMR tak, aby uzyskać 40 pokoleń. Z hodowli wydzielono 12 niezależnych kolonii przzd i po okresie 40-pokoieniowzm. Strukturę obcego DNA oraz ilość kopii kaszty ekspresji analizowano w wydzielonych klonach mztodą blottingu Southerna w kombinacji z elektroforezą na żelu agarozowym fragmentów restrykcyjnych oraz zlektroforezą żzlową z gradientem drgającego pola pełnych chromosomów. Ta ostatnia technika umożliwia rozdzielanie i analizę chromosomów’ drożdży (Schwartz i Cantor, 1984).
Elektroforeza żelowa w polu drgającym (PFGK)
Komórki szczepów 415, 416 i 352 poddano łagodnej lizie w dołku na próbki w 0,7% (wag./obj./ żzlu agarozowym. Uwolnionz in situ chromosomy oddzielono za pomocą urządzenia LKB-Pharmacia Pu^ap^r Plus, zgodnie z instrukcjami LKB-Pharmacia. Po PFGE DNA przeniesiono na nitrocelulozę, zgodnie z procedurą Southerna (1975). Plazmę poddano hybrydyzacji z zastosowaniem sond znakowanych 32P, specyficznych dla MOX i/lub gznu FMD albo genu URA3 z Hansenula polymorpCa. przy czym wiadomo, że genom zawiera pojedynczą kopię tego ostatniego genu.
Porównanie sygnałów pochodzących z dopuszczalnych multimzrzczyych integrantów i sygnałów jżOyokoρiowycC genów (markerów wewnętrznych) umożliwiło ocenę ilości kopii
168 787 odnośnych kaset ekspresji znajdujących się wewnątrz komórki. Analiza chromosomów-1 metodą PFGE wykazała, że klon 415 zawiera około 30-50 kopii kasety ekspresy, podczas gdy klon 416 zawiera około 5-6 kaset ekspresji, a klon 352 około 10 kaset ekspressi. Analiza wykazała, że obcy DNA jest zintegrowany w genomie Hansenula. Analiza Southerna
Szczepy 352, 415 i 416 hodowano przez 40 pokoleń w ośrodku SMR. Z każdej partii wydzielono 12 niezależnych kolonii, przed i po wyżej wspomnianym okresie hodowli. Preparaty DNA z tych sub-klonów poddano analizie Southerna po rozszczepianiu różnymi enzymami restrykcyjnymi, z zastosowaniem sond znakowanych 32P. Analiza wzorów restrykcyjnych wykazała, że kasety ekspresji pozostały nienaruszone, oraz, że wprowadzany DNA był genetycznie trw'ały. Analiza potwierdziła ponadto, że genom szczepu 415 zawiera długie powtórki z kilku kopii plazmidu. Wywnioskowano, że w powtórce takiej występuje połączenie plazmidów typu głowa do ogona.
Przykład XII. Badania ekspresji.
Zrekombinowane szczepy badano rutynowo w celu stwierdzenia obecności HBsAg, metodą blottingu Westema oraz za pomocą testów AUSRIA/AUSZYME.
a) Wzrost hodowli i blotting Westema
Szczepy 352, 415 i 416 hodowano w 11 kolbach w 200 ml ośrodka SMR-gliceryna, w temperaturze 37°C, z intensywnym napowietrzaniem. Na początku fazy staC-jonanie], która charakteryzuje się wyczerpaniem gliceryny, dodano 50 ml/dm3 5-krotnie stężonego ośrodka SMR bez gliceryny, oraz metanol w ilości odpowiadającej jego ostatecznemu stężeniu 10 g/dm3. Próbki objętości 10 ml pobrano z hodowli przed dodaniem metanolu oraz po 24 godzinach po dodaniu metanolu. W celu porównawczych te same szczepy hodowano również w ośrodku SMR zawierającym 30 g/dm3 glikozy (depresja promotorów). Komórki zebrano w późnej fazie logarytmicznej.
Z zebranych komórek przygotowano surowe ekstrakty białkowe na drodze dyspergowania peletki komórek w ilości odpowiadającej około 0,1 g suchej masy w 5 ml buforu PE (0,5 M NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM bufor fosforanowy pH 7,5, 2 mM PMSF). Dodano w przybliżeniu równa objętość kuleczek szklanych o średnicy 0,45 mm, tak że uzyskano prawie stałą mieszaninę. Mieszaninę intensywnie wytrząsano w ciągu 4 minut w temperaturze 4°C, w homoganizatorze Braun MSK (B.Braun and Diessel Biotech GmbH, Melsungen, Republika Federalna Niemiec). Następnie dodano 4 ml buforu PE i produkt homogenizacji wymieszano i odwirowano w ciągu 5 minut w temperaturze 4°C, przy przeciążaniu 40 000 x g. Próbki po
5-25 gg cieczy znad osadu nanoszono na żel do elektroforezy (SDS-poliakryloamid), stosując jako wzorce kontrolne oczyszczony HBsAg (0,05-0,5 gg). Obecność materiału antygenowego wykazano przenosząc białko na nitrocelulozę, zgodnie z metodyką Towbina (1979), i wykrywając monoklonalne przeciwciało RF6 w sposób opisany powyżej w metodzie 5a. Blotting Westema umożliwia dokonanie oceny ilości antygenu wytworzonego w klonach 352,415 i 416, w odniesieniu do znanych ilości czystego HBsAg pochodzącego z drożdży.
Wyniki zestawiono w tabeli 1. W hodowli w kolbach indukowanej metanolem (ośrodek SMR) przy gęstości komórek około 5 g suchej masy/dmU białko S stanowi około 2-5% całości białka wyekstrahowanego z transformowanych szczepów.
Porównanie ekspresji w komórkach hodowanych w warunkach indukcji (metanol), derepresji (gliceryna) i represji (glikoza) wykazuje ścisłą kontrolę promotorów MOX i FMD. Ekspresja jest całkowicie zablokowana w komórkach hodowanych na glikozie. W glicerynie poziom syntezy HBsAg stanowi około 30% poziomu uzyskiwanego w komórkach indukowanych.
b) Antygenowość HBsAg wytworzonego w wyniku ekspresji w Hansenula polymorpha.
Antygenowość materiału zawartego w surowych ekstraktach oznaczano wykonując test
AUSZYME Abbotta oparty na monoklonalnych przeciwciałach. Wyniki podawano w umownfchjednojtkach (abjorbancjaprzf 492 nm naO, 1 μg białka; rozcieńczanie surowych ekstraktów i reakcję prowadzono w 150 mM NaCl, 25 mM buforze fosforanowym o pH 7,4, 0,01% BSA, 0,01% Tween 20). Reaktywność w teście AUSZYME wykazuje obecność konformacyjnych epitopów charakterystycznych dla cząstek sub-wirusowych.
168 787
Tabela 1
Wytwarzanie HBsAg w szczepach z ekspressą genu S
Szczep Promotor Źródło węgla IIBsAg oceniany metodą blottingu Westerna, mg/100 mg białka ΤΊΤΊ „A_________.. 4.- Z oceniany w teście AUSZYME, umowne jednostki A492O, l (ig białka
352 FMD glikoza gliceryna metanol brak sygnału 0,8-1,2 2,5-3,0 0,3 10,0 25,0
415 MOX glikoza gliceryna metanol brak sygnału 1,0-1,5 4,0-5,0 0,1 12,0 45,0
416 MOX glikoza gliceryna metanol brak sygnału 0,05-0,8 2,0-3,0 brak sygnału 5,0 22,0
c)Wirowanie w gradiencie gęstości surowych ekstraktów H.polymorpha.
Surowe ekstrakty otrzymane zgodnie z metodyką opisaną powyżej poddano wirowaniu w gradiencie gęstości, stosując gradienty CsCl lub sacharozy. Sedymentacyjne wirowanie w gradiencie zrównoważone sacharozą wykonywano dodając 100-200 (tg (200 μl) surowego ekstraktu białkowego na wierzch 20-50% gradientu sacharozy w 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NadKO o pH 7,2. Probówki o objętości 5 ml wirowano w ciągu 18 godzin z szybkością 40 000 obrotów/minutę w wirniku Beckman SW 50.1.
Wirowanie w gradiencie chlorku cezu przeprowadzono rozcieńczając 1 objętość surowego ekstraktu białkowego 1 objętością 3 M CsCl w 25 mM buforze fosforanowym o pH 7,4. Wirowanie prowadzono w temperaturze 4°C z szybkością 40 obrotów/minutę w wirniku Beckman 50 Ti w ciągu 40 godzin.
Gradienty poddano frakcjonowaniu, po czym różne frakcje przetestowano z zastosowaniem przeciwciał RF6, metodą blottingu Westerna i/lub z wykorzystaniem testów AUSRIA i/lub AUSZYME. Stwierdzono, że pik materiału HBsAg o gęstości około 1,16-1,19 g/ml tworzy się w gradiencie CsCl. Materiał występujący w tym piku reaguje bardzo dobrze nie tylko z przeciwciałami RF6 w biotach Westerna, ale również w próbie AUSRIA i AUSZYME. Gęstość ta, a także reaktywność w testach AUSRIA/AUSZYME wskazują na obecność konformacyjnych epitopów charakterystycznych dla cząstek. Ponadto w kolejnym eksperymencie porównano gęstości uzyskanego materiału i sub-wirusowych cząstek wydzielonych z surowicy ludzkiej. Stwierdzono, że obydwa materiały wykazują zbliżone gęstości przy izopiknometrycznym wirowaniu w roztworze CsCl.
Przy wirowaniu surowych ekstraktów w gradiencie sacharozy uzyskano frakcje pików reagujące z AUSRIA i AUSZYME, zawierające co najmniej 80% HBsAg, na co wskazuje analiza frakcji gradientowych prowadzona równolegle z AUSRIA/AUSZYME i blottingiem Westema. Stwierdzono, że pozostałe 20% materiału znajduje się głównie w górnych i spodnich frakcjach gradientu i wykazuje reaktywność tylko w analizie metodą blottingu Westerna, co oznacza, iż materiał ten stanowi monometryczna forma białka. Analiza pikowych uzyskanych z gradientów CsCl również potwierdziła, że co najmniej 80% materiału tworzy cząstki.
Cząstki pochodzące z Hansenula są odporne naproteolizę. Inkubacja surowych ekstraktów białkowych zawierających cząstki w ciągu kilku godzin w różnych temperaturach wykazała jedynie bardzo mały stopień degradacji, co stwierdzono analizując wielkości AUSZyMe oraz badając stopień nienaruszona polipeptydu z wykorzystaniem denaturacji w SDS-PAGE, a następnie blottingu Westerna. Materiał analizowano również metodą mikroskopii elektronowej. Obrazy z mikroskopu elektronowego wyraźnie pokazują obecność cząstek o średnicy około 22 nm.
Wyżej opisane wyniki uzyskano w przypadku wszystkich 3 szczepów, 352, 415 i 416.
168 787
Część C
Ekspresja białka preS1-S2-S w Hansenula polymorpha zawierających gen preSl-S2-S.
Przykład XIII. Konstrukcja szczepów Hansenula polymorpha zawierających gen preSl-S2-S.
Hansenula polymorpha RB 10 transformowano fragmentem Pvu-I-Asp718 o 5570 bp, pochodzącym z pMPS-22, obejmującym gen URA3 i gen preSl pod kontrolą promotora MOX (patrz fig. 8). Odpowiedni fragment zawierający gen preS1 pod kontrolą promotora FMD (delecja-9) otrzymano ponadto z plazmidu pMPS-21. Stwierdzono, że integranty uzyskane z tych transformacji zawierają 1-2 kasety ekspresji, co wykazała analiza metodą Southerna. Integrantom zawierającym gen preS 1 pod kontrolą promotora MOX nadano nazwę preS-AM, a integrantom zawierającym gen preS pod kontrolą promotora FMD nadano preS-AF.
Integranty zawierające kilka kaset ekspresji uzyskano przeprowadzając transformację Hansenula polymorpha autonomicznie replikującymi plazmidami pMPS22 i pMPS21, zawierającymi sekwencję HARS. Integranty powstały w wyniku samorzutnej integracji tych plazmidów, jak to opisano w części Materiały i metody, punkt 2b. Tego typu integrantom (transformantom) nadano ogólną nazwę preS-BM (promotor MOX) oraz preS-BF (promotor
FMD).
Szczepy preS-AM-405, preS-BM-402, pre-BM-403 i preS-BM-454, w których ekspresja genu preS1 jest kontrolowana przez promotor MOX, zachowano do dalszej analizy.
2. Stabilność mitotyczna
Stabilność mitotyczną obcego DNA występującego w 4 szczepach zidentyfikowanych w przykładzie XXXI powyżej zbadano wykonując analizę Southerna 12 niezależnych subklonów wydzielonych przed i po okresie hodowli przez 40 pokoleń, w sposób opisany w części B. Analiza potwierdziła genetyczną stabilność zintegrowanych wektorów (patrz również przykład XVI w części D).
3. Ekspresja białka preS w Hansenula polymorpha
Szczepy preS-BM-402, preS-BM-403, preS-AM-405 i preS-BM-454 hodowano w ośrodku SMR zawierającym glicerynę, a następnie prowadzono indukowanie komórek metanolem (10 g/dm3) dokładnie w taki sam sposób, jak to opisano w części B. Komórki zebrano po 25 godzinach od dodania metanolu, po czym przygotowano surowe ekstrakty w sposób opisany w części B.
a) Ilości po 12 pg surowych ekstraktów ze szczepów pre-BM-402, preS-AM-405 i preS-BM-454 analizowano wykonując najpierw elektroforezę na poliakryloamidowym żelu SDS, a następnie blotting Westema z zastosowaniem mieszaniny monoklonalnych przeciwciał (S1.1, S.2 i S2.5), w sposób opisany w części Metody 5(a). Obydwa typy szczepów wykazały obecność podwójnego pasma antygenowego przy 38/39 kD oraz dodatkowego pasma przy 45kD.
Szczep preS-AM-405 wykazał mniejszą zawartość składników 45 kD w .stosunku do składników 39 kD niz szczep preS-BM-402. Szczep preS-BM-454 wykazał największą względną zawartość składników o 45 kD. Profil elektroforetyczny białka preS z powyższych szczepów porównano z antygenem pochodzącym z cząstek z ludzkiej surowicy. Z porównania biotów Westema wynika, że preparaty, zarówno ludzki jak i drożdżowy, wykazują pasmo przy około 38/39 kD.
b) Zaobserwowano również różne poziomy ekspresji w przypadku różnych szczepów. Różnice te są spowodowane przede wszyskkm różnicami w liczbie kopii kasety ekspresji między szczepami. Na podstawie blottingu Westema oceniono, że antygen preS stanowi 0,1-1,5% całości białka komórkowego w różnych szczepach pre-A i preS-B, jak to przedstawiono w tabeli 2.
Na surowych ekstraktach wykonano również test AUSZYME w celu zbadania obecności cząstek. Wyniki zamieszczone w tabeli 2 wykazują bardzo małą reaktywność podaną w jednostkach A492 na 0,1 pg białka.
168 787
Tabela 2
Ekspresja preS w Hansenula polymorpha
Klon Zawartość białka preS oceniana metodą Blottingu Westerna mg preSl/100 mg AUSZYimc, jeunusik i A 492 na 0,1 gg białka
preS-AM-405 0,1-0,2 0,01
preS-BM-402 0,3-0,5 0,02
preS-BM-403 0,4-0,6 0,02
preS-BM-454 1,2 -1,5 0,1-0,2
c) Glikozylowanie: Szczep preS-BM-453 charakteryzujący się wysoką produkcją białka preS (około 1,5% całości białka komórkowego) oraz silnym pasmem 45 kD wybrano do badań glikozylowama. Białko preS z preS-BM-454 analizowano prowadząc inkubację surowych ekstraktów białkowych z endoglikozydazą EndoH. Uzyskane wyniki wyraźnie wskazują, że materiał 45 kD stanowi glikozylowaną formę białka preS.
W wyniku inkubacji 45 (Ig surowego białka w ciągu 0,5, 1,0 i 24 godzin z 0,5 mU endoglikozydazy EndoH, zgodnie z instrukcjami producenta (Boehringer Mannheim, Republika Federalna Niemiec), nastąpiło przesunięcie pasma 45 kD do pozornej masy cząsteczkowej 42 kD. To przesunięcie oznacza, że materiał 45 kD stanowi N-gllkozylowaną formę białka preS, zawierającą jedną grupę rdzeniową o około 3000 D.
Do badania glikozylowania białka preS w Hansenula polymorpha wykorzystano również tunikamycynę, znaną jatko silny inhibitor N-głikozyłowania. Szczep preS-BM-454 hodowano do uzyskania gęstości A(,0) = 10,0, w ośrodku YNB zawierającym glikozę (10 g/dm3). Porcją 10 ml tej hodowli zaszczepiono 100 ml YNB zawierającego 10 g/dm3 metanolu oraz 50 (ig/ml tunikamycyny. pH ośrodka utrzymywano na stałym poziomie 7,2-7,5. Doświadczenie kontrolne prowadzono bez dodatku tunikamycyny. Komórki zbierano po 10, 15 i 30 godzinach od momentu zaszczepienia ośrodka zawierającego tunikamycynę.
Surowe ekstrakty białkowe analizowano metodą blottingu Westema. Badania wykazały, że w komórkach hodowanych w obecności tunikamycyny widoczne jest pojedyncze pasmo przy 42 kD oraz podwójne pasmo przy 38/39 kD. W doświadczeniu kontrolnym pasmo 42 kD zostało zastąpione przez pasmo 45 kD. Podobne wyniki uzyskano w przypadku ekstraktów ze szczepów preS-BM-402, preS-BM-403 i preS-AM-405, które jednak wytwarzają znacznie mniejsze ilości partii białka o 45 kD (nie więcej niż 5-10%% całkowitego zsyntetyzowanego białka pre-S/. Wyniki te sugerują, że pasmo 42 kD reprezentują O-głikozyłowaną formę białka preS.
d) Wirowanie w gradiencie gęstości
Surowe ekstrakty szczepu preS-AM-405 oraz szczeków preS-BM-402, preS-BM-403 i preS-BM-454 poddano analizie przez wirowanie w gradiencie sacharozy i CsCl. Warunki opisane są w przykładzie XII (c), część B. Frakcje gradientowe badano metodą blottingu Westema i za pomocą testów AUSZYME.
Analiza potwierdziła, że w przeciwieństwie do szczepów wytwarzających w wyniku ekspresji antygen S (część B) albo zarówno antygeny preS 1jak i S (część D), szczepy preS nie wytwarzają wydajnie cząstek sub-wirusowyeh. Ani przy izopiknometrycznym wirowaniu z CsCl, ani przy wirowaniu w gradiencie sacharozy nie zaobserwowoano tworzenia się pasma o wymaganej gęstości. Potwierdził to również fakt, że materiał zbliżony do HBsAg z frakcji gradientowych oraz surowe ekstrakty źle reagują w testach AUSRIA i AUSZYME.
Część D
Wytwarzanie cząstek kompozytowych zawierających zarówno antygeny preS jak i S.
Przykład XIV. Konstrukcja szczepów.
Skonstruowano kilka szczepów charakteryzujących się różnymi stosunkami ekspresji preSl do S oraz różnymi całkowitymi poziomami ekspresji.
168 787
Różnice te osiągnięto zmieniając liczbę kopii kaset ekspresji przypadających na genom. Dodatkową zmienność uzyskano umieszczając geny pod kontrolą tht różnych promotorów Hansenula.
Trzy podstawowe typy szczepów rekombinantowych uzyskano w następujący sposób:
a) Szczepy zawierające jedną kopię genu PreSl oraz jedną kopię genu S (szczepy A).
Fragment DNA Nhel o 6,6 kb, zawierający kasetę preSl oraz gen URA3 wydzielono z plazmidu pMPS9 (fig. 9). Fragment DNA Nhel zawierający gen S wydzielono z plazmidu pMPS2 (fig. 5). Fragmenty zligowano stosując ligazę T4 DNA, po czym połączone fragmenty zawierające po jednej kopii każdego z genów wydzielono z żeli agarozowych. Fragmenty te zastosowano do transformowania szczepu RB 10 Hansenula polymorpha aż do osiągnięcia niezależności od uracylu.
Uzyskane transformanty analizowano metodą blottinga Southerna, selekcjonując następnie klony zawierające po jednej zintegrowanej kopii każdej kasety. Szczep preS/S-A-293 zachowano do dalszej analizy.
b) Szczepy zawierające jedną kasetę ekspresji preS oraz szereg kaset ekspresji S (szczepy B).
Hansenula polymorpha stransformowano fragmentem Asp-718 pvul 0 5570 bp, z pMPS22 zawierającym kasetę ekspresji preS1. Wyselekcjonowano transformanty zawierające jedną zintegrowaną kopię kasety. Uzyskanym szczepem był preS-AM-405 opisany w części C, przykład XIII, powyżej.
Szczep preS-AM-405 stransformowano następnie plazmidami ulegającymi autonomicznie replikacji pRB-S-322 (promotor MOX) lub pBR-S-326 (promotor FMD) (fig.7), zawierającymi gen S pod kontrolą odpowiednich promotorów. Obydwa plazmidy dodatkowo zawierają gen kodujący odporność na gentamycynę G418 jaki selektywny marker. Gen Kan jest pod kontrolą promotora ADH1 z Saccharomyces cerevisiae (fig.7), jak to opisano powyżej. W wyniku transformacji uzyskano szereg szczepów zawierających w każdym przypadku jedną zintegrowaną kopię kasety preS1 oraz szereg zintegrowanych kopii (30-100) kasety zawierającej gen S, co wykazały analizy metodą blottingu Southerna i PFGE.
Szczepy preS/S-B-431, preS/S-B-432 i preS/S-B-433 zachowano do dalszej analizy. Szczep preS/S-B-431 przenosi gen S pod kontrolą promotora MOX, podczas gdy szczepy preS/S-B-432 i preS/S-B-433 zawierają kasety ekspresji obejmujące promotor FMD.
c) Szczepy zawierające szereg kaset ekspresji zarówno genu S jak i genu preS (szczepy C).
Hansenula polymorpha stransformowano plazmidem pMPS-22 ulegającym autonomicznie replikacji, zawierającym gen preS-1 (fig.8). W wyniku transformacji uzyskano szereg szczepów zawierających zmienne ilości kaset ekspresji zintegrowanych w jednym genomie. Izolaty zawierające 2-20 kaset ekspresji preSl zidentyfikowano metodą blottingu Southerna. Szczepy te opisane w części C jako preS-BM-402, preS-BM-403 i preS-BM-454, wytwarzają w wyniku ekspresji różne ilości antygenu preS. Takie szczepy preS stransformowano następnie ponownie plazmidami ulegającymi autonomicznie replikacji, pRB -S-322 (promotor mOX) i pRB-S-326 (promotor FMD), zawierającymi gen S (fig. 7). Jako marker transformacji zastosowano odporność na G418.
W wyniku selekcji stabilnych integrantów uzyskano szereg klonów w przypadku każdej z transformacji, przy czym część z nich poddano dalszej analizie.
Do dalszej analizy zachowano następujące szczepy: preS/S-C-452, preS/S-C-465 pochodzący ze szczepu preS-BM-402, szczep preS/S-C-466 pochodzący ze szczepu preS-BM-403, szczep preS/S-C-448-C4 pochodzący ze szczepu preS-BM-454, w których kasety ekspres i genu S zawierają promotor FMD.
W tabeli 3 przedstawiono szczegółowe informacje dotyczące pochodzenia i przeznaczenia wyżej wymienionych szczepów.
168 787
Tabela 3
Charakterystyka szczepów wytwarzających w wyniku ekspresji zarówno białko jak i S
Szczep Szacunkowa liczba kaset preS Szacunkowa liczba kaset S Ekspresja całkowita preS/S (Western mg/100 mg Reaktywność z AUSZYME jednostki umowne A492* Szacunkowy stosunek preS/S na podstawie lmmunoblo-tingu
preS/S-A-293 1 1 ok 0,3- 0,4 5,0 ok. 1.1
preS/S-B-431 1 ok.10 1,5-^,0 10-15 ok. 1.15
preS/S-B-43A 1 ok. 10-15 2,5-3,0 10-20 ok. 1 15
preS/S-B-433 1 ok.20 2,0-2,5 10-15 ok 1-20
preS/S-B-452 kilka > 30-50 3,0-4,0 20-30 ok. 1-8
ZreS/S-C-452 kilka > 30-60 3,5-4,5 15-25 ok. 1:10
presS/S-C-465 kilka > 30-50 3,5-4,5 25-35 ok. 1.5
preS/S-C-466 kilka > 50-80 3,5-1,5 25-35 ok. 1.8
preS/S-C-448 -C4 >20-30 > 10-20 3,0-3,5 10-20 ok. 5:3
Liczby reprezentuj najmniejsze i największe wielkości wyznaczone dla danego szczepu.
Przykład XV. Ekspresja białek preS i S w H. polymorpha
Ekspresję białek preS i S w różnych stransfoirmowanych szczepach H, polymorpha zbadano metodą immunoblottingu opisaną w części Materiały i metody, 5a oraz za pomocą testu AUSZYME. Podsumowanie wyników i właściwości różnych zbadanych szczepów podano w tabeli 3.
Szczepy wytwarzające w wyniku ekspresji zarówno białka preS jak i S hodowano i indukowano w sposób opisany w przykładzie XII, część B, z tym, że objętość hodowli wynosiła 30 ml. Surowe ekstrakty komórkowe przygotowano w sposób opisany powyżej i poddawano je elektroforezie na żelu SDS-poliakryloamidowym, a następnie blottingowi Westerna z wykorzystaniem do detekcji RF6 lub mieszanych przeciwciał monoklonalnych S1.1 i S2.1. 12-15 ggrurowych eksfraktów z indokowany cm metanolemmomórek czezepów preS/A-A-293, preS/S-B-431, preS/S-B-432, preS/S-B-m, preS/S-C-453, preS/S-C-465, preS/S-C-466 i preS/S-C-488-C4 poddawano immuzoblottingowi stosując do detekcji mozodlonalzy RF6. Analiza ta wykazała, że można uzyskać cały zakres szczepów wytwarzających w wyniku ekspresji białka preS i S w różnych .stusuzdany. Na podstawie tych i innych pomiarów immunoblortinguwyny oszacowano, że stosunek białka preS do S w przypadku szczepu'preS/S-B-431 wynosi około 1:15, w przypadku szczepu preS/S-C-452 około 1:8, a w przypadku szczepu preS/S-448-C4 około 5:3. Stwierdzono również, że szczepy różnią się poziomem wytwarzania białek, na co wskazują wyniki zarówno immunoblottingn jak i testu AUSZYME, przedstawione w tabeli 3. Dokonano także immuzoblottizgu ekstraktów komórkowych z tych szczepók z wykorzystaniem do dett^i^i^^ji monoklozalnego S1.1. W przypadku większości sznzezók' białko preS wykryto w postaci podwójnego pasma białkowego przy 38-39 kD z mniejszymi ilościami pasma 45 kD (które, jak to oszacowano, stanowi zaledwie około 5% całości wykrytego białka preS). W przenikieństkie do powyższego, szczep preS/-C-448-C4 wytwarza w kaziku ekspresji w przybliżeniu takie same ilości materiałów o 38-39 kD i 45 kD.
Przykład XVI. Stabilność obcego DNA
Stabilność obcego DNA w wyżej opisazacy trazsfoπnaztany i iztegrantacy preS/S analizowano w sposób opisany w części B. Badania wykazały bardzo dobrą stabilność mitotyczną zrekombizokanyny klonów. Analiza Sou^ema 12 ziezależzycy wydzielonych przed i po 40-pokolezlokej fermentacji szczepów preS/S-453 i preS/S-431 wykazała, że we wszystkich przypadkach zaobserwować można ten sam wzór fragmentów restrykcyjnych. Szczepy zestawione w tabeli 3, preS/S, analizowano ponadto metodą elektroforezy gradientowej w polu drgającym. Dokonano blottingu wydzielonych chromosomów na membranach nitrocelulozowych, po czym yabrydyzowazo je z różnymi radioaktywnymi sondami DNA. Procedura taka
168 787 umożliwia oszacowanie ilości kopii kasety ekspresji S. Potwierdziła ona ostatecznie, że szczepy preS/S są integrantami. Wyniki tych eksperymentów zestawiono w tabeli 3 powyżej.
Przykład XVII. Wydzielanie i charakteryzowanie kompozytowych cząstek a) Częściowe oczyszczanie kompozytowych cząstek z Hansenula polymorpha Hodowlę z fermentora, szczep preS/S-B-431 Hansenula polymorpha, hodowano w ośrodku S opisanym powyżej w Materiałach, 5d, po czym komórki oddzielono przez odwirowanie, po 78-godzinnej indukcji metanolem. Peletkę komórek ponownie zawieszono do stężenia około 120 suchej masy komórek/dm3, w buforze zawierającym 0,5% (wagowo/objętościowych ) Tween 20, 2 mM EDTA, 4 mM PMSF, 5% (objętościowych) izopropanolu i 50 mM bufor z fosforanu sodowego, o pH 9,0. Komórki rozbito w młynku perełkowym (Dynomill Type KLD, Bachofen AG, Bazylea, Szwajcaria) zawierającym perełki szklane o średnicy 0,45-0,7 mm, wykonując 4 przejścia z szybkością przepływu 6 dm3/godzinę przy czasie przebywania w komorze 7 minut.
Ekstrakt komórkowy wyklarowano w wyniku wirowania przez 45 minut przy przeciążeniu 16 000 g, w temperaturze 4°C, po czym ciecz znad osadu oddzielono.
Do cieczy znad osadu dodano 1% (wagowo-^lójęt^s^iowy) krzemionki koloidalnej (Aerosil 380, Degussa, Frankfurt, Republika Federalna Niemiec) i całość mieszano przez noc w temperaturze 4°C w celu doprowadzenia do adsorpcji HBsAg. Krzemionkę odwirowano w ciągu 30 minut przy 4000 g w temperaturze 4°C, po czym dwukrotnie przemyto 0,9% (wagowo-objętościowym) NaCl przez ponowne dyspergowanie peletki i ponowne wirowanie. HBsAg zaadsorbowany na krzemionce zdesorbowano przez ponowne zawieszenie przemytej peletki w 10 mM pirofosforanie sodowym o pH 9,5 i inkubowanie w ciągu 3 godzin w temperaturze 37°C, z mieszaniem. Bufor z pirofosforanu sodowego dodano w objętości stanowiącej około 1/8-1/10 początkowej objętości wyklarowanego ekstraktu komórkowego. Roztwór odwirowano przez 60 minut w temperaturze 4°C przy 17 000 g, po czym ciecz znad osadu oddzielono.
Do cieczy znad osadu dodano CsCl do uzyskania stężenia 1,5 M, po czym mieszaninę wirowano do uzyskania równowagi izopiknometrycznej, w ciągu 70 godzin z szybkością 45 000 obrotów na minutę, w wirniku 50.2 Ti (Spinco Division, Beckman Instruments, Palo Alto, USA. Uzyskane gradienty CsCl rozfrakcjonowano, po czym frakcje poddano analizie w celu wykrycia obecności HBsAg, z wykorzystaniem zestawu Elisa (Enzygnost, Behring-Werke AG, Marburg, Republika Federalna Niemiec), w sposób podany przez producenta. Frakcje pikowe połączono i dializowano względem 10 mM fosforanu sodowo-potasowego, 0,15 M NaCl, pH 6,8. Testy wykonane z tym materiałem oraz z surowym ekstraktem komórkowym wykazały, że przy zastosowaniu tej metodyki odzyskuje się 48% całości materiału reaktywnego według AUSRIA, mniej niż 3% całości białek, mniej niż 0,2% całości cukrów oraz mniej niż 2% całości lipidów.
Peletkę komórek szczepu preS/S-C-452 Hansenula polymorpha ekstrahowano również dokładnie takim samym sposobem, uzyskując podobne wyniki.
Próbki częściowo oczyszczonych preparatów HBsAg ze szczepów preS/S-B-431 i preS/SC-452 analizowano metodami elektroforezy żelowej i immunoblottingu z zastosowaniem monoklonalnych HBS1 i S1.1 jako detektorów HBsAg-podobnych białek, w sposób opisany w przykładzie XVII, poniżej.
Immunoblotting z monoklonalnym HBS1 wykazał obecność reaktywnego pasma przy 24 kD, a ponadto pasma o około 38/39 kD w obydwu preparatach. Immunoblotting z monoklonalnym S1.1 doprowadził do wykrycia jedynie białka preS 1-f^(M^^r^'wn^go w paśmie 38/39 kD, w obydwu preparatach.
Badania te wykazały, że zarówno białka preS1 jak i białka S ulegają współoczyszczaniu na drodze adsorpcji na krzemionce koloidalnej oraz izopiknometrycznego wirowania w gradiencie gęstości CsCl.
b) Wirowanie kompozytowych cząstek w gradiencie gęstości CsCl.
Pobraną z fermentora hodowlę szczepu preS/S-B-431 Hansenula polymorpha hodowano w ośrodku S (Materiały 5d), przy czym zbioru dokonano po 73 godzinach indukcji metanolem. Peletkę komórek oddzieloną po wirowaniu ponownie zawieszono, po czym ekstrakt komórkowy oddzielono przez przepuszczenie zawiesiny przez prasę French Press, w sposób opisany poniżej.
168 787
Komórkowe debris usunięto z pokruszonego lizatu na drodze wirowania erzze 30 minut przy 17 000 g. Surowe ekstrakty komórkowe wirowano 0o stanu równowagi przy 245 000 g,
1,5 M CsCl, w roztworzz s^oli buforowanym fosforanem 0o pH 7,5. Gradienty roefrakcjoyowayo. po czym ereżprowa0zoy.o analizę każdej z frakcji pod kątem aytygeniczyości, stosując testy ELISA (Enzygnost: BeCrlygwerke AG, Marburg, Republika Federalna Niemiec) specyficzne względem HBsAg oraz względem białka preS 1. W testach Enzygnost oznacza się tylko cząstki zgrupowanego HBsAg, w nie monomery białkowe. W teście Elisa spccytfcznym względem białka przSl stosuje się mysie moyoklonalnz przeciwciało S1.1 0o wychwytywania i detekcji antygenu, opisane poniżej w przykładzie XVIII, część D.
Szczytową aktywność HBsAg zaobserwowano przy gęstości 1,18-1,19 g/cm3, w gradiencie CsCl. Podstawowy pik białka preS 1 zaobserwowano przy tzj samej gęstości, wraz z pikiem ubocznym przy gęstości 1,26 g/cm3'.
Gradientowe frakcje analizowano również pod kątem obecności białka przS1 i białka S, metodą lmmuyohlottlygu. Po elektroforezie w żelu poliakrzloamidowzm z dodeezlosiarczayem sodu, zgodnie z Lazmmli’m (1970) i blottingu na yitroeeluloziz, Towbin i inni, 1979, arkusz nltroeeluloeowz iykuhowwnp z polikloyalną surowicą króliczą nastawioną na HBsAg pochodzący z surowicy. Detekcję wiązania przeciwciał wykonano metodą fosfatazy alkwllceyzj.
Zaobserwowano podstawowz pasmo białka przy 24 kD odpowiadające białku S oraz podwójne pasmo przy 38/39 kD. Maksymalną aktywność w lmmuyohlottiygu w przypadku wszysteiec trzech rodzajów białek zaobserwowano w przypadku frakcji w gradiencie CsCl o gęstości 1,18-1,19 g/dm3, co odpowiada pikowi aktywności HBsAg ustalonemu w tzkściz Eyeygyost. Oznacza to, żz większość białek powierzchniowego antygenu HBV w surowym ekstrakcie występuje w strukturach lipoprotelyowzch o gęstości charakterystycznej dla HBsAg.
Kolejny arkusz nitrocelulozy farbowano z mysim moyoklonalyym prezciwciwłzm S1.1. Przeciwciało to wykrywało .jedynie pasma białek przy 38/39 kD, we frakcjach odpowiadających gęstości CsCl 1,18-1,19 g/cm. Surowz ekstrakty komórkowe poddano twkżz strefowemu wirowaniu w gradiencie sacharozy. Surowz ekstrakty komórkowe wprowadzono 0o 5-20% (wagowo-objętościowo) gradientów sacharozy przygotowanych w 50 mM buforze Tris-HCi o pH 8,1, po czym wirowano przy 288 000 g w ciągu 200 minut. Gradienty roefrakejoypwayo, i analizowano frakcje na obecność HBsAg z wykorzystaniem testu Enezgypst Elisa oraz na obecność HBsAg zawierającego białko preS 1 preee wychwyt antygenu za pomocą przeciwciał specyficznych Ola HBsAg, z testu Enzygnost i detekcję za pomocą Mwb S1.1 specyficznego względem białka przS 1. Test Enzygnost wykazał obecność piku o aktywności HBsAg sedymentującego preee gradient.
Test Mab. 1.1. Elisa wykazał obecność tego samego piku, co tzst Eyezgyost, ale z ramieniem aktywności roeclągająezm się do większych gęstości sacharozy. To ramię materiału o większym współczynniku sedymentacji jest wyzlimiyowaye, gdy surowz ekstrakty ze szczepu przS/S-B-431 Hansenula polymorpha częściowo oczyszcza się metodą adsorpcji/dzsorpcji na krzemionce koloiOwlyżj i odwirowuje się w gradiencie CsCl przed wirowaniem w gradiencie gęstości sacharozy. Wyniki tz wykazują, żz HBsAg i białko preSl ulegają wseółsedzmeytacjl w gradientach gęstości CsCl i wykazują charakterystykę gęstości cząstek llppprotzlyowzcC.
c) Aytzgznowość kompozytowych cząstek HBsAg wytworzonych w wyniku ekspresji w Hansznula polymorpha.
Cząstki powiżrecCyipwego antygenu HBsAg z surowego ekstraktu szczepu przS/S-B-431 Hansznula eolzmorpha oczyseczpyo częściowo w sposób opisany powyżej w punkcie a Preparat ten badano pod kątzm reakcji z mysimi przeciwciałami moyoklonalnzmi /Mabs/ skierowanymi przeciw zpitopom elokalleowayzm w regionach preSl, preS2 i S białka powierzchniowego antygenu oraz pod kątem obecności receptora polimerów' albuminy z ludzkiej surowicy (receptora pHSA) w regionie preS2.
C7. Rzakcja z MwbS/.
Mysiz monokloyalye przeciwciało (Mab)S 1.1 skierowant przeciw epitopowi przS 1 białka powierzch^iowzgo antygenu HSV zastosowano w czlu wykrywania obecności tzgo miejsca na cząstce kompozytowej, w tzście ELISA. MabS 1 pokryto zagłębienia płytki do mikromianowania (Immuypplate I; Nunc, Gibco Europę, Ghent, Belgia), po czym prowadzono inkubację z
168 787 częściowo oczyszczonym surowym ekstraktem. Po przemyciu w celu usunięcia nie związanego materiału wychwycenie reaktywnych cząstek potwierdzono prowadząc inkubację z MabS 1.1 sprzężonym z poroksydażą chrzanową, metodą Wilsona i Nakame, 1978.
Wywołanie barwne potwierdzające wiązanie drugiego przeciwciała wykonano stos iłując o-fenyyenodiaminę jako chromogen. Absorbancję mierzono przy 490 nm (względem fi/tru wzorcowego przy 620 nm) w urządzeniu Intermed Immunoreader, NJ 2000 (Analis, Ghent, Be/gia).
Częściowo oczyszczony ekstrakt szczepu preS/S-B-431 Hansenula polymorpha dawał reakcję dodatnią w próbie, świadczącą o wychwytywaniu i wiązaniu MAbS1.1, która jest specyficzna dla regionu preSl. Oczyszczone cząstki powierzchniowego antygenu zawierające jedynie białko S, z S.corovislae RIT4376 (Harford i inni, 1987) nie dawały reakcji w tym teście.
C2. Reakcja z Mab.S'2.5
Mysie monoklonalne przeciwciało S2.5 jest skierowane przeciw regionowi preS2 powierzchniowego antygenu HBV. To Mab zastosowano w teście ELISA w celu stwierdzenia obecności epitopu preS2 na cząstkach kompozytowych. MabS2.5 pokryto zagłębienia płytki do mlkromianowanla, po czym prowadzono inkubację z częściowo oczyszczonym ekstraktem komórkowym z Hansenula po/ymorpha preS/S-B-431. Wiązanie antygenu potwierdzono na drodze inkubacji Z MabS2.5 sprzężonego z peroksydazą chrzanową, oraz barwnego wywoływania w sposób opisany powyżej. W przeprowadzonym teście częściowo oczyszczany ekstrakt komórkowy z Hansenu/a po/ymorpha preS/S-B-43 1 dawał reakcję dodatnią, co wskazywało na obecność epitopu regionu preS2 na cząstkach powierzchniowego antygenu. Cząstki powierzchniowego antygenu zawierające wyłącznie oczyszczone białko S z S. cer^vislae RIT4376 nie dawały reakcji w tej próbie
C3. Reakcja z Mabs RF1 i S1.1 (HRP)
Mysie monokłona/ne przeciwciało RF1 (H. Thomas, Royal Free Hospital, Londyn), skierowane przeciw epitopowi zależnemu od konformacji, zlokalizowanemu w regionie S, zastosowano w teście ELISA. Mab ten zastosowano do powlekania zagłębień w płytkach do mlkromianowanla, po czym prowadzono inkubację z częściowo oczyszczonym ekstraktem szczepu preS/S-B-431 Hansenula polymorphc. Wiązanie cząstek, potwierdzono na drodze inkubacji MabS1.1 sprzężonego z poroksydczą chrzanową, w sposób opisany w części Ci powyżej. Częściowo oczyszczony ekstrakt z Hcnjenąla polymorpha dawał w tej uróbie reakcję dodatnią, podczas gdy oczyszczone cząstki powierzchniowego antygenu z S. corevislao RIT4376 nie dawały reakcji.
C4. Tes dotyczący receptora pHASA
Test na wykrywanie receptora pHSA obecnego w regionie preS2 wykonano zgodnie z procedurą Pontisso i innych (1983). Spolimeryżowaną albuminą z ludzkiej surowicy pokryto zagłębienia w płytce do mlkromianowanla, po czym prowadzono inkubację z częściowo oczyszczonym ekstraktem komórkowym szczepu preS/S-B-431 Hansenu/a polymorpha Po przemyciu w celu u^^nlęcia nlezwlązanego materiału cząstki wychwycone na płytce wykrywano prowadząc inkubację z poliklonalnymi przeciwciałami króliczymi przeciw-HBsAg, znaczonymi J125 (zestaw AUSAB). Częściowo oczyszczony ekstrakt z Hansenula polymorpha daje w tej próbie reakcję dodatnią, podczas gdy oczyszczony HBsAg z S. eorevlsiae RIT4376 nie daje reakcji w tej próbie.
Powyższe wyniki wykazały, że HBjAg-reaStypny materiał występujący w częściowo oczyszczonym ekstrakcie z Hansenula uolymorpha zawiera miejsca antygenowe specyficznie ρiązane przez Mabs skierowane przeciw epltopom w regionach preS 1, preS2 i S powierzchniowego antygenu HBV, oraz że materiał ten zawiera również miejsce reagujące z pHSA.
d) Imm^^^^^o-str^}c'anle cząstek kompozytowych
W celu stwierdzenia, że materiał reaktywny w teście AUSRIA, wyjtę'uąjąey w częściowo oczyszczonym ekstrakcie szczepu ^^^-8-431 Hansenula po/ymorpha zawierał cząstki kompozytowe, przeprowadzono immąΓlO-jtrąeanię z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla białka preS 1.
168 787
Immonokompleksy wychwycono przez utrwalone formaliną komórki Staphylococcus aureus (Staph A) (immunoprecipitin, BRL, Gaithesburg, MD, USA), stosując przeciwmysią surowicą królika jako przeciwciało przekładowe między przeciwciałem monoklonalnym i komórkami Staph A. Komórki Staph A poddano wstępnej obróbce, zgodnie z zaleceniami dostawcy, po czym ponownie zawieszono uzyskując 10% (wagowo-objętościowo) zawiesinę w PBS. Komórki Staph (120 μΐ 10% wag-obj. zawiesiny) inkubowano następnie z 20 μΐ przeciwmysiej surowicy króliczej (RAM) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Kompleks StaphA-RAM odwirowano, przemyto dwukrotnie pBs zawierającym 0,1% obj. Tween 20 i na koniec ponownie zawieszono do uzyskania około 10% (wag.-obj.) zawiesiny w PBS zawierającym 0,1% obj. Tween 20.
Do częściowo oczyszczonego preparatu cząstek szczepu preS/S-B-431 Hansenula polymorpha, otrzymanych w sposób opisany powyżej, oraz do próbki cząstek HBsAg pochodzącego z drożdży białka S (partia HB193, Smith Kline Biologicals, Rixensart, Belgia), z których każda zawierała po 2 fig materiału reaktywnego w teście AUSRIA, w 500 gl, dodano 1 gl MabSl.l (638 fig białka na ml) i mieszaniny inkubowano w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Z kolei dodano 20 gl kompleksu Siaph A-RAM i inkubację kontynuowano przez noc w temperaturze 4°C.
Utworzone immunokompleksy odwirowano, przemyto 5 razy PBS zawierającym 0,1% obj. Tween 20 i raz samym PBS, przed ponownym zawieszeniem peletek w buforze do prowadzenia elektroforezy na SDS-żelu poliakryloamidowym. Wytrącone immuno-osady analizowano metodą immunoblottingu w sposób opisany poniżej, stosując mysie monoklonalne przeciwciało RF6 (H. Thomas, Royal Free Hospital, Londyn) do wykrywania składników zawierających białko HBsAg. Monoklonalne przeciwciało RF6 skierowane jest przeciw epitopowi odporności na denaturację i redukcję w HBsAg pochodzącym z osocza i konkuruje w wiązaniu z monoklonalnym HBS1.
Immonoblotting wykazał, że immuno-strącenia uzyskane z cząstek Hansenula polymorpha preS/S-B-431 zawierały nie tylko białko preS 1, ale również białko S, podczas gdy immuno-strącenia z HBsAg pochodzącego z Saccharomyces nie zawierały białka S.
Potwierdza to, że kompozytowe cząstki o mieszanym składzie polipeptydowym występują, w oczyszczonym częściowo materiale z ekstraktów komórkowych szczepu preS/S-B-431 Hansenula polymorpha.
e) .Mikroskopia elektronowa
Częściowo oczyszczone cząstki HBsAg ze szczepu preS/S-B-431 Hansenula polymorpha zbadano w mikroskopie elektronowym. Materiał rozcieńczono 20 mM buforem Tris-HCl o pH 8,2, z 0,1% wag.-obj. albuminy z surowicy bydlęcej, po czym osadzono na siatkach miedzianorodowych pokrytych błoną z cełloidyny, przed barwieniem octanem uranylu. Obserwacje w mikroskopie elektronowym wykazały obecność sferoidalnych do kulistych cząstek o przeciętnej średnicy 27 nm. Wielkość ta leży w zakresie przeciętnej średnicy cząstek zmierzonej w ten sam sposób dla szeregu oczyszczonych preparatów HBsAg ze szczepu RIT4376 S cereMsiac. (J.Petra i in., Postgrad. Medical Suppl., 2,73-81 (1981)).
Przykład XVIII. 5. Porównanie kompozytowych cząstek wytworzonych w wyniku ekspresji w Hansenula polymorpha i S. cerevisiae.
Hodowle szczepu preS/S-C-453 Hansenula polymorpha i szczepu Y1108 S. cerevisiae hodowano w ośrodku S, w sposób opisany w Materiałach, 5 d. Szczep Y1108 jest diploidalnym .szczepem S. cerevisiae wytwarzającym w 'wyniku ekspresji zarówno białko preS 1 jak i S, z kaset ekspresji zintegrowanych w genomie przez wektory Ty. Szczep zawiera 5-7 kopii kasety ekspresji preSl oraz 3-4 kopie kasety ekspres]i S. Do wzrostu szczepu konieczna jest obecność tryptofanu.
Konstrukcja i integracja chromosomowa takich kaset ekspresji z zastosowaniem wektorów Ty opiśana jest w zgłoszeniu patentowym USA nr 07/292 202. Jako źródło węgla do wzrostu Hansenula polymorpha zastosowano glicerynę w ilości 1,5% wag-obj. Kilka 2-litrowych kolb Erlenmeyera zawierających po 400 ml ośrodka zaszczepiono szczepem preS/S-C-453, po czym prowadzono inkubację w wytrząsarce obiegowej w ciągu około 33 godzin w temperaturze 30°C, do wyczerpania gliceryny. Komórki z trzech kolb odwirowano, a peletkę komórkową prze168 787 chowywano w temperaturze -70°C przed późniejszym wykorzystaniem. Z każdej z 6 kolb odlano po 100 ml ośrodka hodowli i zastąpiono go 100 ml świeżego ośrodka zawierającego 4% wag.-obj. metanolu, po czym kontynuowano inkubację.
Trzy hodowle zebrano przez odwirowanie po dalszych 14 godzinach inkubacji, a kolejne 3 po 38 godzinach inkubacji w obecności metanolu. Komórki odwirowano, a peletkę komórkową przechowywano w temperaturze -70°C przed dalszą obróbką. W drugim eksperymencie kultury
S.cerevisiae Y1108 hodowano w sposób opisany powyżej, zbierając je po 19,5 godzinach inkubacji. Kultury Hansenula polymorpha preS/S-C-453 również hodowano w sposób opisany powyżej, z tym, że komórki zbierano po 26 godzinach wzrostu w ośrodku glicerynowym i po 45 godzinach w ośrodku zawierającym metanol.
Peletki komórek Hansenula polymorpha ponownie zawieszono, aż do uzyskania stężenia około 25% wag.-obj. wilgotnych komórek w buforze zawierającym 0,5% wag.-obj. Tween 20, 2 mM EDTA, 4 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu), 5% wag.-obj. izopropanolu i 50 mM fosforan sodowy, pH 9,o. 10 ml uzyskanej mieszaniny przepuszczono 6 razy przez prasę Press pod ciśnieniem 140 MPa w celu rozbicia komórek. Surowy ekstrakt komórkowy 'wyklarowano na drodze odwirowania przy 17 000 g w ciągu 45 minut w temperaturze 4°C, po czym ciecz znad osadu oddzielono. Peletki komórkowe S. cerevisiae obrabiano w identyczny sposób, z tym że komórki zawieszono do uzyskania stężenia około 50% wag.-obj. wilgotnych komórek w buforze opisanym powyżej.
Zawartość białka w każdej z cieczy znad osadów oznaczano metodą Lowry’ego i innych (1951). Wyklarowane ekstrakty komórkowe analizowano pod kątem obecności HBsAg stosując test AUSRIA i pod kątem obecności epitopu białka preS 1 stosując test Elisa. Zagłębienia w plastikowych tackach (Nunc Immunoplate 1, Gibco Europe, Ghent, Belgia) powleczono mysim przeciwciałem monoklonalnym S1.1 w 50 mM wodorowęglanie sodowym jako buforze o pH 9,6, w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C, po czym roztwór przeciwciał usunięto. Zagłębienia zablokowano prowadząc inkubację z roztworem PBS zawierajacym 1% wag- obj. albuminy z surowicy bydlęcej, w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C.
Wykonano dwa kolejne dwukrotne rozcieńczenia ekstraktów komórek w PBS, dodano następnie do zagłębień 0,2% wag.-obj. albuminy z surowicy bydlęcej i prowadzono inkubację w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C.
Zagłębienia przemyto następnie 3 razy roztworem zawierającym 0,9% wag.-obj. NaCl i 0,05% wag.-obj. Tween 20. Wychwytywanie przeciwciał potwierdzono prowadząc inkubację z monoklonalnym przeciwciałem S1.1, sprzężonym z peroksydazą chrzanową, w sposób opisany przez Wilsona i Nakane (1978).
Do każdego z zagłębień dodano skomugowanego przeciwciała w PBS, 0,2% wag.-obj. albuminy z surowicy bydlęcej, po czym prowadzono inkubację w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C. Wiązanie drugiego przeciwciała potwierdzono dodając 100 gl roztworu zawierającego 4 mg o-fenylenodiaminy (Sigma) i 15 μ1 madtlenku wodoru rozpuszczonego w 10 ml 0,1 ml 0,1 M,KH2PC>4, pH 6,0 i prowadząc inkubację w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję zablokowano dodając 25gl IN H2SO4, po czy zmierzono gęstość optyczną przy 490 nm (wobec filtru wzorcowego 620 nm) w urządzeniu Intermed Immunoreader, NJ200 (Analis, Ghent, Belgia).
Wyniki wyliczano z liniowych części uzyskanych krzywych gęstości optycznej, przedstawiając je w jednostkach gęstości optycznej (OD) na mg białka.
Ilość HBsAg 1 białka preS1 reagującego w teście AUSRIA, wyznaczoną w komórkach (ekstraktach) S. cerevisiae i Hansenula polymorpha, z dwóch eksperymentów, przedstawiono w tabelach 4 i 5. Ilości materiałów reaktywnych w teście AUSRIA, stwierdzono w surowych ekstraktach z S. cerevisiae, szczep Y1108, są około 100 razy mniejsze od ilości w ekstraktach z Hansenula polymorpha preS/S-C-453 indukowanego w ciągu 38-45 godzin w metanolu. Ilość białka preS stwierdzona w próbie Elisa jest około 3-8 razy mniejsza, co oznacza, iż w szczepie Y1108 S. cervisiae stosunek białka preS do białka S jest znacznik większy niż w szczepie preS-S-C-453 Hansenula polymorpha.
168 787
Tabela 4
Test AUSRIA w przypadku surowych ekstraktów komórkowych
Ekstrakt komórkowy Nr kolby Białko (mg/ml) τ τη „λ_/*ττοητ*\ (AUDIMAj % całkowitej ilości białka Białko pieS1 (Elisa), jednostki OD na mg białka
S cer^sue a 16,2 0,011 2,9
Y1108 b 18,0 0,008 3,0
c 12,0 0,010 4,4
H polymorpha a 6,8 0,077 2,4
preS/S-C-453 b 7,4 0,123 2,3
hodowla w c 9,2 0,143 1,7
glicerynie
Indukowanie a 5,5 1,15 9,2
metanolem d 7,0 1,40 11,3
38 godzin c n a 7 ,4 1,46 O o 0,0
Tabela 5
Test AUSRIA w przypadku surowych ekstraktów komórkowych
Ekstrakt komórkowy Nr kolby Białko (mg/ml) HBsAg (AUSRIA) % całkowitej ilości białka Białko preS1 (Elisa), jednostki OD na mg białka
S.errevlsae a 13,3 0,009 8,3
Y1108 b 15,0 0,015 9,7
c 17,1 0,013 8,9
H. polymorpha a 8,4 0,070 1,3
preS/S-C-453 b 8,2 0,061 0,3
hodowla w c 7,9 0,082 0,3
glicerynie
Indukowanie a 6,3 1,106 4,1
metanolem b 6,5 1,314 6,8
45 godzin c 7,7 1,688 5,1
Wyniki te potwierdzono przeprowadzając immunoblotting ekstraktów z pierwszego eksperymentu oraz ekstraktów hodowli indukowanych metanolem, szczepów 454 i 448-C4 jatko szczepów kontrolnych.
Próbki zawierające 15 ugbialkopoddono elektroforezieprzez 12,5 zfcj^a^rm^ij^’cjąc^ 12,5 % rozdzielające żele, zgodnie z metodą Laemmli’ego (1971), po czym poddano immunoblottidgowi w sposób opisany w Materiałach i Metodach 5a, z zastosowaniem do detekcji monoklodalnego HBS1.
Ekstrakty ze szczepu preS/S-C-453 wykazują silnie reaktywne pasmo przy 24 kD, zbliżone do białka S oraz pasmo przy 38-39 kD zbliżone do białka preS. Pasmo 45 kD jest słabo wykrywalne. W przeciwieństwie do powyższego ekstrakty z S. cerevisiae, szczep Y1108, wykazują słabe pasma przy 24 kD i 45 kD. Pasmo dubletowe 38-39 kD białka preS jest słabo wykrywalne. Wyniki immunoblottidgu potwierdziły, że S. cerevisiae wytwarza w wyniku ekspresji mniej białka S i preS niż Hansenula polymorpha indukowany metanolem, oraz że białko wytworzone w wyniku ekspresji (jako białko preS) z S. cerevisiae jest przede wszystkim w formie glikozylowadej o 45 kD.
Przykład XIX. Mikrystrloilowadle białka preS w Hansenula polymorpha
Kultury szczepu LR9, szczepy 452 i 453 hodowano w wytrząsanych kolbach, w ośrodku minimum, z 2,5% obj. gliceryny w ciągu 24 godzin, po czym dodano 1% obj. metanolu. 6 godzin po dodaniu metanolu dodano znaczony trytem kwas mirystynowy i inkubację hodowli konty168 787 nuowano przez 16 godzin. Komórki zebrano, przemyto i rozbito szklanymi perełkami w obecności 1 % SDS i β-merkaptoetanolu. Wyekstrahowane białka oddzielono na drodze elektroforezy na SDS-żel PAGE, po czym wizualizowano je metodą immunoblottingu z monoklonalnym HBS1 i fluorograficznie. Wyniki wykazały, ze pasmo odpowiadające białku preS1 przy 38/39 kD ulegało znakowaniu w przypadku ekstraktów ze szczepów 452 i 453, ale nie uległo znakowaniu w przypadku ekstraktu ze szczepu DR9. Zgadza się to z post-hranslacyinym usuwaniem N-końcowej metioniny i mirystyloilowaniem reszty glicynowej przy pozycji 2 w polipeptydzie (Towler i Gordon, Ann. Rev. Blochem., 57:69-99, 1988).
Przykład XX. Immunogenlczsość antygenów preS z Hansenula polymorpha
Z hodowanych w obecności metanolu kultur szczepów 452 i 454 wykonano surowe ekstrakty białkowe i zaadsorbowano je na wodorotlenku glinu do uzyskania ostatecznego stężenia 1 mg/ml. Zawartość epitopu preS1 w każdym z ekstraktów zmierzono techniką ELISA z zastosowaniem jako wzorców monoklonalnego przeciwciała S 1.11 częściowo oczyszczonego białka preSl z S. cerevisiae. Immunokompleksy do wstrzykiwania wykonano również prowadząc inkubację 600 gl monoklonalnego przeciwciała S1.1 z 1 ml Sepharose Protein G 4 Fast Flow (otrzymanego z Pharmacia IXB, Bruksela, Belgia) w ciągu 2 godzin w temperaturze 4°C. Mieszaninę odwirowano następnie, przemyto PBS i uzyskaną peletkę ponownie zawieszono w 1 ml PBS. 250 gl tej zawiesiny dodano do 3,4 ml każdego z surowych ekstraktów komórkowych i uzyskane mieszaniny inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze 20°C.
Po inkubacji mieszaninę Sepharose Protein G(S 1.1) surowe białko odwirowano, a peletkę zawieszono w 10 ml fosforanie sodowym jako buforze. Połowę tego materiału zaadsorbowano na wodorotlenku glmu do uzyskania ostatecznego stężenia 1 mg/ml.
Grupom po 5 myszy BAlb/c wstrzyknięto dootrzewnowe 4 preparaty. Po upływie miesiąca myszom zaaplikowano dodatkowy zastrzyk z zaadsorbowanych na wodorotlenku glinu 1 gg cząstek, częściowo oc/vs/czonvch, z hodowanej w obecności metanolu kultury szczepu 453. Po upływie ] 5 dni myszom upuszczono krew. Miana przeciwciał anty-S, anty-preS2 i anty-preSl w surowicy wyznaczono w sposób opisany powyżej.
W tabeli 6 przedstawiono miana odpowiednich przeciwciał indukowane w myszach Balb/c, wyrażone jako miana średnie geometryczne (GMT).
Wyniki te wskazują, że przeciwciała anty-preS są indukowane u myszy, którym wstrzyknięto ekstrakt zawierający preS1-S2-S (szczep 454) lub ekstrakt zawierający cząstki kompozytowe (szczep 452), po uzupełnieniu cząstkami kompozytowymi (szczep 453).
Tabela 6
Preparat gg wstrzyknięto antygenu (a) (b) a-HBS GMT mIU/M a-120-145 GMT (c) a 12-32 GMT (c) a 32-47 GMT (c)
Szczep 454 ekstrakt surowy 222 17755 688 240 612
immunoprecypitat 155 616 518 59 1400
Szczep 452 ekstrakt surowy 48 124803 426 59 < 100
immunoprecypitat 48 119903 487 64 784
Uwagi.
(a) W stosunku do antygenu preS1-S2-S z S cerevisiae (b) Wszystkim myszom zaaplikowano zastrzyki w 30 dniu (dodatkowo) zawierające częściowo oczyszczone cząstki ze szczepu 453 (c) Miana wyrażono jako odwrotności rozcieńczenia, przy którym uzyskuje się gęstość optyczną (OD) 1,0
168 787 raojt
- Hansenula DNA -t>j
Fragment ożyły do otrzymania promotera I
ECORI tag λ
FF8D
11527 hp j
ORF
Hansenula DNA
EcoRI lag λ
Fragment użyty do otrzymania promotora
EcoRI BamHI BamHI BamHI EcoRI
EcoRI tag λ | tłOOłpi .Γ~Ί..
tag λ
ORF
Fig. 2
Fig. 3
168 787
-s·
ŁŁ168 787
Pst I
EcoRI \ Nhel Bgl II
Bam Η I Xbal
Nhe I'Hind ΙΙΙ'ίχ ba l\ Hind li© !stu l/Bso Μ II) E“ R Nco I >Pst 1 ,ęPy k°nleC ' Bgl II ,Sgf II Hind III Eco RI (Xco liSal I) tępy koniec
Eco RI
Nhe I Bgl II
EcoRI
Ncol I Hind III
Bgl II
Hind III EcoRI (Xho l/Bam HI) Ps,l *ępy koniec
Fg. 5
Nco I Xba I
Κρη I
Hind llU(stu l^sp M II) Nco) \Pstl tępy koniec Bgl II
168 787
EcoRI
Sali XSal Hind III
EcoRI
Ncol
Bgl II
Xbal
EcoRI Bgl II
BamHI BspKl || (Stul/Asp 718) tępy kSRicc
EcoRI EcoRI Pstl ‘ Barn ΗI
Hind III Bglll Hind III EcoRI (Xho/Sal) tępy koniec
Psil
Pstl
Psil
Fg. 9
Ncol seknOncje H. nslymoniua
i qas ί ΝΝ ia 033 (ίί ροψ u iBg III PU'H
I ms
II l6g ia°oa ii i6g ia 033 iii py?H II 160 III Pu!H
IH033 m ''-ta π i5g
CT
168 787
Fig. 11
168 787
pra S2
(ARG 3
Sal I
Fig. 13
168 787
Fg. 14
168 787
HBHadw -1> pRIT1Q81@ (HBC,)
V pRIT 10633 (HBQ1J
. Trawienie Bal I. Bam Hl/Tft poHmeraza - Ligacja
BstX * Ban ATG Xbal
B RIT 13189 -----1--1-1—
52-χ ©133 175 ofwaift za pomocą Bam ΗI, Xba I + SjmŁ adaptor+ fragmstó Nco I Xba I z pRIT 12331 pRIT 131 SI
BsfX i
Bam '133'
145
ATG /175
Xba j
PRIT 13191
BstX
Xba I Sal I + fragment Xba I Sal I zpRfT 12860
Bzns ATG Xba _ j_145 , ,
52\ ©133 \x'l75
BstX
Fig. 15
168 787
EeeR I
otmrty za psmse? Sae I -Barn Η l trahWeany nalintarazą TA
Fig. 16
168 787
ECORI
Sft
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 6,00 zł

Claims (5)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania cząstki kompozytowej zawierającej co najmniej dwa polipeptydy odpowiadające całości lub części białka o aktywności antygenu powierzchniowego Hepatitis B, znamienny tym, że hoduje się w odpowiednim podłożu, w warunkach, w których zachodzi synteza białka, szczep drożdży metylotroficznych stransformowany wektorem zawierającym cząsteczkę DNA obejmującą kasetę ekspresji (ecl) kodującą pierwszy polipeptyd i/lub kasetę ekspresji (ec2) kodującą drugi polipeptyd i/lub kasetę ekspresji (ec3) kodującą trzeci polipeptyd, przy czym kasety ekspresji zawierają: a) regulon R czuły na metanol i/lub usunięcie źródeł węgla powodujących represję kataboliczną, b) otwartą ramkę odczytu kodującą całość lub część białka wykazującego aktywność biologicznąjednego z powierzchniowych antygenów Hepatitis B oraz
    c) ewentualnie sekwencję DNA służącą jako terminator T, z tym, że R kontroluje transkrypcję ramki odczytu, a T kieruje poliadenylacją i/lub tenminacją transkrypcji wytwarzanego mRNA.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwszy polipeptyd odpowiada całości lub części białka S, drugi polipeptyd odpowiada całości lub części białka preSl, a ewentualny trzeci polipeptyd odpowiada całości lub części białka preS2, albo drugi polipeptyd odpowiada całości lub części białka preS2.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że drożdże metylotroficzne wybrane są z gatunków rodzaju Candida, Kloekcera, Saccharomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Pichia i Hansenula.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że regulon pochodzi z genu biorącego udział w wykorzystaniu metanolu, korzystnie z genu MOX, genu FMD, genu DAS lub genu katalazy, przy czym geny te najkorzystniej pochodzą z Hansenula polymorpha.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze drożdże metylotroficzne wybrane są spośród Hansenula, korzystnie z Hansenula polymorpha, a najkorzystniej ze szczepu wykazującego identyfikacyjną charakterystykę Hansenula polymorpha RB 1θ (DSM 5215).
    Sposób wytwarzania cząstki kompozytowej.
PL90304769A 1989-08-03 1990-07-25 Sposób wytwarzania czastki kompozytowej PL PL168787B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38918489A 1989-08-03 1989-08-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL168787B1 true PL168787B1 (pl) 1996-04-30

Family

ID=23537201

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL90304769A PL168787B1 (pl) 1989-08-03 1990-07-25 Sposób wytwarzania czastki kompozytowej PL
PL90304768A PL168408B1 (pl) 1989-08-03 1990-07-25 Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL90304768A PL168408B1 (pl) 1989-08-03 1990-07-25 Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL

Country Status (2)

Country Link
US (1) US6103519A (pl)
PL (2) PL168787B1 (pl)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030044982A1 (en) * 2001-04-25 2003-03-06 Kenneth Chien Method to treat hemophilia by hepatic gene transfer of factor VIII/IX with vesicle vector
CN100381171C (zh) * 2004-12-30 2008-04-16 成都生物制品研究所 含前s1、前s2和s抗原决定簇的乙肝表面抗原复合颗粒
WO2006113528A2 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Expressing hepatitis b virus surface antigen for vaccine preparation
US20090098531A1 (en) * 2007-09-13 2009-04-16 Abbott Laboratories Detecting hepatitis b virus
US20100136520A1 (en) * 2007-09-13 2010-06-03 Abbott Laboratories Detecting hepatitis b virus
HU231053B1 (hu) * 2011-09-08 2020-03-30 Szegedi Tudományegyetem Rézrezisztens, fengicin hipertermelő Bacillus mojavensis törzs növényi kórokozók elleni védekezésre, alkalmazása és az ezt tartalmazó készítmények

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769238A (en) * 1981-08-04 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Synthesis of human virus antigens by yeast
US4722840A (en) * 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
EP0288198A3 (en) * 1987-04-20 1989-03-29 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of peptide
EP1088830A3 (en) * 1987-06-22 2004-04-07 Medeva Holdings B.V. Hepatitis b surface antigen particles
JPH0678317B2 (ja) * 1987-07-15 1994-10-05 シェリング・コーポレーション 縮合ベンズアゼピン
DE3789866T2 (de) * 1987-07-17 1994-09-22 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh DNA-Moleküle, die für FMDH-Kontrollabschnitte und Strukturgene für ein Protein mit FMDH-Aktivität kodieren, sowie deren Anwendung.
IL90161A0 (en) * 1988-05-13 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of hepatitis b s and pres2 proteins in methylotrophic yeasts
EP0414374B1 (en) * 1989-07-25 1997-10-08 Smithkline Biologicals S.A. Novel antigens and methods for their preparation

Also Published As

Publication number Publication date
PL168408B1 (pl) 1996-02-29
US6103519A (en) 2000-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3069907B2 (ja) 新規な抗原物質及びその製法
AP56A (en) Hepatitis B virus surface antigens and hybrid antigehs containing them.
KR940005588B1 (ko) 효모에서 b형 간염 바이러스 단백질을 제조하는 방법
US6306625B1 (en) Method for obtaining expression of mixed polypeptide particles in yeast
JP3228737B2 (ja) キメラヘパドナウイルスコア抗原蛋白
DK169152B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af et antistof mod HBsAg
EP0522030B1 (en) Hepatitis b vaccine
US6475489B1 (en) Synthesis of human virus antigens by yeast
JPH08198897A (ja) ＨＢｓ抗原の免疫原特性を有し、ＨＢｓ抗原により担持されたエピトープに対して外来の抗原部位を担持する粒子及びかかる粒子の産生法
JPH08317796A (ja) 肝炎ｂ型ウイルスワクチン
PL168787B1 (pl) Sposób wytwarzania czastki kompozytowej PL
HUT67435A (en) Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles
WO1994001132A1 (en) VACCINE COMPRISING MIXED preS1+preS2+S AND CORE PARTICLE
EP0533263A2 (en) A multivalent hepatitis B virus vaccine
EP0340806B1 (en) Synthesis of human virus antigens by yeast
WO1995031558A1 (en) Process for producing hbv surface proteins
IE67139B1 (en) Synthesis of human virus antigens by yeast
DD274052A5 (de) Verfahren zur Herstellung von Rekombinanten Hbv-, Hiv- oder Plasmodium-Oberflächenproteinen bzw. Hybridpartikeln