DD274052A5

DD274052A5 - Verfahren zur Herstellung von Rekombinanten Hbv-, Hiv- oder Plasmodium-Oberflächenproteinen bzw. Hybridpartikeln

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Publication number: DD274052A5
Authority: DD
Publication date: 1989-12-06

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Oberflaechenproteinen bzw. Hybridpartikeln von HBV, HIV oder Plasmodium, bei dem man ein HBV-, HIV- oder Plasmodium-Gen, das fuer das entsprechende Oberflaechenprotein codiert, oder einen Teil des Gens in Ablesephase an das 3-Ende mindestens eines Teils der Pre S2-Region des HBV-Genoms ligiert, wobei dieser Teil so gross ist, dass er fuer ein immunogenes Protein codiert, dieses Fusions-DNA-Molekuel an eine Expressionskontrollsequenz eines Expressionsvektors funktionell ligiert, das erhaltene rekombinante DNA-Molekuel in einen eukaryontischen Wirtsorganismus einschleust, den erhaltenen transformierten Wirtsorganismus in einem Kulturmedium zuechtet und aus dem Zell-Lysat oder Kulturmedium das Protein bzw. das Hybridpartikel isoliert. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen zur Prophylaxe von HBV-, HIV- oder Plasmodium-Infektionen, wobei eines der nach den vorstehenden Verfahren erhaltenen Proteine verwendet wird.

Description

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung von rekombinanten HBV-, HIV- oder Plasmodium-Oberflächenproteinen bzw. Hybridpartikeln

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung· erfolgt auf dem Gebiet der Medizin zur Prophylaxe von HBV-, HIV- oder Plasmodium-Infektionen des Menschen.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik: 26

A. Hepatitis B Impfstoffe

Die Infektion mit Hepatitis B Virus (HBV) ist ein ernstes, weit verbreitetes Gesundheitsproblem. Die Infektion kann akut oder chronisch sein= In den Vereinigten Staaten wird die Zahl der akuten Hepatitisf.älle auf mindestens 100 000 pro Jahr mit einer Todesrate von 1 - 2 % geschätzt. Als chronische Überträger von HBV werden unter gesunden Erwachsenen abhängig vom Alter und sozialer Schicht 0,1 bis 1 % eingestuft. In Südamerika gelten etwa 1 bis 3 %, in der UDSSR und Südeuropa etwa 3 bis 6 % und in Asien und Afrika mehr als 10 % als chronische HBV-Überträger.

-2-

In entwickelten Ländern benötigt man einen Impfstoff für Menschen, die einem .erhöhten Infektionsrisiko ausgesetzt sind. Solche sind Patienten und Personal in medizinischen Einrichtungen, wo man mit Blut in Kontakt kommt, militärisches Personal, Ehepartner von chronischen HBV-Überträgern, Reisende in HBV-endemische Gebiete, Neugeborene von chronischen HBV-Überträgern, Homosexuelle, Prostituierte und Drogenabhängige. In Ländern der Dritten Welt benötigt man einen billigen Impfstoff zur Immunisierung sehr vieler Menschen. Eine solche Immunisierung kann schließlich nicht nur die Zahl akuter Hepatitisfälle und chronischer HBV-Überträger verringern, sondern auch die Erkrankungsziffer und Sterblichkeitsrate bei chronischer aktiver Hepatitis und Leberzellkarzinom reduzieren.

Dane-Partikel, die man für Hepatitis B Virionen hält und die

ν man aus infizierten Patienten isolieren kann, haben einen Durchmesser von etwa 42 nm. Jedes Partikel besteht aus einer Hülle, die das Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) enthält, einem Capsid (HBcAg), einer endogenen Polymerase und einem DNA-Genom. Das Genom ist zirkulär und doppelsträngig mit einem Einzelstrangbereich von etwa 200 Basen. Der Einzelstrangbereich kann in vitro durch die endogene Polymerase zum Doppelstrang gemacht werden. Das DNA-Genom enthält etwa 3200 Basen.

Die Herstellung von HBV-Impfstoffen stellte sich seit langem als schwierig heraus, da das Virus nur schwer in Gewebekultur vermehrbar ist und nur der Mensch als Wirt bekannt ist. Im Labor ist es jedoch möglich, auch Schimpansen mit dem Virus zu infizieren.

Aus Valenzuela et al. , Nature _2_98 (1982), 347 - 350., ist die Expression von HBsAg in Hefe bekannt. Die codierende Sequenz von HBsAg, ein 8H5 Basenpaar großes Taq1 -Hpa'i -Fragment ,wird unter die Kontrolle des Hefe-Alkohol-Dehydrogenase I-Promo-

-3-

tors gestellt. Dieser Arbeit gingen mehrere kurze Berichte über Forschungsaktivitäten auf diesem Gebiet voraus. Dazu gehört die Arbeit von Valenzuela et al. , Arch. Biol. Med. Exp. (Chile), J_4(1) (1981), 21 - 22, aus der die Expression eines DNA-Fragments in Hefe bekannt ist, das für ein Protein codiert, das ähnlich zu HBsAg ist. Dieses DNA-Fragment wird unter die Kontrolle des Hefe-Alkohol-Dehydrogenase I-Promotors gestellt. Ferner ist aus einer Arbeit in Scrip Nr. 616, S. 14 (12. Aug. 1981) bekannt, daß ein Team von US-Wissenschaftlern, dem P. Valenzuela und W.J. Rutter angehören, die Herstellung des Hüllproteins von Hepatitis B Virus in Hefe angekündigt haben. Aus Zuckerman, Nature,295, (1982), 98 - 99, ist bekannt, daß W.J. Rutter über die Expression von glykosyliertem HBsAg in Hefezellen berichtet hat.

Antigene Komponenten von HBV, wie HBsAg, sind laut Berichten in Bakterien hergestellt worden, in die ein rekombinantes DNA-Molekül eingeschleust wurde, das ein Gen enthält, das für das Antigen codiert. Aus Burrell et al., Nature, 2 79, Nr. 5708 (1979), 43 - 47,ist die Expression von HBV-DNA-Seguenzen in E. coli , Stamm HB101 bekannt. Diese DNA-Sequenzen lagen kloniert in dem Plasmid pBR322 vor.

Aus der Europäischen Patentanmeldung Nr. 13 282 ist die Herstellung eines rekombinanten Vektors bekannt, der für HBV-Antigene, wie HBsAg, codiert. Der Vektor wird aus der DNA von Dane-Partikeln und des Plasmids pBR322 hergestellt und eignet sich zur Transformation des E. coli Stammes HB101. Die Autoren geben an, daß als geeignete Wirte auch andere bakterielle Zellen, Hefe und Pilze, animalische und pflanzliche Zellen und andere Wirte zu verstehen sind, obwohl in dieser Anmeldung nur E. coli als Wirtssystem verwendet wird.

Aus Charnay et al. _t Nature, 286 (1980), 893-895, ist die Konstruktion eines Bacteriophagen bekannt, der ein Fusions-

gen aus dem ß-Galactosidase-Gen und dem Strukturgen HBsAg enthält. Der Bacteriophage führt zur Expression eines Fusionsproteins, das die antigenen Determinanten von HBsAg und ß-Galactosidase enthält.

Aus der GB-Patentanmeldung Nr. 2 034 323 ist die Herstellung eines Phagen,der HBV DNA enthält, bekannt. Der E. coli Stamm C600 wird durch diesen rekombinanten Phagen transformiert.

Aus der GB-Patentanmeldung Nr. 2 070 621 ist ein Plasmid bekannt, das einen Teil des HBsAg-Gens, den Promotor und das Z-Gen des Lactose-Operons besitzt,und das in E. coli kloniert wurde.

Aus der Europäischen Patentanmeldung Nr. 20 251 sind rekombinante Vektoren aus dem Plasmid pBR322 und BamHI-Fragmenten von HBV-DNA bekannt, die zur Transformation von E. coli verwendet werden können. Andere Vektoren, die ein BamHI-Fragment von HBV-DNA und einen Teil des Tryptophan-Operons enthalten, wurden verwendet, um Expression in E. coli, Stamm HB101, zu erhalten.

Aus Edman et al. , Nature, 291, Nr. 5815. (1981), 503 - 506, ist die Konstruktion von Plasmiden bekannt, die zur Expression von HBcAg und einem Fusionsprotein aus ß-Lactamase-HBsAg in E. coli führen. Die Expression findet unter Kontrolle des regulatorischen Bereiches des Tryptophan-Operons statt.

Aus Pumpen et al., Gene·, j3£, (1984), 202 - 210, ist bekannt, daß geringe Mengen des HBsAg-Monomers und Fusionsproteine in E. coli synthetisiert werden. Die Expression wird durch Antikörper nachgewiesen, die mit dem denaturierten HBsAg-Monomer reagieren.

Andere Literaturzitate, in denen die Insertion von HBV-DNA

Ι in Bakterien offenbart wird, sind folgende: Charnay et al., Progr. Med. Virol., 11_ (1981), 88-92; MacKay et al. Proc Natl. Acad. Sei. U.S. 7Ό. ^Nr · 7(1981), 4510-4514; Fritsch et al. , CR. Acad. Sei., 287, Nr. 16(1978), 1453; GB-Patentanmeldung 2 034 323 (Derwent Nr, 46874C) und Pasek et al., Nature, 2£2_f Nr;. 6 (1979), 575.

HBV-DNA wurde auch in Säugetierzellen kloniert, nämlich in Zellen des Menschen, der Maus und in Zellen eines menschli-

IQ chen Lebertumors. Aus Dubois et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S., 21, Nr.8(1980), 4549 - 4553, ist beispielsweise die Transformation von Mauszellen mit einem Plasmid bekannt, das das HBV-Genom enthält. Die Expression von HBsAg wird offenbart; aus Hirschman et al., Proc. Natl. Acad, Sei. U.S., 77, Nr. 9 (1980), 5507 - 5511,ist die Herstellung von HBV-ähnlichen Partikeln durch HeLa-Zellen bekannt, die mit HBV-DNA transformiert wurden.

Aus Funakoshi et al., Progr.Med. Virol., \27 (1981), 163 - 167, und Maupas et al., Progr. Med. Virol., 22(1981), 185 - 201., sind Verfahren bekannt, um durch Verwendung von HBsAg aus menschlichem Blut HBV-Impfstoffe herzustellen. Der Impfstoff von Funakoshi et al. enthält 40 ug gereinigtes, formalinbehandeltes HBsAg, Phosphat, Natriumchlorid, 20 mg Mannit und als Adjuvans 0,1 % Aluminiumhydroxid. Aus der Arbeit von Maupas et al. ist bekannt, daß eine Dosis des Tmpfstoffes 1 ml war, der 2 bis 10 ug gereinigtes, formalinbehandeltes HBsAg (bestimmt nach der Methode von Lowry) und 0,1 % Aluminiumhydroxid enthält. Das von Maupas et al. verwendete Protokoll forderte drei Injektionen im Abstand von je einem Monat mit einer Auffrisch -Impfung nach einem Jahr; die Autoren schlagen zwei.Injektionen von konzentriertem HBsAg im Abstand von drei Monaten vor.

_g5 Ergänzende Literaturzitate zur Herstellung von HBV-ImpfStoffen sind Maupas et al., Adamowicz et al. und Funakoshi et al.

bzw. auf den Seiten 3, 37 und 57 von Hepatitis B Vaccine INSERM Symposium No. 18, herausgegeben durch Maupas und Guesry, 1981, Elsevier/North-Holland Biomedical Press.

Hefen sind als Wirtsorganismen zur Expression von bestimmten DNA-Sequenzen verwendet worden. Diese Sequenzen sind jedoch keine HBV DNA-Sequenzen. Aus der GB-Patentanmeldung Nr. 2 068 969 ist die Herstellung von Hühner-Ovalbumin in Hefe bekannt; aus einer Arbeit in Scrip Nr, 640, S. 11 (4. Nov. 1981) ist bekannt, daß ein Interferon-Typ in Hefe hergestellt wird. Aus dem Europäischen Paten-; 11 562 (Derwent Nr. 38762C) sind hybride Hefeplasmide bekannt, die das ura* Hefe-Gen in dem 2 μ Plasmid enthalten.

Das natürliche Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) kann aus Plasma von infizierten Individuen als ein 22 nm großes Partikel isoliert werden. Dieses Partikel besteht aus den zwei Proteinen,P24 und seinem glykosyliertem Derivat GP28. Beide Proteine besitzen 226 Aminosäuren und werden von dem ^{Gen s} des HBV-Genoms codiert.Eine für 163 Aminosäuren codierende DNA-Sequenz, die unmittelbar vor der codierenden Sequenz des S-Proteins auf dem HBV-Genom liegt, wird als Pre-S-codierende Sequer.z bezeichnet. Ein für 55 Aminosäuren codierender DNA-Bereich der Pre S-codierenden Sequenz, der unmittelbar vor dt;r codierenden Sequenz des S-Proteins liegt, v/ird als Pre S2-codierende Sequenz bezeichnet. Der für die übrigen 108 Aminosäuren codierende DNA-Bereich der Pre S-codierenden Sequenz wird als Pre S1-codierende Sequenz bezeichnet. Die Pre S-codierende Sequenz, oder irgendein klei-

g0 ner Teil davon, wird auch als die DNA-Sequenz bezeichnet, die für das HBsAg Vorläuferprotein codiert.

Die Pre S-codierende Sequenz von einigen HBV-Subtypen (z.B. ayw) umfaßt 163 Codons, während sie bei anderen HBV-Subtypen (z.B. adw_) 174 Codons besitzt. In jedem Fall besitzt die Pre S2-Region 55 Codons und liegt unmittelbar vor der codie-

-7-senden Sequenz des S-Proteins.

In der Pre S2-codierenden Sequenz liegt die Bindungs- oder Rezeptorstelle für Polyalbumin, die auf der Oberfläche von Dane-Partikeln und auf der Oberfläche von einigen HBsAg-Partikel:i gefunden wird, welche aus dem Serum von HBV-infizierten Patienten isoliert werden. Obwohl die Pre S2-Region unmittelbar vor der codierenden Region des S-Proteins auf dem HBV-Genom liegt, ist die Pro. S2-Region nicht an der Zusam- \q mensetzung von HBsAg-Partikeln beteiligt; vgl. z.B. Persing et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: (1985), 3440 - 3444.

Aus Valenzuela et al., Nature, 298 (1982), 347 - 350, sind HBsAg-ähnliche Partikel bekannt, die nach Aufschluß von Hefezellen gefunden wurden, welche mit einem Vektor transformiert wurden, der die codierende Sequenz des Proteins enthält. Daraus wurde geschlossen, daß HBsAg-Partikel in Hefe synthetisiert werden.

^Aus Harford et al,, Developments in Biological Standardization, I5_4 (1983), 125 - 139, sind HBsAg-ehnliche Partikel bekannt; die nach Aufschluß von transformierten Hefezellen gefunden wurden. Diese Zellen wurden mit einem Vektor transformiert, der eine DNA-Sequenz enthält, die für 18 Aminosäuren der Ornithin-Carbamoyltransferase codiert. Dieser Sequenz folgten unmittelbar am 3'-Ende ein DNA-Bereich der Pre S2-codierenden Sequenz, der für 42 N-terminale Aminosäuren codiert und anschließend der codierende Bereich des S-Proteins.

3Q Aus Laub et al., J. Virology, 4JH1 ) (1983), 271 - 280, ist die Konstruktion eines Simian Virus 40 Vektors bekannt, in dem die frühe Region durch einen großen Teil des HBV-Genoms, der die Pre S-S proteincodierende Sequenz enthält, ersetzt ist. Diese HBV DNA wurde in SV40 transformierten CV-1 Zellen (COS-Zellen) exprimiert.

-δ-Aus Stibbe et al., J. Virology, 4j[( 2) (1983), 626 - 628, ist bekannt, daß GP33 und GP36 in geringen Mengen vorliegende HBsAg Glykoproteine durch die Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert werden. Aus Stibbe et al., Dev. Biol. Stand., 5_4 (1983), 33-34, ist bekannt, daß HBsAg Partikel, die große Mengen von GP33 und GP36 enthalten, keine höheren Antikörpertiter gegen das Anti S Protein enthalten, als jene HBsAg-Partikel, die fast frei von GP33 und GP36 sind.

!0 Aus Heerman et al., J. Virol., 5_2(2) (1984), 396 - 402, ist bekannt, daß die codierende Sequenz des Protein S und die Pre S-codierende Sequenz, die für 389 Aminosäuren codieren, für das Polypeptid P39 codieren. Dieses Polypeptid wird zusammen mit der glykosylierten Form GP42 und den anderen HBV Oberflächenantigen-assoziierten Polypeptiden P24, GP27, GP33 und GP36 in HBV-Partikeln und viralen Antigenfilamenten gefunden .

Aus Neurath et al., Science, 224 (1984) . 392 - 394, ist bekannt, daß Polypeptide mit den 26 aminoterminalen Aminosäuren der Pre S2-codierenden Sequenz immunogen sind. Es wird darauf hingewiesen, daß Antikörper gegen diese Polypeptide für diagnostische Tests verwendet werden können.

Aus Michel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81_( 1.984), 7708-7712, ist die Expression von HBsAg, das Rezeptoren für das menschliche Serum Polyalbumin trägt, in chinesischen Hamster-Ovarienzellen (CHO) bekannt. Diese Zellen wurden mit einem Plasmid transfiziert, das die Pre S2-S proteincodie-

gO rende Sequenz enthält.

Aus Persing et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, B2_ (1985), 3440 -3444, ist bekannt, daß Maus L-Zellen, die mit einer Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz transformiert wurden, drei HBsAg-verwandte Polypeptide (24, 27 und 35 kd) exprimieren. Diese Polypeptide können zu komplexen

2 7 4 O

-9-immunreaktiven HBsAg-Partikeln mit einem Durchmesser vor.

22 nm ausgebildet werden, die polymerisiertes menschliches Serumalbumin (HSA) binden; Maus L-Zellen dagegen, die mit einer Pre S2-S-codierenden Sequenz, die am 3'-Ende der Pre S2-Region eine Leserahmenmutation besitzt, transformiert wurden, können nur noch 24 und 2" kd große Polypeptide exprimieren, die zu immunreaktiven HBsAg-Partikeln mit einem Durchmesser von 22 nm ausgebildet werden können und nicht mehr HSA binden können. Persing et al. folgern daraus, daß

jQ die Pre S2-S-proteincodierende Sequenz für ein 35 kd großes Polypeptid codiert und daß das Pre S2-Protein für die HSA Bindungsaktivität von HBsAg verantwortlich ist, nicht aber für die Zusammensetzung und Sekretion von HBsAg-Partikeln benötigt wird; es wird ferner geschlossen, daß das

2g in großen Mengen vorliegende 24 kd große Polypeptid von HBsAg nicht in erster Linie durch Spaltung von größeren Vorläuferproteinen (nämlich den 27 oder 35 kd großen Peptiden) erhalten wird.

Aus Milich et al., Science, ^28_ (1985), 1195 - 1199, ist bekannt, daß Impfstoffe, die HBV-Partikel mit Pre S2 und HBsAg enthalten, in bestimmten Mäusen, eine Unempfindlichkeit verhindern können, die auftritt, wenn der Impfstoff nur HBsAg enthält; die verwendeten HBV-Partikel mit Pre S2 und HBsAg wurden aus chinesischen Hamster-Ovarienzellen (CHO) erhalten, die mit einem Plasmid transfiziert worden waren, das die Pre S2-S proteincodierende Sequenz enthielt. Es ist ferner bekannt, daß die 26 Aminosäuren am Aniinoterminus des 33 kd großen Polypeptids,das durch die Pre S2-S

on proteincodierende Sequenz codiert wird, eine dominante Antikörperbindungsstelle in der Pre' S2-Region repräsentieren.

In Michel et al., "Vaccines 86", Brown et al., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1986), 359 - 363, ist die Herstellung von Hepatitis B-Oberflächenantigenpartikel, die das Expressionsprodukt der Pre S2-Region enthalten, beschrieben.

-10-

Aus Neurath et al., Nature, 315 (1985), 154 - 156, ist bekannt, daß die Pre S-Region Proteine der HBV-Hülle codiert, die Domänen besitzen, die spezifisch durch Leberzellen erkannt werden; die Pre S2-S proteincodierende Sequenz für ein Protein codiert, das in HBV-Partikeln vorhanden ist;

synthetische Peptide, die dem Gen entsprechen, das für Pre S-Proteine codiert, immunogen sind. Neurath et al. schließen daraus, daß HBV-Impfstoffe Pre S-Determinanten enthalten sollten

10

Aus Valenzuela et al., Biotechnology, 2 (1985), 317 - 320, ist die Expression der gesamten Pre S2-S proteincodierenden Sequenz in Hefe bekannt; es ist ferner bekannt, daß diese Hefezellet. ein Partikel mit HBsAg und Pre S synthetisieren, das im Elektronenmikroskop und in den Sedimentationseigenschaften sehr ähnlich jenen Partikeln ist, die nur HBsAg enthalten, und daß die Pre S2-Region nicht die Fähigkeit beeinträchtigt, Partikel auszubilden, die den 22 nm großen HBsAg Partikeln sehr ähnlich sind Aus Valenzuela et al.

ist ferner die Hypothese bekannt, daß HBV in die Leber gelangt, indem der HBV-Polyalbumin-Rezeptor durch Polyalbumin an Leberzellen gebunden wird und somit das Virus aufgenommen wird, und daß der Polyalbumin-Rezeptor von HBV durch die Pre S2-Region codiert wird. Valenzuela schließt daraus, daß ein Impfstoff,der Pre S2 enthält, zur Bildung von Antikörpern führt, die nicht nur HBV über einen normalen Mechanismus inaktivieren, sondern auch die Aufnahme des Virus durch Leberzellen stören könnten.

Die Europäische Patentanmeldung Nr. 171 008-A beansprucht die Herstellung von nicht-glykosyliertem Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen P31 Protein in Hefe.

Die Europäische Patentanmeldung Nr. 174 444-A2 beansprucht ein Verfahren zur Herstellung in Hefe von HBsAg-Partikel, die das P31 Protein enthalten.

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Die folgende Tabelle I vergleicht die bekannten Aminosäuresequenzen der Pre S2-Region mit der HBV Pre S2-Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung:

Tabelle I

Vergleich der Aminosäuresequenz der Pre S2-Region von verschiedenen HBV Serotypen

Pre S2 codierende Region

HBV Sub-

typ

-55 -50

-40 -30

-20

-10

Literatur- 0 zitat

0

T L

L

T

V TT

P

I

AP

I

Isoleucin

1

adw

MQWNSTAFHQALQOPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSSSARTGOPVTN Gegenstand Pre S2 co dierende Region

T

L L

L

T

V TT

P

I

AP

Leucin

2

adw

S

Abkürzungen

VLTT

PL

I

AL

Tyrosin·

3

adw

E

K

Aspartat

V TTT

P

I

AL

Phenylalanin

4

adw

P

Threonin

IFS

Histidin.

5

adw

G

Serin

He

I S

Lysin

6

adr

T

A

Glutami nsäure

Leu

IFS I

Arginin

7

adr

T

C

Prolin·

Tyr

IFS I

Tryptophan

8

ayw

T

V

Glycin

Phe

Glutamin

adyw

H T

M

Alanin·

His

I

Asparagin

Aminosäure-

Cystein

Lys

L

Asp

Valin·

Arg

Y

Thr

Methionin

Trp

F

Ser

GIn

H

GIu

Asn

K.

Pro

R

GIy

W

AIa

Q

Cys

N

VaI

Met

-12-Zitierte Literatur

1. Valenzuela ec al., In Animal. Virus Genetics (FieLd. Jaenisch and Fox eds) , 57-70, Academic Press,

New York (1980).

2. Chow et al.. Fourth Annual Congress for Recombinant DNA Research, San Diego, USA, 1984.

3. Fujisawa et al.. Nucl. Acids Res. , VL (1983), 4601 - 4610.

4. Lo et al., Biochem Biophys. Res. Com., 2_, (1986), 382 - 388.

5. Fujisawa et al. , a.a.O.

6. Ono et al., Nucl. Acid Res. , IJ, (1983), 1747 - 1757.

7. Galibert et al.. Nature. 28JL. (1979), 646 - 650. 8. Pasek et al.. Nature. 2_8_2 (1979), 575 - 579.

B. Malaria Impfstoffe

Zahlreiche neuere Arbeiten schlugen vor, daß ein sensitiver

Wirt eine ausreichende Immunität gegenüber dem Sporozoiten einer einzelnen Spezies von Plasmodium erlangen kann durch die Produktion eigener Antikörper gegen das circumsporozoide Protein (CS-Protein) des einzelnen Sporozoiten. 25

Die DNA von Sporozoiten-Proteinen von einigen Typen von Plp.s-. . modium sind kloniert und einige davon durch Anwendung rekombinanter DNA-Techniken exprimiert worden.

^ao Aus der US-Patentschrift 4 466 917 ist ein als p-44 bezeichnete? Sporozoiten-Polypeptid bekannt. Ferner ist die KIonierung und Expression seiner DNA in E. coli bekannt.

Aus Sharma et al., Science, 228 (1985), 879 - 882, ist die Expression eines Teiles des CS-Proteins von Plasmodium knowlesi in Hefe bekannt. Der verwendete Expressionsvektor

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enthält die 5'-regulatorische Region des Hefe-Alkohol-Dehydrogenase I-Gens anstelle der 5¹ "upstream" Region des Plasmodium knowlesi CS-Gens.

Aus WO84-02922-A ist die Klonierung eines DNA-Bereichs einer sich wiederholenden Protein-Untereinheit des CS-Proteins von P. knowlesi bekannt. Ferner ist die Expression dieses DNA-Fragments als Fusionsprotein mit ß-Lactamase oder ß-Galactosidase in E. coli bekannt

10

Aus WO84-02917-A ist die Klonierung und Expression in E. coli einer codierenden Sequenz des CS-Proteins aus dem Blut-Stadium von P. falciparum bekannt.

Aus Dame et al., Science, 225 (1984), 593, ist die Klonierung und Expression des CS-Proteins von P. falciparum in E. coli bekannt. Das Protein besitzt etwa 412 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von etwa 44 000. Es besitzt 41 sich wiederholende Einheiten eines Tetrapeptids. Synthetische Peptide mit 7, 11 oder 15 Aminosäureresten der sich wiederholenden Einheit binden an monoklonale Antikörper, die gegen das CS-Protein gerichtet sind.

Aus Ellis et al., Nature, j301 (1983), 536 - 538, ist die Expression eines Fusionsproteins in E. coli aus ß-Lactamase und P. knowlesi CS-Protein bekannt.

Aus Enea et al. ,Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 81 (1984), 7520 7524, . ist eine analoge sich wiederholende Struktur in dem CS-Protein von P. cynomolgi bekannt. Ferner ist die Klonierung und Expression der DNA des CS-Proteins in E. coli und seine codierende Sequenz bekannt.

Aus Ballou et al. , Science, 228 (1985), 996 - 999, ist bekannt, daß synthetische Peptide der sich wiederholenden Struktur des CS-Proteins von Plasmodium falciparum, die mit

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Rinderserum Albumin (BSA) oder Thyroglobulin verbunden sind, in Mäusen und Kaninchen zu einer Antikörperantwort führen. Daraus wurde geschlossen, daß ein Impfstoff gegen das Sporozoitenstadium des Malaria-Parasiten entwickelt werden kann, indem synthetische Peptide der sich wiederholenden Struktur des CS-Proteins mit einem Carrier-Protein gebunden werden.

Aus Weber et al. , Molecular and Bacterial Parasitologi, 15 (1985), 305-316,ist bekannt, daß ein kloniertes Gen des CS-Proteins eines brasilianischen Stammes von P. falciparum als Sonde verwendet werden kann, um die Struktur von 17 anderen P. falciparum Stämmen durch Nucleinsäure-Hybridisierung zu analysieren. Daraus wurde geschlossen, daß das Gen des CS-Proteins hoch konserviert ist und daß die Entwicklung eines Malaria-Impfstoffes mit dem CS-Protein wahrscheinlich nicht durch Stammvariationen erschwert. *ein wird.

Aus Arnot et al., Science, 230 (1985), 815 - 818, ist die Klonierung des CS-Protein-Gens von P. viväx und seine codierende Sequenz bekannt. Daraus ergab sich, daß die codierende DNA-Sequenz des CS-Proteins von P. vivax homolog zu jener des.. CS-Gens von P. knowlesi,nicht aber homolog zu jener von P. f.ilc parum ist.

Aus Dharma et al., Science, 229 (1985), 779 - 782, ist die komplette Nucleotidsequenz der codierenden Region des" CS-Gens aus dem Nuri-Stamm von P. knowlesi bekannt.

Aus Young et al., Science, 228 (1985), 958 - 962, ist die 3Q Expression des CS-Proteins von P. falciparum in E. coli und seine mögliche Anwendung in einem Malaria-Impfstoff für den Menschen bekannt.

Aus WO84/02917 ist die künstliche Herstellung von PoIy-3g nucleotid-Sequenzen, die im wesentlichen der gesamten oder nur einem Teil der mRNA oder der genomischen DNA von P.

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falciparum entsprechen, bekannt. Ferner ist das einer solchen Sequenz entsprechende Peptid und ein Verfahren zu seiner Herstellung bekannt, ebenso ein Mittel, um in einem Säugetier, das ein solches Peptid enthält, eine Immunantwort gegen P.

falciparum Antigene zu stimulieren.

Aus Mazier et al., Science, 2J31 (1986), 156 - 159, ist bekannt, daß gebildete Antikörper nach der Immunisierung von Mäusen mit mehreren rekombinanten und synthetischen Peptiden des CS-Proteins von P. falciparum, in einer menschlichen Leberzellkultur einen dreifachen Schutz vor dem Parasiten zeigen, nämlich oinen Schutz vor der Anheftung des Sporozoiten an die Leberzell-Oberf lache, vor dem Eintritt und der nachfolgenden intracellulären Entwicklung des Sporozoiten.

C. Polyvalente Impfstoffe

Aus Valenzuela et al., Biotechnology, 2 (1985), 323 - 327, ist bekannt, daß der HBsAg Polyalbuminrezeptor, der durch die Pre S2 codierende Sequenz codiert wird, zur Herstellung von polyvalenten Impfstoffen verwendet werden kann. Aus Valenzuela et al. ist ferner bekannt, daß durch Expression der hybriden HSV-1gD-Pre S2-S proteincodierenden Sequenz in Hefe die Herstellung einen hybriden HBsAg-Herpes simplex 1-Virus Glykoprotein D (HSV-IgD) Partikels ermöglicht wird.

Aus Valenzuela, "Hepatitis B subunit vaccines using recombinant DNA Techniques", 15. Mai 1985, Bio-Expo-5-Meeting, Boston Massachussetts, ist bekannt, daß bei einem Hybrid,wie dem vorstehend beschriebenen HBsAg-HSV-1gD-Partikel, die immunologische Dominanz von HBsAg gegenüber dem fremden immunogenen Polypeptid, das auf der Oberfläche des Partikels präsentiert wird, gefährdet wird.

Aus der Europäischen Patentanmeldung 0 175 261 ist ein neues hybrides Polypeptid bekannt, das zumindest einen großen Teil

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des Hepatitis B Oberflächen-Antigens fusioniert mit einem oder mehreren Oligopeptiden enthält. Das hybride Polypeptid ist in der Lage, in einem zellulären Wirt ein Partikel zu bilden, das zumindest ein Epitop von zumindest einem Oligopeptid präsentiert.

Proteine können posttranslationale Modifikationen erfahren und einige von diesen können die Konformation und Funktion des Proteins grundlegend beeinflussen. Oligosaccharid-Ketten an dem aus Menschen stammenden Pre S1-Pre S2-S und Pre S2-S-Proteins (Heerman et al., J. Virol., 5_2_. (1984), 396 - 402; Stibbe and Gerlich, Virology, 123 (1982), 436 - 442; Stibbe and Gerlich, J. Virol., 46. (1983), 626 - 628, und vermutlich die Myristinsäure an. dem Pre S1- Pre S2-S-Protein (Persing et al., Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses, 28.31. Aug.1986, Cold Spring Harbor Laboratory) könnten die Partikelbildung, die Konformation der Proteine in den Partikeln und die Antigenität und Immunogenität dieser Partikel beeinflussen.

Hefe (Saccharomyces cerevisiae) besitzt die nötigen Enzyme, um Proteine zu glykosylieren (Ballou "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Metabolism and Gene Expression"; Strathern, Jones and Broach Ed., Cold Spring Harbor'Laboratory (1982), 335 - 360) und Fettsäuren zu acylieren (Towler and Glasler, Proc. Natl. Acad. Sei., ίΠ (1986), 2812 2816, ähnlich wie dies höhere eukaryontische Zellen vermögen.

Virale Oberflächenglykoproteine, die in Hefe exprimiert wurden, liegen glykosyliert vor. Aus Jabbar et al. ,Proc. Natl. Acad. Sei., £2 (1985), 2019- 2023, ist bekannt, daß die Expression des Hämagglutinin-Gens von Influenz.a in Hefen zu einem glykosylierten Hämagglutinin-Protein führte. Aus Wen and Schlesinger, Proc. Natl. Acad. Sei., £3_ (1986),

-17-

3639-3643, ist bekannt, daß die Expression von Glykoproteinen des Sindbis und vesiculären Stomatitis Virus in Hefe zu glykosylierten Viral-Proteinen führte. Aus Fujisawa et al. (Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses, 28.-31. Aug. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 62) ist bekannt, daß die Expression des Pre S2-S Gens in Hefe zur Synthese von zwei glykosylierten Formen des Pre S2-S Proteins führte. Aus Kniskern et al. (Abstracts of papers presented at the 1986

IQ meeting on Modern Approaches to New Vaccines, Including Prevention of AIDS, 9.-14. Sept. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 89) ist bekannt, daß die Expression des Pre S1- Pre S2-S Gens in Hefe zur Synthese von zwei Pre S1-Pre S2-S Proteinen mit einer Größe von 45 kd bzw. 39 kd führte. Aus Persing et al. (Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses, 28.-31- Aug. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 19) ist bekannt, daß die Zugabe von ³Η-markierter Myristinsäure zu COS7-Zellen, die Pre S1- Pre S2-S, Pre S2-S ^un<3 S-Proteine exprimieren, zu radioaktiv markierten Pre S1-5?re S2-S-Protein führte.

Fusionsproteine, die in Hefe exprimiert und in ein Partikel verpackt werden, werden nach dem allgemeinen Schema gereinigt: Aerosile Adsorption und Desorption (1) -> Calciumchlorid-Präzipitation (2) -> Phenylagarose oder Phenylboronatagarose-Adorption und Desorption (3) -> Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation oder DEAE-Ionenaustauschchromatographie.

Schritt 1 ist aus der EP-A 0 204 680 und Schritt 3 aus der EP-A 0 199 698,soweit es Phenylagarosa betrifft, bekannt. Die spezifische Kombination von Schritt 1 und Schritt 3 ermöglicht es, kontaminierendes Material stark abzutrennen (Eliminierung von 90 % Protein, Kohlenhydraten und 50 % Lipide).Diese neue Kombination ermöglicht ein gutes Funktio-

-18-nieren der nächsten chromatographischen Schritte.

Im Falle von Fusionsproteinen, die glykosyliert sind, wird Phenylboronat (PI3A) als Affinitätsadsorbens verwendet. Bei pH 9 bildet die Boronatgruppe kovalente Komplexe mit möglichen cis-Diolgruppen an den glykosylierten Seitenketten aus. PBA-GeIe sind gegebenenfalls zur Reinigung von löslichen Glykoproteinen nicht aber zur Reinigung von Partikeln, die Glykoproteine in der Lipid-Doppelschicht eingebettet haben, verwendet worden (vgl. Cook et al., Analyticyl Biochemistry, 149 (1985), 349-535; Middle et al., Biochemical Journal, 20° (1983), 771-779;Cook et al., Biochimica et Biophysica Acta, 828 (1985), 205-212; Maestasane et al., Journal of Chromatography, 189 (1980), 225-231. Da das Partikel viele Liganden-Bindungsstellen enthält, müssen PBA-GeIe mit einer sehr niedrigen PB-Ligandendichte verwendet werden, z.B. PBA-GeIe mit einem Boronatgehalt von < 10ug/ml Gel, vorzugsweise 5 ug Borcnat pro ml Gel. Die Verwendung von Phenylboronatgelen mit sehr niedrigem Boranatgehalt erlaubt die Affinitäts-Chromatographie von Partikeln, die Glykoproteine eingebettet enthalten.

Ziel und Darlegung des Wesens der Erfindung

25

Diese Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine funktionelle codierende DNA-Sequenz enthält, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer Hepatitis B Virus (HBV) Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist. Der Ausdruck "codierende ,Sequenz" oder "codierende Region" wie hier gebraucht, schließt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon ein. Mit dem Ausdruck "funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäure-Modifikationen gemeint, die, wo es angebracht ist, die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immunogenität, wenn dies gewünscht ist, beibehält. Ein solches funkcionelles Derivat

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kann durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie durch Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, beschrieben, hergestellt werden. Im allgemeinen enthält ein solches DNA-Molekül eine regulatorische Region, die vorzugsweise von dem Hefe arg³-Gen stammt.

Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Vektor, der ein rekombinantes DNA-Moleküi enthält, das mit einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist.Das DNA-Molekül enthält eine

JO funktionelle codierende DNA-Sequenz,die in Ablesephase mit einem Teil jer Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist. Mit dem Ausdruck "regulatorische Region", wie hier verwendet, ist eine DNA-Sequenz gemeint, die eine Promoter-Region und andere notwendige Se-

^g quenzen für die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz enthält.

Die Erfindung betrifft auch eine eukaryontische Wirtszelle, die durch einen rekombinanten Vektor transformiert wird, welcher ein DNA-Molekül enthält, das mit einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist. Das DNA-Molekül enthält' eine funktionelle, ccdierende DNArSequenz, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer solchen transformierten Wirtszelle, das die Transformierung einer eukaryontischen Wirtszelle mit solch einem rekombinanten Vektor umfaßt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung

eines hybriden HBsAg enthaltenden Partikels, das ein Peptid enthält oder präsentiert, das durch eine funktionelle codierende DNA-Sequenz codiert wird. Das Verfahren ui.ifaßt die j- Kultivierung einer durch einen rekombinanten Vektor transformierten eukaryontischen Wirtszelle in einem geeigneten

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Kulturmedium und die Isolierung des Partikels aus einem Lysat oder Extrakt dieser Wirtszelle. Der verwendete Vektor enthält ein mit einer regulatorischen Region funktionell verbundenes DNA-Molekül/in dem die funktionelle codierende DNA-Sequenz in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist.

Die Erfindung betrifft auch ein Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) enthaltendes hybrides immunogenes Partikel, das ein Peptid enthält oder präsentiert, das durch eine funktionelle codierende DNA-Sequenz codiert wird.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen hybriden Partikeln enthält.

Die Erfindung betrifft auch eineMizelle, die ein solches hybrides Partikel und Polysorbat enthält und eine.i Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Mizellen enthält.

Mit dem Ausdruck "funktionelle codierende DNA-Sequenz" ist eine codierende DNA-Sequenz gemeint, die nach Fusion in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz an der Zusammensetzung des HBsAg Partikels nicht beteiligt ist und auch nicht dabei stört.

Bevorzugte funktionelle codierende DNA-Sequenzen umfassen, sind aber nicht beschränkt darauf, (a) die gesamte HBV Pre S proteincodierend Sequenz oder ein immunogenes Derivat davon, wie die Pre SZ-, Pre S1- oder Pre S1- Pre S2-proteincodierende Sequenz und (b) andere immunogene codierende Sequenzen, wie die codierende Sequenz des CS-Proteins von Plasmodium, oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon, das Gen für das Hüllprotein von HIV oder ein beliebiges

-21-immunogenes Derivat davon, besonders die codierende Sequenz des C₇-Peptides, des Peptides 121 oder des Dreesman-Peptides, oder ein immunogenes Derivat davon.

Die Erfindung betrifft auch eine HBV Pre S1 proteincodierende Region, die für die folgende Aminosäuresequenz codiert:

-163

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met GIy Thr Asn Leu Ser VaI Pro Asn Pro Leu

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT Ala Phe GIy Ala Asn Sec Asn Asn Pro Asp

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro lie Lys Asp His Trp CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin VaI GIy VaI GIy AIa

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy He Leu GIy Trp Ser Pro Gin Ala GIn

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT

GIy He Leu Thr Thr VaI Sec The He Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro AIa Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg GIn Pro Thr Pro He Ser Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAC GCC Arg Asp Ser His Pro Gin AIa

-22-

1 oder eine HBV Pre S2 proteincodierende Region oder eine HBV Pre S2-S proteincodierende Region, in der der Pre S2-Anteil für die folgende Aminosäuresequenz codiert:

-55 -50

Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-

-40 -30

Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-

Ser-

-20 Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser-

-10 See-See-Ser-AIa-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn;

Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten DNA-Vektor, in dem eine solche Pre S1-, Pre S2- oder Pre S2-S proteincodierende Region mit einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist; eine transformierte Wirtszelle, die einen solchen Vektor enthält; ein Verfahren zur Herstellung einer solchen transformierten Zelle, das die Transformation einer Wirtszelle mit einem solchen Vektor umfaßt; das Protein, das durch eine solche codierende Region codiert wird; ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins; ein Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an einem solchen Protein enthält, das Partikel, das durch eine solehe Pre S2-S proteincodierende Region codiert wird; ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Partikels, einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an einem solchen Partikel enthält und eine Mizelle, die solch ein Partikel und Polysorbat enthält, und einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Mizellen enthält.

Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten DNA-Vektor, in dem eine vollständige Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz oder Pre S1-funktioneile DNA codierende Sequenz- Pre S2-S proteincodierende Sequenz oder ein immunogenes Derivat davon mit einer regulatorischen Region funktionell ver-

-23-

bunden ist; eine Hefe-Wirtszelle, die mit solch einem Vektor transformiert wird; ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirtes, das die Transformation einer Hefe-Wirtszelle mit solch einem Vektor umfaßt; ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch die Pre S1- Pre S2-S-proieincodierende Sequenz oder Pre S1-funktionelle DNA-codierende Sequenz- Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert ist, oder eines immunogenen Derivats davon; das Protein, das durch solch eine Methode hergestellt wird; einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an einem solchen Protein enthält; ein Partikel, das ein PoIypeptid enthält, welches durch die Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz oder Pre S1-funktionelle DNA-codierende Sequenz- Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert wird, oder ein immunogenes Derivat davon; ein Verfahren zu seiner Herstellung, einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Partikeln enthält, eine Mizelle, die ein solches Partikel und Polysorbat enthält und einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Mizellen enthält

Die Erfindung betrifft auch eine Pre S1- Pre S2 proteincodierende Sequenz oder Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz, von denen der Pre S1- Pre 32-Bereich die folgende Aminosäuresequenz besitzt:

PRE-Sl REGION -163

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG OQ Met GIy Thr Asn Leu Ser VaI Pro Asn Pro Leu

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro

_Qc- GCA TTC GGA GCC! AAC TCA AAC AAT CCA GAT ob

AIa Phe GIy AIa Asn Ser Asn Asn Pro Asp

-24-

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro lie Lys Asp His Trp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin VaI GIy VaI GIy Ala

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy He Leu GIv Trp Ser Pro Gin Ala Gin

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT

GIy He Leu Thr Thr VaI Ser Thr He Pro 15

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg Gin Pro Thr Pro He Ser Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin Ala

PRE-S2 REGION -55

ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA Met Gin Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gin

GCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTG Ala Leu Gin Asp Pro Arg VaI Arg GIy Leu

TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA Tyr Phe Pro Ala GIy GIy Ser Ser Ser GIy

ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT Thr VaI Asn Pro AIa Pro Asn lie Ala Ser

-25-

CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG His He Ser Sec Sen Ser Ala Arg Thr GIy

GAC CCT GTG ACG AAC

Asp Pro VaI Thr Asn

Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Vektor, in dem eine solche neue Pre S1- Pre S2 oder Pre S1- Pre S2-S .proteincodierende Sequenz mit einer Expressionskontrollsequenz funktionell verbunden ist; eine Wirtszelle, die mit solch einem Vektor transformiert ist; ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirtes, das die Transformation einer Wirtszelle mit einem solchen Vektor umfaßt; ein Verfahren

^g zur Herstellung eines Proteins, das durch eine solche Pre S1-Pre S2 oder Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert ist oder eines immunogenen Derivats davon; das Protein, das durch eine solche Methode hergestellt wird; einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an einem

2Q solchen Protein enthält; ein Partikel, das ein Polypeptid entiält, das durch eine solche Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert ist, oder ein immunogenes Derivat davon; ein Verfahren zu seiner Herstellung, einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Par-

2g tikeln enthält und eine Mizelle, die ein solches Partikel und Polysorbat enthält.

Folgende Aminosäure-Abkürzungen werden verwendet:

Asp	Aspartat	Ue	Isoleucin
Thr	Threonin	Leu	Leucin·
Ser	Secin	Ty c	Tycosin·
GIu	Glutaminsäure	Phe	Phenylalanin
Pco	Prolin	His	Histidin
GIy	Glycin	Lys	Lysin
AIa	Alanin	Arg	Arginin
Cys	Cystein	Trp	Tryptophan
Va i	Valin	GIn	Glutamin
Met	Methionin	Asn	Asparagin

Fig.	1
Fig.	2
Fig.	3
Fig.	4

Fig.	5
Fig.	6
Fig.	7
Fig.	8

-26-Kurze Beschreibung der Figuren:

ist eine Restriktionskarte von pRIT10601. ist eine Restriktionskarte von pRIT10616. ist eine Restriktionskarte von pMC200. ist die Nucleotid-Sequenz eines Bereiches des 3300 Basenpaar großen Hefe Hindlll-Fragments, das in pMC200 integriert ist und das die Restriktionsstellen Hindi, BgIII und EcoRI besitzt.

zeigt die Herstellung von pRIT10671 und pRIT10673. zei-yt die Herstellung von pRIT10749. " zeigt die Herstellung von pRIT10761 und pRIT10764. zeigt die Herstellung von pRIT10167 (Beispiel 1), PRIT10158 und pRit10162 (Beispiel 3); pRIT10158, PRIT10677 und pRIT10909 (Beispiel 4); pRIT10911 (Beispiel 5); pRIT10679, pRITi0903, pRIT10914 (Beispiel 6); PRIT12211, pRIT12209 und pRIT12230 (Beispiel 7); und pRIT12288 und pRIT12322 (Beispiel 8). Fig. 9 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT10172.

Fig. 10 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT12290.

Fig. 11 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT12322, die die DNA-Bereiche zeigt, die von pRIT12230 und pRIT12288 stammen.

Fig. 12 zeigt die Herstellung von pRIf12571; pRIT12573; PRIT12572 und pRIT12574.

Fig. 13 ist eine Restriktionskarte von pRIT12309.

Fig. 14 zeigt die Herstellung von pRIT12314 und pRIT12544.

Fig. 15 zeigt die Herstellung von pRIT12658. Fig. 16 ist eine Restriktionskarte von pRIT12662.

Fig. 17 zeigt die Herstellung von pRITi2660.

Fig. 18 zeigt die Herstellung von pRIT12845 (a,b,c,d,e,f).

Fig. 1A zeigt die Herstellung von pRIT12662.

Fig. 2A zeigt eine schematische Restriktionskarte des Klons /{. MPf 1 und eine Strategie zu seiner Sequenzierung.

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Fig. 3A zeigt die Nucleotid-Sequenz des CS-Protein-Gens von

P. falciparum

Fig. 4A zeigt die in pRIT12792 enthaltene Pre S1- Pre S2

DNA-codierende Sequenz.

Fig. 1B zeigt eine schematische Restriktionskarte der codierenden Sequenz des HIV Hüllproteins. Fig. 2B zeigt die Konstruktion von pRIT12893. Fig. 3B zeigt die Konstruktion von pRIT12897. Fig. 4B zeigt die Konstruktion von pRIT12899. Fig. SB zeigt die Konstruktion von pRITX.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Expression vcn HBsAg in Hefe

Mit dem Ausdruck "regulatorische Region", wie hier verwendet, ist eine DNA-Sequenz gemeint, die notwendige oder wünschenswerte Sequenzen für die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz enthält. Solche regulatorischen Regionen weiden in der Regel angrenzend an das 5'-Ende der codierenden Sequenz, die exprimiert werden soll, gesetzt. Vorzugsweise w^rd aine weitere Region der Hefe DNA, die ein Terminationssignal für die Transkription enthält, unmittelbar an das 3'-Ende der codierenden Region, die exprimiert werden soll, gesetzt, um die Tarmination der Transkription zu bewirken.

Mit dem Ausdruci: "HBsAg", wie hier gebraucht, ist ein Antigen gemeint, das Proteine umfaßt, die durch die S-proteinco-

QO dierende Sequenz des HBV-Genoms codiert werden. Ein solches HBsAg ist strukturell ähnlich zu natürlichem HBsAg oder hat im wesentlichen die gleichen antigenen Determinanten wie das natürliche - HBsAg, die durch die S-proteincodierende Sequenz codiert werden. Ein solches HBsAg kann eine Immunantwort stimulieren, die spezifisch erkennt und mit natürlichem HBsAg reagiert. Ein solches HBsAg wird auch spezifisch durch Anti-

-28-HBsAg-Antikörper erkannt.

Die HBsAg codierende Sequenz kann aus der DNA von Dane-Partikeln aus dem Serum von infizierten Menschen isoliert werden, indem der Einzelstrangbereich der DNA mit einer DNA-Polymerase,vorzugsweise der endogenen Polymerase; zum Doppelstrana gemacht wird und dieser anschließend mit einer Restriktionsendonuclease geschnitten wird. Die Wahl der Endonuclease hängt teilweise von den einzelnen Dane-Partikeln 3b, Beispielsweise kann die HBsAg-codierende Sequenz der HBV DNA bestimmter Dane-Partikel des adw Serotyps durch ein einzelnes BamHI-Fragment isoliert werden; die .HBsAg-codierende Sequenz der HBV DNA bestimmter Dane-Partikel des ayw Serotyps kai.η durch ein Hhal-Fragment isoliert werden. HBV DNA von Dane-Partikel des gleichen Serotyps können auch unterschiedliche Restriktionsmuster aufweisen.

Die Spaltung von DNA

Die Herstellung von DNA-Fragmenten, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Ligierung von solchen Fragmenten zu rekombinanten DNA-Molekülen und die Insertion solcher rekombinanter DNA-Moleküle in Mikroorganismen wird in an sich bekannter Weise durchgeführt; vgl. die vorstehenden oder nachfolgenden Literaturzitate. Bedingungen werden gewählt, um die Denaturierung der DNA und der Enzyme zu verhindern. Beispielsweise wird der pH-Wert auf einen Bereich von 7 bis 11 eingestellt und die Temperatur unter 60⁰C gehalten. Vorzugsweise wird die Restriktion der DNA bei einer Temperatur von 30 bis 40⁰C und die Ligierung bei 0 bis 10⁰C durchgeführt. Verwendete Restriktionse'nzyme und Ligasen sind handelsüblich und werden nach Vorschrift verwendet. Die T4 DNA-Ligase ist die bevorzugte Ligase.

Die verschiedenen Fragmente und die endgültigen Konstruktionen können in üblicher Weise miteinander verbunden werden.

-29-

In vielen Fällen wurden Gene isoliert,durch Restriktionsenzyme kartiert und auch sequenziert. Zu diesem Zweck kann man die interessierende Sequenz, wie die HBsAg-Sequenz, durch Restriktion des Gens selektionieren und, wenn nötig, weiter manipulieren, wie durch Bal31 Verdauung, in vitro Mutagenese, Primer-vermittelte Reparatur oder ahnliches, um ein Fragment gewünschter Größe herzustellen, das die gewünschte Sequenz enthält und geeignete Enden besitzt. Linker und Anschlußfragmente können benutzt werden, um Sequenzen miteinander zu verbinden und auch verloren geganqene Sequenzen zu ersetzen, wenn innerhalb der interessierenden Region eine Restriktionsstelle verwendet wurde. Die verschiedenen Fragmente, die isoliert werden, können durch Elektrophorese gereinigt werden, elektroeluiert, mit anderen Sequenzen Iigiert, kloniert, wieder isoliert und weiter manipuliert werden.

Die Verwendung von regulatorischen Regionen zur Kontrolle der Transkription des interessierenden Struktur-Gens, wie der HBsAg-Sequenz, erlaubt es, nachdem die Wirtszellen zu einer hohen Dichte gewachsen sind, während dessen das Strukturgen gar nicht oder nur wenig exprimiert wurde, durch Änderung der umgebenden Bedingungen z.B. des Nährstoffes, der Temperatur etc., die Expression des Strukturgens zu induzieren.

Beispielsweise kann man mit der GAL4 regulatorischen Region die Hefezellen in einem Vollmedium mit einer Kombination aus Glycerin und Milchsäure zu einer hohen Dichte, nämlich der mittleren oder späten log-Phase, wachsen lassen und dann die Kohlenstoffquelle ändern und Galactose anbieten. Mit

r·

der PHO5 regulatorischen Region kann man die Zellen in einem Medium mir einer hohen Phosphatkonzentration von etwa 7 mM KH₂PO. wachsen lassen, sie dann ernten und in einem Medium, das phosphatfrei ist, resuspendieren, um eine Derepression und Expression zu bewirken. Bei Temperatursensitivität könnte man die 'Zellen bei 25 bis 37°C wachsen lassen und dann

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die Temperatur passend um . 5 bis 2O°C ändern. Die Wirtszellen weisen dann das mit der regulatorischan Region verbundene Regulationssystem auf.

Die Fusion der HBsAg-Sequenz mit der regulatorischen Region kann durch Verwendung eines Zwischenvektors erreicht werden. Alternativ kann die HBsAg-Sequenz aber auch direkt in einen Vektor integriert werden, der die regulatonsche Region enthält. Ein Vektor ist eine DNA, die das DNA-Fragment der Erfindung tragen und beibehalten kann, beispielsweise ein Phage oder ein Plasinid. Techniken zur Klonierung von DNA-Fragmenten in Phagen sind beispielsweise aus Charnay et al., Nature, Bd. 286 (1980), 893 - 895, und der GB-Patentanmeldung 2 034 323 bekannt. Die HBsAg-Sequenz wird vorzugsweise so mit der regulatorischen Region verbunden, daß nach Expression der HBsAg-Sequenz ein HBsAg entsteht, das frei von fremden Aminosäureresten ist.

In einer Ausführungsform der Erfindung wurde die HBsAgcodierende Sequenz zusammen mit 42 Codons der für das HBsAg Vorläufer (PreS-S) Protein codierenden DNA in Ablesephase mit dem 18. Codon der für das Hefe OCT-Protein codierenden Sequenz ligiert, die unter der Kontrolle des arg³ Promoters steht. Dieses Konstrukt ergibt ein hybrides Partikel, das ein HBsAg-Protein enthält, das neben den 226 Aminosäuren des S-Proteins zusätzlich 60 N-terminale Aminosäuren besitzt.

Ein Beispiel für eine regulatorische Region stammt von dem Hefe arq³-Gen, das für die Ornithin-Carbamoyl-Transferase (OCT) codiert. Die arg³ regulatorische Region ist verantwortlieh für spezifische und allgemeine Kontrollmechanismen. Aus Crabeel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 78 (1981), 6026,ist die Klonierung dieser regulatorischen Region in dem Plasmid pYeura³arg³ in E. coli bekannt. Bevorzugte Wirte sind Stämme von S. cerivisiae, in denen die Argininbiosynthese derepremiert ist, beispielsweise der Stamm 1c1697d.

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Die Verwendung solcher Stämme führt durch den arg³-Promoter zu einer erhöhten Expression im Vergleich zu dem Stamm DC5. Andere nützliche regulatorische Regionen stammen von Hefe-Genen, deren Produkte an der Glykolyse beteiligt sind, beispielsweise von Genen, die für Enolase, Aldolase, Phosphoglyceratkinase und Glyerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codieren; von dem Hefe-Alkohol-Dehydrogenase-Gen; und im allgemeinen von Genen, die am katabolischen Stoffwechsel beteiligt sind, wie das Arginase-Gen.

Ein bevorzugter Vektor zur Klonierung des fusionierten DNA-Fiagments in Hefe ist das Plasmid YEp13, das in E. coii und S. cerevisiae repliziert und stabil ist und daher als Shuttle-Vektor bezeichnet wird. Mehrere andere Hefe-Vektoren sind bekannt und erhältlich. Die HBsAg-Sequenz und die regulätorische Region können in einem Hefe-Vektor nacheinander oder gleichzeitig inseriert werden. Die Transformation von Hefen mit Plasmid-Vektoren, die hefespezifische autonom replizierende Sequenzen enthalten, führt, normalerweise dazu, daß das DNA-Molekül der Erfindung wie ein Plasmid extrachromosomal repliziert wird. Solche Replikons sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Transformation mit Plasmid-Vektoren, die keine funktioneilen Hefe-Replikons enthalten, führt zur Integration des DNA-Moleküls in das Hefe-Genom.

Impfstoffe für den Menschen zum Schutz vor HBV-Infektion, die HBsAg enthalten, das gemäß der Erfindung in Hefe produziert wurde und einen geeigneten Carrier besitzen, können nach bekannten Methoden hergestellt werden. Die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, ist wünschenswert. Das so produzierte HßsAg kann auch mit anderen immunogenen Substanzen kombiniert werden, um Kombinations-Impfstoffe herzustellen. Der HBV-Impfstoff oder der Kombinations-Impfstoff kann beispielsweise subcutan, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Das DNA-Fragment der Erfindung und das davon produzierteHBsAg können auch als Sondenmolekül bzw. Probe verwendet werden, um HBV in biologischen

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Proben durch DNA-Hybridisierungstechniken bzw. in verschiedenen Immunotests nachzuweisen.

Expression eines DNA-Moleküls, das eine funktionelle DNA-Sequenz enthält, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz

fusioniert ist

Diese Erfindung betrifft auch ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine funktiemelle DNA-Sequenz enthält, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist. Die Bezeichnung "codierende Sequenz" oder "codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon.

Mit dem Ausdruck "funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immunogenität beibehält. Solche funktionellen Derivate können durch die übliche ortsspezifische Mutagenese hergestellt werden. Aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, sind ortrspezifische Mutagenese-Techniken bekannt. Eine solche Fusion kann am N-Terminus der Pre S2-Region oder an irgendeinem Punkt innerhalb der Pre S2-Region stattfinden. Es gibt vier

<pc Arten von Fusionen, nämlich am 5 '-Terminus der gesamten Pre S2-Region, an irgendeinem Punkt innerhalb der Pre' S2-Region, so daß die Pre S2-DNA die funktionelle DNA-Sequenz an beiden Seiten flankiert, an dem 5'-terminalen Ende einer verkürzten Pre S2-Region oder am 5'-Terminus der S-protein-

QQ codierenden Region, so daß die Fusion keine Pre S2-DNA enthält. Verschiedene Pre S2-S proteincodierenden Sequenzen sind bekannt und können nach bekannten Methoden hergestellt und isoliert werden (Vgl. die oben zitierte Literatur]. In einer Ausführungsform der Erfindung wurde die ARG3 regulato-

g₅ rische Region zusammen mit 1 8 Codons der für das Hefe-OCT-Protein codierenden DNA in Ablesephase vnit einer verkürzten Pre S2-S pro-

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teincodierenden Sequenz fusioniert, die dann 42 Codons der Pre S2-S proteincodierenden Sequenz zusammen mit der kompletten S-proteincodierenden Sequenz enthält. Bevorzugte funktionelle DNA-Sequenzen sind die codierende Sequenz des circumsporozoiden (CS) Proteins von Plasmodium oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon, das Gen des Hüllproteins von HIV oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon, besonders die codierende Sequenz des C_-Peptides,des Peptides 121 oder Dreesman Peptids oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon und die Pre S2-, Pre S1- oder gesamte Pre SI-Pre S2-S proteincodierende Sequenz oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon. Eine bevorzugte funktioneile DNA-Sequenz sind die ersten 13 N-terminalen Codons der Pre S2-codierenden Sequenz, die dann mit den 42 C-terminalen Codons einer verkürzten Pre S2-Region aus einer Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert werden. Mit dem Ausdruck "immunogenes Derivat" ist eine Sequenz gemeint, die ein Derivat oder eine modifizierte Version einer natürlich vorkommenden Sequenz ist, und die die schützende immunogene Aktivität der natürlichen Sequenz beibehält oder verstärkt. Solche immunogenen Derivate können nach üblichen Methoden hergestellt werden. Der Ausdruck "Pre S2-, Pre S1- oder die gesamte Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz", wie hier verwendet, umfaßt ein beliebiges immunogenes Derivat davon.

Mit dem Ausdruck "circumsporozoides (CS) Protein des Plasmodiums" ist das immunologisch dominante Oberflächenantigen des Sporozoiten von Plasmodium oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon gemeint. Nützliche circumsporozoide

(CS) Proteine umfassen insbesondere jene, die von Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale und P. malaria* stammen. P. falciparum, P. vivax, P. ovale und P. malariae, infizieren den Menschen.

Aus Dame et al., Science, 225 (1984) , 593-599, ist die CS-

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proteincodierende Sequenz von Plasmodium falciparum bekannt. Aus Arnot et al., Science, 230 (1985), 815-818, ist die CS-proteincodierende Sequenz von P. vivax bekannt. Aus Sharma et al., Science, 229 (1985), 779-782, ist die CS-proteincodierende Sequenz von P. knowlesi bekannt. Aus Enea et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8j_ (1984), 7520-7524, ist die CS-proteincodierende Sequenz von P. cynomolgi bekannt. Die CS-proteincodierenden Sequenzen anderer Spezies von Plasmodium sind bekannt (vgl. die vorstehend zitierte Literatur) und/oder können nach üblichen Methoden erhalten werden.

Die Ausdrücke "CSP" oder "CS-Protein" umfassen.das natürliche, normal große circumsporozoide Protein von Plasmodium und auch ein beliebiges immunogenes Derivat davon. Mit dem Ausdruck "immunogenes Derivat" des circumsporozoiden Proteins von Plasmodium ist (a) ein beliebiges Derivat des circumsporozoiden Proteins von Plasmodium, das die schützende immunogene Aktivität beibehält, gemeint oder (b) ein beliebiges Protein, das von einer modifizierten codierenden Sequenz des circumsporozoiden Proteins von Plasmodium abstammt, das eine schützende immunogene Aktivität behält. Solche immunogenen Derivate können nach üblichen Methoden hergestellt werden. Aus Ballou et al., Science, 228 (1985), 996-999, sind einige immunogene synthetische Derivate der CS-proteincodierenden Sequenz von P. falciparum bekannt; vgl. auch Mazier et al., Science, 231 (1986), 156 - 159.

Die CS-codierende Sequenz von verschiedenen Plasmodium-Arten ist bekannt und kann nach bekannten Methoden hergestellt oder isoliert werden [[vgl. beispielsweise WO84-02922-A (P. knowlesi CS-Protein) und Dame et al., Science, 225 (1984), 593 (P. falciparum CS-Protein)]. Ein DNA-Molekül, in dem die CS-codierende Sequenz oder eine beliebige funktioneile DNA-Sequenz in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist, kann nach bekannten Methoden hergestellt wer-

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den, wie durch Ligierung der CS-codierenden Sequenz oder einer anderen beliebigen funktioneilen DNA-Sequenz in Ablesephase mit einem beliebigen Codon der für 55 Aminosäure codierenden Pre 32-codierenden Region aus einer Pre S2-S proteincodierenden Sequenz.

Vorzugsweise verbleibt nach Ligierung mit der CS-codierenden Sequenz oder einer anderen funktioneilen DNA-Sequenz ein genügend großer Teil der Pre S2-codierenden Sequenz, um das CS-Protein oder ein beliebiges anderes funktionelles Protein auf der HBsAg-Partikel-Oberfläche optimal zu präsentieren. Ein genügend großer Teil der Pre S2-Region sollte nämlich verbleiben, so daß das durch die Pre S2-Region codierte PoIypeptid als Brücke zwischen dem durch die funktioneile DNA-Sequenz codierten Produkt und der HBsAg-Partikel-Oberflache fungieren kann. Beispielsweise ist aus Milich et al., Science, 228 (1985), 1195- 1199, bekannt, daß die 26 aminoterminalen Aminosäuren der Pre S2-codierenden Sequenz eine dominante Antikörperbindungsstelle auf der Pre S2-Region darstellen.

Wenn es gewünscht ist, ein hybrides Partikel herzustellen, das die Epitope der Pre S2 und CS bzw, einer anderen funktionellen DNA-Sequenz enthält oder präsentiert, sollte man vorzugsweise die CS-codierende Sjquenz oder eine andere beliebige funktionelle DNA-Sequenz an einem Punkt innerhalb der Pre S2-codierenden Region inserieren, der die Herstellung eines hybriden Partikels erlaubt, das die Epitope der Pre S2 und CS bzw. einer anderen funktioneilen DNA-Sequenz enthält oder präsentiert.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete rekombinante Vektor enthält das rekombinante DNA-Molekül (nämlich eine funktionelle DNA-Sequenz, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz fusioniert ist) , funktionell verbunden mit einer regulatorischen Region. Ein solcher Vektor kann zusätzlich auch ein funktionelles Hefe-Replikon besitzen. Mit dem Ausdruck "Replikon"

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ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die zur extrachromosomalen Stabilität eines solchen rekombinanten Vektors in einem Hefe-Wirtsorganismus beiträgt. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck "regulatorische Region" ist eine beliebige DNA-Region gemeint, die die Transkription und Translation der zu exprimierenden DNA-Sequenz reguliert. Solche regulatorische Regionen sind ebenfalls bekannt.

Solch ein Vektor kann nach üblichen Methoden hergestellt werden, wie durch die Inserierung des DNA-Moleküls der Erfindung in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon einer regulatorischen Region enthält. Die Inserierung erfolgt in solcher Weise, daß das DNA-Molekül mit solch einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist. Das DNA-Molekül wird vorzugsweise in einen Vektor ligiert, der zur Expression in der Hefegattung Saccharomyces befähigt ist.

Die Erfindung betrifft auch eine durch einen solchen rekombinanten Vektor transformierte Hefe-Wirtszelle und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirtes, das die Transformierung einer Hefe-Wirtszelle mit dem rekombinanten Vektor umfaßt. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise durchgeführt. Geeignete Hefezellen sind jene der Gattung Saccharomyces, wobei die Zellen der Art Sö-.ccharomyces cereviöiae und Saccharomyces carlsbergensis besonders geeignet sind.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden HBsAg-Protein enthaltendenPartikels, das das Produkt der funktioi\ellen DNA-Sequenz enthält oder präsentiert. Ein solches Verfahren umfaßt dia Kultivierung der transformierten Hefe-Wirtszellen in einem geeigneten Kulturmedium und die Isolierung des Partikels aus einem Zell-Lysat oder Extrakt dieser Wirtszellen. Mit dem

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Ausdruck "präsentiert oder enthält" ist gemeint, daß das durch die funktionelle DNA-Sequenz codierte Protein in dem hybriden HBsAg-Protein enthaltenden Partikel so enthalten ist, daß es eine Immunantwort stimulieren kann. Gewünschtenfalls wird die Präsentation des durch die funktionelie DNA-Sequenz codierten Proteins nicht die immunogene Aktivität der HBsAg-Epitope stören, wodurch ein bivalenter Impfstoff erhalten wird. Besonders bevorzugt wird das durch die funktionelle DNA-Sequenz codierte Protein auf einem HBsAg-Partikel in solcher Weise präsentiert, daß entweder die maximale Anzahl von Epitopen des durch die funktionale DNA-Sequenz codierten Proteins oder die maximale Anzahl von Epitopen des durch die funktionale DNA-Sequenz codierten Proteins und des HBsAg-Proteins wie angemessen exponiert wird. Mit dem Ausdruck "geeignetes Kulturmedium" ist ein Mediurr gemeint, das das Wachstum des transformierten Wirts ermöglicht und es einem solchen Wirt ermöglicht, das Produkt des hybriden DNA-Fragments, das in dem zur Transformation verwendeten Vektors enthaltun ist, in wiederholbarer Menge zu exprimieren. Dieses hybride DNA-Fragment ist ein Fusionsprodukt aus der funktioneilen DNA-Sequenz und der Pre S2-S proteincodierenden Sequenz. Einem Fachmann ist es bekannt, daß das geeignete Kulturmedium abhängig von der verwendeten Wirtszelle is... Die Isolierung des hybriden Partikels der Erfindung aus einem Zell-Lysat oder Extrakt einer solchen Wirtszelle kann durch übliche Protein-Isolierungstechniken durchgeführt werden.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der die hybriden Partikel dieser Erfindung enthält. Ein solcher Impfstoff wird eine zum Immunschutz notwendige Menge an hybriden Partikel der Erfindung enthalten und ist nach üblichen Methoden herstellbar. Mit dem Ausdruck "Immünschutz" ist gemeint, daß die hybriden Partikel dieser Erfindung in ausreichender Menge verabreicht werden, so daß eine ausreichende Antikörperantwort gegen das Agens erzielt

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wird, die zum Schutz beiträgt und keine ernsten Nebenwirkungen hat. Vorzugsweise enthält der Impfstoff eier Erfindung die Mizellen der Erfindung, nämlich Mizellen, die das Partikel der Erfindung und Polysorbat enthalten. Die bevorzugte Menge an Polysorbat in solch einer Mizelle ist 5 bis 50 ug Polysorbat pro 100 ug Protein. Die Mizelle kann nach dem Verfahren hergesteMt werden, das in der EP-A 0 199 698 beschrieben ist.

In dem Impfstoff der Erfindung kann eine wäßrige Lösung der hybriden Partikel der Erfindung vorzugsweise mit einem physiologischen pH direkt verwendet werden. Alternativ kann das Partikel mit einem beliebigen der bekannten Adjuvantien aufgenommen werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen generell bekannt.

Die Menge des hybriden Partikels der Erfindung ist in jeder Impfstoffdosis auf eine Menge beschränkt, die in typischen Impfstoffen eine zum Immunschutz notwendige Antwort induziert, ohne bedenkliche Nebeneffekte zu haben. Eine solche Menge hängt davon ab, welches spezifische Immunogen verwendet wird und ob ein Adjuvans beigegeben ist. Im allgemeinen wird erwartet, daß jede Dosis 1 bis 1000 ug Protein, vorzugsweise 1 bis 200 ug Protein, enthält. Eine optimale

₃Q Menge für einen speziellen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen ermittelt werden, zu denen die Beobachtung der Antikörpertiter und anderer Reaktionen im Patienten gehört. Nach einer ersten Impfung erhalten die Patienten vorzugsweise nach vier Wochen eine weitere Impfstoff-

„p. Verabreichung/ der alle sechs Monate eine weitere folgt, solange ein Infektionsrisiko besteht.

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Die Immunantwort auf das hybride Partikel der Erfindung kann durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, erhöht werden.

δ Zur Veranschaulichung des hybriden Partikels der Erfindung wurde eine -64 Codon enthaltende DNA-Sequenz, die für das sich wiederholende Epitop des circumsporozoiden (CS) Protein von Plasmodium falciparum codiert und eine acht Codons enthaltende CS-codierende Sequenz [vgl. Dame et al,, Science, 225 (1984) . 593 - 599 Π jeweils in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-codierenden Sequenz, die in einem Hefeexpressionsvektor vorliegt, fusioniert. Dieser Hefeexpregsionsvektor enthält darüber hinaus ein Replikon und eine geeignete regulatorische Region. Beide Expressionsvektoren, nämlich der eine mit der 64 Codons enthaltenden CS-Sequenz und der andere mit der acht Codons enthaltenden Sequenz, wurden jeweils in Hefe-Wirtszellen eingeführt und die Extrakte von solchen transformierten Zellen hinsichtlich der Anwesenheit von HBsAg- und CS-Epitopen auf dem gleichen Molekül untersucht.

Die Ergebnisse wurden durch Immunblo't-Analyse erhalten, wobei ein Gemisch von fünf monoklonalen Antikörpern gegen CS und einem monoklonalen Antikörper gegen HBsAg aus Hefe verwendet wurden. Die Ergebnisse zeigten ein 37 kd großes Hybridprotein aus dem Lysat von Hefen, die mit einem Vektor transformiert wurden, der die 64 Codons enthaltende CS-codieronde Sequenz in Ableiephase fusioniert mit der Pre S2-S proteincodierenden Sequenz enthält. Die Ergebnisse zeigten ein 30 kd großes hybrides Protein aus Lysaten von Hefe, die mit einem Vektor transformiert wurden, der die acht Codons enthaltende CS-codierende Sequenz in Ablesephase fusioniert mit der Pre S2-S proteincodierenden Sequenz enthält. Der Zusammenbau dieser Proteine in HBsAg ähnliche Partikelstrukturen wurde durch die Analyse von Cäsiumchlorid und Sucrosegradienten, Hochdruckflüssigkeitschromatographie

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(HPLiC) und Elektronenmikroskopie gezeigt. Die Präsentation der CS-Epitope auf der Außenseite von solchen Partikeln wurde in ELISA-Tests durch die Zugänglichkeit der CS-Epitope für CS-spezifische Antikörper gezeigt. Die Präsentation von HBsAg-Epitopen auf der Außenseite von solchen Partikeln wurde durch Radioimmun.test (AUSRIA II, Abbott) oder ELISA-Test (Enzygnost-HBsAg, Behringwerke) gezeigt.

Neue Pre S2 und Pre S2-S proteincodierende Sequenzen

Die neuen HBV Pre S2 und Pre S2-S proteincodierenden Sequenzen der Erfindung stammen von dem HBV adw Subtyp und wurden aus dem Plasmid pRIT10616 isoliert. Der Ausdruck "codierende Sequenz" oder "codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dein Ausdruck "funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die wenn dienlich die Partikelbildung nicht stören und/oder die Immunogenität beibehalten, wenn es gewünscht ist. Solche funktioneilen Derivate können durch ortsspezifische Mutagenese, wie z.B. von Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193 - 1201, beschrieben, erhalten werden. Solche Pre S2 und Pre S2-S proteincodierenden Sequenzen können durch übliche rekombinante DNA-Verfahren aus dem Plasmid pRIT10616 erhalten werden. Dieses Plasmid wurde (in E. coli K12 Stamm C600) gemäß des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 2. Juni 1982 unter ATCC 38131 hinterlegt. Die Pre S2-Region einer solchen neuen proteincodierenden Sequenz enthält die folgenden Aminosäuren :

-55 ~ -50 Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-

-40 -³⁰

Pro-Arg-Val-Arg-^Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-

-20 Ser-Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-lle-Ala-Ser-His-Ile-

-10 Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Ptro-Val-Thr-Asn.

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Eine solche Region kann auch durch synthetische Oligonucleotide in üblicher Weise hergestellt werden. Ein bevorzugtes funktionelles Derivat der Pre S2-S-codierendpn Sequenz der Erfindung ist eines, in dem die Aminosäure-Α]anin(GCT) an der Position -45 durch die ortsspezifische Mutagenese durch die Aminosäure Threonin (ACT) ausgetauscht wurde. Ein solches funktionelles Derivat wird in Saccharomyces cerevisiae zweimal stärker exprimiert als die unmodifizierte codierende Sequenz der Erfindung.

In einem rekombinanten Vektor der Erfindung liegt die Pre S2 oder Pre S2-S proteincodierende Sequenz der Erfindung funktionell gebundenan eine regulatorische Region vor. Ein solcher Vektor kann zusätzlich auch ein Replikon enthalten,

I^ das von dem Wirt abhängig ist, in dem es verwendet wird.

Mit dem Ausdruck "Replikon" ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die einen solchen rekombinanten Vektor in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Organismus extrachromosomal stabil hält. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck "regulatorische Region" ist eine beliebige DNA-Sequenz gemeint, die eine Promotorregion und andere Sequenzen enthält, die notwendig sind für die Transkription einer codierenden Sequenz. !Solche regulatorischen Regionen sind bekannt. Solch ein Vektor kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wie Inserierung der Pre S2 oder Pre S2-S proteincodierenden Sequenz der Erfindung in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon und eine regulatorische Region enthält. Diese Inserierung erfolgt in solcher

QQ Weise, daß das DNA-Molekül an eine solche regulatorische Region funktionell verbunden ist.Vorzugsweise wird das DNA-Molekül in einen Vektor inseriert, der in Hefe, wie Sacch-iromyces, exprimiert werden kann.

Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die durch diesen rekombinanten Vektor transformiert ist und ein

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Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirts. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise ausgeführt. Die Wirtszellen können prokaryontische oder eukaryontische Zellen sein. Bevorzugte Wirtszellen sind eukaryontische Zellen, hauptsächlich Hefezellen der Gattung Saccharomyces, besonders jene, die den Arten Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces carlsbergensis angehören.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung

IQ eines Proteins, das durch die Pre S2 und Pre S2-S DNA-Sequenz codiert ist. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten Wirtszellen in einem geeigneten Kulturmedium und die Isolierung des Proteins aus dem Kulturüberstand oder dem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszel-

2g len. Die Isolierungsart hängt von der Fähigkeit der Zellen ab, solche Proteine zu sekretieren. Mit dem Ausdruck "geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und die Pre S2 oder Pre S2-S proteincodierende Sequenz in wiederholbaren Mengen exprimie^ren kann. Dem Fachmann ist es bekannt, daß die Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängen. Das Pre S2-S Protein wird durch übliche Protein-Isolierungstechniken aus einem Kulturlysat oder dem Kulturüberstand eines solchen Wirts isoliert. Das nach dem Verfahren dieser Erfindung hergestellte Protein kann glykosyliert sein, sofern die Wirtszelle dazu in der Lage ist. Wenn ein nicht glykosyliertes Protein gewünscht ist, so wird das Protein in einer Wirtszelle hergestellt, die zur Glykosylierung nicht befähigt ist. Alternativ könnte auch die proteincodierende Sequenz

eg durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193 - 1201, bekannt, verändert werden, bevor das Verfahren der Erfindung durchgeführt wird.

Die Erfindung·betrifft auch einen Impfstoff, der eine zum

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i.-:".· · .kt» notwendige Menge des Pre S2 oder Pre S2-S Proteine der Erfindung enthalt. Ein solcher Impfstoff kann durch übliche Techniken hergestellt werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden HBsAg-Protein enthaltenden Partikels, das ein Protein enthält, das durch die Pre S2-S Sequenz codiert ist. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten eukaryontischen Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Partikels aus dem Kulturüberstand oder dem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Isolierungsart ist abhängig davon, ob die transformierten Wirtszellen solche Partikel sekretieren können. Mit dem Ausdruck "geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, .in denen der transformierte Wirt wachsen und die Pre S2-S proteincodierende Sequenz in Partikelform und in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Dem Fachmann ist es bekannt, daß geeignete Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhän- <3^ei1· Das hybride Partikel wird durch übliche Isolierungstechniken aus dem Kulturlysat oder dem Kulturüberstand eines solchen Wir"es isoliert.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der die hybriden Partikel enthält. Ein solcher Impfstoff wird eine zum Immunschutz notwendige Menge an den hybriden Partikeln enthalten und wird in an sich bekannter Weise hergestellt. Der Impfstoff enthält vorzugsweise die Mizelle der Erfindung, nämlich eine Mizelle, die das Partikel und PoIysorbat enthält. Die bevorzugte Menge von Polysorbat solch einer Mizelle -ist 5 bis 50 ug Polysoroat pro 100 ug Protein. Die Mizelle kann nach dem Verfahren der EP-A 0 199 698 hergestellt werden.

In dem Impfstoff kann eine wäßrige Lösung des Pre S2-S

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Proteins oder des hybriden Partikels, die vorzugsweise einen physiologischen pH-Wert hat, direkt verwendet werden. Alternativ kann dem Protein oder Partikel ein beliebiges Adjuvans beigemengt werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

Aus N^w Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen generell bekannt. Aus der US-Patentschrift 4 235 877 ist beispielsweise die Einkapselung in Liposomen bekannt. Aus den US-Patentschriften 4 372 945 und 4 474 757 ist die Zusammenfassung von Proteinen zu Makromolekülen bekannt.

Das Pre S2-S Protein oder das hybride Partikel liegt in jeder Impfstoffdosis in einer Menge vor, die in typischen Impfstoffen zu einer zum Immunschutz tiotwendigen Antwort ohne bedeutende Nebenwirkungen führt. Eine solche Menge wird von dem spezifischen immunogenen Stoff abhängen und auch davon, ob dem Impfstoff ein Adjuvans beigemengt ist. Im allgemeinen wird erwartet, daß jede Dosis 1 - 1000 \iq Protein, vorzugsweise 1 bis 200 ]xg Protein, enthält. Eine optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann man durch Standarduntersuchungen ermitteln, die die Beobachtung der Antikörpertiter und anderer Reaktionen beim Patienten einschließen. Nach einer ersten Impfung wird der Patient vorzugsweise eine erneute Verabreichung des Impfstoffes nach etwa vier Wochen erhalten, der alle sechs Monate eine weitere folgt, solange Infektionsgefahr besteht.

Die Immunantwort auf das Pre S2-S Protein und das hybride Partikel wird durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, verstärkt

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-45-Neue Pre S1 proteincodierende Sequenz

Die neue HBV Pre S1 proteincodierende Sequenz stammt von einem HBV adw Subtyp und kann aus dem Plasmid pRIT10616 isoliert werden. Die Bezeichnung "codierende Sequenz" oder "codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck "funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die, wenn gewünscht, die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immu-

" Il

nogenität beibehält. Solche funktionelle Derivate können durch übliche ortsspezifische Mutagenese, wie aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193 - 1201, bekannt, hergestellt werden. Eine solche Pre S1 proteincodierende Se-⁴ quenz kann durch übliche rekombinante DNA-Techniken aus dem Plasmid pRIT10616 erhalten werden. Dieses Plasmid wurde (in E. coli K12 Stamm C600) gemäß dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection. Rockville, Maryland, am 2. Juni 1982 unter ATCC 38131 hinterlegt. Die Pre Sei-Region codiert für die folgende Aminosäuresequenz:

-163

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met GIy Thr Asn Leu Ser VaI Pco Asn Pro Leu 25

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pco Asp His Gin Leu Asp Pro

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT Ala Phe GIy Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro He Lys Asp His Tcp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin VaI GIy VaI GIy AIa

-46-

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC PUe GIy Pro GIy Leu The Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy l\3 Leu GIy Trp Ser Pro Gin Ala GIn

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT GIy He Leu Thr Thr VaI Ser Thr He Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro AIa Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg Gin Pico Thr Pro He Ser Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Aap Ser His Pro Gin AIa

Eine solche Region kann auch durch die übliche Synthese von Oligonucleotiden erhalten werden.

In einem rekombinanten Vektor liegt die Pre S1 proteincodierende Sequenz funktionell gebunden an eine regulatorische Region vor. Ein solcher Vektor kann auch zusätzlich ein Replikon enthalten, das von dem Wirt abhängig ist, in dem es verwendet wird. Mit dem Ausdruck "Replikon" ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die einen solchen rekombinanten Vektor in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtsorganismus extrachromosomal stabil hält. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck "regulatorische Region" ist eine DNA-Sequenz gemeint, die eine Promotor-Region und andere Sequenzen enthält, die notwendig sind für die Transkription einer codierenden Sequenz. Solche regulatorische Regionen sind bekannt. Ein solcher Vektor

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kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wie durch Inserierung der Pre S1 proteincodierenden Sequenz in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon und " eine regulatorische Region enthält. Die Inserierung erfolgt in solcher Weise, daß das DNA-Molekül mit dieser regulatorischen Region funktionell verbunden ist. Das DNA-Molekül wird vorzugsweise in einen Vektor inseriert, der in Hefe, wie Saccharomyces, exprimiert werden kann.

Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die mit solch einem rekombinanten Vektor transformiert ist und ein Verfahren zur Herstellung einer solch transformierten Wirtszelle. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise ausgeführt. Wirtszellen können prokaryontische oder eukaryontische Zellen sein. Bevorzugte Wirtszellen sind eukaryontische Zellen, hauptsächlich Hefezellen und von denen die der Gattung Saccharomyces, besonders jene der Art Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces carlsbergensis.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch die Pre S1 proteincodierende Se-quenz codiert wird, Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten Wirtszelle in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Proteins aus dem Kulturüberstand oder dem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtskulturen. Die Isolierungsart hängt davon ab, ob der transformierte. Wirt solche Proteine sekretieren kann. Mit dem Ausdruck "geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und die Pre S1 proteincodierenua Sequenz in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Dem Fachmann ist es bekannt, daß die geeigneten Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängen. Die Isolierung des Pre S1 Proteins aus einem Kulturlysat oder dem Kulturüberstand eines solchen Wirtes wird nach üblichen Methoden durchgeführt. Das Protein, das durch das Verfahren dieser Er-

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findung hergestellt wird, kann glykosyliert sein, sofern die Wirtszelle zur Glykosylierung befähigt ist. Wenn ein nicht glykosyliertes Protein gewünscht wird, sollte das Protein durch Verwendung einer Wirtszelle hergestellt werden, die nicht zur Giykosylierung befähigt ist. Alternativ kann die proteincodierende Sequenz durch die übliche ortsspezifische Mutagenese verändert werden, bevor das Verfahren dieser Erfindung durchgeführt wird. Die ortspezifische Mutagenese wird beispielsweise wie aus Botstein et al., Science, 2£9_ (1985), 1193 -1201, bekannt, durchgeführt.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff,· der das Pre S1 Protein der Erfindung enthält. Ein solcher Impfstoff wird eine zu einem Immunschutz notwendige Menge des Pre S1 Proteins der Erfindung enthalten und durch konventionelle Techniken hergestellt.

Für den Impfstoff kann eine wäßrige Lösung des Pre S1 Proteins, die vorzugsweise einen physiologischen pH-Wert besitzt, direkt verwendet werden. Alternativ kann dem Pre S1 Protein ein beliebiges Adjuvans beigemengt werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben

durch Voller et al., University Park Press, Baltimore", Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen generell bekannt. Aus der US-Patentschrift 4 235 877 ist die Einkapselung in Liposomen bekannt. Aus den US-Patentschriften 4 37? 945 und 4 474 757 ist die Zusammensetzung von Pro-

*" teinen zu Makromolekülen bekannt.

Das Pre S1 Protein liegt in jeder Impfstoffdosis in einer Menge vor, die in typischen Impfstoffen zu einer zum Impfschutz notwendigen Antwort ohne bedeu-

tende Nebenwirkungen führt. Eine solche Menge ist von

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dem verwendeten spezifischen immunogenen Stoff abhängig und auch davon, ob der Stoff ein Adjuvans enthält. Im allgemeinen wird erwartet, daß jede Dosis 1 bis 1000 ug Protein, vorzugsweise 1 bis 200 μα, enthält. Eine optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann man durch Standarduntersuchungen ermitteln, die die Beobachtung von Antikörpertiter und anderen Reaktionen im Patienten umfassen. Nach einer ersten Impfung wird dem Patienten vorzugsweise nach etwa vier Wochen eine erneute Impfstoffdosis verabreicht, der alle sechs Monate e:ne weitere folgt, solange ein Infektionsrisiko besteht. Die Immunantwort auf das Pre S1 Protein wird durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, erhöht.

15

Neue Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz

Die Erfindung betrifft auch eine HBV Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz, von der der Pre S1- Pre S2-Teil die folgende Aminosäuresequenz enthält:

PRE-Sl REGION -163

25

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met GIy Thi Asn Leu S-ir VaI Pro Aen Pro Leu

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATο Ό

Ala Phe GIv Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG

Ti\j Asp ^ühe Asn Pro lie Lys Asp His Trp

35

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA

Pro Ala Ala Asn Gin VaI GIy VaI GIy Ala

-50-

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy lie Leu GIy Trp Ser Pro Gin Ala GIn

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT GIy He Leu Thr Thr VaI Ser Thr lie Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro AIa Ser Thr Asn Arg Gin Set GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg GIn Pro Thr Pro He Ser Pro Pro Leu 15

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin AIa PRE-S2 REGION

-⁵⁵

ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA Met GIn Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gin

GCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTG AIa Leu Gin Asp Pro Arg VaI Arg GIy Leu

TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA Tyr Phe Pro Ala GIy GIy Ser Ser Ser GIy

ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT Thr VaI Asn Pro AIa Pro Asn I¹C AIa Ser

CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG His He Ser Ser Ser Ser AIa Arg Thr GIy 35

GAC CCT GTG ACG AAC Aep Pro VaI Thr Asn

-51-

Die neue HBV Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz der ser Erfindung stammt von einem HBV adw Subtyp und wurde aus dem Plasmid pRIT10616 isoliert. Dieses .Plasmid ist wie oben angegeben bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter ATCC 38131 hinterlegt. Der Ausdruck "codierende Sequenz" oder "codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck "funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die, wenn es gewünscht ist, die Partikelbildung nicht stört und/ oder die Immunogenität beibehält. Solche funktioneilen Derivate können durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie beispielsweise von Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193 - 1201,bekannt, hergestellt werden.

In einem rekombinanten Vektor liegt die

Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz funktionell gebunden an eine regulatorische Region vor. Ein solcher Vektor kann auch zusätzlich ein Replikon enthalten, das von dem Wirt, in dem es verwendet wird, abhängig ist. Mit dem Ausdruck "Replikon" ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die einen solchen rekombinanten Vektor in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtsorganismus extrachromosomal stabil hält. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck "regulatorische Region" ist eine beliebige DNA-Sequenz gemeint, die eine Promotor-Region und »andere Sequenzen enthält, die für die Regulierung der Transkription einer codierenden Sequenz notwendig sind. Solche regulatorischen Regionen sind bekannt. Ein solcher Vektor kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wie durch Inserierung der Pre S1- Pre S2-S proteincodierenden Sequenz in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon und eine regulatorische Region enthält. Die Inserierung erfolgt in einer solchen Weise, daß das DNA-Molekül an eine solche recjulatorische Region funktionell gebunden ist. Das DNA-Molekül wird bevorzugt in einen Vektor inseriert, der in Hefe, wie

-52-Saccharomyces, exprimiert werden kann.

Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die mit einem solchen rekombinanten Vektor transformiert ist und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirts.

Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise ausgeführt. Wirtszellen können prokaryontische oder eukaryontische Zellen sein. Bevorzugte Wirtszellen sind eukaryontische Zellen, hauptsächlich Hefezellen und von denen die Zellen der Gattung Saccharomyces, besonders jene der Art Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces carlsbergensis.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstsllung eines Proteins, das durch die Pre S1- Pre S2-S-Sequenz codiert ist. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Proteins aus dem Wirtszell-Überstand oder dem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die ^Art der Isolierung hängt von der Fähigkeit der Wirtszellen ab, solche Proteine zu sekretieren. Mit dem Ausdruck "geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und das Produkt der Pre S1- Pre S2-S proteincodierenden Sequenz in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Dem Fachmann ist es bekannt, daß die geeigneten Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängen. Die Isolierung des Pre S1- Pre S2-S Proteins aus einem Kulturlysat oder dem Kulturüberstand eines solchen Wirtes wird nach üblichen Methoden durchgeführt. Das Protein, das durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wird, kann glykosyliert sein, sofern die Wirtszelle zur Glykosylierung befähigt ist. Wenn ein nicht glykosyliertes Protein gewünscht ist, sollte das Protein dieser Erfindung durch Verwendung einer Wirtszelle, die nicht zur Glykosylierung fähig ist, hergestellt werden. Alternativ kann die

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proteincodierende Sequenz durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie beispielsweise aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193 - 1201, bekannt, verändert werden, bevor das Verfahren dieser Erfindung durchgeführt wird. Die Pre S1- Pre S2-S codierende Sequenz wird in Hefe oder Säugerzellen als glykosyliertes Protein exprimiert. Die Pre S1-Pre S2-S codierende Sequenz wird in Hefe als Protein exprimiert, das am N-Terminus eine Myristinsäure als Substituenten besitzt.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der das Pre S1- Pre S2-S Protein in einer zum Immunschutz notwendigen Menge enthält. Ein solcher Impfstoff kann durch übliche Techniken hergestellt werden.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden HBsAg-Protein enthaltenden Partikels, das ein Protein enthält, das durch die Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert wird. Ein solches Verfahren umfaßt

*^ die Kultivierung der transformierten eukaryontischen Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Partikels aus dem Wirtszellüberstand oder einem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Art der Isolierung hängt von der Fähigkeit der transformierten Wirtszellen ab, solche Proteine zu sokretieren. Mit dem Ausdruck "ge_r eignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und die Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz in Partikelform und in wiederholbarer Mengen exprimieren kann. Dem Fachmann ist es bekannt,

^ow daß geeignete Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängen. Die Isolierung des Partikels aus Kulturlysat oder Kulturüberstand eines solchen Wirtes wird nach üblichen Methoden durchgeführt.

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Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der die hybriden Partikel enthält. Ein solcher Impfstoff enthält die hybriden Partikel in einer zum Immunschutz notwendigen Menge und wird nach üblichen Methoden hergestellt. Der Impfstoff enthält vorzugsweise die Mizelle, nämlich eine Mizel-Ie, die das Partikel und Polysorbat enthält. Die bevorzugte Menge von Polysorbat in einer solchen Mizelle ist 5 bis 50 ug Polysorbat pro 100 ug Protein. Die Miz.elle kann nach dem in der EP-A 0199 698 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Eine wäßrige Lösung des Pre S1- Pre S2-S-Proteins oder des hybriden Partikels, die vorzugsweise einen physiologischen pH-Wert besitzt, kann direkt für den Impfstoff verwendet werden. Alternativ kann dem Protein oder dem Partikel ein beliebiges Adjuvans beigement werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen generell bekannt. Aus der US-Patentschrift 4 235 877 ist die Einkapselung in Liposomen bekannt. Aus den US-Patentschriften 4 372 945 und 4 474 757 ist die Zusammensetzung von Proteinen zu Makromolekülen bekannt.

Das Pre S1-- Pre S2-S-Protein oder das hybride Partikel liegt in jeder Impfstoffdosis in einer Menge vor, die in typischen Impfstoffen zu einer zum munschutz notwendigen Antwort ohne bedeutende Nebeneffekte führt. Eine solche Menge ist von dem verwendeten spezifischen immunogenen Stoff abhängig und auch davon, ob der Impfstoff ein Adjuvans enthält. Im allgemeinen wird erwartet, daß jede Dosis 1 bis 1000 ug Protein, vorzugsweise 1 bis

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200 ug Protein enthält. Eine optimale Menge für einen bestimmten Impfstoff kann man durch Standarduntersuchungen ermitteln, die die Beobachtung von Antikörpertiter und anderen .Reaktionen im Patienten umfassen. Nach einer ersten

Impfung wird dem Patienten vorzugsweise nach etwa vier

Wochen eine weitere Impfdosis verabreicht, der alle sechs

Monate eine weitere folgt, solange ein Infektionsrisiko besteht.

Die Immunantwort auf das Pre S1- Pre S2-S-Protein oder auf das hybride Partikel wird durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, verstärkt.

Expression des Pre S1- Pre S2-S-Proteins in Hefe

Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten DNA-Vektor, in dem die gesamte Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz an eine Expressions-Kontrollsequenz funktionell gebunden ist. Der Ausdruck "codierende Sequenz" oder "codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck "funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikation gemeint, die, wenn gewünscht, die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immunogenität beibehält. Solche funktionellenDerivate können durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie beispeislweise aus Botstein et al., Science, 229 (1985) , 1193-1201, bekannt, hergestellt werden. Ein

gO solcher Vektor kann zusätzlich ein Replikon enthalten, das von dem Wirt, in dem es verwendet wird, abhängig ist. Vorzugsweise wird die Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz verwendet.

Mit dem Ausdruck "Replikon" ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die einen solchen rekombinanten Vektor in einem Hefe-

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Wirtsorganimus extrachromosomal stabil hält. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck "regulatorische Region" ist eine beliebige DNA-Sequenz gemeint, die eine Promotor-Region und andere Sequenzen enthält, die wich- ι

tig für die Regulierung, der Transkription einer codierenden Sequenz sind.

• Solche regulatorischen Regionen sind bekannt. Ein solcher Vektor kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wie durch Inserierung einer Pre S1- Pre S2-S proteincodierenden Sequenz in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon und eine regulatorische Region enthält. Die Inserierung erfolgt in solcher Weise, daß das DNA-Molekül an die regulatorische Region funktionell gebunden ist. Das DNA-Molekül wird vorzugsweise in einen Vektor ligiert, der in Hefen der Gattung Saccharomyces exprimiert wird.

Vorzugsweise ist die in dem Vektor enthaltene Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz die Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz. Solche Vektoren sind auch nützlich für die Insertion von funktioneilen DNA-Sequenzen, um die rerultierende Pre S1-funktionelle DNA-Sequenz Pre S2-S proteincodierende Sequenz zu exprimieren. Deshalb betrifft diese Erfindung auch ein rekombinantes DNA-Molekül, in dem eine funktioneile DNA-Sequenz in Ablesephase mit der Pre S1-Region aus der Pre S1- Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist und einen ein solches rekombinantes DNA-Molekül enthaltenden Vektor. Die Fusion kann so erfolgen, daß die funkticnelle DNA-Sequenz entweder eine Insertion in der Pre S1-Region bildet, oder einen Teil der Pre S2-Region ersetzt; vgl. unten, Beis iel 21A.

Mit dem Ausdruck "funktioneile DNA-Sequenz" ist eine DNA-Sequenz gemeint, die, wenn sie in Ablesephase mit der Pre SI-Region aus der Pre S1- Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist, nicht an der Zusammensetzung des HBsAg-Partikel beteiligt ist noch die Partikelbildung stört. Bevorzugte funktionelle DNA-Sequenzen umfassen die circum-sporozoide (CS) codierende Sequenz von Plasmodium oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon, die codierende Sequenz

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des HIV Hüllproteins oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon, besonders die codierende Sequenz des C_-Peptids, des Peptides 121 oder des Dreesman Peptides oder codierende Sequenzen von interessierenden Peptiden anderer Viren, besonders jene von Hüllproteinen oder Oberflächenproteinen anderer Parasiten.

Die Erfindung betrifft auch eine Hefe-Wirtszelle, die mit einem solchen rekombinanten Vektor transformiert ist und ein IQ Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirts. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise ausgeführt. Bevorzugte Hefezellen gehören der Gattung Saccharomyces und besonders bevorzugte Zellen der Art Saccharomyces cerevisiae an.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch eine Pre S1- Pre S2-S-proteincodierende Sequenz oder eine Pre S1-funktioneile DNA-Sequenz-Pre S2-proteincodierende Sequenz codiert ist. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Proteins aus dem Kulturüberstand oder aus einem zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Art der Isolierung hängt von der Fähigkeit der Wirtszelle ab, solche Proteine zu sekretieren. Mit dem Ausdruck "geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und das Produkt einer pre S1- Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz oder einer Pre S1-funktioneilen DNA-Sequenz- Pre S2-S-proteincodieren-

gO den Sequenz in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Die Isolierung des Pre S1- Pre S2^-S-Proteins oder des Pre S1-funktionelle DNA-Sequei.z- Pre S2-S-Proteins aus einem Zell-Lysat oder dem Kulturüberstand eines solchen Wirtes wird nach üblichen Methoden durchgeführt. Das Protein, das nach dem Verfahren dieser Erfindung isoliert wird, kann glykosyliert sein, sofern die Wirtszelle die Fähigkeit

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zur Glykosylierung besitzt. Wenn ein nicht glykosyliertes Protein gewünscht ist, sollte das Protein dieser Erfindung durch Verwendung einer Wirtszelle, die nicht zur Glykosylierung befähigt ist, hergestellt werden. Alternativ könnte die proteincodierende Sequenz durch die übliche ortssoezifische Mutagenese, wie beispielsweise aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, bekannt, verändert werden, bevor das Verfahren der Erfindung durchgeführt wird.

Die Erfindung oetrifft auch einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge des Pre S1- Pre S2-S-Proteins oder des Pre S1-funktioneile DNA-Sequenz- Pre S2-S-Proteins enthält, die beide nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurden. Ein solcher Impfstoff kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden Partikels, das ein Protein enthält, das durch eine Pre S1- Pre S2-S-proteincodierende Sequenz oder eine Pre S1-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-proteincodierende Sequenz codiert ist. Eine solche Methode umfaßt die Kultivierung der transformierten Hefe-Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Partikels aus dem Kulturüberstand oder aus einem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Art der Isolierung hängt von der Fähigkeit der Zellen ab, solche Partikel zu gelektieren. Mit dem Ausdruck "geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und die Pre S1- Pre S2-S-proteincodierende Sequenz oder die Pre 51-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-proteincodierende Sequenz in Partikelform und in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Einem Fachmann ist es bekannt, daß die geeigneten Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängen. Die Isolierung des Partikels aus einem Kulturlysat oder dem Kulturüberstand solcher Wirtszellen wird nach üblicher. Methoden ausgeführt.

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Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der die Partikel der Erfindung enthält. Ein solcher Impfstoff enthält eine zum Immunschutz notwendige Menge der Partikel und wird in an sich bekannter Weise hergestellt. Der Impf- ° stoff enthält vorzugsweise die Mizelle der Erfindung, nämlich eine Mizelle, die das Partikel der Erfindung und Polysorbat enthält. Die bevorzugte Menge von Polysorbat in einer₍ solchen Mizelle ist 5 bis 50 \xg Polysorbat pro-100 ug Protein. Die Mizelle kann nach dem in der EP-A 0 199 698 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Für den Impfstoff der Erfindung kann eine wäßrige Lösung des Pre S1- Pre S2-S-Proteins oder des Pre S1-funktioneile DNA-Sequenz- Pre S2-S-Proteins oder des Partikels , die vorzugsweise einen physiologischen pH-Wert besitzt, direkt verwendet werden. Alternativ kann dem Proteinpartikei ein beliebiges Adjuvans beigemengt werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

- - .

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen bekannt. Aus der US-Patentschrift 4 235 877 ist die Einkapseiung in Liposomen bekannt. Aus den US-Patentschriften 4 372 945 und 4 474 757 is zu Makromolekülen bekannt.

4 372 945 und 4 474 757 ist die Zusammensetzung von Proteinen

Das Pre S1- Pre S2-S-Protein oder das Pre S1-funtionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-Protein oder das Partikel liegt in jeder Impfdosis in einer Menge vor, die in typischen Impfstoffen einer zum Immunsch_%utz notwendigen Antwort ohne bedeutende Nebenwirkungen führt. Eine solche Menge ist abhängig von dem verwendeten spezifischen immunogenen Stoff und auch davon, ob der Impfstoff ein Adjuvans enthält. Generell wird erwartet, daß jede Impfdosis 1 bis

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1000 ug Protein, vorzugsweise 1 bis 200 ug, enthält. Eine optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen ermittelt werden, die die Beobachtung von Antikörpertiter und anderen Reaktionen in Patiencen umfassen. Nach einer ersten Impfung wird dem Patienten vorzugsweise nach vier Wochen eine weitere Impfdosis verabreicht, der alle sechs Monate eine weitere folgt, solange ein Infektionsrisiko besteht.

Die Immunantwort gegen das Pre S1- Pre S2-S-Protein oder das Pre S1-funktionelle DNA-Seguenz- Pre S2-S-Protein oder das Partikel wird durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, verstärkt.

Ausführungsbeispiele 20

- Alle Prozentangaben sind Gewichtsprozente und alle Temperaturen werden in ⁰C angegeben.

- Die Enzyme, die für die DNA-Manipulation verwendet werden, wurden von Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs, und/oder Boehringer, bezogen und entsprechend der Vorschrift des Herstellers angewendet.

- Hefe-Wachstumsmedien: Selektivmedium: YNB (Hefestickstoffbase ohne Aminosäure (Difco Labs) 0,675 % (w/v) mit 2 % (w/v) Glucose).

- YEPD Medium: 1 % (w/v) Hefeextrakt, 2 % (w/v) Pepton und 2 % (w/v) Glucose.

- Methoden zur Herstellung von rekombinante DNA-Molekül^en sind aus "Molecular Cloning", T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor· Lab. (1982) bekannt.

- PMSF: Phenylmethylsulphonylfluorid.

-61-Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pro Liter): (pH 7,4) 8,0 g NaCl

0,2 g KCl

1,15g Na₂HPO₄

0,2 g KH₂PO₄

0,1 g CaCl₂ 0,1 g MgCl₂ . 6H₂O

BSA: Rinderserumalbumin (^40-70, Sigma) X-gal: 5-Brom-4-chloroindoyl-ß-D-galactopyran.osid, erhältlich bei Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri.

L-BROTH (pro Liter): 10 g Trypton

5 g NaCl

5 g Hefeextrakt

1 ml 0,1M MgSO₄

Nach Ar.toklavierung Zugabe von 5 ml einer sterilen Thiaminlösung (1 mg/ml). Für feste Medien Zugabe von 15 g Agar pro Liter.

Beispiel 1 Konstruktion des Plasmids pRIT10167

Das Ausgangsmaterial war das Plasmid p6y, das in pBR322 ein 2,1 kb großes Hindlll-Fragment der Hefe-DNA enthält, das für das TDH3-Gen codiert. p3R322 ist aus Bolivar et al., Gene,

QQ (1977), 95 - 113,bekannt. Das p6y Plasmid wurde konstruiert und charakterisiert von Musti et al., Gene, 25 (1983), 133, und von Dr. M. Rosenberg des National Institute of Health erhalten. Das Hindlll-Fragment wurde in ein pBR322 Derivat ohne EcoRI-Stelle umkloniert und es entstand das Plasmid pRIT10164 (ein' nicht wesentlicher Schritt). Die folgenden Manipulationen wurden ausgeführt, um eine BamHI-Stelle an

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dem G-Rest des ATG-Codons der TDH3-codierenden Sequenz einzuführen und ein Hindlll-BamHI DNA-Fragment mit TDH3 Promotoraktivität zu erhalten, in dem die TDH3-Sequenzen intakt und nicht durch die Manipulation verändert sind.-Die wie oben beschrieben hergestellte DNA von pRIT10164 wurde durch zweimalige Cäsiumchlorid-Äthidiumbromid— Dichtegradientenzentrifugation, wie im wesentlichen aus Kahn et al. (Methods in Enzymology, 68, 268, 1979) bekanht, gereinigt. 150 ug der pRIT10164 DNA wurden vollständig mit 75 Einheiten der Endonuclease Xbal verdaut, mit Phenol und Äther extraliiert, mit Äthanol präzipitiert und die DNA in 0,01M Tromethamin-HCl-Puffer zu einer Konzentration von 1 ug pro μΐ aufgenommen. Proben von 20 ug dieser Xbal-gespaltenen DNA wurden mit der Nuclease Bal31 verdaut, um die 61 Basenpaare der DNA zwischen dem ATG-Codon und der Xbal-Stelle zu entfernen. Verdauungen mit Bal31 wurden bei 30⁰C für 1 bis 3 Minuten in einem Puffer mit pH 3,1, der 600 mM NaCl, 12 mM CaCl₉, 12 mM MgCl₀, 1 mM EDTA, 20 mM Tromethamin-HCl enthält, durchgeführt, wobei eine Einheit der Bal31-Nuclease pro 20 ug DNA in einem Reaktionsvolumen von 200 ul verwendet wurde.

Die Enzymreaktionen wurden gestoppt durch Zugabe von Äthylenbis(oxyäthylennitrilo)- tetraessigsäure(EGTA) bis zu einer Endkonzentration von 20 mM . Die Proben wurden mit gleichen Volumina Phenol und Äther extrahiert und mit Äthanol präzipitiert. Jede DNA-Probe wurde in 20 ul 10 mM Tromethamin-HCl-Puffer pH 7,5 resuspendiert. Das Ausmaß der Bal31-Verdauung wurde gemessen, indem etwa 2,5 ug einer jeden DNA-Probe mit der Endonuclease Hpal verdaut wurden und indem die Größe der Hpal-Xbal-Fragmcnte mit dem 335 Basenpaar großen Hpal-Xbal-Fragment von pRIT10164 verglichen wurde. Nach 2 Minuten Verdauung mit Bal31 waren etwa 41 bis 88 Nucleotide von dem Xbal-Hpal-Fragment von pRIT10164 entfernt.

Dieses Ergebnis zeigt an, daß eine ähnliche Anzahl von Basenpaaren von der anderen Xbal-Stelle zu dem ATG-Codon hin ent-

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ferrit worden sind. 5 ug der nach der 2-minütigen Bal31-Verdauung erhaltenen DNA wurden mit der Endonuclease BamHI gespalten, mit Phenol extrahiert und durch Äthanolpräzipitation gesammelt. Diese DNA wurde mit 5 Einheiten der T4 PoIymerase in Gegenwart von Desoxynucleotid-triphosphaten behandelt, um Einzelstrangbereiche an den BamHI-und. Bal31-Stellen aufzufüllen. Die DNA wurde mit Phenol extrahiert und durch Äthanolpräzipitation gesammelt. 2,3 ug dieser DNA wurden mit 5 Einheiten T4 DNA-Ligase behandelt . Die Hälfte des Ligationsansatzes wurde verwendet, um kompetente Zellen des E. coli Stammes K12 MM294, die nach dem Verfahren von Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 69 (1972), 2110, hergestellt wurden, zu transformieren. 1 ml der transformierten E. coli Population wurde in 350 ml L-Broth mit-200 ug/inl Ampicillin verdünnt und die gesamte Plasmid-DNA aus der resultierenden Kultur gereinigt.

80 ug dieser Plasmid-DNA, die eine Population von Plasmidmolekülen mit Bal31 induzierten Deletionen von etwa 40 bis 80 Basenpaaren enthält, wurde nacheinander mit 75 Einheiten der Endonuclease Hindlll und 96 Einheiten der Endonuclease BamHI verdaut, um DNA-Fragmente freizusetzen, in denen eine BamHI-Stelle nach den oben beschriebenen Behandlungen eingeführt wurde. Dies ist der Fall, wo die Bal31 Verdauung an einem G-Rest gestoppt hat. Diese geschnittene DNA wurde auf einem präparativen 1 %igen Agarose-Gel aufgetrennt. Die gewünschten Hindlll-BamHI-Fragmente mit einer Größe von 1000 bis 1100 Basenpaaren wurden in zwei Stückchen aus dem Gel ausgeschnitten, wobei das eine eine DNA mit etwa 1070 Basenpaaren und das andere Gelstückohen eine DNA mit etwa 1030 Basenpaaren enthielt. Die DNA wurde aus den Agarose-Gelstückchen durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen und einer anschließenden Zentrifugation, bei der die Agarose sedimentiert wurde, erhalten. Der flüssige Überstand wurde durch einen Millipore GV Millex Filter gedrückt und die DNA durch zweimalige Äthanolpräzipitationen gesammelt und

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schließlich in 20 μΐ eines 0,01M Tromethamin-HCl-Puffers mit pH 7,5 resuspendiert.

Die Analyse der Agarosegelelektrophorese und der Vergleich mit einer Hindlll, Xbal-verdauten pRITI064 DNA und mit den Fragmenten einer Hindlll EcoRI-gespaltenen /l.t'hagen-DNA zeigten, daß zwei getrennte Hindlll-BamHI-Fragmentpopulationen erhalten wurden. Die eine Fragmentpopulation entsprach einer Größe von etwa 1070 Basenpaaren und die andere einer Größe von etwa 1030 Basenpaaren im Vergleich mit dem 1120 Basenpaar großen Hindlll-Xbal-Ausgangsfragment aus pRIT10164. Etwa 100 ng der 1030 Basenpaare großen Hindlll BamHI-Fragmentpopulation wurde mit 200 ng des Plasmides pUC9 ligiert, das mit Hindlll und BamHI gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war (vgl. US-PS 4 264 731).

Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente Zellen des E. coli Stammes JM103 zu transformieren und auf Ampicillin-Resistenz zu selektionieren. Die Transformation des E. coli Stammes JM103 wurde nach dem von Cohen et al., a.a.O., beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Der Vektor pUC9 und der E. coli Stamm JM103 sind aus Vieira and Messing, Gene, 19 (1982), 259,bekannt und wurden von J. Messing (Universität von Minnesota) erhalten. Der pUC9-Vektor ist erhältlich von Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) und Pharmacia (Uppsala, Schweden). Der E. coli Stamm JMI03 ist erhältlich von J. Messing (Universität von Minnesota). Ein anderer E. coli Stamm mit den Eigenschaften des E. coli Stammes JM103, nämlich der Stamm JM101, ist bei der American Type Culture Collection, Rockv.lle, Maryland, unter ATTC 33876 hinterlegt und kann als Wirt ebenfalls verwendet werden. Etwa 400 ampicillinresistente Kolonien wurden pro ml erhalten und 98 Kolonien davon auf einem Medium, das X-gal enthielt, getestet. 95 davon waren weiß und zeigten die erfolgreiche Insertion eines fremden DNA-Fragments zwischen den Hindlll- und BamHI-Stellen des Vektors an.

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Plasmide einzelner transformierter Kolonien wurden nach Amplifikation der Plasmide durch Zugabe von Spectinomycin (15J ug/ml) in das Kulturmedium im Labormaßstab präpariert (Birnboim and DoIy, Nucl. Acid Res., 7 (1979), 1513.

Die rekombinanten Plasmide wurden auf einem 7,5 %igen PoIyacrylamid-Gel nach einer Doppelverdauung mit Avail und BamHI analysiert und mit dem 450 Basenpaare großen AvaH Xbal-Fragment, das den Promotor und die N-terminale codierende Region von pRIT10164 enthält, und mit den Hpall-Pragmenten der pBR322 DNA verglichen. In 35 von 36 Plasmiden wurde ein Avall-BamHI-Fragment gefunden, das Deletionen von 20 bis 90 Basenpaaren im Vergleich mit pRIT10164 besitzt. Drei Plasmide, die Deletionen von etwa 80 Basenpaaren lpRIT10166), 50 Basenpaaren (pRIT10167-Fig, 8) und 45 Basenpaaren (pRIT10165) enthalten, wurden für weitere Tests ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde durch CsCl-Äthidium-Bromid-Dichtegradien-r tenzentrifugation gereinigt und 25 ug jeweils mit EcoRI

32-verdaut. Die EcoRI-Enden wurden mit γ -P-ATP in einer Kinasereaktion markiert und die Nucleotidsequenz der Hindlll-EcoRI-Fragmente eines jeden Plasmids nach Maxam und Gilbert (Methods in Enzymology, 65 (1980), 499, bestimmt. Die Markierung und Seguenzierung von der EcoRI-Stelle aus im pUC9-Vektoranteil eines jeden rekombinanten Plasmids ist ein passendes Mittel, um die Sequenz an der angrenzenden BamHI-Stelle zu bestimmen, die das Ende der Deletion'in dem TDH3 DNA-Fragment angibt. Diese Sequenzierungsanalyse zeigte, daß in dem Plasmid pRIT10166 die BamHI-Stelle an einem G-Rest in der 5'-nichttranslatierten Region 25 Basen-

gQ paare upstream des ATG-Codons wiederentstanden ist; in PRIT10165 ist die BamHI-Stelle'an der zweiten Base des dritten Codons und in pRIT10167 an dem G des ATG-Codons lokalisiert.

Das Hindlll-BamHI-Fragment der TDH3 DNA in pRITi0167 enthält alle notwendigen Sequenzen in unveränderter Form für

-66-die TDH3-Promotoraktivität.

Beispiel 2 Konstruktion des Vektors pRIT10172

Das 1050 Basenpaare große Hindlll-BamHI TDH3 D^' -Fragment aus pRIT10167, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurde in den aus Broach et al. ,Gene, 8 (1979), 121, bekannten Shuttle-Vektor YEp13 umkloniert. Das Hindlll-BamHI TDH3 DNA-Fragment wurde zwischen die Hindlll-Stelle der zwei Mikron DNA des Vektors und der BamHI-Stelle ligiert und es entstand das rekombinante Plasmid pRIT12159. Die DNA von pRIT12159 wurde mit Xbal und BamHI gespalten und das erhaltene 1650 Basenpaare große Fragment anstelle eines ähnlichen Xbal-BamHI-Fragmentes, das den arg³-Promotor enthält, in das Plasmid pRIT10774 ligiert. Das Plasmid pRIT10774 ist aus Cabezon et al.,(Proc. Natl. Acad. Sei., USA 81 (1986), 6594 6598, bekannt. Dieses Plasmid, in dem die BamHI und Xhol-Stellen des Vektoranteils durch in vitro Manipulation deletiert sind, enthält das YEpI3-Replikon, ein 1470 Basenpaäre großes Hindlll-BamHI-Fragment, das die arg³-Promotorregion besitzt, und ein 11 50 Basenpaare großes BamHI-Hindlll-Fragment, das die arg³-Transkriptions-Terminationsregion besitzt. Die Substitution des arg³-Promotorinserts von pRIT10774 durch das TDH3-Promotorinsert ergibt das Plasmid pRIT10172. Dieses Plasmid besitzt daher neben dem Signal für die Transkriptions-Termination auf dem 1150 Basenpaare großen BamHI-Hindlll arg³ DNA-Fragment eine einzelne BamHI-Steile, die an dem ATG des TDH3-Promotorinserts liegt.

Fremde DNA kann daher in diese Stelle klonier·: werden. Ferner können die zwei DNA-Inserts,die über Hindlll-Stellen miteinander verbunden sind, als eine Expressionseinheit auf einem 2200 Basenpaare großen Hindlll-Fragment entnommen werden und in andere Vektoren inseriert werden. Fig. 9 zeigt eine Restriktionskarte von pRITiO172.

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Beispiel3

Herstellung des Plasmids pRIT12290

Ein 1050 Basenpaare großes Hindlll-EcoRI-Fragment von pRIT10167 (Fig. 8), hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, das das Hindlll-BamHI TDH3-Promotorfragment und den BamHI-Smal-EcoRI-Teil des pUC9-Polylinkers besitzt, wurde zwischen die Hindlll- und EcoRI-Stellen eines pBR322-Derivates ligiert. Es entstand das- rekombinante Plasmid pRIT12176. Das verwendete pBR322-Derivat besitzt eine Deletion der BamHI-Stelle, nachdem diese Stelle durch die T4 DNA-Polymerase aufgefüllt worden war.

Die Plasmid-DNA von pRIT10158 (Fig. 8), hergestellt gemäß Beispiel 4 (b), wurde mit EcoRI gespalten und mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um den EcoRI Einzelstrangbereich aufzufüllen. Diese Präparation wurde ferner mit der Endonuclease CIaI verdaut. Eine weitere Probe der pRIT10158 DNA wurde mit den Endonucleasen CIaI und Haelll verdaut und ein 1150 Basenpaar großes Clal-Haelll-Fragment, das die Transkriptions-Terminationsregion des arg³-Gens besitzt, durch präparative Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution erhalten. Dieses Fragment wurde mit EcoRI gespaltener, T4 DNA-Polymerase behandelter und CIaI nachgespaltener pRIT10158 DNA ligiert. Der Ligationsansatz .wurde verwendet, um kompetente Zellen des E. coli Stammes MM294, die nach Cohen et al.. a.a.O., hergestellt wurden, zu transformieren und dann auf Ampicillin-Resistenz zu selektionieren. Von den transformierten Kolonien wurde ein Plasmid isoliert, das als pRIT10162 identifiziert wurde, in dem das Clal-Haelll arg³ Transkriptions-Terminationsfragment in pRIT10158 zwischen die CIaI und die aufgefüllte EcoRI-Stelie inseriert wurde, und in dem die EcoRI-Stelle wieder hergestellt wurde. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT10162. Die Plasmid-DNA pRITiO162 wurde mit EcoRI und Pstl gespalten, mit ebenfalls EcoRI und Pstl gespaltener

-68-DNA von pRIT12176 gemischt und ligiert. Die Ligasemischung wurde verwendet, um Zellen des E. coli K12 Stammes MM294 nach dem Verfahren von Cohen et al., a.a.O., zu transformieren und auf Ampicillin-Hesistenz zu selektionieren. Ein Plasmid, pRIT12208, wurde aus einer transformierten Kolonie erhalten, in dem das 4630 Basenpaare große EcoRI-Pstl-F'ragment von pRIT12176 mit dem 1930 Basenpaare großen EcoRI-Pstl-Fragment von pRIT10162 ligiert worden war, und in dem die arg³-Transkriptions-Terminationsregion an

jQ der TDH3-Promotorregion angelagert ist. Die arg³ und TDH3-DNA-Regionen können durch Spaltung mit Hindlll in einem 2200 3asenpaaregroßen Fragment aus pRIT12208 erhalten werden. Zum Erhalt der anderen Orientierung dieses Fragments hinsichtlich der Vektorseguenzen wurde das 2200 Basenpaare große Hindlll-Fragment von pRITi2208 in der Hindlll-Stelle eines pBR322-Derivates umkloniert. In diesem Plasmid-Derivat waren die EcoRI- und BamHI-Stellen in Auffüllreaktionen durch die T4 DNA-Polymerase nacheinander deletiert worden. Das resultierende rekombinante Plasmid, in dem das 2200 Basenpaare große Hindlll-Fragment hinsichtlich der Vektorseguenz in anderer Orientierung vorliegt, im Vergleich zu pRIT12 208, wird als pRIT12290 identifiziert. Fig. 10 zeigt eine Restriktionskarte von pRITt2290. In den Plasmiden pRIT12208 und pRIT12290 liegen zwischen den TDH3-Promotor und arg³-Transkriptions-Terminationsfragmenten die einzig vorhandenen BamHI, Smal und Ecol-Restriktionsstellen, die sich gut zur Klonierung von DNA-Fragmenten, die codierende Seguenzen enthalten, eignen. Die Promotor- und Transkriptions-Terminationsregionen können zusammen in einem 2200 Basenpaare großen Hindlll-Frag-

oQ ment als eine Expressionseinheit erhalten werden und in andere Vektoren transferiert wer'den.

Die BamHI-Stelle ist besonders gut geeignet, da sie am ATG-Codon des TDH3-Gens liegt und somit für die Fusion anderer Gene mit dem TDH3-Promotor verwendet werden kann, um diese in Hefe wie nachfolgend veranschaulicht zu exprimieren. Solche

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fusioniarten Sequenzen können aus pRIT12208 oder pRIT12290 durch Spaltung mit der Endonuclease Hindlll oder anderer Endonucleasen an den flankierenden Restriktionsstellen als eine Expressionseinheit erhalten und in Hefe-Shuttle-Vektoren inseriert werden.

Beispiel 4 Konstruktion der Plasmide pRIT1067/7, pRIT10909 und pRIT10158

a) PRIT10677

Ein 1 372 Basenpaare großes BamHI-Fragment von .klonierter HBV-DNA wurde aus pRIT10616 (Harford et al. , Dev. Biol. Standard, 54 (1983), 125-130, ausgeschnitten und mit BamHI

!5 gespaltener pBR327 DNA gemischt und ligiert. Dieses BamHI-Fragment enthält einen Teil der HBsAg-Vorläuferregion, die HBsAg-codierende Sequenz und 3'-nichtcodierende Sequenzen. Aus der Ligationsmischung wurde das Plasmid pRIT10677 ausgewählt, das das HBV BamHI-Fragment in der Orientierung enthält, daß die Xbal-Stelle der HBV DNA benachbart zur Sall-Stelle der pBR327-Vektor-DNA ist. Fig. 8 zeigt die ' Herstellung von pRITiO677.

b) PRIT10909

Das 3300 Basenpaare große Hindlll-Fragment des aus Crabeel

M. et al. ,EMBO J., 2 (1983), 205-212, bekannten Plasmides pMC200 (ohne Beschränkung erhältlich bei American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter ATCC 39131) wurde in ein pBR322-Derivat umkloniert, in dem die

gO EcoRI-Stelle in einer Auffüllreaktion durch die T4 DNA-Po-

lymerase deletiert wurde. Ein resultierendes rekombinantes Plasmid, pRIT10158,(Fig. 8), wurde ausgewählt, in dem die 3 '-Region des arg³-Gens-des Hindlli-Fragments benachbart zu. der CIaI-Stelle des modifizierten pBR32?-Vektors liegt. Aus pRIT10158 wurde ein

gp 1150 Basenpaare großes Clal-Haelll-Fragment erhalten, das

die Transkriptions-Terminationsregion des arg³-Gens enthält.

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Dieses 11 50 Basenpaare große Fragment wurde mit der CIaI-und Hpal gespaltenen DNA des Plasmids pRIT10677 (wio vorstehend in Teil a) beschrieben) ligiert, um die arg³-Terminations-Region an der Hpal-Stelle, die downstream' von der HBsAgcodierenOen Region liegt, einzuführen. Das resultierende Plasmid ist pRIT10909. Fig. 8 zeigt die Herstellung von PRIT10909. Fig. 3 zeigt eine Restriktionskarte von pMC200.

Beispiel5

Konstruktion der Plasmide pRIT10911 und pRIT10912

Die BamHI-Stelle in pRIT10167 (Beispiel 1) und die natürlich vorkommende BamHI-Stelle in der Vorläuferregion des HBsAg-Gens eines in pRIT10616 (Harfe cd et al., Dev. Biol.

Standard, 54 (1983), 125-130, klonierten HBV-Virus des adw-Serotyps, liegen im gleichen Leserahmen vor. Dies ermöglichtdie Fusion mit dem TDH3-Promotorfragment, so daß eine fusionierte DNA-Sequenz entsteht, die ein ATG-Condon, 42 Codons der HBsAg-Precursor-Sequenz und dieser folgend

226 Codons der HBsAg-codierenden Sequenz besitzt. Das Ausci'aü Tiaterial für das in dieser Fusion verwendete HBV DNA-Ta .m» it war das Plasmid pRIT1 0909 (vgl. vorstehend, Beispiel 4, Teil b)). Dieses Plasmid enthält ein 935 Basenpaare großes BamHI-Hpal-Insert, das einen Teil der codierenden Region der HBsAg-Vorläuferregion, die vollständige HBsAg-codierende Sequenz und 128 Basenpaare der 3'-nichttranslatierten DNA enthält, und an das downstream von seiner Hpal-Stelle ein 11 50 Basenpaare großes Haelll-Clalll-DNA-Fragment aus pRIT10158, das die arg³-Transkriptions-Terminationsregion enthält, ligiert worden war. pRIT10158 ist vorstehend in Beispiel 4 Teil b) beschrieben. Das 2 085 Basenpaare große EcoI-BamHI-Fragment wurde aus pRIT10909 ausgeschnitten und zwischen die EcoRI- und BamHI-Stellen von pRIT10167, das wie vorstehend in Beispiel a) beschrieben, hergestellt wurde, ligiert. Es entstand das Plasmid

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pRIT10911. Das 3135 pb große Hindlll-Fragment von pRIT10911, das Hefe-DNA-Transkriptionssignale und die HBsAg-codierende Sequenz enthält, wurde in den Shuttle-Vektor YEpI3 inseriert.' Es entstand das Plasmid pRIT10912. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT10911.

Beispiel 6 Konstruktion der Plasmide pRIT10903 und pRIT10914

Das Ziel der nachfolgend beschriebenen Konstruktionen war, überschüssige Nucleotide am 5'-Ende eines DNA-Fragmentes, das zumindest für den N-terminalen Bereich des reifen HBsAg codiert, zu entfernen, so daß eine aus 6 bp bestehende Restriktionsstelle an der ersten Base des zweiten Codons geschaffen wird. Das resultierende Fragment kann dann mit Promotorfragmenten fusioniert werden, die eine aus 6 Basenpaare bestehende Restriktionsstelle an dem Initiationscodon besitzen, wobei Mungo Bohnen-Nuclease oder S1-Nuclease verwendet werden, um Einzelstrangbereiche zu entfernen und für die Ligierung stumpfe Enden zu schaffen, wie dies Rosenberg et al., Methods in Enzymology, 101C, 123 (1983), beschrieben hat.

Ein 1225 bp großes FnuDII-Fragment von HBV DNA aus PRIT10616 (vgl. Harford et al. (1983), Devel. Biol. Standard, 54, 125 - 130), das das HBsAg-Gen enthält, wurde isoliert, mit synthetischen Octomer EcoRI-Linkern versehen und in die EcoRI-Stelle des Vektors pACYC184 ligiert. Es entstand das Plasmid pRIT10679 (Fig. 8). Der Vektor pACYC184 wurde von S. Cohen erhalten und ist aus Ch'ang A.C.Y. und Cohen S. (1978), J. Bacteriol., 134, 1141 - 1156, bekannt. pACYC184 ist auch von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter ATCC 37033 erhältlich. Von diesem EcoRI (FnuDII)-Fragment wurde ein 125 bp großes EcoRI-Xbal-Fragment erhalten, das die C-terminale Region der HBsAg-Vor-

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läufer-DNA, das HBsAg ATG-Codon und 90 bp der HBsAg-codierenden Sequenz enthält. Dieses 125 bp große ExoRI-Xbal-Fragment wurde zwischen die EcoRI- und Xbal-Stellen von pRIT10158 (vgl. Beispiel 4 b) eingeführt. Das resultierende Plasmid pRIT10903 enthält daher eine einzige EcoRI-Stelle an der Verbindung zwischen arg³-DNA und HBV-DNA und eine einzige Xhol-Stelle in der arg³-Promocorregion. Fig. zeigt die Herstellung von pRIT10903.

150 yg der pRIT10903 Plasmid-DNA, die durch CsCl-Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt wurde, wurden mit 80 Einheiten der EcoRI-Endonuclease.gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Äthanol präzipitiert und in 10 mM Tromethamin-HCl-Puffer (pH 7,5) zu einer Konzentration von 1 ug pro μΐ aufgenommen. Die DNA wurde in drei Proben von jeweils 50 ug aufgeteilt und bei 30⁰C 50, 75 und 90 Sekunden mit der Nuclease Bal31 inkubiert. Jede Reaktionsmischung enthielt den gleichen in Beispiel 1 beschriebenen Reaktionspuffer, 50 ug EcoRI-verdaute pRITi0903-DNA und 2,5 Einhei- ten der Nuclease Bal31 in einem Endvolumen von 500 μΐ. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EGTA bis zu einer Endkonzentration von 20 mM gestoppt. Die Reaktionsmischungen wurden auf Eis gestellt, mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert und mit Äthanol präzipitiert. Die Bal31-behandelten DNA-Proben wurden jeweils in 50 μΐ 10 mM Tromethamin-HCl-Puffer aufgenommen. 2,5 ug der DNA wurden mit der Endonuclease BstEIl verdaut und auf einem 7,5 %igen Polyacrylamid-Gel mit dem EcoRI-BstEII-Verdau von pRIT10903, der ein 285 bp großes Fragment freisetzt, verglichen. Die Behandlung mit der Nuclease Bal31 75 Sekunden bei 30⁰C reduziert die Größe dieses EcoRI-BstEII-Fragments um 10 bis 'JO bp. Es entsteht eine Serie von einzelnen DNA-Fragmenten, bei denen schätzungsweise 10, 30, 45 und 60 bp entfernt sinJ Die Entfernung von 29 bp, ausgehend von der ursprünglichen FnuDII-Stelle, würde zur Entfernung der gesamten HBsAg-Vorläufer-DNA und des HBsAg ATG-Codons führen.

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5 ug der pRIT10903 DNA, die 75 Sekunden mit Bal31 behandelt worden war, wurden mit 8 Einheiten der Nuclease Xhol verdaut, mit Phenol extrahiert und mit Äthanol präzipitiert. Diese DNA wurde dann mit 5 Einheiten der T4 DNA-Polymerase in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphaten inkubiert, um Einzelstrangbereiche an den Xhol- und Bal31-Enden aufzufüllen mit Phenol behandelt und mit Äthanol präzipitiert. Die DNA wurde dann mit 5 Einheiten der T4 DNA-Ligase 16 Stunden bei 16⁰C inkubiert. Die Ligationsmischung wurde schließlich verwendet, um kompetente .Zellen des E. coli K12 Stammes MM294 zu transformieren und diese dann auf Ampicillin-Resistenz zu selektionieren, wie aus dem vorstehend angegebenen Verfahren von Cohen et al., bekannt ist. Etwa 2000 ampicillinresistente Kolonien pro ml wurden nach dem Ausplattieren erhalten. Aus 47 einzelnen Kolonien wurden Plasmide im Labormaßstab (vgl. Birnboim et al., a.a.O.) präpariert, von denen 23 eine Xhol-Stelle besitzen, Dies deutet darauf hin, daß die Auffüllreaktion an der ursprünglichen Xhol-Stelle und die Ligierung an ein 3'-Ende, das mit einem G-Rest endet, erfolgreich verlaufen ist. Diese 23 Plasmide wurden weiter mit Xhol und Xbal verdaut, um die Größe des kleinen Restriktionsfragmentes im Vergleich mit den ursprünglichen EcoRI-Xbal-Fragmenten aus pPITiO9O3 zu vergleichen.

Mehrere Plasmide wurden identifiziert, die schätzungsweise Deletionen von 25 bis 40 bp besitzen. Ein Plasmid, pRIT109i4, dessen Xhol-Xbal-Fragment schätzungsweise eine Größe von 95 bis 100 bp besitzt, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT10914. DNA dieses Plasmides wurde durch CaCl-Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und 25 ug einer solchen DNA wurden mit 140 Einheiten der Xbal-Endonuclease gespalten.

Die Xbal-Enden wurden mit γ- P-ATP markiert und die markierte DNA wurde mit 15 Einheitender Hindlll-Endonuclease ge-

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spalten. Das kleine 765 bp Hindlll-Xbal-Fragment wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution isoliert und nachfolgend durch Äthanol präzipitiert. Die Nucleotid-Sequenz an und im Bereich der Xhol-Stelle wurde bestimmt, indem dieses Fragment von dem markierten Xbal-Ende aus nach Maxam und Gilbert sequenziert· wurde. Die Sequenzdaten zeigten, daß die Xhol-Stelle an der ersten Base des zweiten Codons der HBsAg-codierenden Sequenz liegt'.

XhoI

CTCGAGAAC

HBsAg Nucleotide

Nach Entfernung von Einzelstrangbereichen ist dieses Fragment daher zur Fusion mit der BamHI-Verlängerung des TDH3 Promotor-Fragmentes von pRIT10167 (Beispiel 1) geeignet.

Beispiel 7 Konstruktion der Plasmide pRIT12211, pRIT12209, pRIT12230 und pRIT12265

Das Plasmid pRIT10911, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde als Ausgangsmaterial für weitere Manipulationen verwendet. Um gewünschte Restriktioiisstellen einzuführen, wurde das Plasmid mit den Endonucleasen BamHJ. und Xbal gespalten und das ausgeschnittene Fragment durch ein 2275 bp großes BamHI-Xbal-Fragment aus pRIT10158 (Beispiel 4) ersetzt. Diese Manipulation führt zu dem Plasmid pRIT12211, in dem das Hindlll-BamHI TDH3 Promotor-Fragment neben einem BamHI-Xbal-Fragment liegt, das eine Xhol-Stelle enthält. Ferner enthält dieses Plasmid ein Xbal-Hindlll-Fragment, in dem die C-terminale Region der HBsAg-codierenden Sequenz und 128 bp der 3'-nichtcodierenden Sequenz mit der 1150 bp arg³-Transkriptions-Terminationsregion fusioniert ist. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRITi2211. Das Plasmid pRIT12211

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wurde mit den Endonucleasen Xhol und Xbal gespalten. Hierdurch wurde ein 1600 bp großes Fragment entfernt, das durch ein 94 bp großes Xhol-Xbal-Fragment der modifizierten HBsAg DNA aus pRIT10914, hergestellt gemäß Beispiel 5, ersetzt wurde. Dieses 94 bp große Fragment wurde nach der Doppelverdauung der pRITiO914 DNA mit Xhol und Xbal durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und anschließende Elektroelution aus dem entsprechenden Gelstückchen gereinigt und durch Äthanol präzipitiert. Das durch die Insertion des 94 bp großen Fragments entstandene Plasmid pRIT12209 (vgl. Fig. 8) wurde durch CsCl-Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. 50 ug dieser DNA wurden mit 90 Einheiten der BamHI-Endonuclease und 60 Einheiten der Xhol-Endonuclease verdaut, um die 990 bp große unwesentliche DNA zwischen dem TDH3 Promotor und der HBsAg-codierenden Region zu entfernen. Die DNA wurde dann mit Phenol extrahiert und anschließend mit Äthanol präzipitiert. 16 ug dieser DNA wurden 30 Minuten bei 30⁰C mit 20 Einheiten der Mungo Bohnen-Nuclease (PL Biochemicals) in einem Volumen von 125 μΐ inkubiert. Der verwendete Inkubationspuffer enthielt 30 mM Natriumacetat (pH 4,6), 250 mM Natriumchlorid, 1 mM Zink-' Chlorid und 5 % Glycerin. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,2 % gestoppt, und die DNA mit einem gleichen Volumen an Phenol extrahiert und anschließend mit Äthanol präzipitiert. Eine Teilmenge von 0,5 ug dieser mit Mungo Bohnen-Nuclease behandelten Probe wurde mit 2 Einheiten der T4 DNA-Ligase 16 Stunden bei 16°C inkubiert und dann mit 2 Einheiten der BamHI-Endonuclease gespalten, um jegliche Vektormoleküle zu zerstören, die bisher unbehandelt geblieben sind. Diese Mischung wurde verwendet, um korfpentente Zellen des E. coli K12 Stammes MM294 zu transformieren und anschließend auf Aüipicillinresistenz gemäß Cohen et al., a.a.O., zj selektionieren. Etwa 2000 ampicillinresistente Kolonien pro ml Transformationsmischung wurden erhalten. Von 24 amplifizierten Kolonien wurden die Plasmide im Labormaßstab (gemäß

-76-dem Verfahren von Birnboim et al., a.a.O.) präpariert.

16 der 24 Plasmide ergaben nach Verdauung mit der Endo- ° nuclease Hindlll zwei DNA-Fragmente mit einer Größe von

2700 bp (pUC9-Vektor) und 3000 bp. Das 3000 bp große Fragment besitzt die für ein DNA-Fragment erwartete Größe, in dem die HBsAg-codierende Sequenz und die arg³-Terminationsregion an das TDH3 Promotor-Fragnient ligiert ist. 10

Vier Plasmid-Kandidaten wurden für die weitere Untersuchung hergenommen. Die DNA eines jeden Plasmides wurde mit der Endonuclease Xbal gespalten, in einer Kinase-Reaktion mit PATP markiert, mit der Endonuclease Hindlll gespalten und durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt. Das 1190 bp große markierte Hindlll-Xbal-Fragment wurde durch Elektroelution isoliert und durch Äthanol präzipitiert. Die Sequenz eines jeden isolierten Fragments wurde nach Maxam und Gilbert, a.a.O., bestimmt. Zwei Plasmide wurden gefunden,die die korrekte Sequenz ATGGAGAAC für eine perfekte Fusion zwischen der TDH3 Promotor-Region und dem HBsAg-Gen besitzen. Eines dieser Plasmide, pRIT12230, wurde für weitere Manipulationen verwendet. Fig. 8 zeigt die Herstellung von PRIT12230. Die DNA dieses Plasmids (pRIT12230) wurde mit der Endonuclease Hindlll gespalten und das 3000 bp große Fragment, in dem die HBsAg-codierende Sequenz fusioniert mit dem TDH3 Promotor vorliegt, in den Shuttle-Vektor XEp13 ligiert. Das resultierende Plasmid, pRIT12265, wurde nach dem von Ito et al., J. Bact. 153 (1983), 163, beschriebenen Ver-. fahren in den Hefestamm HC5 (MATa, leu2-3, Ieu2-112, his3, can1-11) (erhalten von J. Broach (State University of N.Y., Stony Brook)eingeschleust. Dieser Hefestamm ist auch ohne Beschränkung von der American Type Culture Collection unter ATCC 20630 erhältlich.

2 7 4 O

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Beispiel 8

Konstruktion der Plasmide pRIT12288 und pRIT12322

Das Plasmid pRIT12230 (Beispiel 7) enthält 3'-downstream vom Stop-Codon des HBsAg-Strukturgens 128 bp, die nicht für HBV codieren.

Zur Entfernung dieser 128 bp wurden 25 ug von pRIT12230, hergestellt gemäß Beispiel 7, mit Accl und EcoRI verdaut. pRIT12230 enthält eina einzige Accl-Stelle, die in der codierenden Sequenz des S-Gens 7 Nucleotide vor dem TAA Stop-Codon liegt. Die.verdaute DNA wurde auf einem 1 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und das größere 4200 bp große Vektor-Fragment aus dem Gel durch Elektroelution erhalten und durch Äthanol präzipitiert.

Künstliche 12 mer und 14 raer Einzelstrang-DNA-Linker-Moleküle mit den folgenden Sequenzen wurden für die Insertion zwischen der Accl-und EcoRI-Stelle von pRIT12330 hergestellt: . 5¹ ATACATTTAACG 3¹

12 mer

3' TGTAAATTGCT'&AA 5'

14 mer .

Dies stellt die korrekten C-terminalen HBsAg-Codons und das TAA-Stop-Codon wieder her und liefert für den Zusatz von Transkriptions-Terminationsfragmenten eine EcoRI-Stelle, die sonst nirgendwo in dem TDH3 Promotor oder den HBsAg-codierenden Sequenzen vorliegt.

100 pMol der synthetischen 12 mer und 100 pMol der synthetischen 14 mer Einzelstränge werden in einem Endvolumen von 10 bis 20 μΐ zusammengemischt, 15 Minuten bei 70⁰C erhitzt und dann innerhalb von 3 Stunden langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um das Aneinanderlagern beider Stränge entlang ihrer komplementären Sequenzen zu erreichen. Zu

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dieser "annealing"-Mischung werden 0,15 pMol (400 ng) des 4200 bp langen AccI-EcoRI-Frägments von pRIT12230, ΊOfach konzentrierter Ligationspuffer und 2 Einheiten der T4 DNA-Ligase gegeben.

Diese Mischung wird 4 Stunden bei 16°C inkubiert, sodann werden weitere 2 Einheiten der T4. TNA-Ligase zugesetzt. Hierauf wird die Mischung über Nacht auf Eis gestellt. Die Iigierte Mischung wird verwendet, um kompetente Seilen des

IQ Stammes MM294 zu transformieren und dann auf Ampicillin-Resistenz gemäß Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69 (1972), 2110, zu selektionieren. Plasmide werden von 12 oder mehr Einzelkdlcnien im Labormaßstab gemäß dem Verfahren von Birnboim und DoIy, Nucl. Acids Res., 7 (1979),

jL5 1513, präpariert und durch Restriktions-Endonucleasenanalysiert. Plasmide mit der Insertion des Linkers zwischen der Accl und EcoRI-Stelle zeigen nach Verdauung mit Accl oder EcoRI eine einzelne 4200 bp große DNA-Bande« Die Richtigkeit der Linkerinsertion in einem solchen Plasmid kann

2Q durch die DNA-Sequenzierung ausgehend von der EcoRI-Stelle oder der Accl-Stelle nach dem chemischen Modifkationsverfahren von Maxam und Gilbert (Methods in Enzymology, 65 (1980), 499), nachgewiesen werden.

Um ein Transkriptions-Terminationsfragment zu beschaffen, wurde ein Plasmid mit dem AccI-EcoRI-Linker-Insert, erhalten wie vorstehend beschrieben, mit der Endonuclease EcoRI gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt (US-Patent 4 264 732). Das 2650 bp große Hindlll-Fragment von

₃Q pRIT10162, hergestellt gemäß Beispiel 3, wurde in die Hindlll-Stelle des Vektors pBR327 umkloniert. Es entstand das Plasmid pRIT12288. pBR3L7 ist aus Soberon et al., Gene, 9 (1980), 287 - 305, bekannt und kann wie in Beispiel 10, Teil(b) beschrieben, aus dem Plasmid pRIT12309,

gg das bei American Type Culture Collection unter ATCC 67187

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erhältlich ist, hergestellt werden. Fig. 8 zeigt die Konstruktion von PRIT12288.

Das Hindlll-Fragment ist in pRIT12288 so orientiert, daß die arg³-Transkriptions-Terminationsregion neben den EcoRI-rnd Clal-Restriktionsstellen auf der pBR327-Hälfte liegt. Von pRIT12288 wird ein 1180 bp großes EcoRI-Fragment erhalten, das die arg³-Transkriptions-Terminationsregion enthält. Dieses Fragment wird an das beschriebene EcoRI-gespaltene und mit alkalischer Phosphatase behandelte pRIT12230-Derivat ligiert. Plasmide, die aus der Ligationsmischung hervorgehen, werden hinsichtlich der Insertion und der Orientierung des 1180 bp großen EcoRI-Fragments untersucht. Die Orientierung des Inserts kann durch Spaltung mit der Endonucleasc Hindlll bestimmt werden, die Fragmente einer Größe von 2880 und 2720 bp freisetzt., sofern das Insert die gewünschte Orientierung hat.

Ein Plasmid, pRIT12322, wurde konstruiert, in dem der Accl-EcoRI-Linker die 128 bp lange unerwünschte HBV-DNA ersetzt und in dem das 1180 bp lange EcoRI-Fragment von pRIT12288· in der richtigen Orientierung vorliegt, nämlich downstream der HBsAg-codierenden Sequenz. Ein 2900 bp großes Hindlll-Fragment kann aus pRITi2322 ausgeschnitten werden, das die HBsAg-Expressionseinheit enthält, zu der der TDH3-Promotor, die HBsAg-codierende Sequenz und die arg³-Transkriptions-Terminationsregion gehört. Fig. 8 zeigt die Konstruktion von pRITi2322; vgl. auch Fig. 11, die eine Restriktionskarte von pRIT12232 zeigt und angibt, welche Tei-Ie davon von pRIT12288 und pRIT12230 stammen.

Beispiel 9 Konstruktion des Plasmids pRIT12329

Wie in.Beispiel 8 beschrieben, enthält pRIT12322 ein 2900 bp

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großes Hindlll-Fragment, das alle notwendigen Signalsequenzen für die Expression von HBsAg unter der Kontrolle des TDH3-Promotors enthält. Diese Expressionseinheit wurde in einen Hefe Shuttle-Vektor ligiert.

Die DNA des Shuttle-Vektors YEp13 wurde mit der·Endonuclease Hindlll gespalten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und als Empfänger für das Hindlll-Fragment aus pRIT12322, hergestellt gemäß Beispiel 8, verwendet. Ein Plasmid, pRIT12329, wurde isoliert, das neben dem YEpI3-Replikon auch das 2900 bp große Hindlll-Fragment mit der Expressionseinheit, wie in Beispiel 8 beschrieben, enthält.

Beispiel 10

Konstruktion von Plasmid-Vektoren zur Expression von hybriden antigenen HBsAg-CS in Hefe

A. Konstruktion der Plasmide pRITi2573 und pRIT12574 Das Plasmid WR201 wurde vom Walter Reed Army Institute of Research erhalten und erqitot sich aus der Insertion eines 2,3 kb großen EcoRI-Fragmentes aus AmPfI (Dame et al., Science, 225 (1984)., 5 93-599), das die vollständige DNA-Sequenz des Circumsporözoiden (CS) -Proteins von Plasmodium falciparum enthält, in den Vektor pUC8. Die Fig. 2k zeigt die schematische Restriktionskarte und eine Strategie zur Sequenzierung des Klons AmPFA. Die Positionen von Restriktionsstellen, die in der Figur aufgezeigt sind, wurden aus der Seguenz bestimmt und durch Restriktionsspaltung nachge- wiesen: A₁ Avail; Ac, Acc!; B₁ Bstnl; D₁ Dral; Dd, Ddel; F, Fokl; N, Ndel; R₁ Rsal; S, Stül; T, TthIII; Tq, Taql; X, XhoII. Die Pfeile geben den Startpunkt, die Richtung und den Umfang der bestimmten Sequenzen an. Die CS-proteincodierende Sequenz wird durch eine dicke Linie angezeigt. Die Fig. 3A zeigt die Nucleotid-Sequenz des CS-Protein-Gens von P. falciparum. Die Nucleotid-Sequenz des CS-Protein-Gens in

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i^st gezeigt. Vektor pUC8 ist aus Vieira et al., Gene,19 (1982), 259, bekannt. pUC8 ist bei Amersham und Pharmacia erhältlich. Ein 1215 bp großes Stul-Rsal-Fragment des Plasmids WR201, das die CS-proteincodierende Seguenz ohne die ersten 52 bp (Fig. 12) enthält, wurde durch Elektroelution aus einem 7,5 ^igen Polyacr 'lamidgel gereinigti Dieses Fragment wurde mit Sau3A q< chnitten, um kleinere Fragmente zu bilden. Diese umfassen unter anderem ein 192 bp großes Sau3A Fragment, das für 16 sich wiederholende Tetrapeptide des CS-Proteins codiert, und drei identische 24 bp große Sau3A-Fragmente, die für zwei sich wiederholende Tetrapeptide des CS-Proteins codieren.

Das Plasmid pRITiO91 1 (hergestellt gemäß Beispiel 5)i_st ein pUC9-Derivat, das ein 3136 bp großes Hindlll-Fragment einer Expressionseinheit enthält, in der ein 1050 bp großes Hindlll-BamHI-Hefeqlycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (TDH3)-Promotor-Fragment (welches das ATG liefert) an der BamHI-Stelle mit einem 935 bp großen BamHI-Hpal-Fragment der HBV-DNA fusioniert ist. Dieses HBV-DNA-Fragment codiert für die 42 terminalen Aminosäuren der Pre S2-Region, die 226 Aminosäuren des S-Gens (Serotyp adw) und besitzt 128 bp der 3'-nichtcodierenden DNA. Das S-Gen wird durch ein 1150 bp großes Hefe-DNA-Fragment flankiert, das das arg³-Transkriptions-Terminationssignal enthält. pUC9 ist aus Vieira et al., Gene, 19 (1982), 259-268, bekannt. Die BamHI-Stelle von pRIT10911, die an dem ATG-Initiationscodon liegt, ist in Ablesephase mit den Sau3A-Stellen des repetitiven Epitops von CS von Plasmodium falciparum.

Die DNA des Plasmids pRIT10911 wurde mit der Endonuclease BamHI gespalten, mit alkalischer Phosphatase behandelt, mit Phenol extrahiert und durch Äthanol präzipitiert. 0,2 ug dieser DNA wurden mit 0,2 \xq des durch Sau3A gespaltenen Stul-Rsal CS-Genfragments, hergestellt wie oben beschrieben, gemischt und mit T4 DNA-Ligase behandelt. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente Zellen des

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E. coli Stammes K1 2 ΜΜ294, hergestellt gemäß Cohen et al., .Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69 (1972), 2110, zu transformieren. 32 Plasmide von transformierten Einzelkolonien wurden nach Amplif ikation der Plasmide durch Zuqabe von Spectinomycin (300 ug/ml) zum Kulturmedium im Labormaßstab (Birnboim et al., Nucleic Acids Research, 7 (1979), 1513), präpariert. Die rekombinanten Plasmide wurden nach der Verdauung mit BamHI und Xbal auf einem 7,5 %igen Polyacrylamidge.l analysiert und mit dem 219 bp großen BamHI-Xbal-Fragment von pRITiO911 (Plasmid, das die Sequenz für die ersten 42 Aminosäuren der Pre S2-Vorläuferregion und die beginnende Sequenz der HBsAg-Region enthält) und mit den Haelll-Fragmenten der <j>x174 DNA verglichen.

Unter den 32 Plasmiden zeigte ein Plasmid ein 411 bp großes BamHI-Xbal-Fragment, das der Insertion eines 192 bp großen Sau3A-Fragments in richtiger Orientierung entsprach. Dieses Plasmid wurde mit pRIT12572 bezeichnet. Ein anderes Plasmid zeigte ein 243 bp großes BamHI-Xbal-Fragment, das der Insertion eines 24 bp großen Sau3A-Fragments in richtiger Orientierung entsprach. Dieses Plasmid wurde mit pRIT12571 bezeichnet. Fig. 12 zeigt die Herstellung von pRIT12571 und PRIT12572.

Die Hindlll-Fragmente von pRIT12572 und pRITi2571, die den TDH3-Promotor, die codierende Sequenz des hybriden CS-HBsAg und die arg³-Terminationsregion enthalten, wurden in YEpI3 umkloniert. Es entstanden die Plasmide pRIT12574 und PRIT12573 (Fig. 12). YEp13 ist aus Broach et al., Gene, 8 (1979), 121-133, bekannt. Fig. 12 zeigt die Herstellung von PRIT12573 und pRITi2574.

Lithiumacetatbehandelte Hefezellen (Ito et al., J. Bacteriol. 153 (1983), 163-168), des Stammes Saccharomyces cerevisiae DC-5.(a, leu2-3, Ieu2-112, his³, can1-11) und Saccharomyces cerevisiae 10S44C (pep4-3, leu2-3, Ieu2-112) wurden durch

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die Plasmide pRIT10912, pRIT12574 und pRITi2573 transformiert und auf Leucin-Unabhängigkeit selektioniert. Die Hefestä'mme DC5 und 10S44C wurden von M. Crabee] vom Ceria Institut, Anderlecht, Belgien (vgl. auch Cabezon, T. et al., Proc. Natl. Acad., Sei., USA, 81 (1984), 6594-6598,) erhalten. Der Hefestamm DC5 wurde in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 2. Juni 1982 unter ATCC 20630 hinterlegt.Der Hefestamm 10S44C wurde in der American Type Culture Collection, !0 Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 18. August 1986 unter ATCC 20819 hinterlegt.Das erwartete hybride Protein von pRIT12573 soll 277 Aminosäuren enthalten, während das erwartete hybride Protein von pRIT12574 333 Aminosäuren enthalten soll.

Es ist auch möglich, die CS-Epitopregion in dem Vektor der Erfindung zu erweitern. Beispielsweise können in die BamHI-Stelle der Plasmide pRIT12572 und pRIT12571 zusätzlich Sau3A-Fragmente der CS-Protein-DNA, z.B. 192 bp große oder 24 bp große Sau3A-Fragmente, wie folgt ligiert werden:

Die Plasmid-DNA von pRIT12572 oder pRIT12571 wird mit der Endonuelease BamHI gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das 1215 bp große Stul-Rsal-Fragment des Plasmids WR201, erhalten wie oben beschrieben, wird mit der Endonuelease Sau3A gespalten, um die 192 bp großen und 24 bp großen Fragmente freizusetzen, die die Tetrapeptidwiederholungen aufweisen. Diese Fragmente werden mit BamHI gespaltenen und mit alkalischer Phosphatase behandelten Vek-

_g0 toren pRIT12572 oder pRIT12571 gemischt und mit T4 DNA-Ligase behandelt. Die Ligationsmischungen werden zur Transformation von Zellen des E.'coli Stammes K12 verwendet. Die Zellen werden auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Plasmide von transformierten Kolonien werden hinsicht-

o₅ lieh der Größe der BamHI-Xbal-Fragmente durch Endonuclease-Verdauung ausgesucht und mit ähnlich verdauter DNA

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von pRIT12572 oder pRIT12571, besonders mit den 411 bp großen und 243 bp großen BamHI-Xbal-Fragmenten von pRIT12572 und pRIT12571 verglichen, die die Fusion aus den sich wiederholenden CS-Sequenzen und dem Teil der Pre S2-S-codierenden Sequenz tragen. Eine Zunahme der Größe dieser Fragmente um 192 bp oder 24 bp weist auf die Insertion eines sich wiederholenden Tetrapeptid-Fragmentes an der BamHI-Stelle von PRIT12572 und pRIT12571 hin. Die Anwesenheit einer BamHI-Stelle in solchen Plasmiden weist auf die Insertion der 192 bp großen oder 24 bp großen Sau3A-Fragmente in der für die Fusion am ATG-Codon korrekten Orientierung hin. Dieses vorstehend beschriebene Verfahren kann wiederholt werden, wenn es wünschenswert ist, weitere 192 bp große oder 24 bp große Sau3A-Fragmente einzuführen, die für die sich wiederholenden CS-Tetrapeptide codieren, wodurch die CS-Tetrapeptidregion auf dem hybriden Partikel erweitert werden kann. Wie bereits dargelegt, können die Hindlll-Fragmente, die die Expressionseinheiten enthalten, aus solchen Derivaten von pRIT12572 oder pRIT12571 ncch üblichen Methoden ausgeschnitten und in YEp13 oder andere geeignete Hefe-Klonierungsvektoren inseriert \fnd in Hefezellen eingeführt werden.

B. Konstruktion von pRIT12309, pRITi2314 und dem Expressions-Shuttle-Vektor pRIT12377, der die komplette 2 Mikron Hefe-DNA enthält

Das Plasmid pRIT12309 umfaßt die komplette 6318 bp große 2 Mikron Hefe-DNA-Sequenz, die in die EcoRI-Stelle des Plasmid-Vektors pBR327 kloniert ist. Die 6318 bp große 2 Mikron Hefe-DNA-Sequenz wurde aus dem Plasmid pCV1 9 erhalten, das von J. Broach, Princeton University, überlassen wurde. Das Plasmid pRIT12309 wurde in dem E. coli Stamm K12 MM924 gemäß Budapester Vertrag in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter ATCC 67187 hinterlegt.Fig. 13 zeigt eine Restriktiönskarte von pRITi2309. Die Insertion der 2 Mikron DNA-Sequenz in eine der zwei EcoRI-Stellen von

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pBR327 unterbricht die 2 Mikron A codierende Region und führt dazu, daß das resultierende hybride Molekül pRITi 2309 keine Α-Gen bzw. FLP-Funktion aufweist. Eine Beschreibung der 2 Mikron-Struktur und Funktion ist aus Broach J., "The Molecular Biology of the yeast Saccharomyces: Life cycle and Inheritance", 445 - 470, Strathern J.N., Jones E.W. und Broach J.R. (Herausg.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1981),bekannt.

pBR327 ist aus Soberon et al., Gene, 9 (1980), 287-305, bekannt und wurde von F. Bolivar (Department of Molecular Biology, National University of Mexico, Mexico 20DF) erhalten. Einem Fachmann ist es bekannt, daß das Plasmid pBR 327 aus dem Plasmid pRIT12309 erhalten werden kann. Die pRIT12309 Plasmid-DNA wird aus dem E. coli Stamm, der in der American Type Culture Collection unter ATCC 67187 hinterlegt ist, durch eine der zahlreichen üblichen Verfahren isoliert, mit EcoRI gespalten und wieder ligiert. Die Ligationsmischung wird verwendet", um kompetente E. coli K'i2-Zellen zu transformieren und auf Ampicillin-oder Tetracyclin-Resistenz zu. selektionieren. Eine beträchtliche Anzahl der transformierten Kolonion wird Plasmide enthalten, in denen nur die pBR327 Hälfte von pRIT12309 vorhanden ist, ohne eines der 2 Mikron DNA-Fragmente.

Das 2850 bp große Clal-Sall-Fragment, das die TDH3-arg³-Expressionseinheit und flankierende pBR322-Sequenzen aus pRIT12290 (beschrieben in Beispiel 3) enthält, wurde in den Vektor pRIT12309 zwischen der Clal-und Sall-Stelle umkloniert. Das resultierende Plasmid, pRITi2314 wurde mit der Endonuclease Sail gespalten und mit dem 2218 bp großen SaII-Xhol-Fragment aus YEp13, das das Hefe LEU2-Gen enthält, ligiert. Fig. 14 zeigt die Herstellung von pRIT12314. YEp13 ist von der American Type Culture Collection unter ATCC 37115 erhältlich. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente Zellen des Stammes JA221, die nach Cohen et al.,

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a.a.O., präpariert wurden, zu transformieren und auf Leucin-Unabhängigkeit und Ampicillin-Resistenz zu selektionieren.

Der Stamm JA221 ist von der American Type Culture Collection unter ATCC 33875 erhältlich.

Ein Plasmid, pRIT12544, in dem das 2218 bp große Sall-Xhol LEU2-Genfragment in die Sall-Stelie von pRIT12314 inseriert wurde, wurde aus einem Klon dieser Transformation erhal-

*® ten. Die Orientierung dieser Insertion ist so, daß die wieder entstandene Sall-Stelle auf jener Seite liegt, die der TDH3-arg³-Expressionseinheit am nächster, ist. Das Plasmid pRIT12544 ist ein E. coli Hefe-Shuttle-Vektor mit einer einzigen BamHI-und Smal-Stelle, die zwischen den TDH3-Promotor und arg³-Transkriptions-Terminationsregionen liegen. Diese Restriktionsstellen eignen sich zur Insertion von DNA-Sequenzen, die unter der Kontrolle des TDH3-Promotors stehen sollen. Fig. 14 zeigt die Herstellung von pRIT12544.

C. Konstruktion des Plasmids pRIT12658 Das 3328 bp große Hindlll-Fragment von pRIT12574, ein YEp13-Derivat, hergestellt gemäß Beispiel 10, Teil A, wurde in ein pBR322-Derivat mit delitierter BamHI-Stelle, die in einer Auffüllreaktion durch die T4 DNA-PoIymerase zerstört wurde, umkloniert. Es entstand das Plasmid pRIT12608. Dieses Plasmid enthält eine einzige BamHI-Stelle, die an dem ATG-Initiations-Codon der CS-HBsAG-codierenden Sequenz liegt (Fig. 15). Das 2550 bp große BamHI-Sall-Fragment von pRIT12608, das die CS-HBsAg-codierende Sequenz, die arg³-Transkriptions-Terminationsre-

gion und flankierende pBR322-Sequenzen besitzt, wurde zwischen der BamHI- und Sall-Stelle von pRIT12544 (Fig. 15) wie vorstehend beschrieben kloniert. Es entstand das Plasmid

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pRIT12658 (Fig. 15). Durch diesen Austausch wurde die CS-HBsAg-codierende Sequenz in einem Hefe-Shuttle-Vektor, der die komplette 2 Mikron DNA enthält, unter die Kontrolle des TDH3-Promotors gestellt. Fig. 15 zeigt die Herstellung von PRIT12658.

Beispiel 11 Synthese eines hybriden Proteins in Hefe

Die Hefestämme (Saccharomyces cerevisiae) DC5 oder 10S44C wurden nach dem von Ito et al., J. Bacteriol.·, 153 (1983), 163-168, beschriebenen Verfahren jeweils mit den Plasniden PRIT10912 (Beispiel 5), pRIT12573 (Beispiel 10), pRITi2574 (Beispiel 10), pRIT12658 (Beispiel 10), pRIT12329 (Beispiel 9) und pRITi0172 (Beispiel 2) transformiert, sodann in flüssige-..ι Medium, dem Leucin fehlte (YNB oder YNB + 80 ug/ml Histidin) getrennt kultiviert und in der. mittleren l.ogphase geerntet. Zellen von 1 oder 2 ml Kultur wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 50 μΐ 0,125M Tris-HCl (pH 6,8)-Puffer, der 20 % Glycerin, 4 % SDS, 6M Harnstoff und 10 % 2-Mercaptoäthanol enthielt, resuspendiert. Nach einer Inkubation von 5 Minuten bei 100⁰C wurde die Probe in Hälften geteilt, die dann in einem 12,5%igen Trenn-, 5%igem Schicht-Gel nach dem Verfahren von Laemmli (Nature, 227 (1971),^: 680) elektrophoretisch aufgetrennt wurden.

HBsAg- und CS-Protein-Sequenzen wurden durch die Protein-Immunoblot - Technik (vgl. Burnette, Anal. Biochem., 112 (1981), 195-203; Gershoni and Palade, Anal. Biochem., 131 (1983), 1-15; Towbin and Gordon, J. Immunol. Methods, 72 (1984), 31 3-340), identifiziert. Nach dem elektrischen Transfer der Proteine auf ein Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schüll, 0,45 um) (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76 (1979), 4350-4354^ wurde das Filter 1 Stunde

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vor

bei 37°C in 3 % gelatineenthaltendem PBS/inkubiert. Nachfolgend wurde das Filter 5mal jeweils 5 Minuten mit PBS, das 0,1 % Tween 20 (Polyoxyäthylensorbitan-monolaurat)enthält, gewaschen und eine Hälfte des Filters 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einer Mischung von 5 monoklonalen Antikörpern gegen das CS-Protein (Dame et al., Science, 225 (1984), 593-599], in PBS, 1 % Gelatine, behandelt. Die andere Hälfte des Filters wurde mit einem monoklonalen Antikörper gegen HBsAg, HepYTAS12, in PBS, 1 % Gelatine, behandelt. HepYTAS12 ist ein Antiköi^r gegen gereinigtes HBsAg aus Hefe, der gegen das reduktions- und denaturierungsresistente Epitop gerichtet ist. Die Filter wurden jeweils 5 Minuten mit PBS, 0,1 % Tween 20 gewaschen und mit einem zweiten biotinylierten Antimaus-Schafantikörper (Amersham) in PBS, 1 % Gelatine, 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Die Filter wurden wieder mit PBS, 0,1 % Tween 20, 5mal jeweils 5 Minuten gewaschen und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Streptavidin-biotinylierten Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Komplex (Amersham) behandelt. Die Filter wurden wieder 3mal jeweils 5 Minuten mit PBS, 0,1 % Tween 20, gewaschen und schließlich mit 30 μΐ H„O„ und HRP-Farbentwicklerreagens, das 30 mg 4-Chloro-naph€halin-1-ol (BioRad) in 10 ml Methanol·, und 50 ml PBS enthält, inkubiert. Die Molekulargewichte der Antigene wurden durch den Vergleich mit den vorher angefärbten Proteinmarkern Ovalbumin, Alphachymotrypsinogen, beta-Lactoglobulin, Lysozym, Cytochrom C (BRL) abgeschätzt.

Beide Hefestämme DC5 und 10S44C, die mit pRIT12573 transformiert wurden, zeigten die Produktion eines Antigens, das mit beiden Anti-CS- und Anti-HBsAg-Antikörpern reagiert und ein geschätztes Molekulargewicht von 30 kd aufweist . . Beide Hefestämme DC5 und 10S44C, die mit pRIT12574 oder pRIT12658 transformiert wurden, zeigten die Produktion eines Antigens, das mit beiden Anti-CS- und Anti-HBsAg-Antikörpern reagiert und das ein geschätztes

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Molekulargewicht von 37 kd besitzt. Einige Antigene mit kleineren Molekulargewichten wurden ebenfalls gefunden, die auf den Abbau des hybriden Proteins schließen lassen. Kontrollproben von Zellen, die Plasmide enthalten ohne CS- oder HBsAg-Sequenzen (pRIT10172) zeigten keine Reaktion. Kontrollproben von Zellen, die Plasmide enthalten mit nur HBsAg-Seguenzen (pRIT12329 oder pRITiO912) zeigten nur eine Reaktion mit den Anti-HBsAg-Antikörpern.

Diese Ergebnisse zeigen, daß ein Hybridprotein mit dem erwarteten Molekulargewicht, das CS- und HBsAg-Sequenzen enthält, in jenen Hefen synthetisiert wird, die mit einem Plasmid transformiert wurden, das die CS-codierende Sequenz in Ablese-Phase mit der Pre S2-HBsAg-codierenden Sequenz fusioniert enthält.

Ferner wurde gezeigt-, daß die Bandenintensität in der Anti-HBsAg-Reaktion für das Protein von pRIT12573 und pRIT12574 etwa dieselbe ist, während die Intensität der Anti-CS-Reaktion für ein Protein von pRIT12574 wesentlich höher ist als für ein Protein von pRIT12573. Dies zeigt an, daß bei der gleichen Menge an HBsAg-Sequenzen mehr Sequenzen des sich wiederholenden Epitops des CS-Proteins in pRIT12574 als in pRIT12573 vorhanden sind.

Beispiel 12

Synthese von hybriden Partikeln, die das CSP-Epitop präsentieren

Die Hefestämme (Saccharomyces cerevisiae) DC5 odor 10S44C, die entweder pRIT10172 (Beispiel 2), pRIT12329 (Beispiel 9), pRIT12573 (Beispiel 10) oder pRIT12574 (Beispiel 10) enthalten, wurden in einem Selektivmedium (200 ml YNB oder YNB + 80 ug/ml Histidin) bis zum Ende der log-Phase kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und

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in 10 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,4), der 0,5 % Tween 20 (Polyoxyäthylensorbitan-monolaurat), 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) und 2,5 % Isopropanol enthält, resuspendiert. Die Zellen wurden aufgeschlossen, indem sie zweimal durch eine French-Presse bei einem Druck von (1,38 χ 10 Pa) (20 000 psi) geführt wurden. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 30 OOOxg abzentrifugiert. Die Gesamtprotein-Konzentration des flüssigen Überstandes (Rohzellextrakt) wurde nach einem von Lowry et al. (J. Biol. Chem., 193 (1951), 265-275). beschriebenen Verfahren mit Rinderserumalbumin als Standard gemessen. Die Anwesenheit von HBsAg wurde durch Anwendung eines Radioimmun-Test-Kits (AUSRIA II, Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) oder eines ELISA-Kits (Enzygnost-HBsAg Mikro, Behringwerke, Marburg), untersucht.

Die Verfügbarkeit von CS-Sequenzen in den HBsAg-Partikeln für Immunreaktionen wurde in dem vorstehend angesprochenen ELISA-Test untersucht. Geeignete Verdünnungen von Proben, die getestet werden sollen (in PBS, das 0,2 % BSA enthält), konnten über Nacht an die Anti-HBsAg-Festphase (Enzygnost Kit) binden. Die gebundenen HBsAg-Partikel wurden 1 Stunde bei 37°C mit einer 1 : 10 000 Verdünnung' (in PBS, das 0,1 % BSA enthält) einer Mischung von 5 monoklrlalen Antikörpern gegen das CS-Protein (Dame et al., Science, 225 (1984), 593-599^ als ersten Antikörper inkubiert, und dann mit einer 1 : 500 Verdünnung (in' PBS, das 0,1 % BSA enthält) eines biotinylierten Anti-Maus-Schaf-Immunglobulins (Amersham) als zweiten Antikörper 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Der Nachweis ergab sich durch die Inkubation einer 1 : 1000 Verdünnung (in PBS, das 0,1 % BSA enthält)eines Streptavidin-biotinylierten Meerrettich-Peroxidase-Komplexes (Amersham) und einem Chromogen aus dem Enzygnost-Kit 30 Minuten bei 37°C. Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten wurden die Tabletts 4mal mit einer Waschlösung aus dem Enzygnost-Kit gewaschen. Die Farbentwicklung wurde bei 510 nm in einem(Titertek Multiskan, Dyna-

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tech) Photometer bestimmt.

Die Messung der Proteinkonzentration und der AUSRIA-Aktivtät (Tabelle II) in Rohzellextrakten ergab, daß pRIT12573 zur gleichen Expressionshöhe von HBsAg führt, wie pRIT12329, pRIT12574 zeigte jedoch eine 10fach niedrigere AUSRIA-Aktivität. Immunblot-Analysen dieser Extrakte ergaben, daß in diesen drei Fällen eine gleiche Menge von HBsAg-verwandtem Protein synthetisiert ward.

Tabelle II AUSRIA-Aktivität in Rohzellextrakten

Plasmid	Gen	Protein	HBsAg(RIA)	HBsAg
		(mg/ml)	(ng/ml)	ng/mg
				Protein

PRIT10172	—	S	24	bp)	PreS2-S	5.6	0	0
PRIT12329	CS (	192	bp)	PreS2-S	3.3	5700	1730
FRIT12573	CS (			3.6	4000	1110
PRIT12574				2.8	450	160

Der ELISA-Test ergab, daß in pRITi2573 und pRIT12574-Extrakten (Tabelle III) eine Struktur vorliegt, die HBsAg und CS-Epitope· exprimiert, und daß mehr reagierende CS-Epitope pro HBsAg-Epitope in pRIT12574-Extrakten als in pRIT12573-Extrakten vorliegen.

Um die Natur dieser im RIA- und ELISA-Test positiven Strukturen zu untersuchen, wurOe 1 ml der Rohzellextrakte mit 1,5M Cäsiumchlorid in 50 nM Natriumphosphat (pH 7,4) gemischt und 40 Stunden bei 40 OOOXg in einem Beckman SW50.1 Rotor zentrifugiert. Gesammelte Fraktionen wurden auf An-Wesenheit von HFsAg- und CS-Antikörper-Bindungsaktivität in den vorstehend beschriebenen RIA- und ELISA-Tests untersucht. HBsAg-

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und CS-antigene Aktivität lag jeweils in der gleichen Fraktion der Gradienten von pRIT12573 und pRIT12574 vor. Ihre Schwimmdichte war geringfügig höher (rho =1,20 g/cm³) als jene in dem Gradienten von pRIT12329 (rho =1,18 g/cm³).

Immunblot-Analysen der Gradienten-Fraktionen bestätigten die RIA/ELISA-Ergebnisse. HBsAg- und/oder CS-Sequenzen wurden nur in jenen Fraktionen gefunden, d;ο im- RIA/ELISA-Test reagierten. 10

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Tabelle III

Im Antigen vorhandene HBsAg- und CS-Epitope, gebunden an immobilisierte anti-HBsAg-Antikörper

Rohzell-Extrakt aus:

Ver- ELISA (HBsAg) ELISA (CS) dünnung ^OD ₅io ^{nm OD}510 ^nm

1OS44C (PRIT1O172)

10S44C (PRIT12329)

1OS44C (PRIT12573)

10S44C (PRIT12574)

lOOx

0.000

0.065

lOOx	0.580	0.054
200X	0.341	0.041
400X	0.188	• 0.056
lOOx	1.298	1.596
200X	1.080	1.299
400X	0.702	0.898
80Ox	0.336	0.560
160Ox	0.155	0.323
3200X	0.075	0.189
lOOx	0.662	1.678
200X	0.370	1.506
400X	0.183	1.130
80Ox	0.079	0.798
160Ox	0.044	0.449
32OOX	0.061	0.205

Diese Ergebnisse zeigen , daß die hybriden Proteine, die 30 von pRIT12573 und pRIT12574 in Hefe exprimiert werden, zu

Partikeln zusammengesetzt werden, die ähnlich den 22 nm großen HBsAg-Psrtikeln sind. Die Partikel, die durch die Expression von pRIT12573 und pRIT12574 hergestellt werden, zeigen die CS-Sequenzen/ihrer Oberfläche, was durch ihre Fa-35 higkeit mit Anti-CS-Antikörpern zu reagieren, belegt wird. Im Falle von pRIT12574 verhindern jene CS-Sequenzen im RIA-

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Test teilweise die Zugänglichkeit der a-Determinanfce von HBsAg (die hauptsächlich für die AUSRIA Aktivität verant wortlich ist) .

Beispiel 13 A. Reinigung von hybriden Partikeln

Der Rohzellextrakt des Hefestammes 10S44C,der pRIT12574, hergestellt gemäß Beispiel 10, enthält, wurde durch Polyäthylenglykol (PEG) 400-Präzipitation gereinigt und durch Ultrafiltration in einer AMICON DC-Kammer konzenr triert. Diese Kammer enthält eine Membran, die Proteine nur bis zu einer Größe von 100 kd durchläßt.

Die weitere Reinigung der hybriden Partikel wurde nach üblichen Verfahren, wie CsCl-Zentrifugation, Hydroxyapatit-Chromatographie und Gelfiltration, durchgeführt.

Der endgereinigte Zellextrakt von 10S44C, der pRIT12574 enthält, zeigte im Ausschlußvolumen einer HPLC TSK-3000-Säuie (LKB) einen Hauptpeak, der HBsAg und CS-Antigenität besitzt. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (Laemmli, Nature, 22 7(1971), 680), der eine Silberfärbung (Wray et al., Anal. Biochem.,

118 (1981 ), 197 - 203j folgte, zeigte eine Hauptbande mit einem geschätzten Molekulargewicht (MW) von 37 kd. Die Elektronenmikroskopie nach negativer Färbung mit Uranylacetat zeigte Partikel, die etwa die gleiche Größe und Form besitzen wie aus Hefe erhaltenes HBsAg.

B. Reinigung von hybriden Part'ikeln Rohhefezellextrakte werden hergestellt, indem die gewaschenen Hefezellen in Gegenwart des gleichen Gewichtes an 50 mM Natriumphosphat-Extraktionspuffer(pH 8,1), dem 4 mM Titriplex III, 1 % Tween 20, 4 mM PMSF und 10 % Isopropanol zugesetzt sind, nach dem "Dynomill"-Verfahren aufgebrochen werden.

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Die Zelltrümmer werden durch 90-minütige Zentrifugation bei 11 000><g entfernt. 500 ml des zentrifugierten Rohextraktes werden mit 1N Essigsäure auf pH 7,2 eingestellt und über Nacht bei 4⁰C in Gegenwart von 10 g kolloidaler Kieseierde (Aerosil 380, Degussa) gerührt. Nachfolgend wurde die Suspension 1 Stunde bei 3500Kg zentrifugiert und das Pellet dreimal in der Zeit von 15 Minuten mit 150 ml 0,15M NaCl, dem 2 mM PMSF und 5 mM EDTA zugegeben sind, gewaschen. Schließlich wird das Aerosil-Pellet mit 250 ml 10 mM Pyrophosphatpuffer (pH 9,5), der 2 % Tween 20 enthält, 3 Stunden bei 37°C eluiert. Dem Eluat wird tropfenweise eine 1M Calciumchloridlösung bis zu einer Endkonzentration von 30 mM Calciumchlorid zugegeben und der pH-Wert auf 7 eingestellt. Die Lösung wird über Nacht bei 4°C stehengelassen und dann 15 Minuten bei 6500xg . zentrifugiert. Der Überstand wird gegen 2 χ 51 1OmM Tris/HCl (pH 7,1) bei 4°C dialysiert und nachfolgend viermal mit Dialysepuffer verdünnt.

Nach Zugabe von 30 mM Calciumchlorid und 1M Natriumchlorid wird die auf pH 7,1 eingestellte verdünnte Antigenlösung an einer 150 ml-Säule aus Phenyl-Sepharose FF, die mit dem gleichen CaCl^/NaCl-enthaltenden Tris-Puffer äquilibriert wurde, mit einer Flußrate von 30 cm/Std. aufgetrennt. Nachfolgend wird die Säule mit Aquilibrierungspuffer gewaschen,

die bis/OD_28Qnm gegen Null geht, und mit 6M Harnstoff in 10 mM Tris/HCl pH 9 bei gleicher Flußrate eluiert.

Alternativ wird die dialysierte und viermal verdünnte Antigenlösung mit 20 % (NH₄)„SO* (pH 7) ergänzt und an einer 150 ml Säule aus Phenyl-Sepharose FF, die in 10 mM Tris/HCl (pH 7,1) 20 % (NH₄J₂SO₄ äquilibriert wurde, bei einer Flußrate von 30 cm/Std. aufgetrennt. Nach dem Waschen der Säule mit dem Aquilibrierungspuffer wurde die Säule bei gleicher Flußrate mit 10 mM Tris/HCl, pH 7,1, eluiert.

-96-

Die Antigen-positiven Fraktionen wurden vereinigt und schließlich bei 4°C in einem oder zwei aufeinanderfolgenden Cäsiumchlorid-Dichtegradienten 65 Stunden bei 245 00OXg zentrifugiert. Die gereinigten hybriden CS-HBsAg-Partikel besitzen eine Schwimmdichte von 1,23 g/cm³.

Beispiel 14 Immunogenität von hybriden Partikeln

Hybride Partikel, gereinigt aus dem Hefestamm Saccharomyces cerevisiae 10S44C, der pRIT12574 enthält, und ' gemäß Beispiel 13 hergestellt, wurden in dieser Form oder mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans in Labortiere gespritzt (Young et al., Science 228(1985), 958 - 962)..

C57Bl/6-Mäuse (6-8 Wochen alt), Meerschweinchen und Ka-

und ninchen wurden an den Tagen 0, 21 und 49 subcutan/intraperitoneal immunisiert. Die Tiere wurden an den Tagen 7, 28, 56 und 84 ausgeblutet. Nach dem Gerinnen des Blutes über Nacht bei 4°C wurde das Serum abgetrennt und bis zu seiner Verwendung bei -70⁰C eingefroren.

Kaninchen, zwei Gruppen von jeweils zwei Tieren, erhielten bei jeder Immunisierung 10 \iq des hybriden CS-HBsAg-Proteins in 1 ml Dosen mit oder ohne Aluminiumhydroxid. Als Kontrolle wurden zwei Kaninchen mit 10 ug Heptavax B^ (Merck Sharpe & Dohme) nach dem gleichen Impfschema immunisiert. Mäuse und Meerschweinchen, in Gruppen von 5 Tieren, erhielten bei jeder Immunisierung 1 und 5 ug des hybriden Proteins in 0,5 ml Dosen. Nicht-immunisierte Tiere dienten als Kontrollen.

Zur Bestimmung der Antikörperantwort wurden die Seren von Mäusen für jede Gruppe zusammengefaßt, während die Seren von Meerschweinchen und Kaninchen einzeln untersucht wurden., Anti-C£-Antikörpertiter wurden im ELISA-Test gemessen, wo-

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bei das rekombinante CS-Protein R32tet32 als Antigen verwendet wurde (vgl. Young et al., Science, 228 (1985), 958 962). Anti-HBsAg-Titer wurden mit dem AUSAB-Kit (Abbott Laboratories) und dem WHO-Standard bestimmt.

Weder Meerschweinchen noch Mäuse entwickelten eine nennenswerte Antikörperantwort auf HBsAg bei wiederholter Verabreichung. Dagegen entwickelten diese Tierspezies eine Anti-CS-Antikörperantwort, die durch wiederholte Verabreichung verstärkt wurde. Im ELISA-Test wurde ein Absorptionswert von 1 bei 1600-fachen (Mäusen) und 900-fachen (Meerschweinchen) Serumverdünnungen erhalten. Die Immunogenität der hybriden Partikel wurde nicht durch Adsorption an Aluminiumhydroxid verstärkt.

Im Gegensatz dazu entwickelten Kaninchen Antikörper gegen CS und HBsAg. Reziproke Titer mit einem Adsorptionswert von 1 im Anti-CS ELISA- Test ergaben 800 und

3200. Anti-HBsAg-Titer, die mit den hybriden Partikelnerhalten wurden, welche an Aluminiumhydroxid adsorbiert waren, ergaben 4000 und 20 000 mUI/ml, während die Kaninchen, die mit Heptavax immunisiert wurden, einen Titer von 10 bis 10 mUI/ml ergaben.Die Adsorption der Hybrid-Partikel an Aluminiumhydroxid verstärkte die Immunantwort.

Seren von Mäusen, Meerschweinchen und Kaninchen reagierten stark in der (circumsporozoid)-Präzipitin-Reaktion und inhibierten in vitro auch gut das Eindringen von Sporozoiten in Leber-Tumorzellen (Young et al., Science, 228 (1905), 958 - 962/ (vgl. Tabelle IV). Beide Reaktionen zeigen eine schützende Immunantwort an.

14	9	2	91
22	3	O	96
24	1	O	100

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Tabelle IV

(Circumsporozoid)-Präzipitin (CSP)-Reaktivität und pro zentuale Inhibierung des Eindringens von Sporozoiten {% IES) in HepG2-A 16 Lebertumorzellen

Tiere

1 Woche nach der zweiten CSP-Reaktivität % IES Verabreichung (4+ 2+ 0)

Vereinigte Mäuseseren Kaninchen #36

Meerschweinchen #1107

Die CSP-Reaktivität wird in Klammern angegeben:

0 - keine erkennbare CSP-Reaktivität

2+ - granuläres Präzipitat auf der Sporozoiten-Oberflache

4+ - fadenförmiges Filament vom Ende der Sporozoiten

Beispiel 15 Impfstoffherstellung

Ein Impfstoff wird folgendermaßen hergestellt: zu einer gepufferten wäßrigen Lösung von 3 % Aluminiumhydroxid '10 mM Natriuinphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,8; sterilisiert durch Filtration) werden erfindungsgemäß hergestellte Partikel in gleichem Puffer unter Rühren bis zu einer Endkonzentration des Polypeptids von 100 ug/ml und des Aluminiums (Al ⁺) von 0,5 mg/ml zugegeben. Der pH wird auf 6,8 gehalten. Die Mischung wird über Nacht bei 0⁰C stehengelassen. Thimersol wird bis zu einer Endkonzentration von 0,005 % zugegeben. Der pH wird überprüft und, wenn nötig, wieder auf 6,8 eingestellt.

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Beispiele von Pre S2-S Protein und Pre Sl-Pre S2-S Proteinherstellung in Hefe

Es wurde festgestellt, daß die Insertion der Pre f S2-S-proteinoodierende> Seguenz in einen. Hefe-Expressionsvektor in Hefe zur Synthese von Partikeln führt, die das glykosylierte Pre S2 Protein auf ihrer Oberfläche zeigen und den natürlichen 22 nm großen HBsAg-Partikeln sehr ähnlich sind. Es war zuvor aber nicht korrekt beschrieben, daß Hefen, die mit irgendeinem Teil des HBV-Genoms transformiert sind, ein glykosyliertes Produkt exprimieren.

Die folgenden Beispiele betreffen die Expression der glykosylierten Form eines Proteins in Hefe, das neben der Pre S2-Region auch die S-Proteinregion des Hepatitis B-Oberflächenantigens enthält. Zur Verwendung als Humanimpfstoff kann das Protein aus Hefezellen in Form von Partikeln isoliert und gereinigt werden. Das in Hefezellen exprimierte PreS1-Pre S2-S Protein ist auch glykosyliert und kann zur Verwendung in einem Impfstoff gegen das Hepatitis B-Virus aus Hefezellen in Form von Partikeln isoliert und gereinigt werden. Hinsichtlich des Nachweises von Glykosylierung soll folgendes beachtet werden:

1. Die Beispiele 25, 26 und 27 tetreffen die Bindung von Concanavalin A, den Effekt von Tunicamycin und die Emp-

OQ findli^hkeit auf die Endoglykosidaae H. Jedes Beispiel zeigt, daß die Pre S2-S-Proteinspezies von 33 kd glykosyliert ist. Somit wurde die Glykosylierung durch drei unabhängige Verfahren gezeigt.

2, Die Spezifität dieser Mittel ist:

or a) Concanavalin A bindet vorzugsweise an Mannosereste; b) Tunicamycin inhibiert alle Glykosylierungen, die N-

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glykosidisch an Aspargin gebunden sind;

c) die Endoglykosidase H spaltet an Asparagin gebundene Oligosaccharide mit hohem Mannose-Anteil, indem ein N-Acetylglucosaminrest am Asparagin haften bleibt.

3. Aus den kombinierten Ergebnissen der Beispiele 25, 26 und 27 und dem vorstehend Beschriebenen wird geschlossen, daß die 33 kd Form des Pre S2-S-Proteins (Tunicamycin-Inhibition, Empfindlichkeit für Endo H) eine N-gebundene Oligosaccharidkette mit hohem Mannose-Anteil (Sensitivität für Endo H) besitzt. Die beobachtete Änderung des Molekulargewichts (etwa 3000) nach der Behandlung mit Tunicamycin und der Verdauung mit Endo H zeigt an, daß die Oligosaccharidstruktur aus etwa 10 Zuckerresten beateht. Dies ist etwa die Größe einer Kernglykosylierung in Hefe. Somit ist wahrscheinlich nur eine der drei möglichen GIykosylierungsstellen in dem Pre S2-S-Protein glykosyliert.

4. Die Reinigungsschemen, die in Beispiel 28 und 29 beschrieben sind, die hinsichtlich der Zuckerreste eines Glykoproteins ausgerichtet sind, enthalten einen affinitätschromatographischen Schritt.

5. Phenylboronat hat eine Spezifität für 1,2-cis-Diolgrüppen .

6. Linsensepharose ist Glucose-Mannose-spezifisch.

Beispiel 16

Konstruktion von pRIT12662 - ein E. coli Vektor, der die Pre S2-S-Expressionseinheit enthält (Fig. 16)

Das Plasmid pRIT12290, hergestellt gemäß Beispiel 3, wurde modifiziert, indem das synthetische BamHI-Eco-RI-Verlängerungsfragment, das für die N-terminalen Aminosäuren der Pre S2-Region codiert, zwischen die TDH3-Promotor- und arg³-Terminator-Fragmente ligiert wird. Dies wurde folgendermaßen durchgeführt:

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Das Plasmid pRI^rr12290 wurde mit den Endonucleasen BamHI und EcoRI gespalten und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. 200 pMol des phosphorylierten synthetischen Verlängerungs-Fragments

BamHI 5' GATC CAG TGG 3 EcoRI

	GATC	Gin	Trp	3
5'		CAG	TGG	5
3'	GTC	ACCTTAA

wurden mit 0,1 pMol des BamHI-EcoRI geschnittenen und dephosporylierten Plasmids pRIT12290 ligiert, indem eine Einheit (U) der T4 DNA-Ligase verwendet wurde. Mit der Li<?ationsmischung wurde der E. coli Stamm MM294 transformiert und auf Ampiciliin-Resistenz selektioniert.

Ig Eine Transformante, die das gewünschte Plasmid mit dem synthetischen Verlängerungsfragment zwischen der BamHI- und EcoRI-Stelle besitzt, wurde identifiziert und tsoliert. Das Plasmid wurde mit pRIT12621 bezeichnet. Im nächsten Schritt wurden die vier zusätzlichen Basenpaare (Kern der BamHI-Stelle) in pRIT12621 entfernt, um das ATG-Codon in Ablesephase mit dem zweiten Codon des Pre S2-Region zu bringen. Im nächsten Schritt wurde ein EcoRI-Fragment, das den Rest der Pre S2-codierenden Region und die komplette S-codierende Region enthält, in die EcoRI-Stelle von pRIT1 2621 ligiert. Es wurde die komplette Pre S2-S-codierende Sequenz erhalten. In diesem Stadium wurden die DNA-Manipulationen, die nachfolgend die Linearisieren, das Herbeiführen von Deletion und die Rezirkularisieren des Plasmids pRIT12621 umfassen, ohne Amplifikation durch Transformation der als Zwischenprodukt verwendeten Plasmide durchgeführt. Es wurde folgendermaßen verfahren:

30 pMol (120 ug) der pRITi2621 DNA wurden mit 120 Einheiten von BamHI linearisiert. Nach der Abtrennung des Restriktionsenzymsdurch Phenolextraktion wurde das Plasmid durch Äthanol präzipitiert und in den entsprechenden Puffer aufgenommen,

*> ⁷ 4 O

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um die Einzelstrangbereiche der BamHI-Stelle mit 280 Einheiten der Mungo Bohnen-Nuclease zu verdauen. Die Nuclease wurde durch Phenolextraktion entfernt, der dann eine Äthanolpräzipitation folgte. Das so behandelte Plasmid wurde in dem Ligationspuffer resuspendiert und mit 10 Einheiten der T4 DNA-Ligase rezirkularisiert.

Der das ligierte Plasmid enthaltende Ansatz wurde mit Phenol extrahiert, mit Äthanol präzipitiert und in dem entsprechenden Puffer aufgenommen und mit dem Enzym EcoRI gespalten. Nach der Abtrennung der EcoRI-Endonuclease durch Phenolextraktion und Äthanol-Präzipitation wurden 0,05 pMol (0,2 ug der DNA) in dem Ligationspuffer resuspendiert und mit 0,4 pMol (0,2 ug) eines 838 bp großen EcoRI-Fragments, das aus pRIT12581 isoliert wurde und das die gesamte C-terminale codierende Region des Pre S2-S-Proteins enthält, ligiert.

Ein Plasmid, das im wesentlichen dem pRIT12581 ähnlich ist, kann folgendermaßen konstruiert werden. Der Vektor pUC9 (erhältlich bei Amersham und Pharmacia) wird mit der Endonuclease EcoRI verdaut und mit alkalischer Phosphatase (US-PS 4 264 731) behandelt. Das Plasmid pRIT10616 (ATCC 39131) wird mit EcoRI und Accl gespalten und das 826 pb große EcoRI-AccI-Fragment, das einen Teil der Pre S2-S-codierenden Region enthält, durch präparative Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution erhalten. Etwa 0,4 pMol (0,2 ug) von diesem Fragment werden mit etwa 10 pMol eines synthetischen Verlängerungsfragmentes, das die folgenden 12 bp besitzt^und das, wie in Beispiel 8 beschrieben, durch Aneinanderlagern der beiden Einzelstränge entstanden ist, gemischt. Diese Mischung wird mit T4 DNA-Ligase behandelt und dann mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten. Zu dieser so behandelten Mischung werden 0,2"ug des EcoRI-gespaltener. und mit alkalischer Phosphatase behandelten pUC9-Vektors, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, gegeben und die Mischung mit T4 DNA-Ligase behandelt. Mit dieser Mischung wurden kompetente Zellen des E. coli Sammtes K12 transformiert und auf -^Tabelle folgt auf S. 102a

- 102a -

He

Tyr Stop 5' ATACATTTAACG

Accl

3' TGTAAATTGCTTAA

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Ampicillin-Resistenz selektioniert. Kolonien diessr Transformanten wurden auf die Anwesenheit eines Plasmids untersucht, das neben dem 2650 bp großen pUCii-Vektor-Fraginents auch ein 838 bp großes EcoRI-Fragment besitzt. Dieses EcoRI-Fragment umfaßt ein 826 bp großes EcoRI-AccI-Pre S2-S-Fragment und

den 12 bp großen synthetischen AccI-EcoRI-Linker. Die Richtigkeit dieser so identifizierten Konstruktion kann durch DNA-Sequenzierung nach Maxam und Gilbert bewiesen werden. Vorzugsweise erfolgt die DNA-Sequenzierung, ausgehend von -^q einer Restriktionsstelle, die nur im pUC9-Polylinker einmal vorkommt.

Die Ligationsmischung, die die Plasmid-DNA von pRIT12621, behandelt wie vorstehend beschrieben, und das 838 bp große

^q EcoRI-Fragment von pRIT12581 enthält, wurde verwendet, um den E. coli Stamm MM294 nach Cohen et al., a.a.O., zu transformieren. Eine Transformante, die ein .Plasmid mit dem EcoRI-Fragment in richtiger Orientierung enthält, wurde identifiziert und das Plasmid als pRIT12662 bezeichnet (vgl. Fig.

1A und Fig. 16). Fig. 1A zeigt die Herstellung von pRIT12662, Fig. 16 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT12662. Die Pre S2-Region von pRIT12662 wurde nach Maxam und Gilbert sequenziert, um den Leserahmen am N-Terminus zu überprüfen, der wie folgt aussieht:

Met GIn Trp Asn Ser

AAAC AAAC AAA ATG CAG TGG AAT TCC

PTDH3 pre S2-S

modifizierte Region

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Dem Fachmann ist es bekannt, daß der Vektor pRIT12662 auch verwendet werden kann, um weitere funktionelle DNA-Sequenzen durch geeignete in vitro Manipulationen des Vektors in die Pre S2-Region einzuführen. Die Pre S2-codierende Sequenz enthält die Restriktionsstellen für die EcoRI, Pstl und BamHI-Endonucleasen. Jede dieser Restriktionsstellen kann verwendet werden, um funktionelle DNA-Sequenzen, die für interessierende Peptide codieren, einzuführen und in Ablesephase Fusionen mit der Pre S2-Region zu schaffen. Solche Fusionen werden von dem Pre S2-eingeführte Sequeoz-Pre S2-S-Typ sein. Diese Restriktionsstellen können auch in vitro durch das beispielsweise von Botstein et al., Science, 229 (1985)_t 1193-1201.beschriebenenVerfahren manipuliert werden, um andere Vektoren zu schaffen und andere Restriktionsstellen oder Leserahmen zur Insertion von funktioneilen DNA-Sequenzen zu liefern.

Beispiel 17

Konstruktion von pRIT12377 und pRIT12660, einem Hefeplasmid, das das Pre S2-S-Protein exprimiert

DNA des Plasmids pRIT12309, hergestellt gemäß Beispiel 10B, wurde mit der Endonucleas : Sail gespalten und mit einem 2218 bp großer XhoI-Sall-DNA-Fragment ligiert, das das Hefe LEU2-Gen üP.thält und das durch Verdauung von YEpI 3 und durch Reinigung aus einem Polyacrylamidgel erhalten wurde. Die Ligationsmischung wurde zur Transformation von Zellen des E. coli K12 Stammes JA221 verwendet und sodann auf Ampiciliin-Resistenz und Leucin-Unabhängigkeit selektioniert. Der Stamm JA221 ist von der American Type Culture Collection unter 33875 erhältlich. Aus einör transformierten Kolonie wurde das Plasnr.d pRIT12377 identifiziert, das das 2218 bp große LEU2 Xhol-Sall-Fragment in der Sall-Stelle von pRIT'. 2309 enthält.

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Die Orientierung des Fragments ist derartig, daß die wiedererhaltene Sall-Stelle auf jener Seite der pBR327 DNA vorliegt, auf der auch die Aval-Stelle liegt. Das Plasmid pRIT12377 ist ein E. coli Hefe-Shuttle-Vektor, der die not-

° wendigen Funktionen für die Selektion, Replikation und Stabilität in beiden Organismen besitzt.

Das 3050 bp Hindlll-Fragment von pRIT12662 (Beispiel 16), das die Pre S2-S-Expressionseinheit enthält, wurde durch

*0 Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt, mit T4 Polymerase behandelt und in pRIT12377 ligiert. pRITi2377 war zuvor durch BamHI geöffnet worden und durch die T4 DNA-Polymerase behandelt worden. Diese Ligationsmischung wurde zum Transformieren von Zellen des E. coli Stamm MM294 verwendet. Die Zellen wurden sodann auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Eine E. coli Transformante, die das Plasmid pRITi2660 besitzt, wurde erhalten. Fig. 17 zeigt die Herstellung von pRIT12660.

nn Dieses Plasmid, pRIT12660, wurde verwendet, um zwei Stämme von Saccharomyces cerevisiae, nämlich Stamm DC4 cir° und Stamm 10S44C cir° gemäß Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 79 (1978), 2157 - 2161, zu transformieren.

Beide Stämme, DC5 cir° und 10S44C cir°, wurden in der 25

American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 18. Aug. 1986 unter ATCC 20820 und ATCC 20818 hinterlegt.

Beispiej. 18

Die Pre S2-Region in dem Plasmid pRIT12662

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Die Pre S2-Region in dem Plasmid pRIT12662 wurde nach Maxam und Gilbert sequenziert. Es wurde gefunden, daß im Vergleich zu einem anderen Virus des adw2-Serotpys (Valenzuela et al., a.a.O., 1980 - Tabelle I, S. 11) vier Basenaustausche vorliegen, die zu drei Aminosäureaustauschen fühten. An der Position - 45 ein Alaninrest anstelle eines Threoninrestes, an der Position - 34 ein Phenylalaninrest anstelle eines Leucinrestes und an der Position - 11 ein Serinrest anstelle eines Isoleucinrestes. Der letzte Austausch betrifft einen Rest, der bisher in allen bekannten Serotypen nicht verändert war (Lo et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 2 (1986) , 382 - 383).

Beispiel 19 Synthese von Partikeln, die einen Rezeptor tragen für polymerisie^tes human Serumalbumin (pHSA)

Die Hefestämme (Saccharomyces cerevisiae) DC5 cir° oder 10S44C cir°, die entweder pRIT12660 oder pRIT12363 (Beispiel 16) enthalten, wurden im Selektivmedium (200 ml YNB + 80 ug/ml Histidin (DC5 cir°) oder YNB (10S44C cir°)) bis in die log-Phase kultiviert. pRIT12363 ist mit pRIT12660 identisch mit der Ausnahme, daß pRIT12363 nw das S-Gen aus HBV enthält. Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 50 mM Natriumphosphat pH 8 resuspendiert, das 0,5 % Tween 20 (Polyäthylensorbitan-monolaurat), 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) und 2,5 % Isopropanol enthält. Die Zellen wurden aufgeschlossen, indem sie zweimal durch eine French-Presse mit einem Druck von (1,38 χ 10 Pa) (20 000 psi) geschickt wurden. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 30 OOOxg zentrifugiert. Die Gesamtprotein-Konzentration in dem flüssigen Überstand (Rohzellextrakt) wurde nach Lowry et al., J. Biol. Chem., 193 (1951), 265 - 275, gemessen, wobei Rinderserumalbumin als Standard verwendet wurde. Die An-

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Wesenheit von HBsAg-verwandtem Material wurde untersucht, indem ein Radioimmun-Test-Kit (AUSRIA II), der von Abbott Laboratories erhältlich ist, verwendet wurde. Die Ergebnisse (Tabelle V) zeigen , daß pRIT12660 die Synthese eines antigenen Materials steuert, das mit den HBsAg-Partikeln verwandt ist. Die Expressionshöhe, die auf der AUSRIA-Aktivität basiert, ist etwa die gleiche, wie inden' Hefestämmen DC5 cir" und 10S44C cir°.

In einem Radioimmun-Test zum Nachweis eines Rezeptors für polymerisiertes human Serumalbumin (pHSA) (Pontisso et al., J. Virol. Methods, 6 (1983), 151 -159) ergab der Rohextrakt von Zellen,die pRIT12660 enthalten, eine positive Reaktion im Gegensatz zu dem Rohextrakt aus Zellen, die pRIT12363 enthalten. Keine Reaktion über den Background wurde mit polymerisiertem Rinaerserumalbumin erhalten.

Cäsiumchlorid-Gleichgewichtszentrifugation der Rohextrakte von Zellen, die pRIT12660 enthalten, zeigte das AUSRIA-positive Material in einer Bande mit der Schwimmdichte rho = 1,20 g/cm³. Diese Bande entsprach jener, die man bei HBsAg-Partikeln aus Serum bzw. Hefe bekommt. Das Material aus diesem Teil des Gradienten ergibt im pHSA-Test ein positives Resultat.

Die vorstehend erwähnten Ergebnisse zeigen, daß in Hefezellen, die pRIT12660 enthalten, ein HBsAg-verwandtes Protein exprimiert wird, das einen Rezeptor für pHSA auf seiner Oberfläche besitzt und das in eine Struktur eingebaut wird, die ähnlich dem 22 nm großen Partikeln aus dem Serum ist.

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Tabelle VA AUSRIA-Aktivität in Rohzellextrakten

Stamm

Plasmid

Protein mg/ml

HBsAg-verwandte HBsAg-verwandte Antigenität Antigenität

nq/ml

nq/mq Brotein

DC5 cir° PRIT1266O 13.4 DC5 cir° PRIT1266O 12.6 10S44C cir° PRIT1266O 10.8 1OS44C cir° PRIT1266O 9.5

7 7 6 6

522 555 556 631

Beispiel 20

4 S-verwandte Protein-Spezies, die in Hefen exprimiert wer den, welche mit pRITi2660 transformiert sind

. '^^ur Analysierung von HBsAg-verwandten Protein-Monomeren, die in Zellen exprimiert werden, welche pRIT12660 enthalten, wurden die Zellen im Selektivmedium, entweder in Erlenmeyer-Kolben oder in;Fermentern bis in die log-Phase kultiviert und durch Zentrifugation gesammelt.

Zu den sedimentierten Zellen (0,1 g) wurden zuerst 20 μΐ 40 mM PMSF in Isopropanol und dann 200 μΐ Prcbenpuffer für die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (0,125M Tris-HCl, pH 6,8 mit 20 % Glycerin, 4 % SDS, 6M Harnstoff und 10 % 2-Mercaptoäthanol) zugegeben. Die Proben wurden stark aufgewirbelt und Teilmengen von 2 bis 20 ul weiter in Probenpuffer bis zu einem Endvolumen von 40 μΐ verdünnt, 5 Minuten auf 100⁰C erhitzt und in einem 12,5 %igen Trenn-5 %igen Schicht - -Gel gemäß nach einem aus Laemmli (Nature, 227 (1971),680) bekannten Verfahren elektrophoretisch aufgetrennt .

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Nach dem Elektrotransfer (Towbin et al., Proc. Natl. Acad.

Sei., USA, 76 (1979),4350 -4354), der Proteine auf ein Nitrocellulosefilter (0,45 um, BioRad) wurde das Filter 1 Stunde bei 37°C in PBS mit 3 % Gelatine vorinkubiert. Das Filter wurde mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen ein Denaturierungs-Reduktions-resistentes Epitop des aus Menschen isolierten HBsAg (Monoklonal-Antikörper Nr. 6, erhalten von H. Thomas, Royal Free Hospital, London, England) gerichtet ist, inkubiert. Die Antikörperbindung wurde ermittelt durch die aufeinanderfolgende Inkubation mit biotinyliertem Schaf-Antimaus-Immunglobulin (RPN 1021, Amersham, Verdünnung 1:250 in PBS mit 1 % Gelatine), Streptavidin-biotinyliertem Meerrettichperoxidcise-Komplex (RPN 1051, Amersham, Verdünnung 1:400 in PBS mit 1 % Gelatine)

und 30 μΐ H-O₂ und HRP Farbentwickler-Reagens, das 4-Chloronaphthalin-1-ol (BioRad) , 30 mg in 1 0 ml Methanol und 50 ml PBS enthält. Zwischen den einzelnen Inkubationen wurde das Filter mit PBS, das 0,1 % Tween 20 enthält,.gewaschen.

Der Immunblot zeigte vier mit dem S-Protein (p23) verwandte Proteinbanden, die ein geschätztes Molekulargewicht von 33 kd, 30 kd, 28 kd und 25 kd besitzen und durch den monoklonalen Antikörper ermittelt wurden. Die Mehrheit des mit dem S-Protein verwandten Materials findet sich in der 33 kd Proteinbande und wandert etwas schneller als das aus Stibbe und Gerlich (Virology, 123 (1982), 436-442) bekannte gp33-Protein. Die kleinste Proteinbande wandert langsamer als das in Hefe synthetisierte S-Protein (p23).

Beispiel 21

4 S-verwandte· Protein-Spezies (33 kd, 30 kd, 28 kd und 25 kd), die zu Partikeln zusammengesetzt werden

Rohextrakte aus Zellen, die pRITi2660 (Beispiel 16) enthalten, werden wie in Beispiel 19 beschrieben hergestellt.

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Alternativ werden Hefezellen in einem Dynomill (in Gegenwart des gleichen Gewichtes an Extraktionspuffer) (200 mM Tris, 3M NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Äthylenglykol-bis-(beta-aminoäthyläther)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA), 4 mM PMSF, 10 % Isopropanol) zerrieben und nachfolgend 45 Minuten bei 30 000Xg zentrifugiert.

Die auf pRITi2660 zurückzuführenden Partikel werden teilweise aus dem Rohzellextrakt durch Ultrafiltration, Cäsiumchlorid-Gleichgewichtszentrifugation und Hydroxyapatit-Chromatographie gereinigt. Diese Methoden sind bekannt. Die vier Proteinbanden des mit dem S-Protein verwandten Materials, die in der Western-blot-Analyse ermittelt wurden, werden durch diese Schritte mitgereinigt.

Eine Immunblot-Analyse (wie in Beispiel 20 beschrieben) der AUSRIA-positiven Cäsiumchlorid-Fraktionen nach einer Gleichgewichtszentrifugation zeigte, daß die 4 S-verwandten Banden in jeder Fraktion mit den gleichen relativen Mengen vorliegen.

Das Material ist somit in homogener Weise über die Peak-Fraktionen des Gradienten verteilt

\

Beispiel22

33 kd und 30 kd Proteine, die einen Rezeptor für polymerisiertes humanes Serumalbumin haben

Human-Serumalbumin (Sigma, A 8763) wurde durch eine Glutaraldehyd-Behandlung (Merck, A-12179) polymerisiert und nach einem aus Pontisso et al. (J. Virol. Methods, 6 (1973), 151 159; bekannten Verfahren gereinigt. Die Reaktivität der 4 S-verwandten Proteine gegenüber pHSA wurde in einem Western blot getestet. Teilweise gereinigte Präpar.ationen von Partikeln, die auf pRIT126b0 (Beispiel 21V zurückzuführen sind wurden . SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt und auf ein Nitro-.

-111-

cellulosefilter gemäß Beispiel 20 transferiert. Das Nitrocellulosefilter wurde nacheinander mit pHSA (15 ug/ml in PBS mit 1 % Gelatine), Kaninchen-Antiserum gegen Human-Albumin (Behringwerke, ORCB 04/05, 1/125 Verdünnung in PBS mit 1 % Gelatine), biotinyliertem Esel-Antikaninchen-Immunglobulin (Amersham RPN 1004, 1/250 Verdünnung in PBS mit 1 % Gelatine), Streptavidin-biotinylierter Meerrettichperoxidase (Amersham RPN 1051 1/400 Verdünnung in PBS mit 1 % Gelatine) und H_O₂ und 4-Chloro-naphthalin-1-öl gemäß Beispiel 20 inkubiert.

Die zwei größten S-verwandten Proteinbanden (das 33 kd und 30 kd-Protein) reagierten mit pHSA, während die zwei kleinsten (28 kd und 25 kd-Proteine) keine Reaktion zeigten. 15

Beispiel 23

33 kd und 30 kd Proteine, die eine spezifische Sequenz für die Pre S2-Region des Pre S2-S-Proteins enthalten

Ein Peptid, das 23 von 26 N-terminalen Aminosäuren des Pre S2-S Proteins besitzt, wurde synthetisiert (NH₂-Met-GIu-Trp-Asn-Ser-Thr-Aia-Phe-His-Gin-AIa-Leu-Gin-Asp-Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Leu-Pro-Ala-Gly-Cys-COOH) und über das C-terminale Ende an das Napfschnecken-Hämocyanin (Peninsula Laboratories) gebunden. Kaninchen wurden subcutan mit 100 ug des Konjugats (dies entspricht 20 ug Peptid) in Freund's komplettem Adjuvans immunisiert. An den Tagen 8 und 15 wurden weitere 100 ug Konjugat in Freund's kompletten Adjuvans und an den Tagen 28, 69 und 149 weitere 100 ug in PBS verabreicht. Die Entwicklung des Antikörpertiters wurde verfolgt, indem in regelmäßigen Abständen Blutproben entnommen und Serumverdünnungen durch Inkubation mit synthetischem Peptid, das in fester Phase vorlag, getestet wurden.

Gebundene Antikörper wurden durch jodiertes Protein A ermittelt (New England Nuclear). Für die Anwendung im Immunblot

-112-

wurden Seren ausgewählt, die einen Antipeptidtiter von größer oder gleich 1/5120 hatten. Das Serum wurde nach einer lOOfachen Verdünnung oder nach zum Teil erfolgter Reinigung des IgG verwendet. IgG wurde teilweise gereinigt durch Präzipitation mit Na-SC^ (120 mg/ml Serum), Resuspendieren in PBS und wiederholter Präzipitation mit 14 % Na„SO. Die resuspendierte IgG-Lösung wurde an einer PD1O-Säule (Pharmacia) entsalzt.

Die Bestimmung der Reaktivität dieser Antikörper gegenüber den S-verwandten Proteinen im Immunblot erfolgte gemäß Beispiel 22 durch Zugabe von biotinyliertem Esel-Antikaninchen-Immunglobulin, Streptavidin-biotinylierter Meerrettichperoxidase und H₂O_ und 4-Chloro-naphthalin-1-öl.

Proteine aus teilweise gereinigten Präparationen der Partikel, die auf pRIT12660 zurückzuführen sind (Beispiel 21) wurden durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufge trennt und gemäß Beispiel 20 auf Nitrocellulose transferiert. Auf dem Gel wurden auch die S-Protein (p23) Partikel aufgetragen, die aus Hefen gereinigt wurden, welche pRIT12363 enthalten. Der Immunblot zeigte, daß die zwei größten S-verwandten Proteinbanden (33 kd- und 30 kd-Bande) mit den Antipeptid-Antikörper reagieren, während die zwei kleinsten (28 kd- und 25 kd-Bande) keine Reaktion zeigten. Das S-Protein (p23) zeigt keine Reaktion mit dem Antipeptid-Antikörper .

Beispiel 24

Human Anti-Hepatitis B-Aritikörper aus natürlich infizierten Personen, die ein Epitop oder mehrere Epitope auf 33 kd und 30 kd Pre S2-S-Proteinen erkennen, die nicht auf dem S-Protein vorhanden sind

-113-

Die Reaktivität von vereinigtem Gammaglobulin aus Anti-Hepatits B-positiven Patienten (Belgisches Rotes Kreuz, 100 150 IU/ml Lot 85A08) gegen die vier S-verwandten Proteine wurden mit dem in Beispiel 20 beschriebenen Immunblot-Varfahren getestet. Eine teilweise gereinigte Präparation (Beispiel 21) von Partikeln,die auf pRIT12660 zurückzuführen sind, wurde durch SDS dissoziiert und die freigesetzten Proteine durch CDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt. Nach dem Transfer der Proteine auf ein Nitrocellulose-Filter wurde das Filter mit einer 10fachen Verdünnung des Anti-Hepatitis B-Gammaglobulin in PBS mit 1 % Gelatine inkubiert. Die Antikörper-Bindung wurde gemäß Beispiel 20 durch die aufeinanderfolgende Inkubation mit biotinyliertem Schaf-Antihuman-Immunglobulin (Amersham RPN1003, 1/250 Verdünnung in PBS mit 1 % Gelatine), Streptavidin-biotinylierter Meerrettichperoxydase und H„O_ und 4-Chloro-naphthalin-1-öl bestimmt.

Die zwei größten S-verwandten Proteinbanden (33 kd- und 30 kd-Bande) reagieren mit den Human-Antikörpern, während^ die zwei kleinsten (28 kd- und 25 kd-Bande) keine Reaktion zeigen. Das S-Protein (p23), das aus Partikeln von Hefezellen stammt, die pRIT12363 enthalten, reagiert nicht mit diesen Human-Antikörpern. Diese Ergebnisse zeigen, daß Gammaglobulin, welches aus infizierten Personen erhalten wirr¹, Epitope auf denaturierten und reduzierten Pre S2-S-Prottinen spezifisch erkennt, die auf denaturiertem reduzierrtTi S-Protein nicht vorhanden sind. Es ist bekannt, daß die· Epitope auf dem S-Protein, das aus Humanse^um oder Hefe stammt, überwiegend gleich sind. >

Beispiel 10A

Die 33 kd Protein-Spezies besitzt eine Mannose enthaltende Oligosaccharid-Struktur besitzt.

-114-

Das Pre S2-S-Protein aus teilweise gereinigten Präparationen von Partikeln aus 10S44C cir° Zellen, die pRITi2660 enthalten, wurde elektrophoretisch aufgetrennt und gemäß Beispiel 20 auf ein Nitrocellulose-Filter transferiert. Auf dem Gel wurden auch das S-Protein von gereinigten Partikeln aus Hefen, die pRITi2363 enthalten sowie HBsAg-Partikel aus infiziertem Humanserum, die von Dr. W.H. Gerlich, Institut für medizinische Mikrobiologie, Universität Göttingen, erhalten wurden, aufgetragen.

10

Eine Hälfte des Nitrocellulose^Filters wurde mit 50 ug/ml Concanavalin A (Calbiochem A grade) in 10 mM tris pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl„ und 0,05 % Tween 20 inkubiert und nachfolgend mit 30 ug/ml Meerrettichperoxidase (Sigma Typ VI P 8375) in 10 mM tris pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,05 % Tween 20 und mit H„O₂ und 4-Chloronaphthalin-1-ol gemäß'Beispiel 20 inkubiert.

Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten wurde das FiI-te.v mit 10 mM Tris pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid und 0,05 % Tween 20 (Hawkes, Anal. Biochem., 123 (1982), 143 - 146; Clegg, Anal. Biochem., 127 (1982), 389-394) gewaschen. Die andere Hälfte des Nitrocellulose-Filters wurde mit dem monoklonalen Antikörper 6 inkubiert und gemäß Beispiel 20 behandelt.

Die 33K Proteinbande reagiert mit dem Concanavalin A-Peroxidase-Reagens,während keine der 30 kd-, 28 kd- und 25 kd-Proteinbanden oder das S-Protein, das aus Zellen stammt, 3Q die pRIT12363 enthalten, reagieren. In Gegenwart von 0,1M Methyl-alpha-D-mannopyranosid wird die Bindung von Concanavalin A an das 33K Protein verhindert.

35

-115-

Beispiel 26 Eine Oligosaccharid-Struktur, die N-glykosidisch an Asparagin gebunden ist

Zellen, die pRIT12660 oder pRIT12377 (Beispiel 17) enthalten, wurden im Selektivmedium [YNB + 80 ug/ml Histidin (DC5 cir^e) oder YNB (10S44C cir°)3 bis zu einer OD₆₂_nm von 0,2 kultiviert. Tunicamycin (Calbiochem) wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 ug/nil zugegeben und die Kultur

35 30 Minuten bei 30⁰C inkubiert. Dann wurden 20 uCi S-Methionin (1000 Ci/mMol) (New England Nuclear) pro ml zugegeben und die Kulturen weitere 15 Minuten inkubiert. 2 ml der markierten Zellkultur, die entweder mit Tunicamycin bebandelt wurde oder unbehandelt bleibt, wurden in einer (Mikrofuge) zentrifugiert und die Zellen dann in 40 μΐ 1 % SDS aufgenommen und durch 2minütiges heftiges Aufwirbeln in Gegenwart von 0,3 g Glasperlen (Durchmesser 0,45 bis 0,50 mm) aufgeschlossen.

Die Immunprazipitation wurde im wesentlichen nach dem von Julius et al. ,Cell, 36 (1984 ) , 309-318, beschriebenen Verfahren durchgeführt. Das Lysat wurde 3 Minuten bei 100⁰C gekocht, mit 0_v5 ml PBS, das 1 % Triton X100, 0,5 % Natriumdeoxycholat und 0,1 % SDS enthält, verdünnt und 1 Minute erneut bei 100⁰C gekocht.

25 μΐ einer 10 %igen Suspension von vorgewaschenem Immunopräzipitin (Formalin, fixierte Staph Α-Zellen, Bethesda Research Laboratories) wurden zu dem gekochten Extrakt zugegeben und C·· eser dann 30. Minuten bsi 0⁰C inkubiert. Die Mischung wurde durch 5minütige Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge gereinigt. Zu dem flüssigen Überstand wurden 2,5 μΐ des monoklonalen Antikörpers 6,der spezifisch für das S-Protein .ist (vgl. Beispiel 20) zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei O⁰C inkubiert. Weitere 25 μΐ des Immunopräzipitins wurden dann zugegeben und die Mischung

-116-

wurde 30 Minuten bei O⁰C inkubiert. Die Immunkomplexe wurden durch Zentrifugation (5 Minuten in einer Mikrozentrifuge) gesammelt und mit PBS, das 2M Harnstoff enthält, mit PBS, das 1 % 2-Mercaptoäthanol enthält, und mit PBS ohne Zusatz gewaschen. Die zuletzt erhaltenen Sedimente wurden in Probenpuffer dür die Elektrophorese gemäß Beispiel 20 resuspendiert .

Proben, die 10 cpm enthalten , wurden in einem 12,5 %igen SDS-Polyacrylamidgel (vgl. Beispiel 20) elektrophoretisch aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele in 40 % Methanol, 10 % Essigsäure, fixiert, für die Autoradiographie mit Verstärkerlösung (Amersham) behandelt und unter vermindertem Druck auf einem Filterpapier getrocknet. Die Autoradiographie wurde erstellt, indem ein Kodak X-Omat S-FiIm auf die Gele aufgelegt wurde und diese dann bei -70⁰C eingeschlossen wurden.

Diese Ergebnisse zeigten, daß Zellen, die pRIT12660 enthalten, in Abwesenheit von Tunicamycin ein 33 kd-Protein synthetisieren, während sie in Anwesenheit von Tunicamycin ein 30 kd-Protein synthetisieren. Beide Banden sind in den entsprechenden-Proben der Zellen, die pRIT12377 enthalten, nicht vorhanden.

Dieses Ergebnis zeigt, daß das in dem Hefestamm DC5 cir" exprimierte ?3 kd Pre S2-S-Protein einen Oligosaccharid-Anteil trägt, der N-glykosidisch an den Asparaginrest gebunden ist. Höchstwahrscheinlich ist r.ur eine Oligosacch'iridkette an die 33 kd-Form des Pre S2-S-Proteins gebunden, ' die nicht viel größer als eine Kernglykosylierung ist.

Beispiel 27 Oligosaccharid-Struktur, die einen hohen Anteil an Mannose enthält

-117-

Rohextrakte von Zellen, die pRIT12660 enthalten, oder teilweise gereinigte Partikel aus diesen Extrakten, die Pre S2-S enthalten (Beispiel 21), wurden mit Endo-N-Acetylglucosaminidase (Endo H; EC.3.2.1.96) aus Streptomyces plicatus.(New England Nuclear) behandelt.

Teilweise gereinigte Partikel (50 μΐ, 450 ug/ml Protein) wurden 3 Minuten bei 100⁰C in Gegenwart von 0,1 % Natriumdodecylsulfat gekocht und dann 10fach mit 100 mM Natriumcitrat pK 5 veraiAnnt. Zu 240 μΐ dieser Mischung wurden 2,4 μΐ Endo H (74 ug/ml) zugesetzt. Proben mit und ohne zugesetzter Endo H wurden 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Anlayse der Endo Η-behandelten und unbehandelten Proben durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Immunblot, in dem zur Bestimmung der monoklonale Antikörper 6 gegen das S-Protein; wie in Beispiel 20 beschrieben, verwendet wurde, zeigte das Verschwinden der 33 kdr-Bande und das Auftreten einer 31 kd-Bande nach Behandlung mit Endo H. Die 31 kd-Bande reagiert nach wie vor mit dem Concanavalin A-Peroxidase-Reagentien, wie vorstehend beschrieben. Die anderen Banden (30 kd, 28 kd und 25 kd) wurden durch Endo H-Behandlung nicht beeinflußt. Längere Inkubationen oder höhere Endo H-Konzentrationen ergaben identische Ergebnisse. Das Ergebnis zeigt, daß die Oligosaccharid-Struktur, die an das 33 kd-Protein gebunden ist, einen hohen Anteil Mannose enthält und etwa die Größe einer Kernglykosylierung besitzt.

Beispiel 28 Reinigung von Partikeln, die das Pre S2-S-Protein enthalten

Rohexcrakte von Hefezellen, die Pre S2-S-Partikel enthalten, wurden hergestellt, indem die gewaschenen Hefezellen in einem "Dynomill" in Gegenwart eines gleichen Gewichtes an Extraktionspuffer, der entweder 50 mM Natriumphosphat pH 8,1,

-118-

4 mM EDTA, 1,0 % Tween 20, 4 mM PMSF und 10 % Isopropanol enthält oder 200 mM Tris-HCl pH 9,0, 3,OM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA (Äthylenglykol-bis-beta-aminoäthyläther-N,N,N',N'-tetraessigsäure), 1 % Tween 20, 4 mM PMSF und 10 % Isopropanol enthält, zerrieben.

Die homogene Suspension wird auf den pH 8,0 oder 9,0 eingestellt und nachfolgend 45 Minuten bei 30 000*g zentrifugiert .

500 ml des Rohhefezeilextraktes, eingestellt auf pH 7,2, werden mit 10g kolloidalem Kieselgel (Aerosil 380 Degussa) versetzt. Die kolloidale Suspension wird über Nacht bei 4°C gerührt und anschließend mit niedriger Geschwindigkeit abzentrifugiert. Das Sediment wird dreimal mit 150 ml 0,15M NaCl jeweils 15 Minuten gewaschen und dann chargenweise mit 250 ml 10M Pyrophosphatpuf f er (pH 9 , 3) , der 2% Tereen-20 "enthält, 3 Stunden bei 37⁰C eluiert. Das Eluat, eine gelblich, leicht schillernde lösung, wird über eine 50 ml Säule aus Phenylboronat-Agarose (Amicon), die in 10 mM Pyrophosphatpuffer pH 9 äquilibriert wurde, gegeben. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 15 ml/Std.

Die Säule wird ferner mit 2 Säulenvolumen des Äquilibrierungspuffers gewaschen und dann in umgekehrter Richtung mit 100 mM Sorbit in 50 mM Tris (pH 7,2) mit einer Fließgeschwindigkeit von 15 ml/Std. eluiert. Eluierte Fraktionen des Peaks wurden vereinigt und nach dem Einstellen des pH auf 8,1 über eine(DEAE-Fractogel) TSK-Säule, die in 50 mM Tris pH 8,1 äquilibriert wurde, gegeben. Partikel werden in dem gleichen Puffer, der 75 mM NaCl enthält, eluiert. Nach diesem Schritt werden restliche Nucleinsäuren entfernt (<1 ug/20 ug Protein). Die Ergebnisse sind in Tabelle VI gezeigt.

-119-

Tabelle VI Zwei-Stufen-Reiniqung von Pre S2-S-enthaltenden Partikeln

Fraktion

mg S-verwandtes

protein mg ml (RIA) protein

mg

mg PoIy-Lipide Saccharide

Rohextrakt

500 11.3 14.600 5,286

7.850

Eluat (Aerosil)

270

5.96

385

554

249

Durchfluß PBA-Säule

315

2.83*

365

360

267

Eluat· PBA- Säule

70

2.3

2.9

2.5

* nicht ausreichend glykosyliert, um an der Säule festgehalten zu werden.

Material, das aus Zellen, die pRIT12660 enthalten, gemäß Beispiel 28 gereinigt wurde und das ferner durch eine Cäsiumchlorid-Gleichgewichtszentrifugation gereinigt wurde, wurde nach Anfärben mit Uranylacetat elektronenmikroskopisch untersucht. Die Untersuchung zeigte einzelne Partikelstrukturen mit einem Durchmesser von etwa 19 Mikrometer und ferner, daß solche hybriden Partikel zwischen 5 bis 20 ug Tween 20 pro 100 ug Protein enthielten.

Beispiel

Affinitätschromatographie an Linsensepharose

-120-

In diesem Beispiel wird die Chromatographie an Phenylboronat-Agarose durch die Affinitätschromatographie an Linsen-Sepharose (Pharmacia) ersetzt.

50 ml des gemäß Beispiel 28 erhaltenen Aerosil-Eluats wurden auf eine 5 ml Säule aus Linsen-Sepharose gegeben, die in einem Aquilibrierungspuffer, der 10 mM Tris (pH 7,2), 0,14MNaCl und 0,3 % Tween enthält, äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 2 Säulenvolumen eines Äquilibrierungspuffers, der 10 mM Tris (pH 7,2) enthält, gewaschen und dann mit diesem Aquilibrierungspuffer, der zusätzlich einen Zucker enthält, eluiert. Der verwendete Zucker besitzt eine Spezifität für Linsen und ist beispielsweise 0,5M alpha-Methylmannopyranosid. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII gezeigt.

Tabelle VII

Anwendung von Linsen-Sepharose-Affinitätschromatographie zur Reinigung von Pre S2-S-enthaltenden Partikeln

Fraktion

Volumen _vq S-verwand- _Gesamt_

τ· OG

(ml) Protein (RIA) Protein

Rohextrakt

Eluat (Aerosil)

2170

1700

3 gr

138 mg

Durchfluß Linsen-Sepharose

Eluat Linsen-Sepharose

12.5

428

925

1.26 mg

Die Untersuchung ergab, daß die wie beschrieben gereinigten hybriden Partikel 5 bis 50 ug Tween 20 pro 100 ug Pro-

-121-tein enthielten.

Beispiel 30 Immunogenität des Pre S2-S-Partikels

Die Immunogenität von Partikeln, die aus Extrakten von Zellen isoliert wurden, die pRIT12660 (Beispiel 16) enthalten, wurde an 2 Mäuseistämmen untersucht: Balb/c (H₂d) und NMR1 (H₀Q). Vor der Injektion wurde den Partikeln Al(OH).. zügesetzt. Die Mäuse (5 Mäuse pro Gruppe) wurden mit 0,3 ug des RIA-reaktiven Materials intraperitoneal gespritzt. Einen Monat nach der Immunisierung wurden die Mäuse ausgeblutet und die Seren von Mäusen der gleichen Gruppe vereinigt. Der Titer der Anti-S-Antikörper der vereinigten Seren wurde mit dem AUSAB-Kit (Abbott Labs) und dem WHO-Standard bestimmt. Die Titer wurden in mlu/ml nach der Hollinger-Formel (Hollinger et al., in Szmuness et al., Viral Hepatitis, Philadelphia: Franklin Institute Press, 1982, 451 - 466) umgerechnet. Die Anti-Pre S2-Antikörper wurden in einem Festphasen-Test (RIA) bestimmt, in dem das synthetische Pre S2-Peptid aus Beispiel 23 an einem Kunstharz fixiert ist und die gebundenen Antikörper durch ein Ziegen-

1 25 Anti-Mausimmunglobulin IgG, Jas mit Jod markiert ist, bestimmt werden. Die in Tabelle VIII zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß die Partikel aus Zellen, die pRIT12660 enthalten, in beiden Mäusestämmen Antikörper gegen das Anti-S- und Anti-Pre S2-Peptid induzieren. In dem Mausstamm NMR1 wird ein höherer Antikörpertiter gegen das Anti-Pre S2-Peptid induziert als in dem Starnm Balb/c. Der Anti-S-Titer, der in den Stämmen Balb/c oder NMR1 erhalten wird, ist 2-bis 3mal höher als jener Titer, der durch eine höhere Dosis von Partikeln ohne Pre S2-Sequenz aus Zellen erhalten wird, die pRIT12363 enthalten. Pre S-Determinanten verstärken die Antwort auf S-Determinanten. Dieser Verstärkungseffekt ist nicht erkennbar, wenn das Pre S2-synthetische Peptid zu-

-122-

sammen mit Partikeln, denen die Pre S2-Sequenz fehlt, injiziert wird. Überdies ist das synthetische Pre S2-Peptid allein nicht in der Lage, Anti-Pre S2-Antikörper hervorzurufen.

Dies zeigt , daß die Verknüpfung von Pre S2-Determinanten und S-Determinanten auf dem gleichen Partikel notwendig ist, um eine Anti-Pre S2-Antwort zu erhalten. Darüber hinaus führt diese Verknüpfung zu einer verbesserten Anti-S-Antwort. 10

Die Ergebnisse der Immuncgenitäts-Untersuchungen, die das Pre S2-S-Partikel betreffen, sind in Tabelle VIII zusammengefaßt. 15

-123-

Tabelle VIII Immunogenität des Pre S2-S Partikels

Dosis

Injizierte von S-Präparation verwandtem Antigen (Ug)(I)

Titer von

Anti-S Antikörper

(mlU/ml) (2)

Balb/c NMRl

Aus Hefe erhaltenes S-Partikel, das auf PRIT12363 zurückzuführen ist

1

1404

719

Anti-Pre S2 Antikörper (3)

Balb/c NMRl

Aus Hefe er- 1.55 haltenes S-Partikel,das auf PRIT12363 und das synthetische Pre S2-Peptid zurückzuführen ist

0.08 ug

Synthetisches Pre S2-Peptid:

l 0.08 ug

Aus Hefe erhaltenes (Pre S2-S) Partikel, das auf pRIT12660 zurückzuführen ist

748

1163

0.3 3344

2418

120

(1) bestimmt mit dem AUSRIA-Kit (Abbott Labs) und dem "Proposed International Reference Preparation" von Dr. Schild, National Institute of Biological Standardization, London.

-124-

(2) bestimmt mit dem AUSAB-Kit (Abbott Labs) und dem

WHO-Standard (3) bestimmt mit einem Festpiü'senradioi mmun-Test und dem an einem Kunstharz fixierten synthetischen Pre S2-Peptid.

Der Titer hat die Verdünnung, die zu einer eindeutigen Bindung des Antikörpers führt (2,5mal stärker als das negative Kontrollserum)

10

Beispiele für die Expression der gesamten Pre S1- Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz in Hefe

Beispiel 31

Konstruktion des Plasmids pRIT12845, das in Hefe das Pre S1-Pre S2-S-Protein exprimiert

Im ersten Schritt wurde die TDH3-Promotorregion mit der Pre S1-N-terminalen Region aus dem HBV-Genom fusioniert. Das Ausgangsmaterial war das Plasmid pRIT12792, das ein 495 bp großes Ncol-Xbal-Fragment besitzt, das die Pre S1-Pre S2-codierende Sequenz mit Ausnahme des letzten Asparagincodons enthält. Die Ncol-Stelle überlappt das ATG-Codon des Aminosäurerestes an der Stelle-163 der HBV-Pre S1-Sequenz. Die Sequenz des Ncol-Xbal-Fragmentes ist in Fig. 4A gezeigt.

Ein im wesentlichen ähnliches Plasmid zu pRIT12792 ist pRIT12793 (5940 bp),das bei der American Type Cultur Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 5. Sept. 1986 unter ATCC 67193 hinterlegt wurde. Aus dem Plasmid pRIT12793 kann ein 495 bp großes Ncol-Xbal-Fragment erhalten werden, das die vollständige Pre Si- Pre S2-codierende Sequenz enthält. Dieses Fragment, das am 3'-Ende die

-125-

Sequenz äCGAACTAATAATCTAGA besitzt, unterscheidet sich von jenem in Fig. 4A gezeigten durch ein einziges Nucleotid. Dieses Nucleotid ist unterstrichen. In den folgenden Beispielen kann PRIT12792 durch pRIT12793 ersetzt werden. Die Ncol-Xbal-Fragmente, die in pRIT12792 und pRIT12793 enthalten sind, wurden durch in vitro-Manipulation der Pre S1- Pre S2-DNA-Region des Hepatitis B-Virusstarrimes (Serotyp adw) , dessen DNA in pRIT10616 kloniert ist, erhalten. Das Pla.-jmid pRIT10616 ist von der American Type Culture Collection unter ATCC 39131 erhältlich.

52 ug von pRIT12792 wurden mit den Restriktion'senzymen Ncol und Xbal gespalten und mit Mungo Bohnen-Nuclease behandelt, um die 5'-überstehenden Enden zu entfernern. 600 ng (2 pMol) des behandelten und gereinigten 495 bp großen Ncol-Xbal-Fragmentes wurden mit 170 ng (0,02 pMol) des Vektors pRIT12314 ligiert. pRIT12314 war mit den Restriktionsenzymen BamHI und Smal geöffnet worden und ebenfalls mit Mungo Bohnen-Nuclease behandelt worden. pRITi2314 enthält das vollständige 2 Mikron DNA-Fragment von S. cerevisiae und eine Fxpressionseinheit, in der der TDH3-Promotor durch eiren ia-HI-Smal-EcoRI-Linker von der arg³-Terminations- ^n qotrennt ist.

BamHI EcoRI

Smal

ATGGATCCCCGGGAATTC ....

Promotor TDH-. Terminationsregion ARG₃

Eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion von pRIT12314 ist in Beispiel 10(3) zu finden. Die vorstehend beschriebene Ligationsmischung wurde zur Transformation"von E. coli,. Stamm MM294, verwendet. Es wurde sodann auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Sechs Transformanten, die

-126-

ein Plasmid enthalten, in dem das Pre S1- Pre S2-Fragment in richtiger Orientierung inseriert ist, wurden erhalten. Die Plasmide dieser Transformanten sind pRIT12843 (a .... f) (Fig. 18).

Der zweite Schritt war die Inserierurg der S-codierenden Region in jedes der Plasmide pRIT12843 (a .... f), um das vollständige Pre S1-S2-S-Gen zu erhalten.

Dies wurde folgendermaßen durchgeführt:

Die Plasmide pRIT12843 (a .... f) wurden jeweils mit den Enzymen BamHI und Sail geschnitten. Die BamHI-Stelle liegt am Beginn der Pre S2-Region, während die Sall-Stelle hinter der arg³-Terminationsregion in der pBR327 DNA liegt.

80 ng (0,012 /uMol) des größten BamHI-Sall-Fragments

(10 400 bp), das aus jedem Plasmid pRIT12843 (a f)

isoliert wurde, wurden mit 300 ng (0,11 pMol) des kleinen BamHI-Sall-Fragmentes von pRIT12660 (Beispiel 16) ligiert. Das kleine (4800 bp) BamHI-Sall-Fragment von pRIT12660 ent_r hält einen Teil der Pre S2-S-codierenden Sequenz, die ARG-Terminationssequenzen und die LEU2-Hefesequenz. Nach Ligierung und Transformation von E. coli, Stamm MM294, mit jedem der Plasmide pRIT12843 (a .... f) gemäß Cohen et al.,

a.a.O., wurden eine Reihe ampicillinresistenter Klone erhalten, die die bezeichneten Plasmide pRIT12845 (a .... f) tragen. Fig. 18 zeigt die Herstellung von pRIT12845 (a....f) Diese Plasmide wurden verwendet, um einzeln den Saccharo-

myces cerevisiae Stamm 10S44C cir° gemäß Ito et al. zu 30

transformieren. Kulturen von einzelnen transformierten Klonen wurden mit dem AUSRIA-Test (Abbott) getestet. Rohzellextrakte aus aufgeschlossenen Hefezellen wurden in PBS, das 0,5 % Tween 20, 2 mM PMSF und 5 % Isopropanol enthält, resuspendiert. Aus jeder der sechs getrennten Transformationen -

[mit pRIT12845 (a .... f^ wurde eine Transformante ausge-

-127-

wählt und getestet. Fünf der sechs getesteten Transformanten ergaben einen positiven AUSRIA-Test. .

Zur Feststellung, ob ein Protein, das im AUSRIA-Test eine S-verwandte Antigenität zeigte, die vollständige Größe hat, wurden Proben der oben beschriebenen Rohzellextrakte im Immunblot, wie in Beispiel 20 beschrieben, untersucht. Vier der fünf im AUSRIA-Test positiven Transformanten zeigten ein S-verwandtes Protein von etwa 39K. Eine Transformante (Extrakt ja) zeigte ein S-verwandtes Protein von 23K. Das für die Expression des 39K Proteins im Extrakt (e) verantwortliche Plasmid wird pRlT12845 genannt; vgl. Fig. 18.

15

Beispiel 32

Partikel, die aus dem Pre S1- Pre S2-S-Protein zusammengesetzt sind und die einen Rezeptor für polymerisiertes human „β Serumalbumin und ein Pre S1-Epitop auf ihrer Oberfläche tragen

Rohextrakte aus Zellen des Stammes 10S44C cir°, die entwe-

der pRIT12845, pRITi2660 oder pRITi2377 enthalten und Rohextrakte aus Zellen des Stammes DC5 cir°, die pRIT12363 enthalten, -wurden gemäß Beispiel 19 hergestellt. Die Bestimmung der Protein-Gesamtkonzentration, der HBsAgverwandten Antigenität und die Bestimmung eines Rezeptors für polymerisiertes Humanserumalbumin wurden gemäß Beispiel 19 durchgeführt. Das Ergebnis zeigte eine starke Bindungsaktivität für polymerisiertes Humanserumalbumin in Extrakten des Stammes 10S44C cir°, die pRIT12843 I oder pRIT12660 (vgl. auch Beispiel 10) enthalten, dagegen keine Bindungsaktivität in Extrakten des Stammes 10S44C cir' die pRIT12377 enthalten oder des Stammes DC5 cir°, die

OO

pRIT12363 enthalten.

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Die Cäsiumchlorid-Gleichgewichtszentrifugation von Rohe.^- trakten aus Zellen des Stammes 10S44C cir°, die pRIT12845 (beschrieben in Beispiel 12) enthalten und die im AUSRIA-Test für einzelne Cäsiumchlorid-Fraktionen bestimmte HBsAgverwandte Antigenität ergaben für das Antigen eine Bande mit einer Schwimmdichte von etwa 1,2 g/cm³. Dies wurde durch die Immunblot-Analyse der Cäsiumchlorid-Fraktionen bestätigt. Die Pre S1-Antikörper-Bindungsaktivität in den Casiumchlor.id-Fraktionen wurde in dem in Beispiel 12 beschriebenen ELISA-Test bestimmt. Nach der Bindung des Antigens an die in fester Phase vorliegenden Anti-HBsAg-Antikörper wurde das gebundene Antigen mit dem monoklonalen Antikörper MA18/7 (Beispiel 31) inkubiert, der dann durch biotinyliertes Anti-Maus-Immunglobulin, Streptavidin-biotinyliertem

^g Meerrettichperoxidase-Komplex und Chromogen gemäß Beispiel 12 bestimmt wurde.

Es wurde gefunden, daß die Pre S1-spezifische Antikörper-Bindungsaktivität und die HBsAg-verwandte Antigenität in dem Cäsiumchloridgradienten in gleicher Höhe laufen. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Pre S1- Pre S2-S-Protein, das in Zellen des Stammes 10S44C cir° produziert wird, die pRIT12845 enthalten, in Partikel eingebaut wird, die ähnlich den 22 nm großen HBsAg-Partikeln aus dem Serum sind. Die Partikel zeigen auf ihrer Oberfläche Pre S1-nspezifische Sequenzen und einen Rezeptor für polymerisiertes Humanserumalbumin. Aus der Höhe der Aktivität des Partikels im AUSRIA-Test und der Intensität der Reaktion des Pre S1- Pre S2-S-Proteins in einer Immunblot-Analyse, kann geschlossen werden, daß die

Q₀ S-Determinanten des Partikels durch die Pre S-Sequenzen ?n diesem Partikel teilweise blockiert oder deformiert werden.

Beispiel 33

Zwei Proteine, mit einem Molekulargewicht von etwa 38 und 45 kd, die beide Pre S1-,Pre S2- und S-Epitope

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j tragen und die in Hefe exprimiert werden, die pRIT12845 enthält.

HBsAg-verwandte Proteinmonomere, die in Zellen exprimiert werden, welche pR.TT12845 enthalten, wurden, wie in Beispiel 20 beschrieben, analysiert.

Die Wanderung und Immunreaktivitat von zellulären Proteinen

wurden mit Proteinen aus HBsAg-Partikeln (Serotyp ad), die

^q aus menschlichem Serum gereinigt wurden (erhalten von Dr. W.H.

Gerlich, Institut für medizinische Mikrobiologie, Universität Göttingen) verglichen.

Drei Immunreagentien wurden zur Analyse der Proteineverwen^det:

- der monoklonale Antikörper, der ein S-Epitop erkennt (erhalten von H. Thomas - Beispiel 20).

- ein polyvalentes Kaninchen-Antiserum gegen das synthetische Pre S2-Peptid (beschrieben in Beispiel 23)

2Q - der monoklonale Antikörper MA18/7, der spezifisch für ein Pre S1-Epitop ist; vgl. Heerman et al., J. Virol., 52 (1984), 396 - 402.

Der Immunblot zeigte unter den zellulären Proteinen aus den Zellen des Stammes 10S44C, die pRIT12845 enthalten, die Anwesenheit von zwei Proteinen, die spezifisch mit allen drei vorstehend beschriebenen Immunreagentien reagieren. Das Molekulargewicht dieser zwei Proteine wurde auf 38 und 45 kd geschätzt. Die Molekülirgewichtsbestimmung der Proteine O₀ basierte auf der Wanderung des aus dem Serum stammenden

HBsAg, wie von Heerman et al., -J. Virol., 52 (1984), 396 402, definiert. Das 38 kd. große Pre S1 Pre S2-S-Protein, das durch pRIT12845 codiert ist, wandert etwas schneller als das ρ 39 Pre S1- Pre S2-S-Protein, das aus _g5 HBsAg-Partikeln stammt. Das p39-Protein von Partikeln des Serotyps ad aus menschlichem Serum hat vermutlich eine Pre S1-

7 4 0

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Region von 119 Aminosäuren (Heerman et al., J. Virol. 52, 396 - 402, 1984). pRIT12845 codiert für eine Pre S1-Region von 108 Aminosäuren.

Diese Ergebnisse zeigen, daß Hefezellen, die pRIT12845 enthalten, zwei Proteine mit etwa 38 und <·5 kd exprimieren, die Pre S1. Pre S2 und S-Epitope tragen.

YQ Beispiel 34

Die 45 kd Pre S1- Pre S2-S-Protein-Spezies, die eine N-glykosidisch gebundene Oligosaccharidkette mit einem hohen Anteil Mannose enthält

^g Zellen, die pRIT12845 enthalten, wurden mit einem gleichen Gewicht an Glasperlen (Durchmesser 0,45 bis 0,55 mm) in einem mit gleichem Gewicht vorhandenen 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), der 2 % SDS und 8 mM EDTA enthält, durch starkes Aufwirbeln mit einem(Vortex)-Mixer aufge-

2Q schlossen.

Nach einer Zentrifugation wurde der Überstand 4 Minuten bei 100⁰C gekocht.

10 μΐ des gekochten flüssigen Überstanden wurden mit. 40 μΐ 25 mM Natriumeitratpuffer (pH 5,0) und 2 μΐ EndoH (74 ug/ml) (vgl. Beispiel 27) versetzt. Proben mit und ohne zugesetzter EndoH wurden 2 1/2 Stunden bei 37°C inkubiert.

QQ Die EndoH-behandelten und unbehandelten Proben wurden durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Immunblot gemäß Beispiel 20 analysiert. Der Blot wurde mit den monoklonalen Antikörpern 6 (S-spezifisch) und MA18/7 (Pre S1-spezifisch) (vgl. Beispiel 33) analysiert.

Der Immunblot zeigte mit beiden monoklonalen Antikörpern das

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Verschwinden der 45 kd Bande und das Auftreten einer 41 kd Bande nach EndoH-Behandlung. Das Wandern der 38 kd Bande wurde durch die EndoH-Behandlung nicht beeinflußt.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die 45 kd Pre S1- Pre S2-S-Protein-Spezies eine N-glykosidisch gebundene Oligosaccharidkette trägt, die einen hohen Mannoseanteil enthält.

Beispiel 35 Das 38 kd Pre S1- Pre S2-S-Protein, das Myristinsäure über eine Ί Amidbindung kovalent gebunden enthält "

Zellen des Hefestammes 10S44C cir°, die entweder pRIT12845, pRIT12660 oder pRIT12377 enthalten, wurden in YNB bis zu einer optischen Dichte ,_on von 0,4 kultiviert.

ozunm

Zellen (20 ml Kultur) wurden 60 Minuten, mit 1 mCi 3H-märkierter Myristinsäure (New England Nuclear) markiert und dann durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellen wurden mit kaltem Wasser gewaschen, in 100 μΐ 5 mM Tris-HCl (pH 7,4), das 3 mM (DTT), 1 % SDS und 1 mM PMSF enthält, resuspendiert und mit 100 mg Glasperlen durch ömaliges, jeweils 30 Sekunden dauerndes Aufwirbeln auüeinem Vortex aufgebrochen, wobei zwischen den einzelnen Aufwirbelungsschritten mit Eis gekühlt wurde. Zelltrümmer wurden durch 1minütige Zentrifugation in einer Eppendorff 5414-Zentrifuge (Towler und Glaser, Proc. Natl. Acad., Sei., 83.(1986), 2812-2816) entfernt. 20 \xl des Extraktes wurden 3 1/2 Stunden bei Raumtemperatur mit_f 7 μΐ einer frisch hergestellten Lösung aus 4M Hydroxylamin, 20 mM Glycin pH 10 behandelt,

Hydroxylaminbehandelte und -unbehandelte Proben wurden durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt und durch nachfolgende Autoradiographie gemäß Beispiel 26 dargestellt. Die Hydroxylamin unbehandelten Proben wur-

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den ebenfalls einer Immunblot-Analyse mit dem monoklonalen Antikörper gegen ein S-Epitop gemäß Beispiel 20 unterzogen.

Der Immunblot zeigte Ergebnisse, die identisch mit jenen von Beispiel 20 und 33 sind. Die Autoradiographie zeigte eine markierte Bande von 38 kd nur in den Extrakten aus Zellen, die pRIT12845 enthalten. Die Bande war hydroxylaminstabil.

,ester Dies zeigt an, daß aer 3H-markierte Myristinsäure/über eine Amidbindung vorliegt. Keine markierten Banden, die spezifisch für die Extrakte von Zellen sind, die pRIT12660 enthalten, wurden bestimmt.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das 38 kd Pre S1- Pre S2-S-Protein eine über eine Amidbindung kovalent gebundene Myri-

ester

stinsäure enthält. Im allgemeinen wird Myristinsaure/kovalent an Proteine über eine Amidbindung an ein aminoterminales Glycin gebunden. Dies deutet darauf hin, daß der Rest Met am N-Terminus des Pre S1- Pre S2-S-Proteins entfernt wurde und daß der Rest GIy ,an der Position 2 für die Acylierung mit Myristinsaure verfügbar wurde.

Beispiel 36 Verwendung von Pre S1-Vektoren zur Insertion von funktionellen DNA-Sequenzen

Das Ausgangsmaterial ist das in Beispiel 31 beschriebene Plasmid pRIT12793. Das Plasmid enthält die Pre S1- Pre S2-codierende Sequenz auf einem 495 bp großen Ncol-Xbal-Fragment. Das Plasmid pRIT12793 wird mit der Restriktionsendonuclease Ncol gespalten, mit T4 DNA-Polymerase zum Auffüllen dei überhängenden Einzelstränge behandelt und mit Xbal Endonuclease nachgeschnitten. Das so behandelte Ncol-Xbal-Fragment wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt und in den Vektor pUC12 inseriert,

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der mit den Endonucleasen Smal und Xbal gespalten war. Der Klonierungsvektor pUC12 ist erhältlich bei Amersham (Little Chalfont, Bucks, United Kingdom) und Pharmacia (Piscataway, NJ). Das Plasmid pRITX wird gemäß Fig.

5B . erhalten. In der Pre S1- Pre S2-Region des Plasmids pRITX überlappt die einzige Ncol-Stelle das ATG-Startcodon der Pre S1-Region. Eine Xbal-Stelle ist direkt daneben und downstream des TAA-Stopcodons am C-Terminus der Pre S2-codierenden Sequenz vorhanden. Die einzige BstX-Restriktionsstelle ist nahe des N-terminalen Endes der Pre Sl-codierenden Region.

Dem Fachmann ist bekannt, daß der Vektor pRITX oder ähnliche derivatisierte Vektoren, die die Pre S1-S2-Sequenzen enthalten, zur Inserierung an der BstXI-Stelle von weiteren funktioneilen DNA-Sequenzen, die für interessierende Peptide codieren, verwendet v/erden können, um diese Sequen-

Ablesephase zen in / mit der Pre S1-Region zu fusionieren.

Darüber hinaus können funktionelle DNA-Sequenzen nach der Doppelverdauung von pRITX und Derivaten mit BstX und BamHI oder EcoRI und Pstl und der Entfernung des größeren Teils der Pre S1-codierenden Region und des N-terminalen Teils der Pre S2-Sequenz zwischen die entsprechenden Restriktionsstellen eingeführt werden. Solche Fusionen werden vom Typ Pre S1-eingeführte funktionell DNA-Pre S2-Sequenzen sein. Sind einmal solche Fusionen gemacht, können sie in andere Plasmide einrekombiniert werden, die den Rest der Pre S1-Pre S2-Sequenzen und jene Sequenzen enthalten, die für die Stabilität und Replikation in E. coli und Saccharomyces cerevisiae (vgl. Beispiel 16A) botwendig sind.

Beispiel 37 Fusion eines Peptids aus Proteinen des HTLVIII-Virus und der Pre S2-Region aus der Pre S2-S-Sequenz zur Herstellung neuer Hybrid-Partikel

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Die Pre S2-Region einer HBV-Pre S2-codierenden Sequenz kann auch zur Fusion mit Peptidsequenzen anderer viraler Antigene verwendet werden, zu denen auch jene des als HIV, HTLV-III oder LAV bekannten Retrovirus gehören, das der Verursacher von AIDS ist.

Das klonierte Genom eines HIV-Virus ist aus Ratner L. et al. . Nature, 313 (1985) , 277 - 284, und Shaw G. et al. , Science, 226(1984), 1165-11 71, . bekannt. Von diesem genomischen Klon können verschiedene Subfragmente als funktioneile DNA-Sequenzen erhalten werden, die für Peptide von Interesse codieren. Die Fusion von solchen funktionellen Sequenzen mit der Pre S2-S-Sequenz kann zur Herstellung von neuen Hybridpartikeln, die Epitope der HlV-Virusproteine enthalten, genutzt werden. Solche Hybridpartikel können als Grundlage für einen Humanimpfstoff gegen das infektiöse HIV-Virus dienen.

Folgende Peptidregionen sind von Interesse:

a) C7-Peptid

Diese Region umfaßt 45 Aminosäurereste ; sie liegt unmittelbar an der Stelle,- wo das Vorläufer-Hüllprotein gespalten wird; vgl. Starcich B.R. et al., Cell, 45 (1986); 637 - 648.

b) Peptid 121 .

Diese Region besitzt eine relativ konservierte Aminosäuresequenz, die in mehreren retroviralen (transmembrane) Hüllproteinen vorliegt; vgl. Cianciolo G.J. et al., Science, 230 (1985), 453 - 455. Es wird vermutet, daß diese Sequenz an der durch das Retrovirus induzierten Immunsuppression beteiligt ist; vgl. Synderman R. und Cianciolo G.J., Immunol. Today, 5 (1984), 240.

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c) "Dreesman Peptid"

Das synthetische Peptid entspricht der Aminosäuresequenz 735 bis 752 des glykosylierten Vorläufer-Hüllproteins von HIV. Dieses Peptid wurde von Kennedy R.C. et al., Science, 231 (1986), 1 556 - 1559, verv/endet, um Kaninchen zu immunisieren. Das erhaltene Antiserum wurde verwendet, um die Erkennung von HIV-Hüllproteinen durch induzierte Antikörper zu untersuchen. Die erhaltenen Ergebnisse lassen vermuten, daß diese Region eine Iti;munantwort gegen das native Glykoprotein induzieren kann.

A. Fusion der DNA-Sequenz des C7-Peptides eines HTLV-III

Isolatsmit der Pre S2-S-Region von pRIT10911 Das Ausgangsmaterial war das Plasmid pBH10-R2, das das klonierte Genom des HIV-Isolates BH10 enthält. Dieses Plasmid wurde von R.C. Gallo, National Institutes of Health, Bethesda, MD, erhalten. Ein 3108 bp großes Sall-Xhol-Fragment, das den viralen Replikationsursprung enthält, wurde aus pBHi0-R2 ausgeschnitten und zwischen der Sail und Xhol-Stelle von pUC18 kloniert. Es entstand das Plasmid pRIT12901. Eine Restriktionskarte dieses Sall-Xhol-Fragments ist in Fig. 1-B gezeigt. Das Plasmid pUC18 ist von Norrander J. et al., Gene, 26 (1983), 101- 106, beschrieben und erhältlich von Pharmacia Inc., Piscataway, N.J..

Für eine Fusion wurde pRIT1290 'at den Endonucleasen BgIII und MboII gespalten und das entstandene 117 bp große Fragment durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution (vgl. Fig. 1B) isoliert. Die DNA dieses Fragments wurde zur Entfernung von überstehenden Einzelstrangbereichen mit Mungo Bohnen -Nuclease behandelt und dann mit der DNA von pRIT10911 (vgl. Beispiel 5),ligiert, die mit BamHI gespalten und mit Mungo Bohnen-Nuclease behandelt worden war. Aus dieser Ligationsmischung wurde das Plasmid pRIT12893 isoliert, in dem das 117 bp große Bglll-MboII-Fragment von pRIT12901 in pRIT10911 inseriert worden war. Die Nucleotid-Sequenz im

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Bereich des Fusionspunktes des TDH3-Promotors und des Mungo· Bohnen-Nuclease-behandelten 117 bp großen HTLV-III BgIII-MboII-Fragments wurde bestimmt. Es zeigte sich, daß IO Nucleotide zuviel von dem Bglll-Ende des Fragments entfernt worden waren. Folgende Sequenz wurde erhalten:

5' ATGGAGGAGGAGATATGAGGGA 3'

in der das erste unterstrichene ATG-Codon jenes des TDH3-Promotors aus pRIT10911 ist und das zweite ein internes ATG-Co-

IQ don des C7-Peptidfragments ist. Das zweite ATG-Codon überlappt mit einem TGA-Terminationscodon. Dieses Terminationscodon liegt in dem gleichen Leserahmen wie das erste ATG-Codon. Die Bestimmung der DNA-Sequenz des 3'-Endes der Fusionsregion in pRIT12893 zeigte die korrekte Sequenz für die

des

in Abiesephase-Fusion / MboII, Mungo Bohnen-Nuclease-behandelten Endes des HTLV-III-Fragments und der Pre S2-Sequenz von pRIT10911, wie in Fig. 2B gezeigt.

Die DNA von pRIT12893 wurde dann mit der Endonuclease Hindlll gespalten und das erhaltene 3250 bp große Fragment isoliert und durch Agarosegel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt. Das 3250 bp große Hindlll-Fragment wurde dann in die Hindlll-Stelle des Plasmids YEpI3 inseriert. Es entstand pRIT12894. Die DNA des Plasmids wurde dann zur 2ß Transformation von Zellen der Hefestämme DC5 und 10S44C nach Ito et al. (vgl. Beispiel 10) verwendet. Die Zellen wurden auf Leucin-Unabhängigkeit selektioniert.

QQ Die Transkription und Translation in Hefezelien der C7-Pre S2-S-Fusions-DNA in pRIT12894 führt zur Synthese eines kleinen, aus 5 Aminosäure bestehenden Peptides, das an dem TDH3-ATG-Codon beginnt und an dem unterstrichenen TGA-Codon endet sowie eines C7-Pre S2-S-Fusionspeptides, das an dem zweiten ATG-Codon im Inneren der C7-Sequenz beginnt. Dieses. Fusionsprodukt enthält 38 Aminosäurereste des C7-Peptids anstelle der

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45 .Aminosäurereste des intakten Bglll-MboII-Mungo, Bonnen-Nuclease behandelten C7-Fragmentes. Andere Plasmide als pRIT12893, die aus derselben Ligationsmischung erhalten wurden, können .. untersucht und sequenziert werden, um festzustellen, ob sie eine Fusion tragen, die dem kompletten Fragment entspricht.

B. Fusion der DNA-Sequenz des Peptids 121 mit der Pre S2-S-Region von pRIT10911

Zur Fusion wurde die DNA von pRIT12901 (beschrieben in Teil A) mit den Endonucleasen Hhal und Hindlll gespalten, um das in Fig. 1B gezeigte 230 bp große Fragment freizusetzen. Dieses Fragment wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt und dann mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um überstehende Einzelstrangbereiche aufzufüllen.

Das so behandelte Fragment wurde mit der DNA von pRIT10911, die mit BamHI gespalten und mit Mungo Bohnen-Nuclease behandelt worden war, ligiert. Aus dieser Ligationsmischung wurde das Plasmid pRIT12897 erhalten, in das das 230 bp Fragment der HIV-DNA im richtigen Leserahmen für die Fusion mit der Pre S2-Sequenz von pRIT10911 inseriert worden war (vgl. Fig. 3B). Die DNA des Plasmids pRIT12897 wurde mit der Endonuclease Kindlll gespalten und das erhaltene 3365 bp große Fragment, das den TDH3-Promotor, die HIV-Pre S2-S-FU-sion und die arg³-Terminationsregion enthält, durch Agarosegel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt. Dieses 3365 bp große Fragment wurde in YEp13 ligiert, das mit der Endonuclease Hindlll gespalten worden war. Es entstand das Plasmid pRIT12898. Dieses Plasmid wurde zur Transformation von Zellen der Hefestämme DC5 und 10S44C nach Ito et al. gemäß Beispiel 10 verwendet. Die Zellen wurden auf Leucin_r Unabhängigkeit selektioniert.

C. Fusion der DNA-Sequenz des "Dreesman"-Peptids mit der Pre S2-Region von pRIT1.911

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Ein synthetisches 60 bp Fragment mit der nachstehend angegebenen Sequenz wurde in an sich bekannter Weise hergestellt, nämlich durch Synthese zweier Einzelstränge und deren Aneinanderlagerung:

5' GATCTCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGA 3· 3 ' AGCTGTCCGGGCTTCCTTATCTTCTTCTTCCACCTCTCTC¹Γ 5

5¹ GACAGAGACAGATCCCCG 3·

3¹ CTGTCTCTGTCTAGGGGCCTAC 5'

Dieses Fragment hat am 5'-Ende BgIII und am 3'-Ende BamHI-überstehende Einzelstrangbereiche. Etwa 200 ng eines doppelsträngigen Fragments und 300 ng des mit RamHI gespaltenen

¹^ Plasmids pRIT10911 wurden gemischt und ligiert. Aus dieser Ligationsmischung wurde das Plasmid pRIT12899 erhalten, in das das 60 bp große Fragment an der BamHI-Stelle von pRIT10911 so inseriert worden war, daß eine Fusion im Ableseraster entstanden war (vgl. Fig. 4B). DNA

von pRIT12899 wurde mit der Endonuclease Hindlll gespalten und das erhaltene 3200 bp große Hindlll-Fragment durch Agarosegel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt. Dieses Hindlll-Fragment wurde in die Hindlll-Stelle von YEpI3 inseriert· !Es entstand das Plasmid pRIT12900. Dieses Plasmid wurde dann zur Transformation^von Zellen der'Hefestämme DC5 und 10S44C nach Ito et al. gemäß Beispiel 10 verwendet. Die Zellen wurden auf Leucin-Unabhängigkeit .selektioniert.

Beispiel 38

Expression von pRIT12894 und pRITi2898-codierten Fusionsproteinen

Die Hefestämme DC5 oder 10S44C, die entweder YEp13, pRIT12363, pRIT10912, pRIT12894 oder pRIT12898 enthalten,

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wurden getrennt in flüssigem Medium ohne Leucin (YNB + 80 ug/nl Histidin oder YNB) kultiviert. Zelluläre Proteine wurden durch Immunblot gemäß Beispiel 11 analysiert. Als erster Antikörper wurde ein monoklonaler Antikörper verwendet, der gegen ein denaturierungs- und reduktionsresistentes Epitop eines aus Menschen stammenden HBsAg gerichtet ist (monoklonaler Antikörper 6, erhalten von H. Thomas, Royal Free Hospital, London, England). pRIT10912 ist in Beispiel 5 beschrieben. pRIT12894 und PRIT12898 sind in Beispiel 37 beschrieben. In pRIT12363 liegt das 2900 bp große Hindlll-Fragment von pRIT12322 (Beispiel 8), das das S-Gen von HBV fusioniert mit dem TDH3-Promotor enthält, in einem Hefeplasmid-Vektor vor, der identisch mit PRIT12377 (Beispiel 10, Teil B) ist. pRIT12363 produziert HBsAg unter der Kontrolle des TDH3-Promotors.

Unter den gesamten zellulären Proteinen aus den Hefestämmen DC5 und 10S44C, die mit. pRIT12894 transformiert wurden, wurde durch den Immunblot eine mit dem S-Protein verwandte Proteinbande identifiziert, die einem geschätzten Molekulargewicht von etwa 32 kd entspricht. Eine mit dem S-Protein verwandte Proteinbande mit geschätztem Molekulargewicht von etwa 45 kd wurde; untar den gesamten zellulären Proteinen aus den Hefestämmen DC5 und 10S44C, die durch pRIT12898 transformiert wurden, gefunden. Unter den gesamten zellulären Proteinen aus dem Hefestamm DC5, der durch pRIT10912 transformiert wurde, wurde ein mit dein S-Protein verwandte Proteinbande mit einem geschätzten Molekulargewicht von etwa 29 kd gefunden.

Rohextrakte von Zellen des Hefestammes DC5, die entweder pRIT12363, pRIT10912 oder pRIT12894 enthalten, wurden gemäß Beispiel 12 hergestellt. Die Proteinkbnzentration und die AUSRIA-Aktivität wurden gemäß Beispeil 12 gemessen. Die Immunblot-Analyse dieser Rohextrakte wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt.

, -140-

Die Cäsiumcilorid-Gleichgewichtszentrifuation der Rohextrakte (beschrieben in Beispiel 12) und Bestimmung der HBsAg-verwandten Antigenität in den Cäsiumchlorid-Fraktionen durch den AUSRIA-^Test zeigten das Antigen in einer Bande mit der Schwimmdichte von etwa 1,2 g/cm³. Dieses Ergebnis wurde durch die Immunblot-Analyse der Cäsiumchlorid-Fraktionen bestätigt.

Diese Ergebnisse zeigten, daß das 32 kd Fusionsprotein, das ^ in Zellen des Hefestammes DC5, die pRIT12894 tragen, produziert wird, in Partikel eingebaut wird, die ähnlich dem 22 nm großen HBsAg-Partikel aus Humanserum sind. Aus der Höhe der Aktivität jener Partikel in dem AUSRIA-Test, _und der Intensität der Reaktion des 32 kd Proteins in der Immunbiot- *5 Analyse, kann geschlossen werden, daß die S-Determinanten dieser Partikel durch die C7-Sequenzen teilweise blockiert oder deformiert werden.

Aus diesen Ergebnissen wird geschlossen, daß Hefezellen der Stämme DC5 und 10S44C, die entweder mit pRIT12894 oder pRIT12898 transformiert sind, spezifisch ein Fusionsprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 32 kd oder 45 kd synthetisieren'^ die beide ein S-Epitop tragen.

Dem Fachmann ist bekannt, daß hybride Partikel, die HIV-Virus-Peptid-Epitope tragen, aus Kulturen von Hefezellen, die mit pRIT12894, pRIT12898 oder pRITi2900 transformiert sind, durch übliche Methoden isoliert und gereinigt werden können. Solche gereinigten Partikel können dann zusammen mit einem Adjuvans, wie Al(OH)₃ oder AlPO. als Humanimpfstoff verwendet werden. Die bevorzugte Dosis liegt im Bereich von 1 bis 1000 \iq Protein und wird durch übliche Prüfungen bestimmt. Die Erfindung umfaßt auch andere Peptidregionen von viralem HIV-Protein, die mit der Pre S2-S-Region von HBV-codierenden Sequenzen fusioniert werden können, um hybride Partikel zu bilden, die ein HIV-Epitop von Interesse zeigen.

Claims

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Patentanspruch

1. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Oberflächenproteinen bzw. Hybridpartikeln von HBV/HIV oder Plasmodium, dadurch gekennzeichnet, daß man ein HBV-, HIV- oder Plasmodium-Gen, das für das entsprechende Oberflächenprotein codiert, oder einen Teil des Gens in Ablesephase an aas 3'-Ende mindestens eines Teils der Pre S2-Region des HBV-Genoms ligiert, wobei dieser Teil so groß ist, daß er für ein immunogenes Protein codiert, dieses Fusions-DNA-Molekül an eine Expressionskontrollsequenz eines Expressionsvektors funktionell ligiert, das erhaltene rekombinante DNA-Molekül in einen euharyontischen Wirtsorganismus einschleust, den erhaltenen transformierten Wirtsorganismus in einem Kulturmedium züchtet und aus dem Zell-Lyaat oder Kulturmedium das Protein bzw. das Hybridpartikel isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des rekombinanten HBV-Oberflächenproteins bzw. Hybridpartikels entweder die Pre S2-, Pre S1- oder die gesamte Pre S1- Pre S2-DNA-Sequenz verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des rekombinanten Plasmodium-Oberflächenproteins bzw. Hybridpartikels die für das circumsporozoide (CS)-Protein codierende DNA-Sequenz verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des rekombinanten HIV-Oberflächenproteins bzw. Hybridpartikels die für das HIVC7-Protein, das Peptid 121 oder das Dressman-Peptid codierende Sequenz verwendet.

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5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als CS-proteincodierende DNA-Sequenz ein für 16 sich wiederholende Tetrapeptide codierendes 192 bp großes SauIIIA-Fragment verwendet wird, wobei dieses Fragment durch SauIIIA-Spaltung eines 1215 bp großen, für das CS-Protein minus der ersten 52 bp codierenden, StuI-RSal-Fragments des Plasmids WR 201 erhalten wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich weitere SauIIIA-Fragmente der CS-proteincodierenden DNA-Sequenz verwendet werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Expressionskontrollsequenz der TDH3-Promoter verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als eu!:aryontischer Wirt eine Hefezelle verwendet wird.

S. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefen solche der Gattung Saccharomyces verwendet werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefen solche der Art Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces carlsbergensis verwendet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefen solche des Stammes DC5, DC5 cir°, 10S44C oder 10S44C cir° verwendet werden. _f
12. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pre S1-DNA-Sequenz verwendet, die für die folgende Aminosäuresequenz codiert:

-143-

-163

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met GIy Thr Asn Leu Sec VaI Pro Asn Pco Leu

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pco Asp His Gin Leu Asp Pco

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT Ala Phe GIy Ala Asn Sec Asn Asn Pco Asp

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Tcp Asp Phe Asn Pco He Lys Asp His Tcp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pco Ala Ala Asn Gin VaI GIy VaI GIy AIa

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pco GIy Leu The Pco Pco His GIy

GCT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy He Leu GIy Tcp Sec Pco Gin Ala GIn

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT

GIy He Leu The The VaI Sec The He Pco

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA

. Pco Pco AIa See The Asn Acg Gin Sec GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA

Acg GIn Pco The Pco He See Pc_?o Pco Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC

Acg Asp Sec His Pco Gin Ala

-144-
13. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pre S2-DNA-Sequenz verwendet, die für die folgende Aminosäuresequenz codiert:

-55 -50 oc

Mec-GIn-Tcp-Asn-Sec-The-AIa-Phe-His-GIn-Ala-Leu-GIn-Asp-

-40 -30

Pco-Arg-VaL-Arg-Gly-Leu-Tyc-Phe-Pco-Ala-Gly-Gly-Sec-Sec-Sec-

-20
Gly-Thc-VaL-Asn-Pco-Ala-Pco-Asn-ILe-ALa-Sec-His-IIe-Sec-

-¹⁰

Sec-Sec-Sec-Ala -Arg-Thr-GLy-As ρ-P co-VaI-The-As η
14. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pre S1- Pre 52-DNA-Sequenz verwendet, die für die folgende Aminosäuresequenz codiert:

Pee Sl Region

-163

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG

Met GIy The Asn Leu Sec VaI Pco Asn Pco Leu 25

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pco Asp His Gin Leu Asp Pco

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT 30

ALa Phe GLy ALa Asn See 'Asn Asn Pco Asp

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG

Tcp Asp Phe Asn Pco ILe Lys Asp His Tcp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA

Pco Ala ALa Asn GLn VaL GLy VaL GLy ALa

-145-

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC

Phe GIy Pro GIy leu Thr Pco Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG

GIy He Leu GIy Trp Ser Pro Gin Ala Gin

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT

GIy lie Leu Thr Thr VaI Ser Thr lie Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA

Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA

Arg Gin Pro Thr Pro He Ser Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC

Arg Asp Ser His Pro Gin Ala

Pre S2 Region
-55

ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA

Met Gin Trp Asn Ser Thr Ala Phe His GLn

GCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTG Ala Leu Gin Asp Pro Arg VaI Arg GIy Leu

TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA

Tyr Phe Pro Ala GLy GIy Ser Ser Ser GIy

ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT

Thr VaI Asn Pro AIa Pro Asn lie Ala Ser

CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG hCT GGG

His He Ser Ser Ser Ser AIa Arg Thr GIy

GAC CCT GTG ACG AAC

Asp Pro VaI Thr Asn