DD285612A5 - Verfahren zur herstellung eines hiv-impfstoffes - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen zur Prophylaxe von HIV-Infektionen, wobei rekombinante Oberflaechenproteine bzw. Hybridpartikel von HIV verwendet werden, die durch ein gentechnologisches Verfahren gewonnen werden, bei dem man ein Gen, das fuer das entsprechende Oberflaechenprotein codiert, oder einen Teil des Gens in Ablesephase an das 3-Ende mindestens eines Teils der Pre S2-Region des HBV-Genoms ligiert, wobei dieser Teil so grosz ist, dasz er fuer ein immunogenes Protein codiert, dieses Fusions-DNA-Molekuel an eine Expressionskontrollsequenz eines Expressionsvektors funktionell ligiert, das erhaltene rekombinante DNA-Molekuel in einen eukaryontischen Wirtsorganismus einschleust, den erhaltenen transformierten Wirtsorganismus in einem Kulturmedium zuechtet und aus dem Zell-Lysat oder Kulturmedium das Protein bzw. das Hybridpartikel isoliert.{HIV; Oberflaechenprotein-Gen; Oberflaechenprotein; Hybridpartikel; Expressionsvektor; DNA-Rekombinationstechnik; Nachweis von induzierten Antikoerpern; Prophylaxe; Impfstoff gegen HIV-Infektionen}

Description

) 2

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung eines HIV-Impfstoffes

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Medizin zur Prophylaxe von HIV-Infektionen des Menschen

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Charakteristik des bekannten Standes der Technik:

A. HIV-Impfstoife

Die Infektion mit HIV-Virus und in der Folge AIDS ist ein ernstes, weit verbreitetes Gesundheitsproblem. AIDS wird durch das als HIV, HTLVIII oder als LAV bekannte Retrovirus hervorgerufen. Das clonierte Genom eines HIV-Virus ist aus Ratner et al., Nature 313 (1985), 277-284 und aus Shaw, G. et al., Science 226 (1984), 1165-1171, bekannt.

In entwickelten Ländern benötigt man einen HIV-Impfstoff für Menschen, die einem erhöhten Infektionsrisiko ausgesetzt sind. Solche sind Patienten und Personal in medizinischen Einrichtungen, wo man mit Blut in Kontakt kommt, militärisches Personal, Ehepartner von infizierten Personen, Rei-

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sende in Gebiete, in denen HIV endemisch ist, Neugeborene von infizierten Müttern, Homosexuelle, Prostituierte und Drogenabhängige. Daher benötigt man einen billigen Impfstoff zur Immunisierung sehr vieler Menschen. Eine solche Immunisierung kann schließlich nicht nur die Zahl von HIV-Infektionen, sondern auch die Erkrankungsziffer und Sterblichkeitsrate reduzieren.

B. Hepatitis B Impfstoffe

Die Infektion mit Hepatitis B Virus (HBV) ist ein ernstes, weit verbreitetes Gesundheitsproblem. Die Infektion kann akut oder chronisch sein. In den Vereinigten Staaten wird die Zahl der akuten Hepatitisfälle auf mindestens 100 000 pro Jahr mit einer Todesrate von 1 - 2 % geschätzt. Als chronische übertrager von HBV werden unter gesunden Erwachsenen abhängig vom Alter und sozialer Schicht 0,1 bis 1 % eingestuft. In Südamerika gelten etwa l bis 3 %, in der UDSSR und Südeuropa etwa 3 bis 6 % und in Asien und Afrika mehr als 10 % als chronische HBV-überträger. 20

In entwickelten Ländern benötigt man einen Impfstoff für Menschen, die einem.erhöhten Infektionsrisiko ausgesetzt sind. Solche sind Patienten und Personal in medizinischen Einrichtungen, wo man mit Blut in Kontakt kommt, militärisches Personal, Ehepartner von chronischen HBV-Überträgern, Reisende in HBV-endemische Gebiete, Neugeborene von chronischen HBV-Überträgern*, Homosexuelle, Prostituierte und Drogenabhängige. In Ländern der Dritten Welt benötigt man einen billigen Impfstoff zur Immunisierung sehr vieler Menschen. Eine solche Immunisierung kann schließlich nicht nur die Zahl akuter Hepatitisfälle und chronischer HBV-Überträger verringern, sondern auch die Erkrankungsziffer und Sterblichkeitsrate bei chronischer aktiver Hepatitis und Leberzellkarzinom reduzieren.

Dane-Partikel, die man für Hepatitis B Virionen hält und die man aus infizierten Patienten isolieren kann, haben einen

² δ S 6 ί 2

Durchmesser von etwa 42 nm. Jedes Partikel besteht aus einer Hülle, die das Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) enthält, einem Capsid (HBcAg), einer endogenen Polymerase und einem DNA-Genom. Das Genom ist zirkulär und doppelsträngig mit einem Einzelstrangbereich von etwa 200 Basen. Der Einzelstrangbereich kann in vitro durch die endogene Polymeraso zum Doppelstrang gemacht werden. Das DNA-Genom enthält etwa 3200 Basen.

Die Herstellung von HBV-Impfstoffen stellte sich seit langem als schwierig heraus, da das Virus nur schwer in Gewebekultur vermehrbar ist und nur der Mensch als Wirt bekannt ist. Im Labor ist es jedoch möglich, auch Schimpansen mit dem Virus zu infizieren

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Auf Valenzuela et al. , Nature 228 (1982), 347 - 350, ist die Expression von HBsAg in Hefe bekannt. Die codierende Sequenz von HBsAg, ein 835 Basenpaar großes Taq1 -Hpa1-Fragment wird unter die Kontrolle des Hefe-Alkohol-Dehydrogenase I-Promotors gestellt. Dieser Arbeit gingen mehrere kurze Berichte über Forschungsaktivitäten auf diesem Gebiet voraus. Dazu gehört die Arbeit von Valenzuela et al. , Arch. Biol. Med. Exp. (Chile), 24.(1) (1981), 21 - 22, aus der die Expression eines DNA-Fragments in Hefe bekannt ist, das für ein Protein codiert, das ähnlich zu HBsAg ist. Dieses DNA-Fragment wird unter die Kontrolle des Hefe-Alkohol-Dehydrogenase I-Promotors gestellt. Ferner ist aus einer Arbeit in Scrip Nr. 6I6, S. 14 (12. Aug. 1981) bekannt, daß ein Team von US-Wissenschaftlern, dem P. Valenzuela und W.J. Rutter angehören, die Herstellung des Hüllproteins von Hepatitis B Virus in Hefe angekündigt haben. Aus Zuckerman, Nature,295, (1982) 98 - 99 ist bekannt, daß W.J. Rutter über die Expression von glyko-' syliertem HBsAg in Hefezellen berichtet hat.

Antigene Komponenten von HBV, wie HBsAg, sind laut Berichten in Bakterien hergestellt worden, in die ein rekombi-

^ .) 6 ί 2

nantes DNA-Molekül eingeschleust wurde, das ein Gen enthält, das für das Antigen codiert. Alis Burrell et al., Nature, r79, Nr. 5708 (1979), 43 - 47,ist die Expression von HBV-DNA-Sequenzen in E. coli , Stamm HB101 bekannt. Diese DNA-Sequenzen lagen kloniert in dem Plasmid pBR322 vor.

Aus der Europäischen Patentanmeldung Nr. 13 282 ist die Herstellung eines rekcmbinanten Vektors bekannt, der für HBV-Antigene, wie HBsAg, codiert. Der Vektor wird aus der DNA von Dane-Partikeln und des Plasmids pBR322 hergestellt und eignet sich zur Transformation des E. coli Stammes HB101. Die Autoren geben an, daß als geeignete Wirte auch andere bakterielle Zellen, Hefe und Pilze, animalische und pflanzliche Zellen und andere Wirte zu verstehen sind, obwohl in dieser Anmaldung nur E. coli als Wirtssystem verwendet wird.

Aus Charnay et al., Nature, _28£ (1980), 893-895, ist die Konstruktion eines Bacteriophagen bekannt, der ein Fusionsgen aus dem ß-Galactosidase-Gen und dem Strukturgen HBsAg enthält. Der Bacteriophage führt zur Expression eines Fusionsproteins, das die antigenen Determinanten von HBsAg und ß-Galactosidase enthält.

Aus der GB-Patentanmeldung Nr. 2 034 323 ist die Herstellung eines Phagen,der HBV DNA enthält, bekannt. Der E. coli Stamm C600 wird durch diesen rekombinanten Phagen transformifc. t.

Aus der GB-Patentanmeldung Nr. 2 070 621 ist ein Plasmid bekannt, das einen Teil des HBsAg-Gens, den Promotor und das Z-Gen des Lactose-Operons besitzt,und das in E. coli kloniert wurde.

Aus der Europäischen Patentanmeldung Nr. 20 251 sind rekombinante Vektoren aus dem Pias-

ί 2

mid pBR3Z2 und BamHI-Fragmenten von HBV-DNA bekannt, die zur Transformation von E. coli· verwendet werden können. Andere Vektoren, die ein BamHI-Fragment von HBV-DNA und einen Teil des Tryptophan-Operons enthalten, wurden verwendet, um Expression in E. coli, Stamm HB101, zu erhalten.

Aus Edman et al., Nature, 2_91_, Nr. 5815 (1981), 503 - 506 ist die Konstruktion von Plasmiden bekannt, die zur Expression von HBcAg und einem Fusionsprotein aus ß-Lactamase-HBsAg in iä. coli führen. Die Expression findet unter Kontrolle des regulatorischen Bereiches des Tryptophan-Operons statt.

Aus Pumpen et al., Gene, 30, (1984), 202 - 210, ist bekannt, daß geringe Mengen des HBsAg-Monomers und Fusionsproteine in E. coli synthetisiert werden. Die Expression wird durch Antikörper nachgewiesen, die mit dem denaturierten HBsAg-Monomer reagieren.

Andere Literaturzitate, in deno.n die Insertion von HBV-DNA in Bakterien offenbart wird, sind folgende: Charnay et al., Progr. Med. Virol., 2J7 (1981), 88-92; MacKay et al., Proc. Natl. Acad. Sei.· U.S. 78, Nr.· 7(1981), 4510-4514; Fritsch et al. ,CR. Acad. Sei., 2£7, Nr. 16(1978), 1453; GB-Patentanmeldung 2 034 323 (Derwent Nr. 46874C) und Pasek et al. Nature, .2£2, Nr. 6 (1 979 ) , 575 .

HBV-DNA wurde auch in Säugetierzellen kloniert, nämlich in Zellen des Menschen, der Maus und in Zellen eines menschlichen Lebertumors. Aus Dubois et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S., 77, Nr.8(1980), 4549 - 4553, ist beispielsweise die Transformation von Mauszellen mit einem Piasmid bekannt, das das HBV-Genom enthält. Die Expression von HBsAg wird offenbart; aus Hirschman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S., 77, Nr. 9 (1980), 5507 - 5511,ist die Herstellung von HBV-ähn-5

liehen Partikeln durch HeLa-Zellen bekannt, die mit HBV-DNA transformiert wurden.

Aus Funakoshi et al., Progr.Med. Virol., 22 (1981), 163 - 167, und Maupas et al. , Progr. Med. Virol., 22(1981), 185-201 sind Verfahren bekannt, um durch Verwendung von HBsAg aus menschlichem Blut HBV-Impfstoffe herzustellen. Der Impfstoff von Funakoshi et al. enthält 40 ug gereinigtes, formalinbehandeltes HBsAg, Phosphat, Natriumchlorid, 20 mg Mannit und als Adjuvans 0,1 % Aluminiumhydroxid. Aus der Arbeit von Maupas et al. ist bekannt, daß eine Dosis des Impfstoffes 1 ml war, der 2 bis 10 ug gereinigtes, formalinbehandeltes HBsAg (bestimmt nach" der Methode von Lowry) und 0,1 % Aluminiumhydroxid enthält. Das von Maupas et al. verwendete Protokoll forderte drei Injektionen im Abstand von je einem Monat mit einer Auffrisch -Impfung nach einem Jahr; die Autoren schlagen zwei Injektionen von konzentriertem HBsAg im Abstand von drei Monaten vor.

Ergänzende Literaturzitate zur Herstellung von HBV-Impfstoffen sind Maupas et al., Adamowicz et al. und Funakoshi et al. bzw. auf den Seiten 3, 37 und 57 von Hepatitis B Vaccine INSERM Symposium No. 18, heraus/-geben durch Maupas und Guesry, 1981, Elsevier/North-Holland Biomedical Press.

Hefen sind als Wirtsorganismen zur Expression von bestimmten DNA-Sequenzen verwendet worden. Diese Sequenzen sind jedoch keine HBV DNA-Sequenzen. Aus der GB-Patentanmeldung Nr.

2 068 969 ist die Herstellung von Hühner-Ovalbumin in Hefe bekannt; aus einer Arbeit in Scrip Nr. 640, S. 11 (4. Nov.

1981) ist bekannt, daß ein Interferon-Typ _in Hefe hergestellt wird. Aus dem Europäischen Patent 11 562 (Derwent Nr. 38762C) sind hybride Hefeplasmide bekannt, die das urat Hefe-Gen in dem 2 u Plasmid enthalten.

Das natürliche Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) kann aus Plasma von infizierten Individuen als ein 22 nm großes Partikel isoliert werden. Dieses Partikel besteht aus den zwei Proteinen,P24 und seinem glykosyliertem Derivat GP28.

Beide Proteine besitzen 226 Aminosäuren und werden von dem Gen S des HBV-Genoms codiert.Eine für 163 Aminosäuren codierende DNA-Sequenz, die unmittelbar vor der codierenden Sequenz des S-Proteins auf dem HBV-Genom liegt, wird als Pre-S-codierende Sequenz bezeichnet. Ein für 55 Aminosäuren codierender DNA-Bereich der Pre S-codierender. Sequenz, der unmittelbar vor der codierenden Sequenz des S-Proteins liegt, wird als Pre S2-codierende Sequenz bezeichnet. Der für die übrigen 108 Aminosäuren codierende DMA-Bereich der Pre S-codierenden Sequenz wird als Pre S1-codierende Sequenz bezeichnet. Die Pre S-codierende Sequenz, oder irgendein kleiner Teil davon, wird auch als die DNA-Sequenz bezeichnet, die für das HBsAg Vorläuferprotein codiert.

Die Pre S-codierende Sequenz von einigen HBV-Subtypen (z.B. ayw) umfaßt 163 Codons, während sie bei anderen HBV-Subtypen (z.B. adw₂) 174 Codons besitzt. In jedem Fall besitzt die Pre S2-Region 55 Codons und liegt unmittelbar vor der codierenden Sequenz des S-Proteins.

In der Pre S2-codierenden Sequenz liegt die Bindungs- oder Rezeptorstelle für Polyalbum-in, die auf der Oberfläche von Dane-Partikeln und auf der Oberfläche von einigen HBsAg-Partikeln gefunden wird, welche aus dem Serum von HBV-infizier-

ten Patienten isoliert werden. Obwohl die Pre S2-Region unmittelbar vor der codierenden Region des S-Proteins auf dem HBV-Genom liegt, ist die Pre S2-Region nicht an der Zusammensetzung von HBsAg-Partikeln beteiligt; vgl. z.B. Persing

et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82 (1985) 3440 - 3444 30

Aus Valenzuela et al., Nature, _29£ (1982), 347 - 350, sind HBsAg-ähnliche Partikel bekannt, die nach Aufschluß von Hefezellen gefunden wurden, welche mit einem Vektor transformiert wurden, der die codierende Sequenz des Proteins enthält. Daraus wurde geschlossen, daß HBsAg-Partikel in Hefe synthetisiert werden.

Ι Aus Harford et al., Developments in Biological Standardization 54 (1983), 125-139, sind HBsAg-ähnliche Partikel bekannt, die' nach Aufschluß von transformierten Hefezellen gefunden wurden. Diese Zellen wurden mit einem Vektor transformiert, der eine DNA-Sequenz enthält, die für 18 Aminosäuren der Ornithin-Carbamoyltransferase codiert. Dieser Sequenz folgten unmittelbar am 3'-Ende ein DNA-Bereich der Pre S2-codierenden Sequenz, der für 42 N-terminale Aminosäuren codiert und anschließend der codierende Bereich des S-Proteins 10

Aus Laub et al., J. Virology, 48_( 1 ) (1983), 271 - 280, ist die Konstruktion eines Simian Virus 40 Vektors bekannt, in dem die frühe Region durch einen großen Teil des HBV-Genoms, der die Pre S-S proteincodierende Sequenz enthält, ersetzt ist. Diese HBV DNA wurde in SV40 transformierten CV-I Zellen (COS-' Zellen) exprimiert.

Aus Stibbe et al., J. Virology, 4j5(2) (1983), 626 - 628, ist bekannt, daß GP33 und GP36 in geringen Menger, vorliegende

HBsAg Glykoproteine durch die Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert werden. Aus Stibbe et al., Dev. Biol. Stand., 5_4 (1983), 33-34, ist bekannt, daß HBsAg Partikel, die große Mengen von GP33 und GP36 enthalten, keine höheren Antikörpertiter gegen das Anti S Protein enthalten, als jene

HBsAg-Partikei, die fast frei von GP33 und GP36 sind.

Aus Heerman et al., J. Virol., 5_2(2) (1984), 396 - 402, ist bekannt, daß die codierende Sequenz des Protein S und die Pre S-codierende Sequenz, die für 389 Aminosäuren codieren für das Polypeptid P39 codieren. Dieses Polypeptid wird zusammen mit der glykosylierten Form GP42 und den anderen HBV Oberflächenantigen-assoziierten Polypeptiden P24, GP27, GP33 und GP36 in HBV-Partikeln und viralen Antigenfilamenten gefunden

35

Aus Neurath et al., Science, 224,(1984), 392 - 394, ist bekannt, daß Polypeptide mit den 26 aminoterminalen Aminosäu-

<5* ί 2

— 9 —

ren der Pre S2-codierenden Sequenz immunogen sind. Es wird darauf hingewiesen, daß Antikörper gegen diese Polypeptide für diagnostische Tests verwendet werden können.

Aus Michel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. JSA, 81 (1984), 7708-7712, ist die Express on von HBsAg, das Rezeptoren für das menschliche Serum Polya. -urnin trägt, in chinesischen Hamster-Ovarienzellen (CHO) bekannt. Diese Zellen wurden mit einem Plasmid transfiziert, das die Pre S2-S proteincodierende Sequenz enthält.

Aus Persing et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, £2 (1985), 3440 -3444, ist bekannt, daß Maus L-Zellen, die mit einer Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz transformiert wurden, drei HBsAg-verwandte Polypeptide (24, 2 7 und 35 kd) exprimieren. Diese Polypeptide können zu komplexen immunreaktiven HBsAg-Partikeln mit einem Durchmesser von 22 nm ausgebildet werden, die polymerisiertes menschliches Serumalbumin (HSA) binden; Maus L-Zellen dagegen, die mit

²^ einer Pre S2-S-codierenden Sequenz, die am 3'-Ende der Pre S2-Region eine Leserahmenmutation besitzt, transformiert wurden, können nur noch 24 und 2 7 kd große Polypeptide exprimieren, die zu immunreaktiven HBsAg-Partikeln mit einem Durchmesser von 22 nm iusgebildet werden können und nicht

*^b mehr HSA binden können. Persing et al. folgern daraus, daß die Pre S2-S-proteincodierende Sequenz für ein 35 kd großes Polypeptid codiert und daß das Pre S2-Protein für die HSA Bindungsaktivität von HBsAg verantwortlich ist, nicht aber für die Zusammensetzung und Sekretion von HBsAg-Partikeln benötigt wird; es wird ferner geschlossen, daß das in großen Mengen vorliegende 24 kd große Polypeptid von HBsAg nicht in erster Linie durch Spaltung von größeren Vorläuferproteinen (nämlich den 27 od'-r 35 kd großen Pepti-

den) erhalten wird

35

Aus Milich et al.. Science, 22%_ (1985), 1195 - 1199, ist bekannt, daß Impfstoffe, die HBV-Partikel mit Pre S2 und HBsAg

2 a 5 6 I 2

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enthalten, in bestimmten Mäusen eine Unempfindlichkeit verhindern können, die auftritt, wenn der Impfstoff nur HBsAg enthält; die verwendeten HBV-Partikel mit Pre S2 und HBsAg wurden aus chinesischen Hamster-Ovarienzellen (CHO) erhalten, die mit einem Plasmid transfiziert worden waren, das die Pre S2-S proteincodierende Sequenz enthielt. Es ist ferner bekannt, daß die 26 Aminosäuren am Aminoterminus des 33 kd großen Polypeptids,das durch die Pre S2-S prote.incodierende Sequenz codiert wird, eine dominante Antikörperbindungsstfille in :1er Pre S2-Region repräsentieren.

In Michel et al., "Vaccines 86", Brown et al., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1,986), 359 - 363, ist die Herstellung von Hepatitis B-Oberflächenantigenpartikel, die das Expressionsprodukt der Pre S2-Region enthalten, beschrieben.

Aus Neuratn it al., Nature, 315 (1985), 154 - 156, ist bekannt, daß die Pre S-Region Proteine der HBV-Hülle codiert, die Domänen besitzen, die spezifisch durch Leberzellen er-

²^ kannt werden; die Pre S2-S proteincodierende Sequenz für ein Protein codiert, das in HBV-Partikeln vorhanden ist; synthetische Peptide, die dem' Gen entsprechen, das für Pre S-Proteine codiert, immunogen ind. Neurath et al. schließen daraus, daß HBV-Impfstoffe Pre S-Determinanten enthalten soV.ten.

Aus Valenzuela et al., Biotechnology, 3_ (1985), 317 - 320, ist die Expression der gesamten Pre S2-S proteincodierenden Sequenz in Hefe bekannt; es ist ferner bekannt, daß diese

^ Hefezellen ein Partikel mit HBsAg und Pre S synthetisieren, das im Elektronenmikroskop und in den Sedimentationseigenschaften sehr ähnlich jenen Partikeln ist, die nur HBsAg enthalten, und daß die Pre S2-Region nicht die Fähigkeit beeinträchtigt, Partikel auszubilden, die den 22 nm großen

^ HBsAg Partikeln sehr ähnlich sind Aus Valenzuela et al.

ist ferner die Hypothese bekannt, daß HBV in die Leber ge-

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langt, indem der HBV-Polyalbumin-Rezeptor durch Polyalbumin an Leberzellen gebunden wird und somit das Virus aufgenommen wird, und daß der Polyalbumin-Rezeptor von HßV durch die Pre S2-Region codiert wird. Valenzuela schließt daraus, daß ein Impfstoff,der Pre S2 enthält, zur Bildung von Antikörpern führt, die nicht nur HBV über einen normalen Mechanismus inaktivieren, sondern auch die Aufnahme des Virus durch Leberzellen stören könnten.

Die Europäische Patentanmeldung Nr. 171 008-A beansprucht die Herstellung von nicht-glykosyliertem Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen P31 Protein in Hefe.

Die Europäische Patentanmeldung Nr. 174 444-A2 beansprucht ein 15

Verfahren zur Herstellung in Hefe von HBsAg-Partikel, die das P31 Protein enthalten.

Die folgende Tabelle I vergleicht die bekannten Aminosäure-20

Sequenzen der Pre S2-Region mit der HBV Pre 32-Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung:

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2856 1

Tabelle I

Vergleich der Aminosäuresequenz n*_r p^ schiedenen hrv s_o,-_n<.,,p_rn

HBV

Sub-

typ

Pre S2 codierende Region

-55 -50

-40

_3Q

-20-10

adw

"WNSTAFHqALOOPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSSSAHTGDPVTM

adw

H

L

T

T L

K

L

T

0

Aspartat

V

•

He

adw

T

L

L

T

T

Threonin

V

Leu

adw

T

Aminosäure-Abkürzungen

S

Serin

Vl

Tyr

adw

T

Asp

E

Glutami nsäure

V

Phe

adr

Th r

P

Prolin

His

adr

Ser

G

Glycin

Lys

ayw

GIu

A

Alanin

Arg

adyw

Pro

C

Cystein

Trp

GIy

V

Valin·

GIn

AIa

M

Methionin

Asn

Cys

VaI

Met

TT TT

P P PL

TTT P I I I I IFS I S IFS I IFS I

AP AP AL AL

Literaturzitat

Gegenstand Pre a2 codierende Region

6 "

Isoleucin Leucin Tyrosin. Phenylalanin·

Histidin

Lysin

Arginin

Tryptophan

Glutamin

Asparagin

2854 I 2

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Zitierte Literatur

L. Valenzuela s: al., Ia Animal. Vicus Genetics

(Field, iaeniscti and Fox eds) , 57-70, Academic Pcsss. ο

New York (1980).

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8. Pasek et aL.. Nature. !£2.(1979), 575 - 579.

C. Polyvaiente Impfstoffe

Aus Valenzuela et al., Biotechnology, 3_ (1985), 323 - 327, ist bekannt, daß der HBsAg Polyalbuminrezeptor, der durch die Pre S2 codierende Sequenz codiert wird, zur Herstellung von polyvalenten Impfstoffen verwendet werden kann. Aus Valenzuela et al. ist ferner bekannt, daß durch Expression der hybriden HSV-1gD-Pre S2-S proteincodierenden Sequenz in Hefe die Herstellung eines hybriden HBsAg-Herpes simplex 1-Virus Glykoprotein D (HSV-IgD) Partikels ermöglicht wird.

O₀ Aus Valenzuela, "Hepatitis B subunit vaccines using recombinant DNA Techniques", 15. Mai 1985, Bio-Expo-5-Meeting, Boston Massachussetts, ist bekannt, daß bei einem Hybrid,wie dem vorstehend beschriebenen HBsAg-HSV-1gD-Partikel,die immunologische Dominanz von HBsAg gegenüber dem fremden immuno-

gj- genen Polypeptid, das auf der Oberfläche des Partikels präsentiert wird, gefährdet wird.

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Aus der Europäischen Patentanmeldung 0 175 261 ist ein neues hybrides Polypeptid bekannt, das zumindest einen großen Teil des Hepatitis B Oberflächen-Antigens fusioniert mit einem oder mehreren Oligopeptiden enthält. Das hybride Polypeptid ist in der Lage, in einem zellulären Wirt ein Partikel zu bilden, das zumindest ein Epitop von zumindest einem Oligopeptid präsentiert.

Die Pre S2-Region einer HBV-Pre S2-codierenden Sequenz kann auch zur Fusion mit Peptidsequenzen anderer viraler Antigene verwendet werden, zu denen auch jene des als HIV, HTLV-III oder LAV bekannten Retrovirus gehören, das der Verursacher von AIDS ist.

Das klonierte Genom eines HIV-Virus ist aus Ratner L. et al. , Nature, 313 (1985) , 277 - 284, und Shaw G. et al.,

Science, 226(1984), 1165-1171, . bekannt. Von diesem'genomischen Klon können verschiedene Subfragrnente als funktioneile DNA-Sequenzen erhalten werden, die für Peptide von Interesse codieren. Die Fusion von solchen funktioneilen Sequenzen mit der Pre S2-S-Sequenz kann zur Herstellung von neuen Hybridpartikeln, die Epitope der HlV-Virusproteine enthalten, genutzt werden. Solche Hybridpartikel können als Grundlage für einen Humanimpfstoff gegen das infektiöse HIV-Virus dienen.

folgende Feptidregionen sind von Interesse:

a) C7-Peptid

Diese Region umfaßt 45 Aminosäurereste ; sie liegt unmittelbar an der Stelle, wo das Vorläufer-Hüllprotein gespalten wird;

vgl. Starcich B.R. et al., Cell, 45 (1986), 637 - 648. 35

³i>6 / 2

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b) Peptid 121

Diese Region besitzt eine relativ konservierte Aminosäuresequenz, die in mehreren retroviralen (transmembrane) Hüllproteinen vorliegt; vgl. Cianciolo G.J. et al., Science, 230 (1985), 453 - 455. Es wird vermutet, daß diese Sequenz an der durch das Retrovirus induzierten Immunsuppression beteiligt ist; vgl. Synderman R. und Cianciolo G.J., Immunol, Today, 5 (1984), 240.

c) "Dreesman Peptid"

Das synthetische Peptid entspricht der Aminosäuresequenz bis 752 des glykosylierten Vorläufer-Hüllproteins von HIV. Dieses Peptid wurde von Kennedy R.C. et al., Science, 231 (1986), 1556 - 1559 , verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. Das erhaltene Antiserum wurde verwendet, um die Erkennung von HIV-Hüllproteinen durch induzierte Antikörper zu untersuchen. Die erhaltenen Ergebnisse lassen vermuten, daß diese Region eine Immunantwort gegen das native Glykoprotein induzieren kann.

Proteine können posttranslationale Modifikationen erfahren und einige von diesen können die Konformation und Funktion

des Proteins grundlegend beeinflussen. Oligosaccharid-Ketten 25

an dem aus Menschen stammenden Pre S1-Pre S2-S und Pre S2-S-Proteins (Heerman et al., J. Virol., 5_2 (1984), 396 - 402· Stibbe and Gerlich, Virology, vn_ (1982), 436 - 442; Stibbe and Gerlich, J. Virol., 4£ (1983), 626 - 628, und vermutlich die Myristinsäure an dem Pre S1- Pre S2-S-Prote.\n (Persing et al., Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses, 28.31. Aug.1986, Cold Spring Harbor Laboratory) könnten die Partikelbildung, die Konformation der Proteine in den Partikeln und die Antigenität und Immunogenität diaser Partikel beeinflussen.

2 8 5 < f 2 '

- 16 -

Hefe (Saccharomyces cerevisiae) besitzt die nötigen Enzyme, um Proteine zu glykosylieren (Ballou "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Metabolism and Gene Expression"; Strathern, Jones and Broach Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1982), 335 - 360) und Fettsäuren zu acylieren (Towler and Glasler, Proc. Natl. Acad. Sei., £3 (1986), 2812 2816, ähnlich wie dies höhere eukaryontische Zellen vermögen.

Virale Oberflächenglykoproteine, die in Hefe exprimiert wurden, liegen glykosyliert vor. Aus Jabbar et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., £2 (1985), 2019 - 2023, ist bekannt, daß die Expression des Hämagglutinin-Gens von Influenza in Hefen zu einem glykosylierten Hämagglutinin-Protein führte. Aus ¹^ Wen and Schlesinger, Proc. Natl. Acad. Sei., Q2_ (1986), 3639-3643, ist bekannt, daß die Expression von Glykoproteinen des Sindbis u d vesiculären Stomatitis Virus in Hefe zu glykosylierten Viral-Proteinen führte. Aus Fujisawa et al. (Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses, 28.-31. Aug. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 62) ist bekannt, daß die Expression des Pre S2-S Gens in Hefe zur Synthese von zwei glykosylierten Formen des Pre S2-S Proteins führte. Aus

Kniskern et al. (Abstracts of papers presented at the 1986 25

meeting on Modern Approaches to New Vaccines, Including Prevention of AIDS, 9.-14. Sept. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 89) ist bekannt, daß die Expression des Pre S1- Pre S2-S Gens in Hefe zur Synthese von zwei Pre S1-

Pre S2-S Proteinen mit einer Größe von 45 kd bzw. 39 kd 30

führte. Aus Persing et al. (Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses, 28„-31- Aug. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 19) ist bekannt, daß die Zugabe von ³Η-markierter Myristinsäure zu COS7-Zellen, die Pre S1- Pre S2-S, Pre S2-S und S-Proteine exprimieren, zu radioaktiv markierten Pre S1- ?re S2-S-Protein führte.

-π

Fusionsproteine, die in Hefe exprimiert und in ein Partikel verpackt werden, werden nach dem allgemeinen Schema gereinigt: Aerosile Adsorption und Desorption (D-, Calciumchlorid-Präzipitation (2) -> Phenylagarose oder Phenylboronatagarose-Adorption und Desorption (3) -> Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation oder UEAE-Ionenaustauschchromatographie.

Schritt 1 ist aus der EP-AO 204 680 und Schritt 3 aus der EP-A 0 199 698,soweit es Phenylagarose betrifft, bekannt. Die spezifische Kombination von Schritt 1 und Schritt 3 ermöglicht es, kontaminierendes Material stark abzutrennen (Eliminierung von 90 % Protein, Kohlenhydraten und 50 % Lipide).Diese neue Kombination ermöglicht ein gutes Funktionieren der nächsten chromatographischen Schritte.

Im Falle von Fusionsproteinen, die g.lykosyliert sind, wird Phenylboronat (PBA) als Affinitätsadsorbens verwendet, :3t i pH 9 bildet die Boronatgruppe kovalente Komplexe mit möglichen cis-Diolgruppen an den glykosylierten Seitenketten aus. PBA-GeIe sind gegebenenfalls zur Reinigung von löslichen Glykoproteinen nicht aber zur Reinigung von Partikeln, die Glykoproteine in der Lipid-Doppelschicht eingebettet haben, verwendet worden (vgl. Cook et al., Analyticyl Biochemistry, 149 (1985), 349 535; Middle et al., Biochemical Journal, 20_9 (1983), 771-779;Cook et al., Biochimica et Biophysica Acta, £28. (1985), 205-212; Maestasane et al., Journal of Chromatography, j_89 (1980), 225-231. Da das Partikel viele Liganden-Bindungsstellen enthält, müssen PBA-GeIe mit einer sehr niedrigen PB-Ligandendichte verwendet werden, z.B. PBA-GeIe mit einem Boronatgehalt von < 10ug/ml Gel, vorzugsweise 5 ug Boronat pro ml Gel. Die Verwendung von Phenylborcnatgelen mit sehr niedrigem Boranatgehalt erlaubt die Affinitäts-Chromatographie von Partikeln, die Glykoproteine eingebettet enthalten.

2 β 5 ό ί 2

73 215 12

- 17a-

Ziel der Erfindung

Kit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines billigen HIV-Impfstoffes bereitgestellt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen HIV-Impfstoff herzustellen, der für die Iraraunisierung sehr vieler Menschen, die einem erhöhten Infektionsrisiko ausgesetzt sind, geeignet ist.

2856

Ιί5 -

Dior.p i:rl iiuluiH) bot.ri ΓΓΙ: oin Verfahren zur Horstollung eines ülV-liiipi st öl lor,, ho i (Join ein rokombinantes DNA-Molekül ver-W(¹MdOt: wird, il.is; ο i na i'unktionelle codierende DNA-Sequenz onthä.lt, dio in Ablor.ophnsc mit oinem Teil der Pro S2-Region nun oinor llop.il i l".ir. I) Virus (HDV) Pro S2-S proteincodierondnn Soquoir.' Iu:;ioninrt ist. Dor Ausdruck "codierende Se-

I'¹ quonz" ndor "cmlieroncla Uogion"₍ wie nier gebraucht, schiie/Jt auch oin bei iobigor» iunktionellos Derivat davon ein. Mit dem Ausdruck " funkU i.ono I los Derivat" ist eine codierende Seuqenz mit Aminonauro-Modi fikationen gemeint, die, wo es angebracht iat, die PartikoIbildung nicht stört und/oder die Immunoge-

ΙΊ nitat, wnnn dion gewünscht ist, beibehält. Ein solches funktionoller. Derivat kann durch die übliche ortsspezifische Mutngonoso, wie durch Hotstoin et al., Science, 229 (1905),

1193-1201, beschrieben, hergestellt werden. Im allgemeinen enthalt ο In r.olchoo DNA-Molekül eine regulatorische Region, wo clio vory.iiqflwoif.p von dem Hefe arg³-Gon stammt.

Dio Kri:.i.ndung ))of.ri L'tt auch oin Verfahren, bei dem ein rokombjnantor Vnk¹ · vorwondot wird, der ein rokombinantos DNA-Molckul oiiUhri ,U, das mit einer rogulatorischon Region

'•^:'i funktionell voi/bundon ist. Das DNA-Molekül enthält eine funktional.Io lujdiorondo DNA-Sequenz, die in Ablesephase mit einem Toil dor Pro .'.;.?.-liegion aus einer HBV Pre S2-S proteincodiorondon »Srquoir/. fusioniert ist. Mit dem Ausdruck "regulatorischo Roqion", wio hier verwendet, ist eine DNA-Sequenz

HO gomoint, dio ivine Promoter-Region und andere notwendige Sequenzen für dio Transkription und Translation einer codierenden iioquonv, (Mithält.

Die Krfindupg hotrifft auch ein Verfahren, bei dem eine Hi Gukaryontificho Wlrtszelle verwendet wird, die durch einen rekombinanton Vektor transformiert wird, welcher ein DNA-Molekül ontluilt, dar, mit einer regulatorischen Region funktio-

5 6 1 2

- 19 -

neu verbunden ist. Das DNA-Molekül enthält eine funktioneile, codierende DNA-Sequenz,'die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren bei dem eine solche transformierte Wirtszelle hergestellt wird. Dazu gehört auch die Transformation einer eukaryontischen Wirtszelle mit solch einem rekombinanten Vektor.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren bei dem ein hybrides HBsAg enthaltendes Partikel hergestellt wird, das ein Peptid enthält oder präsentiert, das durch eine funktioneile codierende DNA-Sequenz codiert wird. Das Verfahren umfa/Jt die Kultivierung einer durch einen rekombinanten Vektor transformierten eukaryontischen Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium und die Isolierung des Partikels aus einem Lysat oder Extrakt dieser Wirtszelle. Der verwendete Vektor enthält ein mit einer regulatorischen Region funktionell verbundenes DNA-Molekül, in dem die funktioneile codierende DNA-Sequenz in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz fusioniert ist.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein Impfstoff hergestellt wird, der ein Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) enthaltendes hybrides immunogenes Partikel enthält, das ein Peptid enthält oder präsentiert, das durch eine funktionelle codierende DNA-Sequenz codiert wird.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen hybriden Partikeln enthält.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, der Mizellen enthält, die ein solches hybrides Partikel und Polysorbat enthalten und einen Impf-

2 8 5 <5 1

- 20 -

stoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Mizellen enthält.

Mit dem Ausdruck "funktionelle codierende DNA-Sequenz" ist eine codierende DNA-Sequenz gemeint, die nach Fusion in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz an der Zusammensetzung des HBsAg Partikels nicht beteiligt ist und auch nicht dabei

stört

10

Bevorzugte funktionelle codierende DNA-Sequenzen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf das das Hüllprotein von HTV oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon codierende Gen, besonders die DNA-Sequenz, die das Cy-Peptid, das Peptid 121 oder das Dreesman-Peptid, oder ein immunogenes Derivat davon codiert.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem eine HBV Pre Sl proteioncodierende Region verwendet wird, die für die folgende Aminosäuresequenz codiert:

-163

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG MfcC GIy Thr Asn Leu Sec VaI Pro Asn Pro Lau

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT Ala Phe GIy Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro lie Lys Asp His Trp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin VaI GIy VaI GIy AIa

- 21 -

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TCG AGC CCT CAG GCT CAG GIy He Leu GIy Trp Ser Pro Gin Ala GIn

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT GIy He Leu Thr Thr VaI Ser Thr He Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro AIa Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg GIn Pro Thr Pro He Ser Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin AIa

oder bei dem eine HVB Pre S2 proteincodierende Region oder eine HBV Pre S2-S proteincodierende Region verwendet wird, in der der Pre S2-Anteil für die folgende Aminosäuresequenz codiert:

-55 -50

Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-

-40 -30

Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Serser-

-20 Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser-

-10

Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn; 35

- 22 -

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein rekOÄibinanter DNA-Vektor verwendet wird, in dem eine solche Fre Sl-, Pre S2- oder Pre S2-S proteincodierende Region mit

einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist; eine 5

transformierte Wirtszelle, die einen solchen Vektor enthält; und ein Verfahren zur Herstellung einer solchen transformierten Zelle, das die Transformation einer Wirtszelle mit einem solchen Vektor umfaßt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein rekombinanter DNA-Vektor verwendet wird, in dem eine Pre Slfunktionelle DNA codierende Sequenz- Pre S2-S proteincodierende Sequenz oder ein immunogenes Derivat davon mit einer regulatorischen Region funktionel? verbunden ist; eine Hefe-Wirtszelle, die mit solch einem Vektor transformiert wird; ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirtes, das die Transformation einer Hefe-Wirtszelle mit solch einem Vektor umfaßt; ein Verfahren zur Herstellung

eines Proteins, das durch die Pre Sl-funktioneile DNA-codie-20

rende Sequenz- Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert ist, oder eines immunogenen Derivats davon; das Protein, das. durch solch eine Methode hergestellt wird; einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an einem solchen

Protein enthält; ein Partikel, das ein Polypeptid enthält, 25

welches durch die Pre Sl-funktionelle DNA-codierende Sequenz- Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert wird, oder ein immunogenes Derivat davon; ein Verfahren zu seiner Herstellung, einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Partikeln enthält, oine Mizelle, die ein solches Partikel und Polysorbat enthält und einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Mizellen enthält.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem eine Pre 35

Sl- Pre S2 proteincodierende Sequenz oder Pre Sl- Pre S2-S

² S 56 1

- 23 -

proteincüdierende Sequenz verwendet wird, von denen der Pre Sl- Pre S2-Bereich die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

PRE-Sl REGION -163

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met GIy Thr Asn Leu Sec VaI Pro Asn Pro Leu

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT Ala Phe GIy Ala Asn Set Asn Asn Pro Asp 15

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro lie Lye Asp His Trp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin VaI GIy VaI GIy AIa

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy lie Leu GIy Trp Ser Pro Gin Ala GIn

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT

GIy Ue Leu Thr Thr VaI Ser Thr lie Pro 30

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA

Pro Pro AIa Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA

Arg GIn Pro Thr Pro He Set Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC

Arg Asp ser His Pro Gin AIa

2 θ S <S f

- 24 -

PRE-S2 REGION -55 ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA Met Gin Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gin

GCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTG Ala Leu Gin Asp Pro Arg VaI Arg GIy Leu

TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA Tyr Phe Pro Ala GIy GIy Ser Ser Ser GIy

ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT Thr VaI Asn Pro AIa Pro Asn lie AIa Ser

CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG His He Ser Ser Ser Ser AIa Arg Thr GIy

GAC CCT GTG ACG AAC Asp Pro VaI Thr Asn

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein rekombinanter Vektor verwendet wird, in dem eine solche neue Pre Sl- Pre S2 oder Pre Sl- Pre Se-S proteincodierende Se-.

quenz mit einer Expressionskontrollsequenz funktionell verbunden ist; eine Wirtszelle, die mit solch einem Vektor transformiert ist; und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirtes, das die Transformation einer

Wirtszelle mit einem solchen Vektor umfa/3t. 30

2 8 5 6 ί 2

- 25 Folgende Aminosäure-Abkürzungen werden verwendet:

ASP	Aspartat	He	Isoleucin
Thr	Threonin	Leu	Leucin·
Sec	Serin	Ty c	Tyrosin'
GIu	Glutaminsäure	Phe	Phenylalanin
Pro	roLLn	His	Histidin
GIy	Glycin	Lys	Lysin
Ala	Alanin	Arg	Arginin
Cys	Cystein	Trp	Tryptophan
VaI	Valin	GIn	Glutamin'
Me c	Methionin	Asn	Asparagin
Kurze	Beschreibuna der	Figuren:
Fig. 1	ist eine Restriktionskarte	von pRITl0601.
Fig. 2	ist eine Restriktionskarte	von PRIT10616.
Fig. 3	ist eine Restriktionskarte	von PMC200.

Fig.	5
Fig.	6
Fig.	7
Fig.	8

Fig. 4 ist die Nucleotid-Sequenz eines Bereiches des 3300 Basenpaar großen Hefe Hindlll-Fragments, das in

pMC200 integriert ist und das die Restriktionsstellen Hindi, BgIII und EcoRI besitzt, zeigt die Herstellung von pRIT10671 und pRIT10673. zeigt die Herstellung von pRIT10749.

"ⁱ- ⁿ zeigt die Herstellung von pRITlO761 und pRIT10764. zeigt die Herstellung von pRIT10167 (Beispiel 1), PRIT10158 und pRit10162 (Beispiel 3); pRIT10158, pRIT10677 und pRIT10909 (Beispiel 4); pRIT10911 (Beispiel 5); pRIT10679, pRIT10903, pRIT10914 (Beispiel 6); pRIT12211, pRIT12209 und pRIT12230 (Bei

spiel 7); und pRIT12288 und pRIT12322 (Beispiel 8).

Fig. 9 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT10172.

Fig. 10 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT12290.

Fig. 11 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT12322, die die DNA-Bereiche zeigt, die von pRIT12230 und pRIT12288 stammen.

- 26 -

Fig. 12 ist eine Restriktionskarte von pRIT12309.

Fig. 13 zeigt die Herstellung von pRIT12314 und pRIT12544.

Fig. 14 ist eine Restriktionskarte von pRIT12662.

Fig. 15 zeigt die Herstellung von pRIT12660.

Fig. 16 zeigt die Herstellung von pRIT12845 (a,b,c,d,e,f).

Fig. 17 zeigt die Herstellung von pRIT12662.

Fig. 18 zeigt die in pRIT12792 enthaltene Pre Sl- Pre S2

DNA-codierende Sequenz.

Fig. 19 zeigt eine scheu.itische Restriktionskarte der codierenden Sequenz des HIV Hüllproteins.

Fig. 20 zeigt die Konstruktion von pRIT12893.

Fig. 21 zeigt die Konstruktion von pRIT12897.

Fig. 22 zeigt die Konstruktion von pRIT12899.

Fig. 23 zeigt die Konstruktion von pRITX.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Expression von HBsAg in Hefe

Mit dem Ausdruck "regulatorische Region", wie hier verwendet, ist eine DNA-Sequenz gemeint, die notwendige oder wünschenswerte Sequenzen für die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz enthält. Solche regulatorischen Rogionen werden in der Regel angrenzend an das 5'-Ende der codierenden Sequenz, die exprimiert werden soll, gesetzt. Vorzugsweise wird eine weitere Region der Hefe DNA, die ein Terminationssignal für die Transkription enthält, unmittelbar an das 3'-Ende der codierenden Region, die exprimiert werden soll, gesetzt, um die Termination der Transkription _ zu bewirken.

Mit dem Ausdruck "HBsAg", wie hier gebraucht, ist ein Antigen gemeint, das Proteine umfaßt, die durch die S-proteincodierende Sequenz des HBV-Genoms codiert werden. Ein solches HBsAg ist strukturell ähnlich zu natürlichem HBsAg oder hat im wesentlichen die gleichen antigenen Determinanten wie das natürliche - HBsAg, die durch die S-proteincodierende Sequenz

2854 ί 2

- 27 -

codiert werden. Ein solches HBsAg kann eine Immunantwort stimulieren, die spezifisch erkennt und mit natürlichem HBsAg reagiert. Ein solches HBsAg wird auch spezifisch durch Anti-HBsAg-Antikörper erkannt

5

Die HBsAg codierende Sequenz kann aus der DNA von Dane-Partikeln aus dem Serum von infizierten Menschen isoliert werden, indem der Einzelstrangbereich der DNA mit einer DNA-Polymerase,vorzugsweise der endogenen Polymerase, zum Doppelstrang gemacht wird und dieser anschließend mit einer Restriktionsendonuclease geschnitten wird. Die Wahl der Endonuclease hängt teilweise von den einzelnen Dane-Partikeln ab. Beispielsweise kann die HBsAg-codierende Sequenz der HBV DNA bestimmter Dane-Partikel des adw Serotyps durch ein einzelnes BamHI-Fragment isoliert werden; die HBsAg-codierende Sequenz der HBV DNA bestimmter Dane-Partikel des ayw Serotyps kann durch ein Hhal-Fragment isoliert werden. HBV DNA von Dane-Partikel des gleichen Serotyps können auch unterschiedliche Restriktionsmuster aufweisen.

Die Spaltung von DNA

Die Herstellung von DNA-Fragmenten, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Ligierung von solchen Fragmenten zu rekombinanten DNA-Molekülen und die Insertion solcher rekombinanter DNA-Moleküle in Mikroorganismen wird in an sich bekannter Weise durchgeführt; vgl. die vorstehenden oder nachfolgenden a.Leraturzitate. Bedingungen werden gewählt,

um die Denaturierung der DNA und der Enzyme zu verhindern 30

Beispielsweise wird der pH-Wert auf einen Bereich von 7 bis 11 eingestellt und die Temperatur unter 60⁰C gehalten. Vorzugsweise wird die Restriktion der DNA bei einer Temperatur von 30 bis 4O⁰C und die Ligierung bei 0 bis 10⁰C durchgeführt. Verwendete Restriktionsenzyme und Ligasen sind handelsüblieh und werden nach Vorschrift verwendet. Die T4 DNA-Ligase ist die bevorzugte Ligase.

285* f 2

- 28 -

Die verschiedenen Fragmente und die endgültigen Konstruktionen können in üblicher Weise miteinander verbunden werden.

In vielen Fällen wurden Gene isoliert,durch Restriktionsenzyme kartiert und auch sequenziert. Zu diesem Zweck kann man die interessierende Sequenz, wie die HBsAg-Sequenz, durch Restriktion des Gens selektionieren und, wenn nötig, weiter manipulieren, wie durch Bal31 Verdauung, in vitro Mutagenese, Primer-vermittelte Reparatur oder ähnliches, um ein Fragment gewünschter Größe herzustellen, das die gewünschte Sequenz enthält und geeignete Enden besitzt. Linker und Anschlußfragmente können benutzt werden, um Sequenzen miteinander zu verbinden und auch verloren gegangene Sequenzen zu ersetzen, wenn innerhalb der interessierenden Region eine Restriktionsstelle verwendet wurde. Die verschiedenen Fragmente, die isoliert werden, können durch Elektrophorese gereinigt werden, elektroeluiert, mit anderen Sequenzen Iigiert, kloniert, wieder isoliert und weiter manipuliert werden

20

Die Verwendung von regulatorischen Regionen zur Kontrolle der Transkription des interessierenden Struktur-Gens, wie der HBsAg-Sequenz, erlaubt es, nachdem die Wirtszellen zu einer hohen Dichte gewachsen sind, während dessen das Strukturgen gar nicht oder nur wenig exprimiert wurde, durch Änderung der umgebenden Bedingungen z.B. des Nährstoffes, der Temperatur etc., die Expression des Strukturgens zu induzieren.

Beispielsweise kann man mit der GAL4 regulatorischen Region die Hefezellen in einem Vollmedium mit einer Kombination aus Glycerin und Milchsäure zu einer hohen Dichte, nämlich der mittleren oder späten log-Phase, wachsen lassen und dann die Kohlenstoffquelle ändern und Galactose anbieten. Mit der PHO5 regulatorischen Region kann man die Zellen in einem" Medium mit einer hohen Phosphatkonzentration von etwa 7 mM KH₂PO₄ wachsen lassen, sie dann ernten und in einem Medium,

2850 ί 2

- 29 -

das phosphatfrei ist, resuspendieren, um eine Depression und Expression zu bewirken. Bei Temperatursensitivität könnte man die Zellen bei 25 bis 37"C wachsen lassen und dann die Temperatur passend um 5 bis 20⁰C ändern. Die Wirtszellen weisen dann das mxt der regulatorischen Region verbundene Regulationssystem auf.

Die Fusion der HBsAg-Sequenz mit der regulatorischen Region kann durch Verwendung eines Zwischenvektors erreicht werden Alternativ kann die HBsAg-Sequenz aber auch direkt in einen Vektor integriert werden, der die regulatorische Region enthält. Ein Vektor ist eine DNA, die das DMA-Fragment der Erfindung tragen und beibehalten kann, beispielsweise ein Phage oder ein Plasmid. Techniken zur Klonierung von DNA-

Fragmenten in Phagen sind beispielsweise aus Charnay et al

Nature. Bd. 286 (1980), 893 - 895, und der GB-Patentanmeldung 2 034 323 bekannt. Die HBsAg-Sequenz wird vorzugsweise so mit der regulatorischen Region verbunden, daß nach Expression der HBsAg-Sequenz ein HBsAg entsteht, das frei von

fremden Aminosäureresten ist.

In einer Ausführungsform der Erfindung wurde die HBsAgcodierende Sequenz zusammen mit 42 Codons der für das HBsAg Vorläufer (PreS-S) Protein codierenden DNA in Ablesephase mit dem 18. Codon der für das Hefe OCT-Protein codierenden Sequenz Ugiert, die unter der Kontrolle des arg« Promoters steht. Dieses Konstrukt ergibt ein hybrides Partikel, das ein HBsAg-Protein enthält, das neben den 226 Aminosäuren des S-

Proteins zusätzlich 60 N-terminale Aminosäuren besitzt. 30

Ein Beispiel für eine regulatorische Region stammt von dem Hefe arg'-Gen, das für die Ornithin-Carbamoyl-Transferase (OCT) codiert. Die arg* regulatorische Region ist verantwortlieh für spezifische und allgemeine Kontrollmechanismen. Aus Crabeel et al., Proc. Natl. Ac*d. Sei. USA, Bd. 78 (1981), 6026,ist die Klonierung dieser regulatorischen Re-

- 30 -

gion in dem Plasmid pYeura'arg' _{in E}. _CQli ^^^ sxnd Stämme von S. ceri_Vi_sia_e! in _{denen die ArgininD1Q}_ synthese derepremiert ist, beispielsweise der Stamm 1c1697d.

Dxe Verwendung solcher Stämme führt durch den arg'-Promoter zu exner erhöhten Expressxon xm Vergleich zu dem Stamm DC₅ Andere nützlxche regulatorxsche Regionen stammen von Hefe ' Genen, deren Produkte an der Glykolyse beteiligt sind box soxelswexse von Genen, die für Enolase, Aldolase, Phosphcglyceratkxnase und Glyerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codieren; von dem Hefe-Alkohol-Dehydrogenase-Gen; und im allgemeinen von Genen, die am katabolischen Stoffwechsel beteiligt sind, wie das Arginase-Gen.

Ein bevorzugter Vektor zur Klonierung des fusionierten DNA-Fragments in Hefe ist das Plasmid YEpU, das in E. coli und S. cerevisiae repliziert und stabil ist und daher als Shuttle-Vektor bezeichnet wird. Mehrere andere Hefe-Vektoren sxnd bekannt und erhältlich. Die HBsAg-Sequenz und die regulatorxsche Region können in einem Hefe-Vektor nacheinander oder gleichzeitig inseriert werden. Die Transformation von Hefen mit Plasmid-Vektoren, die hefespezifische autonom replizierende Sequenzen enthalten, führt normalerweise dazu, daß das DNA-Molekül der Erfindung wie ein Plasmid extra chromosomal repliziert wird. Solche Replikons sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Transformation mit Plasmxd-Vektoren, die keine funktioneilen Hefe-Replikons enthalten fuhrt zur Integration des DNA-Moleküls in das Hefe-Genom. '

impfstoffe für den Menschen zum Schutz vor HBV-Infektion die HBSAg enthalten, das gemäß der Erfindung in Hefe produziert wurde und einen geeigneten Carrier besitzen, können nach bekannten Methoden hergestellt „erden. Die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat i-t wünschenswert. Das so produzierte HBsAg kann auch mit änderen immunogenen Substanzen kombiniert werden, um Kombinations-Impfstoffe herzustellen. Der HBV-Impfstoff oder der Kombinations-Impfstoff kann beispielsweise subcutan, intravenös oder xntramuskulär verabreicht werden.

SU 2 '

- 31 -

Expression eines DNA-Moleküls, das eine funktioneile DNA-Sequenz enthält, die in Ablese'phase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz

fusioniert ist

Diese Erfindung betrifft auch ein rekornbinantes DNA-Molekül, das eine funktioneile DNA-Sequenz enthält, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre .',2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist. Die Bezeichnung "codierende Sequenz" oder "codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck "funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die

die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immunogenität 15

beibehält. Solche funktioneilen Derivate können durch die übliche ortsspezifische Mutagenese hergestellt werden. Aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, sind ortspezifische Mutagenese-Techniken bekannt. Eine solche Fusion

kann am N-Terminus der Pre S2-Region oder an irgendeinem 20

Punkt innerhalb der Pre S2-Region stattfinden. Es gibt vier Arten von Fusionen, nämlich am 5'-Terminus der gesamten Pre S2-Renion, an irgendeinem Punkt innerhalb der Pre S2-Region, so daß die Pre S2-DNA die funktionelle DNA-Sequenz

au beiden Seiten flankiert, an dem 5 '-terminalen Ende einer 25

verkürzten Pre S2-Region oder am 5'-Terminus der S-proteincodiertnden Region, so daQ die Fusion keine Pre S2-DNA enthält. Verschiedene Pre S2-S proteincodierenden Sequenzen sind bekannt und können nach bekannten Methoden hergestellt

und isoliert werden (j/gl. die oben zitierte Literatur]. In

einer Ausführungsform der Erfindung wurde die ARG3 regulatorische Rügion zusairmen mit \ 8 Codons der für das Hefe-OCT-Protein codierenden DNA in Ablesephase ndt einer verkürzten Pre S2-S proteincodierenden Sequenz, fusioniert, die dann 42 Codons der Pre-S2-S proteincodierenden Sequenz zusammen mit der korn-

- 32 -

pletten S-proteincodierenden Sequenz enthält. Bevorzugte funktioneile DNA-Sequenzen sind das Gen für das Hüllprotein von HIV oder für ein beliebiges immunogenes Derivat davon, besonders die das C₇-Peptid, das Peptid 121 oder das Drees-'

man Peptid oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon codierende Sequenz. Mit dem Ausdruck "immunogenes Derivat" ist eine Sequenz gemeint, die ein Derivat oder eine modifizierte Version einer natürlichen vorkommenden Sequenz ist, und die die schützende immunogene Aktivität der natürlichen Sequenz beibehält oder verstärkt. Solche immunogenen Derivate können nach üblichen Methoden hergestellt werden. Der Ausdruck "Pre S2-, Pre Sl- oder die gesamte ?re Sl- Pre S2-S proteincodierende Sequenz", wie hier verwendet, umfa/Jt ein beliebiges

immunogenes Derivat davon

15

Ein DNA-Molekül, in dem die codierende Sequenz von HIV oder eine beliebige funktioneile DNA-Sequenz in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S protein-

codierenc'en Sequenz fusioniert ist, kam nach bekannten Me-20

thoden hergestellt werden, wie durch Ligierung der codierenden Sequenz von HIV oder einer anderen beliebigen funktioneilen DNA-Sequenz in Ablesephase mit einem beliebigen Coden der für 55 Aminosäure codierenden Pre S2-codierenden Region aus einer Pre S2-S proteincodierenden Sequenz.

Vorzugsweise verbleibt nach Ligierung mit der codierenden Sequenz von HIV oder einer anderen funktionellen DNA-Sequenz ein genügend großer Teil der Pre S2-codierenden Sequenz, um

das HIV-Protein oder ein beliebiges anderes funktionelles 30

Protein auf der HBsAg-Partikel-Oberfläche optimal zu präsentieren. Ein genügend großer Teil der Pre S2-Region sollte nämlich verbleiben, so da/3 das durch die Pre S2-Region codierte Polypeptid als Brücke zwischen dem durch die funktio-

nelle DNA-Sequenz codierten Produkt und der HBsAg-Partikel-35

Oberfläche fungieren kann. Beispielsweise ist aus Milich et

2 8 s if 2

- 33 -

al., Science 228 (1985), 1195 -1199, bekannt, da/3 die 26 aminotenninalen Aminosäuren der Pre S2-codierenden Sequenz eine dominante Antikörperbindungsstelle auf der Pre S2-Region darstellen. Wenn es gewünscht ist, ein hybrides Partikel herzustellen, das die Epitope der Pre S2 und HIV bzw. einer anderen funktioneilen DNA-Sequenz enthält oder präsentiert, sollte man vorzugsweise die codierende Sequenz von HIV oder eine andere beliebige funktioneile DNA-Sequenz an einem Punkt innerhalb der Pre S2-codierenden Region inserieren, der die Herstellung eines hybriden Partikels erlaubt, das die Epitope von Pre S2 und HIV bzw. von einer anderen' funktionellen DNA-Sequenz enthält oder präsentiert.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete rekombinante Vektor enthält das rekombinante DNA-Molekül (nämlich eine funktioneile DNA-Sequenz, die in Ablesephase mit einem'Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S-proteinraxiierenden Sequenz fusioniert ist), funktionell verbunden mit einer regulatorischen Region. Ein solcher Vektor kann zusätzlich auch ein funktionelles Hefe-Replikon besitzen. Mit den Ausdruck "Replikon" ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die zur extrachromosomalen Stabilität eines solchen rekombinanten Vektors in einem Hefe-Wirtsorganismus beiträgt. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck "regulatorische Region" ist eine beliebige DNA-Region gemeint, die die Transkription und Translation der zu exprimierenden DNA-Sequenz reguliert. Solche regulafc^rischt». Regionen sind ebenfalls bekannt.

Solch ein Vektor kann nach üblichen Methoden hergestellt werden, wie durch die Inserierung des DNA-Moleküls der Erfindung in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon einer regulatorischen Region enthält. Die Inserierung

erfolgt in solcher Weise, daß das DNA-Molekül mit solch einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist. Das DNA-Mole-

5*12

- 34 -

kül wird vorzugsweise in einen Vektor ligiert, der zur Expression in der Hefegattung Saccharomyces befähigt ist.

Die Erfindung betrifft auch eine durch einen solchen rekombinanten Vektor transformierte Hefe-Wirtszel.le und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirtes, das die Transformierung einer Hefe-Wirtszelle mit dem rekombinanten Vektor umfaßt. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise durchgeführt. Geeignete Hefezellen sind jene der Gattung Saccharomyces, wobei die Zellen der Art Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces carlsbergensis besonders geeignet sind.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden HBsAg-Protein enthaltendenPartikels, das das Produkt der funktioneilen DNA-Sequenz enthält oder'präsentiert. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten Hefe-Wirtszellen in einem geeigneten Kulturmedium und die Isolierung des Partikels aus einem Zell-Lysat oder Extrakt dieser Wirtszellen. Mit dem

Ausdruck "präsentiert oder enthält" ist gemeint, daß das durch die funktionell DNA-Sequenz codierte Protein in dem hybriden HBsAg-Protein enthaltenden Partikel so enthalten ist, daß es eine Immunantwort stimulieren kann. Gewunschtenfalls wird die Präsentation des durch die funktionell DNA-Sequenz codierten Proteins nicht die immunogene Aktivität der HBsAg-Epitope stören, wodurch ein bivalenter Impfstoff erhalten wird. Besonders bevorzugt wird das durch die funktioneile DNA-Sequenz codierte Protein auf einem HBsAg-Partikel in solcher Weise präsentiert, daß entweder die maximale Anzahl von Epitopen des durch die funktionale DNA-Sequenz codierten Proteins oder die maximale Anzahl von Epitopen des durch die funktionale DNA-Sequenz codierten Proteins und des HBsAg-Proteins wie angemessen exponiert wird. Mit dem Ausdruck "geeignetes Kulturmedium" ist ein Medium gemeint, das das Wachstum des

2 8 5*12

- 35 -

transformierten Wirts ermöglicht und es einem solchen Wirt ermöglicht, das Produkt des hybriden DNA-Fragments, das in dem zur Transformation verwendeten Vektors enthalten ist, in wiederholbarer Menge zu exprimieren. Dieses hybride DNA-Fragment ist ein Fusionsprodukt aus der funktioneilen DNA-Sequenz und der Pre S2-S proteincodierenden Sequenz. Einem Fachmann ist es bekannt, daß das geeignete Kulturmedium abhängig von der verwendeten Wirtszelle ist. Die Isolierung des hybriden Partikels der Erfindung aus einem Zell-Lysat oder Extrakt einer solchen Wirtszelle kann durch übliche Protein-Isolierungstechniken durchgeführt werden.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der die hybriden Partikel dieser Erfindung enthält. Ein solcher Irnprstoff wird eine zum Immunschutz notwendige Menge an hybriden Partikel der Erfindung enthalten und ist nach üblichen Methoden herstellbar. Mit dem Ausdruck "Immunschutz" ist gemeint, daß die hybriden Partikel dieser Erfindung in ausreichender Menge verabreicht werden, so daß eine ausreichende Antikörperantwort gegen das Agens erzielt wird, die zum Schutz beiträgt und keine ernsten Nebenwirkungen hat. Vorzugsweise enthält der Impfstoff der Erfindung die Mizellen der Erfindung, nämlich Mizellen, die das Partikel der Erfindung und Polysorbat enthalten. Die bevorzugte Menge an Polysorbat in solch einer Mizelle ist 5 bis 50 ug Polysorbat pro 100 ug Protein. Die Mizelle kann nach dem Verfahren hergestellt werden, das in der EP-A 0 199 698 beschrieben ist.

In dem Impfstoff der Erfindung kann eine wäßrige Lösung der hybriden Partikel der Erfindung vorzugsweise mit einem physiologischen pH direkt verwendet werden. Alternativ kann das Partikel mit einem beliebigen der bekannten Adjuvantien aufgenommen werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

- 36 -

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA,' 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen generell bekannt.

Aus der US-Patentschrift 4 235 877 ist beispielsweise die Einkapselung in Liposomen bekannt.

Die Menge des hybriden Partikels der Erfindung ist in jeder Impfstoffdosis auf eine Menge beschränkt, die in typischen Impfstoffen eine zum Immunschutz notwendige Antwort induziert, ohne bedenkliche Nebeneffekte zu haben. Eine solche Menge hängt davon ab, welches spezifische Immunogen verwendet wird und ob ein Adjuvans beigegeben ist. Im allgemeinen wird erwartet, daß jede Dosis 1 bis 1000 ug Protein, vorzugsweise 1 bis 200 ug Protein, enthält. Eine optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen ermittelt werden, zu denen die Beobachtung der Antikörpertiter und anderer Reaktionen im Patienten gehört. Nach einer ersten Impfung erhalten die Patienten vorzugsweise nach vier Wochen eine weitere Impfstoffverabreichung, der alle sechs Monate eine weitere folgt, solange ein Infektionsrisiko besteht.

Die Immunantwort auf das hybride Partikel der Erfindung kann durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, erhöht werden.

Neue Pre S2 und Pre S2-S proteincodierende Seguenzen

Die neuen HBV Pre S2 und Pre S2-S proteincodierenden Sequenzen der Erfindung stammen von dem HBV adw Subtyp und wurden au3 dem Plasmid pRIT10616 isoliert. Der Ausdruck

"codierende Sequenz" oder "codierende Region", wie hier ver-35

wendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck "funktionelles Derivat" ist eine co-

- 37 -

dierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die wenn dienlich die Partikelbildung nicht stören und/oder die Immunogenität beibehalten, wenn es gewünscht ist. Solche funktioneilen Derivate können durch ortsspezifische Mutagenese, wie z.B. von Botstein et al., Science, 229. (1985), ¹¹⁹³ - ^I201' beschrieben, erhalten werden. Solche Pre S2 und Pre S2-S proteincodierenden Sequenzen können durch übliche rekombinante DNA-Verfahren aus dem Plasmid _PRIT10616 erhalten werden. Dieses Plasmid wurde (in _E. coil K12 Stamm C600) gemäß des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 2. Juni 1982 unter ATCC 38131 hinterlegt. Die Pre S2-Region einer solchen neuen proteincodierenden Sequenz enthält die folgenden Aminosäuren:

-55 -50

Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-

-40 _30

Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pco-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-

-20 Ser-Gly-Thr-Val-Aen-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-

-10 Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-rtbii.

Eine solche Region kann auch durch synthetische Oligonucleotide in üblicher Weise hergestellt werden. Ein bevorzugtes funktionelles Derivat der Pre S2-S-codierendPn Sequenz der Erfindung ist

eines, in dem die Aminosäure-Alanin(GCT) an der Position -45 durch die ortsspezifische Mutagenese durch die Aminosäure Threonin (ACT) ausgetauscht wurde. Ein solches funktionelles Derivat wird in Saccharomyces cerevisiae zweimal stärker exprimiert als die unmodifizierte codierende Sequenz der Erfindung.

2 8 5 η

- 38 Neue Pre SI oroteincodierende

Die neue HBV Pre si proteincodierende Sequenz stammt von einem HBV adw Subtyp und kann aus dem Pias mid PRITIO₆₁₆ isoliert werden. Die Bezeichnung "codierende Sequenz" oder "codierende Region", „_ie hier verwendet umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon Mit dem Ausdruck "funktionelles Derivat" ist eine codierende Se quenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die wenn ge wünscht, die Partikelbildung-nicht stört und/oder die immunogenität beibehält. Solche "funktioneile Derivate" können durch übliche ortsspezifische Mutagenese, wie aus Botstein et al., Science, 229 (I₉B₅), I₁₉₃ - ₁₂01, bekannt, hergestellt werden. Eine solche Pre si proteincodierende Sequenz kann durch übliche rekombinante DNA-Techniken aus dem Plasmid PRIT10616 erhalten werden. Dieses Plasmid wurde (in E. coli K12 Stamm C600) gemäß dem Budapester Vertrag be! der American Type Culture Collection, Rockville Maryland, am 2. Juni 1982 unter ATCC 38131 hinterlegt. Die Pre Sei-Region codiert für die folgende Aminosäuresequenz:

-163

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met GIy Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu 25

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT Ala Phe GIy Ala Αβη Sec Asn Asn Pro Asp

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pco lie Lye Asp His Trp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Αβη Gin Val GIy Val GIy Ala

- 39 -

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy lie Leu GIy Tcp Sec Pco Gin Ala Gin

/2

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT

GIy lie Leu Thr Thr VaI Ser Thr He Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA

Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg Gin Pro Thr Pro lie Ser Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin Ala

Eine solche Region kann auch durch die übliche Synthese von Oligonucleotiden erhalten werden.

Neue Pre SI- Pre S2-S proteincodierende Sequenz

Die Erfindung betrifft auch eine HBV Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz, von der der Pre S1- Pre S2-Teil die folgende Aminosäuresequenz enthält:

PRE-Sl REGION -163

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met GIy Tnr Asn Leu Ser VaI Pro Asn Pro Leu

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro

' £ ·^: ί 1

- 40 -

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT Ala Phe GIy Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro He Lys Asp His Trp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin VaI GIy VaI GIy Ala

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy lie Leu GIy Trp Ser Pro Gin Ala Gin

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA A' V ATT CCT GIy lie Leu Thr Thr VaI Ser Thr He Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro Ala Ser Thr Aen Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg Gin Pro Thr Pro He Ser Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC

Arg Αβρ Ser Hie Pro Gin Ala PRE-S2 REGION

-55

ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA Met Gin Trp Asn Ser Thr Ala Phe Hia Gin

GCT CVG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTG Ala Leu Gin Aap Pro Arg VaI Arg GIy Leu TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA Tyr Phe Pro Ala GIy GIy Ser Ser Ser GIy

- 41 -

ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT Thr VaI Asn Pro Ala Pro Asn Lie Ala Ser

CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGGHie lie Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr GIy

GAC CCT GTG ACG AAC Aap Pro VaI Thr Asn

Die neue HBV Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz der

Erfindung stammt von einem HBV adw Subtyp und wurde aus dem Plasmid pRIT10616 isoliert. Dieses Plasmid ist wie oben angegeben bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter ATCC 38131 hinterlegt. Der Ausdruck 5

"codierende Sequenz" oder "codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck "funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die,

wenn es gewünscht ist, die Partikelbildung nicht stört und/ 20

oder die Immunogenität beibehält. Solche funktioneilen Derivate können durch die übliche ortsspezifische Mutage.ese, wie beispielsweise von Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193 - 1201,bekannt, hergestellt werden.

Expression des Pre Sl- Pre S2-S Proteins in HPf^

Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten DNA-Vektor, in dem die gesamte Pre Sl- Pre S2-S proteincodierende Sequenz an eine Expressions-Kontrollsequenz funktionell gebunden ist. Ein solcher Vektor kann zusätzlich ein Replikon enthalten, das von dem Wirt, in dem es verwendet wird, abhängig ist. Vorz gsweise wird die Pre Sl- Pre S2-S proteincodierende Sequenz verwendet.

Mit dem Ausdruck "Replikon" ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die einen solchen rekombinanten Vektor in einem Hefe-

8 5 0 1 2

- 42 -

Wirtsorganismus extrachromosomal stabil hält. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck "regulatorische Region" ist eine beliebige DNA-Sequenz gemeint, die eine Promotor-Region und andere Sequenzen enthält, die wichtig für die Regulierung der Transkription einer codierenden Sequenz sind. Solche regulatorischen Regionen sind bekannt. Ein solcher Vektor kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wie durch Inserierung einer Pre Sl- Pre S2-S proteincodierenden Sequenz in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon und eine regulatorische Region enthält. Die

Inserierung erfolgt in solcher Weise, daß das DNA-Molekül an die reg llatorische Region funktionell gebunden ist. Das DNA-Molekül wird vorzugsweise in einen Vektor ligiert, der in Hefen der Gattung Saccharomyces exprimiert wird. Vorzugs-

weise ist die in dem Vektor enthaltene Pre Sl- Pre S2-S proteincodierende Sequenz die Pre Sl- Pre S2-S proteincodierende Sequenz. Solche Vektoren sind nützlich für die Insertion von funktionellen DNA-Sequenzen, um die resultierende

Pre Sl-funktionelle DNA-Sequenz Pre S2-S proteincodierende 20

Sequenz zu exprimieren. Deshalb betrifft diese Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, in dem eine funktioneile DNA-Sequenz in Ablesephase mit der Pre Sl-Region aus der Pre Sl-Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist und einen

ein solches rekombinantes DNA-Molekül enthaltenden Vektor. 25

Die Fusion kann so erfolgen, da/9 die funktioneile DNA-Sequenz entweder eine Insertion in der Pre Sl-Region bildet, oder einen Teil der Pre S2-Region ersetzt; vgl. unten, Beispiel 21A.

Mit dem Ausdruck "funktionelle DNA-Sequenz" ist eine DNA-Sequenz gemeint, die, wenn sie in Ablesephase mit der Pre Sl-Region aus der Pre Sl- Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist, nicht an der Zusammensetzung des HBsAg-Partikel beteiligt ist noch die Partikelbildung stört. Bevorzugte funktionelle DNA-Sequenzen umfassen die das HIV-Hüllprotein oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon codie-

285* ί 2

- 43 -

rende Sequenz, besonders die codierende Sequenz des C₇-Peptids, des Peptides 121 oder des-Dreesman Peptides oder codierende Sequenzen von interessierenden Peptiden anderer Viren, besonders jene von Hüllproteinen.

Die Erfindui,/ betrifft auch eine Hefe-Wirtszelle, die mit einem solchen rekombinanten Vektor transformiert ist und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirts. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise ausgeführt. Bevorzugte Hefezellen gehören der Gattung Saccharomyces und besonders bevorzugte Zellen der Art Saccharomyces cerevisiae an.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch eine Pre Sl-funktionelle DNA-Sequenz-Pre S2-proteincodierende Sequenz codiert ist. Ein solches Verfahren umfa£c die Kultivierung der transformierten Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Proteins aus dem Kulturüberstand oder aus einem ZeIl-Ly-

²^ sat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Art der isolierung hängt von der Fähigkeit der Wirtszelle ab, solche Proteine zu sekretieren. Mit dem Ausdruck "geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und das Produkt einer Pre Sl-funktione.llen DNA-Sequenz-Pre S2- S-proteincodierenden Sequenz in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Die Isolierung des Pre Sl-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-Proteins aus einem Zell-Lysat oder dem Kulturüberstand eines solchen Wirtes wird nach üblichen Methoden durchgeführt. Das Protein, das nach dem Verfahren dieser Erfindung isoliert wird, kann glykosyliert sein, sofern die Wirtszelle die Fähigkeit zur Glykosylierung besitzt. Wenn ein nicht glykosyliertes Protein gewünscht ist, sollte das Protein dieser Erfindung durch Verwendung einer Wirtszelle, die nicht zur Glykosylierung befähigt ist, hergestellt werden. Alternativ könnte die proteincodierende Sequenz durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie bei-

1856 i 2

- 44 -

spielsweise aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193 1201, bekannt, verändert werden, bevor das Verfahren der Erfindung durchgeführt wird.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der eine zum Inununschutz notwendige Menge des Pre Sl-funktionelle DNA-Seguenz- Pre S2-S-Proteins enthält, die beide nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurden. Ein solcher Impfstoff

kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden. 10

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden Partikels, das ein Protein enthält, das durch eine Pre Sl-funktionelle DNA-Sequsnz- Pre S2-S-proteincodierende Sequenz codiert ist. Eine solche Methode umfa/Jt die Kultivierung der transformierten Hefe-Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Partikels aus dem Kulturuberstand oder aus einem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Art der Isolierung hängt von der Fähigkeit der Zellen ab, solche Partikel zu selektieren. Mit dem Ausdruck "geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und die Pre Slfunktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-proteincodierende Sequenz in Partikelform und in wiederholbarer Menge.expriraieren kann. Einem Fachmann ist es bekannt, da£ die geeigneten KuI-turmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängen. Die Isolierung des Partikels aus einem Kulturlysat oder dem Kulturuberstand solcher Wirtszellen wird nach üblichen Methoden ausgeführt.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der die Partikel der Erfindung enthält. Ein solcher Impfstoff enthält eine zum Immunschutz notwendige Menge der Partikel und wird in an sich bekannter Weise hergestellt. Der Impfstoff enthält vorzugsweise die Mizelle der Erfindung, nämlich eine Mizelle, die das Partikel der Erfindung und Polysorbat enthält. Die bevorzugte Menge von Polysor-

- 45 -

bat in einer solchen Mizelle ist 5 bis 50 ug Polysorbat pro 100 ug Protein. Die Mizelle kann nach dem in der EP-A ¹O 199 698 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Für den Impfstoff der Erfindung kann eine wäßrige Lösung des Pre Sl-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-Proteins oder des Partikels, die vorzugsweise einen physiologischen pH-Wert besitzt, direkt verwendet werden. Alternativ kann dem Proteinpartikel ein beliebiges Adjuvans beigemengt werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen bekannt. Aus der US-Patentschrift 4 235 877 ist die Einkapselung in Liposomen bekannt. Aus den US-Patentschriften 4 372 945 und 4 474 757 ist die Zusammensetzung von Proteinen zu Makromolekülen bekannt.

Das Pre Sl-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-Protein oder das Partikel liegt in jeder Impfdosis in einer Menge vor, die in typischen Impfstoffen einer zum Immunschutz notwendigen Antwort ohne bedeutende Nebenwirkungen führt. Eine solche Menge ist abhängig von dein verwendeten spezifischen immunogenen Stoff und auch davon, ob der Impfstoff ein Adjuvans enthält. Generell wird erwartet, da/3 jede Impf dosis 1 bis 1000 μg Protein, vorzugsweise 1 bis 200 ßq, enthält. Eine optimale Menqie für einen speziellen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen ermittelt werden, die die Beobachtung von Antikörpertiter und anderen Reaktionen in Patienten umfassen. Nach einer ersten Impfung wird dem Patienten vorzugsweise nach vier Wochen eine weitere Imfdosis verabreicht, der alle selchs Monate eine weitere folgt, solange

ein Infektionsrisiko besteht

35

2 θ 5 <5 \ 2

- 46 1

Die inununantwort gegen das Pre Sl-funktionelle DNA-Sequenz-

ein ^S2"^S:^PrOtein °^{der das Part}i^l wird durch die Verwendung exnes Ad_Duvans, wie Aluminiumhydroxid, verstärkt

Ausführunqsbeispiele

- Al.'.e Prozentangaben sind Gewichtsprozente und alle Tempe_ir raturen werden in ⁰C angegeben.

- Die Enzyme, die für die DNA-Manipulation verwendet werden, wurden von Bethesda Research Laboratories, New England Diolabs, und/oder Boehringer, bezogen und entsprechend der Vorschrift des Herstellers angewendet,

- Hefe-Wachstumsmedien: Selektivmedium: YNB (Hefestickstoffbase ohne Aminosäure (Difco Labs) 0,675 % (w/v) mit 2 % (w/v) Glucose).

- YEPD Medium: 1 56 (w/v) Hefeextrakt, 2 % (w/v) Pepton und 2 % (w/v) Glucose.

- Methoden zur Herstellung von rekombinante DNA-Molekül^en sind aus "Molecular Cloning", T. Marnatis et al., Cold Spring Harbor Lab. (1982) bekannt.

- PMSF: Phenylmethylsulphonylfluorid.

2 8 5 ^ ί 2

- 4 7 Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pro Liter): (pH 7,4) 8,0 g NaCl

0,2 g KCl

1,15g Na₂HPO₄

0,2 g KH₂PO₄

0,1 g CaCl-0,1 g MgCl₂ . 6H₃O

BSA: Rinderserumalbumin ^4370; Sigma) X-gal: S-Brom-^-chioroindoyl-ß-D-galactopyranosid, erhältlich bei Sigma Chemical Co., St. Lcuis, Missouri.

L-BROTH (pro Liter): 5 10 g Trypton

5 g NaCl

5 g Hefeextrakt

1 ml 0,1M MgSO₄

Nach Autoklavierung Zugabe von 5 ml einer sterilen Thiaminlösung (1 mg/ml). Für feste Medien Zugabe von 15 g Agar pro Liter.

Beispiel 1 Konstruktion des Plasmids pRIT10167

Das Ausgangsmaterial war das Plasmid p6y, das in pBR322 ein 2,1 kb großes Hindlll-Fragment der Hefe-DNA enthält, das für das TDH3-Gen codiert. pBR322 ist aus Bolivar et al., Gene, 2

QQ (1977), 95 - 113,bekannt. Das p6y Plasmid wurde konstruiert und charakterisiert von Musti et al., Gene, 25 (1983), 133, und von Dr. M. Rosenberg des National Institute of Health erhalten. Das Hindlll-Fragment wurde in ein pBR322 Derivat ohne EcoRI-Stelle umkloniert und es entstand das Plasmid pRIT10164 (ein nicht wesentlicher Schritt). Die folgenden Manipulationen wurden ausgeführt, um eine BamHI-Stelle an

2856 ί 2

- 48 -

dem G-Rest des ATG-Codons der TDH3-codierenden Sequenz einzuführen und ein Hindlll-BamHI DNA-Fragment mit TDH3 Promotoraktivität zu erhalten, in dem die TDH3-Sequenzen intakt und nicht durch die Manipulation verändert sind. Die wie oben beschrieben hergestellte DNA von pRIT10164 wurde durch zweimalige Cäsiumchlorid-Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation, wie im wesentlichen aus Kahn et al. (Methods in Enzymology, 68, 268, 1979) bekannt, gereinigt. 150 ug der pRIT10164 DNA wurden vollständig mit 75 Einheiten der Endonuclease Xbal verdaut, mit Phenol und Äther extrahiert, mit Äthanol präzipitiert und die DNA in 0,01 M Tromethamin-HCl-Puffer zu einer Konzentration von 1 ug pro μΐ aufgenommen. Proben von 20 ug dieser Xbal-gespaltenen DNA wurden mit der Nuclease Bal31 verdaut, um die 61 Basenpaare der DNA zwischen dem ATG-Codon und der Xbal-Stelle zu entfernen. Verdauungen mit Bal31 wurden bei 30⁰C für 1 bis 3 Minuten in einem Puffer mit pH 3,1, der 600 mM NaCl, 12 mM CaCl₂, 12 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 20 mM Tromethamin-HCl enthält, durchgeführt, wobei eine Einheit der Bal31-Nuclease pro 20 ug DNA in einem Reaktionsvolumen von 200 μΐ verwendet wurde.

Die Enzymreaktionen wurden gestoppt durch Zugabe von Äthylenbis(oxyäthylennitrilo)- tetraessigsäure(EGTA) bis zu einer Endkonzentration von 20 mM . Die Proben wurden mit gleichen Volumina Phenol und Kther extrahiert und mit Äthanol präzipitiert. Jede DNA-Probe wurde in 20 μΐ 10 mM Tromethamin-HCl-Puffer pH 7,5 resuspendiert. Das Ausmaß der Bal31-Verdauung wurde gemessen, indem etwa 2,5 ug einer jeden DNA-Probe mit der Endonuclease Hpal verdaut wurden und indem die Größe der Hpal-Xbal-Fragmente mit dem 335 Basenpaar großen Hpal-Xbal-Fragment von pRIT10164 verglichen wurde. Nach 2 Minuten Verdauung mit Bal31 waren etwa 41 bis 88 Nucleotide von dem Xbal-Hpal-Fragment von pRIT10164 entfernt.

Dieses Ergebnis zeigt an, daß eine ähnliche Anzahl von Basenpaaren von der anderen Xbal-Stelle zu dem ATG-Codon hin ent-

2850 ί 2

- 49 -

ferrit worden sind. 5 ug der nach der 2-minütigen Bal31 -Verdauung erhaltenen DNA wurden·mit der Endonuclease BamHI gespaltan, mit Phenol extrahiert und durch Äthanolpräzipitation gesammelt. Diese DNA wurde mit 5 Einheiten der T4 PoIymerase in Gegenwart von Desoxynucleotid-triphosphaten. behandelt, um Einzelstrangbereiche an den BamHI-und Bal31-Stellen aufzufüllen. Die DNA wurde mit Phenol extrahiert und durch Äthanolpräzipiⁱ:ation gesammelt. 2,3 ug dieser DNA wurden mit 5 Einheiten T4 DNA-Ligase behandelt . Die Hälfte des Ligationsansatzes wurde verwendet, um kompetente Zellen des E. coli Stammes K12 MM294, die nach dem Verfahren von Cohen et al., Froc. Natl. Acad. Sei. 69 (1972), 2110, hergestellt wurden, zu transformieren. 1 ml der transformierten E. coli Population wurde in 350 ml L-Broth mit 200 μ9/πι1 Antpicillin verdünnt und die gesamte Plasmid-DNA aus der resultierenden Kultur gereinigt.

80 ug dieser Plasmid-DNA, die eine Population von Plasmidmolekülen mit Bal31 induzierten Deletionen von etwa 40 bis 80 Basenpaaren enthält, wurde nacheinander mit 75 Einheiten der Endonuclease Hindlll und 96 Einheiten der Endonuclease BamHI verdaut, um DNA-Fragmente freizusetzen, in denen eine BamHI-Stelle nach den oben beschriebenen Behandlungen eingeführt wurde. Dies ist der Fall, wo die Bal31 Verdauung an einem G-Rest gestoppt hat. Diese geschnittene DNA wurde auf einem präparativen 1 ^igen Agarose-Gel aufgetrennt. Die gewünschten Hindlll-BamHI-Fragmente mit einer Größe von 1000 bis 1100 Basenpaaren wurden in zwei Stückchen aus dem Gel ausgeschnitten, wobei das eine eine DNA mit etwa 1070 Basenpaaren und das andere Gelstückchen eine DNA mit etwa 1030 Basenpaaren enthielt. Die DNA wurde aus den Agarose-Gelstückchen durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen und einer anschließenden Zentrifugation, bei der die Agarose sedimentiert wurde, erhalten. Der flüssige Überstand wurde durch einen Millipore GV Millex Filter gedrückt und die DNA durch zweimalige Athanolpräzipitationen gesammelt und

2856-/2

- 50 -

schließlich in 20 ul eines 0,01M Tromethamin-HCl-Puffers mit pH 7,5 resuspendiert.

Die Analyse der Agarosegelelektrophorese und der Vergleich mit einer Hindlll, Xbal-verdauten pRIT1064 DNA und mix: den Fragmenten einer Hindlll EcoRI-gespaltenen /\»Phagen-DNA zeigten, daß zwei getrennte Hindlll-BamHI-Fragmentpopulationen erhalten wurden. Die eine Fragmentpopulation entsprach einer Größe von etwa 1070 Basenpaaren und die andere einer Größe von etwa 10.30 Basenpaaren im Vergleich mit dem 1120 Basenpaar großen Hindlll-Xbal-Ausgangsfragment aus pRIT10164. Etwa 100 ng der 10.30 Basenpaam großen Hindlll BamHI-Fragmentpopulation wurde mit 200 ng des Plasmides pUC9 ligiert, das mit Hindlll und BamHI gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war (vgl. US-PS 4 264 731).

Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente Zellen des E. coli Stammes JM103 zu transformieren und auf Ampicillin-Resistenz zu selektionieren. Die Transformation des E. coli Stammes JM103 wurde nach dem von Cohen et al., a.a.O., beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Der Vektor pUC9 und der E. coli Stamm JM103 sind aus Vieira and Messing, Gene, 19 (1982), 259,bekannt und wurden von J. Messing (Universität von Minnesota) erhalten. Der pUC9-Vektor ist erhältlich von Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) und Pharmacia (Uppsala, Schweden). Der E. coli Stamm JM103 ist erhältlich von J. Messing (Universität von Minnesota). Ein anderer E. coli Stamm mit den Eigenschaften des E. coli Stammes JM103, nämlich der Stamm JM101, ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter ATTC 33876 hinterlegt und kann als Wirt ebenfalls verwendet werden. Etwa 400 ampicillinresistente Kolonien wurden pro ml erhalten und 98 Kolonien davon auf einem Medium, das X-gal enthielt, getestet. 95 davon waren weiß und zeigten die erfolgreiche Insertion eines fremden DNA-Fragments zwischen den Hindlll- und BamHI-Stellen des Vektors an.

2 8 5*12

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Plasmide einzelner transformierter Kolonien wurden nach Aniplifikation der Plasmide durch Zugabe von Spectinomycin (150 ug/ml) in das Kulturmedium im Labormaßstab präpariert (Birnboim and DoIy, Nucl. Acid Res., 7 (1979), 1513.

Die rekombinanten Plasmide wurden auf einem 7,5 %igen PoIyacrylamid-Gel nach einer Doppelverdauung mit Avail und BamHI analysiert und mit dem 450 Basenpaare großen AvailXbal-Fragment, das den Promotor und die N-terminale codierende Region von pRIT10164 enthält,, und mit den Hpall-Fragmenten der pBR322 DNA verglichen. In 35 von 36 Plasmiden wurde ein Avall-BamHI-Fragment gefunden, das Deletionen von 20 bis 90 Basenpaaren im Vergleich mit pRIT10164 besitzt. Drei Plasmide, die Deletionen von etwa 80 Basenpaaren (pRIT10166),

!5 50 Basenpaaren (pRIT10167-Fig. 8) und 45 Basenpaaren (pRIT10165) enthalten, wurden für weitere Tests ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde durch CsCl-Ä'thidium-Branid-Dichtegradien-r tenzentrifugation gereinigt und 25 ug jeweils mit EcoRI

32

verdaut. Die EcoRI-Enden wurden mit γ -P-ATP in einer Kinasereaktion markiert und die Nucleotidsequenz der Hindlll-EcoRI-Fragmente eines jeden Plasmids nach Maxam und Gilbert (Methods in Enzymology, 65 (1980), 499, bestimmt. Die Markierung und Sequenzierung von der EcoRI-Stelle aus im pUC9-Vektoranteil eines jeden rekombinanten Plasmids ist ein passendes Mittel, um die Sequenz an der angrenzenden BamHI-Stelle zu bestimmen, die das Ende der Deletion in dem TDH3 DNA-Fragment angibt. Diese Sequenzierungsanalyse zeigte, daß in dem Plasmid pRIT10166 die BamHI-Stelle an einem G-Rest in der 5'-nichttransiatierten Region 25 Basen-

OQ paare upstream des ATG-Codons wiederentstanden ist; in pRIT10165 ist die BamHI-Stelle an der zweiten Ba?,e des dritten Codons und in pRIT10167 an dem G das ATfj-Codons lokalisiert.

.-,c- Das Hindlll-BamHI-Fragment der TDH3 DNA in pRIT10167 ent-

hält alle notwendigen Sequenzen in unveränderter Form für

2 S 5 6 i 2

- 52 die TDH3-Promotoraktivität.

Beispiel 2 Konstruktion des Vektors pRIT10172

Das 1050 Basenpaare große Hindlll-BamHI TDH3 DNA-Fragment aus pRIT10167, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurde in den aus Broach et al. ,Gene, 8 (19 79), 121, bekannten Shuttle-Vektor YEpI3 umkloniert. Das Hindlll-BamHI TDH3 DNA-Fragment wurde zwischen die Hindlll-Stelle der zwei Mikron DNA des Vektors und der BamHI-Stelle ligiert und es entstand das rekombinante Plasmid pRIT12159. Die DNA von pRIT12159 wurde mit Xbal und BamHI gespalten und das erhaltene 1650 Basenpaare große Fragment anstelle eines ähnlichen Xbal-BamHI-Fragmentes, das den arg³-Promotor enthält,, in das Plasmid pRIT10774 ligiert. Das Plasmid pRIT10774 ist aus Cabezon et al., (Proc. Natl, Acad. Sei., USA 81 (1986), 6594 6598, bekannt. Dieses Plasmid, in dem die BamHI und Xhol-Stellen des Vektoranteils durch in vitro Manipulation deletiert sind, enthält das YEpI3-Replikon, ein 1470 Basenpaare großes Hindlll-BamHI-Fragment, das die arg³-Promotorregion besitzt, und ein 11 50 Basenpaare großes BamHI-Hindlll-Fragment, das die arg³-Transkriptions-Terminationsregion besitzt. Die Substitution des arg³-Promotorinserts von pRIT10774 durch das TDH3-Promotorinsert ergibt das Plasmid pRIT10172. Dieses Plasmid besitzt daher neben dem Signal für die Transkriptions-Termination auf dem 1150 Basenpaare großen BamHI-Hindlll arg³ DNA-Fragment eine einzelne BamHI-Stelle, die an dem ATG des TDH3-Prornotorinserts liegt.

Fremde DNA kann daher in diese Stelle kloniert werden. Ferner können die zwei DNA-Inserts,die über Hindlll-Stellen miteinander verbunden sind, als eine Expressiop.deinheit auf einem 2200 Basenpaare großen Hindlll-Fragment entnommen werden und in andere Vektoren inseriert werden. Fig. 9 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT10172.

285* t 2

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Beispiel 3 Herstellung des Plasmids pRIT12290

Ein 1 050 Basenpaare großes Hindlll-EcoRI-Fragment von pRIT10167 (Fig. 8), hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, das das Hindlll-BamHI TDH3-Promotorfragment und den BamHI-Smal-EcoRI-Teil des pUC9-Polylinkers besitzt, wurde zwischen die Hindlll- und EcoRI-Stellen eines pBR322-Derivates ligiert. Es entstand das rekombinante Plasmid pRIT12176. Das verwendete pBR322-Derivat besitzt eine Deletion der BamHI-Stelle, nachdem diese Stelle durch die T4 DNA-Polymerase aufgefüllt worden war.

Die Plasmid-DNA von pRIT10158 (Fig. 8), hergestellt gemäß Beispiel 4 (H, wurde mit EcoRI gespalten und mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um den EcoRI. Einzelstrangbereich aufzufüllen. Diese Präparation wurde ferner mit der Endonuclease CIaI verdaut. Eine weitere Probe der pRIT10158 DNA wurde mit den Endonucleasen CIaI und Haelll verdaut 'and ein 1150 Basenpaar großes Clal-Haelll-Fragment, das die Transkriptions-Terminationsregion des arg³-Gens besitzt, durch präparative Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelut.ion erhalten. Dieses Fragment wurde mit EcoRI gespaltener, T4 DNA-Polymerase behandelter und CIaI nachgespaltenei pRIT10158 DNA ligiert. Der Ligationsansatz wurde verwendet, um kompetente Zellen des E. coli Stammes MM294, die nach Cohen et al., a.a.O., hergestellt wurden, zu transformieren und dann auf Ampicillin-Resistenz zu selektionieren. Von den transformierten Kolonien wurde ein Plasmid isoliert, das als pRIT10162 identifiziert wurde, in dem das Clal-Haelll arg³ Transkriptions-Terminationsfragment in pRIT10158 zwischen die CIaI und die aufgefüllte EcoRI-Stelle inseriert wurde, und in dem die EcoRI-Stelle wieder hergestellt wurde. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT10162. Die Plasmid-DNA pRIT10162 wurde mit EcoRI und Pstl gespalten, mit ebenfalls EcoRI und Pstl gespaltener

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DNA von pRIT12176 gemischt und ligiert. Die Ligasemischung wurde verwendet, um Zellen des E. coli K12 Stammes MM294 nach dem Verfahren von Cohen et al., a.a.O., zu transformieren und auf Ampicillin-Resistenz zu selektionieren. Ein Plasmid, pRIT12208, wurde aus einer transformierten Kolonie erhalten, in dem das 4630 Basenpaare große EcoRI-Pstl-Fragment von pRIT12176 mit dem 1930 Basenpaare großen EcoRI-Pstl-Fragment von pRIT10162 ligiert worden war, und in dem die arg³-Transkriptions-Terminationsregion an der TDH3-Promotorregion angelagert ist. Die arg³ und TDH3-DNA-Regionen können durch Spaltung mit Hindlll in einem 2200 Basenpaare großen Fragment aus pRIT12208 erhalten werder.. Zum Erhalt der anderen Orientierung dieses Fragments hinsichtlich der Vektorsequenzen wurde das 2200 Basenpaare große Hindlll-Fragment von pRIT12208 in der Hindlll-Stelle eines pBR322-Derivates umkloniert. In diesem Plasmid-rDerivat waren die EcoRI- und BamHI-Stellen in Auffüllreaktionen durch die T4 DNA-Polymerase nacheinander deletiert worden. Das resultierende rekombinante Plasmid, in dem das 2200 Basenpaare gro-

2Q ße Hindlll-Fragment hinsichtlich der Vektorsequenz in anderer Orientierung vorliegt, im Vergleich zu pRIT12 208, wird als pRIT12290 identifiziert. Fig. 10 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT12290. In den Plasmiden pRIT12208 und pRIT12290 liegen zwischen den TDH3-Promotor und arg³-Transkriptions-

oc Terminationsfragmenten die einzig vorhandenen BamHI, Smal und Ecol-Restriktionsstellen, die sich gut zur Klonierung von DNA-Fragmenten, die codierende Sequenzen enthalten, eignen. Die Promotor- und Transkriptions-Terminationsregionen können zusammen in einem /.200 Basenpaare großen Hindlll-Frag-

_a0 ment als eine Expressionseinheit erhalten werden und in andere Vektoren transferiert werden.

Die BamHI-Stelle ist besonders gut geeignet, da sie am ATG-Codon des TDH3-Gens liegt und somit für die Fusion anderer Gene _₅ mit dem TDH3-Promotor verwendet werden kann, um diese in Hefe wie nachfolgend veranschaulicht zu exprimieren. Solche

28Si i 2 '

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fusionierten Sequenzen können aus pRIT12208 oder pRIT12290 durch Spaltung mit der Endonuclease Hindlll oder anderer Endonucleasen an den flankierenden Restriktionsstellen als eine Expressionseinheit erhalten und in Hefe-Shuttle-Vektoren inseriert werden.

Beispiel 4 Konstruktion der Plasmide pRIT10677, pRIT10909 und pRIT10158

a) PRIT10677

Ein 1 372 Basenpaare großes BamHI-Fragment von klonierter HBV-DNA wurde aus pRIT10616 (Harford et al. , Dev. Biol

Standard, 54 (1983), 125-130, ausgeschnitten und mit BamHI

jg gespaltener pBR327 DNA gemischt und ligiert. Dieses BamHI-Fragment enthält einen Teil der HBsAg-Vorläuferregion, die HBsAg-codierende Sequenz und 3'-nichtcodierende Sequenzen. Aus der Ligationsmischung wurde das Plasmid pRIT10677 ausgewählt, das das HBV BamHI-Fragment in der Orientierung

2Q enthält, daß die Xbal-Stelle der HBV DNA benachbart zur Sall-Stelle der pBR327-Vektor-DNA ist. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT10677.

b) PRIT10909

2Q Das 3300 Basenpaare große Hindlll-Fragment des aus Crabeel

M. et al. ,EMBO J., 2 (1983), 205-212, bekannten Flasmides pMC200 (ohne Beschränkung erhältlich bei American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter ATCC 39131) wurde in ein pBR322-Derivat umkloniert, in dem die

₃q EcoRI-Stelle in einer Auffüllreaktion durch die T4 DNA-Po-

lymerase deletiert wurde. Ein resultierendes rekombinantes Plasmid, pRITI0158,(Fig. 8), wurde ausgewählt, in dem die 3'-Region des a^g³-Gens des Hindlll-Fragments benachbart zu der CIaI-Stelle des modifizierten pBR322-Vektors liegt. Aus pRIT10158 wurde ein 1 150 Basenpaare großes Clal-Haelll-Fragment erhalten, das

die Transkriptions-Terminationsregion des arg³-Gens enthält.

2850 12

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Dieses 1150 Basenpaare große Fragment wurde mit der CIaI-und Hpal gespaltenen DNA des Plasmids pRIT10677 (wie vorstehend in Teil a) beschrieben) ligiert, um die arg³-Terminations-Region an der Hpal-Stelle, die downstream von der HBsAgcodierenden Region liegt, einzuführen. Das resultierende Plasmid ist pRIT10909. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT10909. Fig. 3 zeigt eine Restriktionskarte von pMC200.

Beispiel 5 Konstruktion der Plasmide pRIT10911 und pRIT10912

Die BamHI-Stelle in pRIT10167 (Beispiel 1) und die natürlich vorkommende BamHI-Stelle in der Vorläuferregion des HBsAg-Gens eines in pRIT10616 (Harford et al., Dev. Biol.

Standard, 54 (1983), 125-130, klonierten HBV-Virus des adw-Serotyps, liegen im gleichen Leserahmen vor. Dies ermöglichtdie Fusion mit dem TDH3-Promotorfragment, so daß eine fusionierte DNA-Sequenz entsteht, die ein ATG-Condon, 42 Codons der HBsAg-Precursor-Sequenz und dieser folgend

226 Codons der HBsAg-codierenden Sequenz besitzt. Das Ausgangsmaterial für das in dieser Fusion verwendete HBV DNA-Fragment war das Plasmid pRIT10909 (vgl. vorstehend, Beispiel 4, Teil b)). Dieses Plasmid enthält ein 935 Basenpaare <jroßes BamHI-Hpal-Insert, das einen Teil der codierenden Region der HBsAg-Vorläuferregion, die vollständige HBsAg-codierende Sequenz und 128 Basenpaare der 3 -nichttranslatierten DNA enthält, und an das downstream von seiner Hpal-Stelle ein 11 50 Basenpaare großes Haelll-Clalll-DNA-Fragment aus pRiT10158, das die arg³-Transkriptions-Terminationsregion enthält, ligiert worden war. pRIT10158 ist vorstehend in Beispiel 4 Teil b) beschrieben. Das 2085 Basenpaare große EcoI-BamHI-Fragment wurde aus pRIT10909 ausgeschnitten und zwischen die EccRI- und BamHI-Stellen von pRIT10167, das wie vorstehend in Beispiel a) beschrieben, hergestellt wurde, ligiert. Es entstand das Plasmid

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pRIT10911. Das 3135 pb große Hindlll-Fragment von pRIT10911, das Hefe-DNA-Trans.kriptionssignale und die HBsAg-codierende Sequenz enthält, wurde in den Shuttle-Vektor YEp13 inseriert. Es entstand das Plasmid pRIT10912. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT10911.

Beispiel 6 Konstruktion der Plasmide pRIT10903 und pRIT10914

Das Ziel der nachfolgend beschriebenen Konstruktionen war, überschüssige Nucleotide am 5'-Ende eines DNA-Fragmentes, das zumindest für den N-terminalen Bereich des reifen HBsAg codiert, zu entfernen, so daß eine aus 6 bp bestehende Restriktionsstelle an der ersten Base des zweiten Codons geschaffen wird. Das resultierende Fragment kann dann ir.it Promotorfragmenten fusioniert werden, die eine aus 6 Basenpaare bestehende Restriktionsstelle an dem Initiationscodon besitzen, wobei Mungo Bohnen-Nuclease oder S1-Nuclease verwendet werden, um Einzelstrangbereiche zu entfernen und für die Ligierung stumpfe Enden zu schaffen, wie dies Rosenberg et al., Methods in Enzymology, 101C, 123 (1983), beschrieben hat.

Ein 1225 bp großes FnuDII-Fragment von HBV DNA aus PRIT10616 (vgl. Harford et al. (1983), Devel. Biol. Standard, 54, 125 - 130), das das HBsAg-Gen enthält, wurde isoliert, mit synthetischen Octomer EcoRI-Linkern versehen und in die EcoRI-Stelle des Vektors pACYC184 ligiert. Es entstand das Plasmid pRIT106 79 (Fig. 8). Der Vektor pACYC184 wurde von S. Cohen erhalten und ist aus Chang A.C.Y. und Cohen S. (1978), J. Bacteriol., 134, 1141 - 1156, bekannt. pACYC184 ist auch von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter ATCC 37033 erhältlich. Von diesem EcoRI (FnuDII)-Fragment wurde ein 125 bp großes EooRI-Xbal-Fragment erhalten, das die C-terminale Region der HBsAg-Vor-

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läufer-DNA, das HBsAg ATG-Codon und 90 bp der HBsAg-codierenden Sequenz enthält. Dieses 125 bp große ExoRI-Xbal-Fragment wurde zwischen die EcoRI- und Xbal-Stellen von pRIT10158 (vgl. Beispiel 4 b) eingeführt. Das resultierende Plasmid pRIT10903 enthält daher eine einzige EcoRI-Stelle an der Verbindung zwischen arg³-DNA und HBV-DNA und eine einzige Xhol-Stelle in der arg³-Promotorregion. Fig. zeigt die Herstellung von pRIT10903.

150 ug der pRIT10903 Plasmid-DNA, die durch CsCl-Ä'thidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation gtreinigt wurde, wurden mit 80 Einheiten der EcoRI-Endonuclease gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Äthanol präzipitiert und in 10 mM Tromethamin-HCl-Puffer (pH 7,5) zu einer Konzentration von 1 Ug pro μΐ aufgenommen. Die DNA wurde in drei Proben von jeweils 50 \>.g aufgeteilt und bei 30"C 50, 75 und 90 Sekunden mit der Nuclease Bal31 inkubiert. Jede Reaktionsmischung enthielt den gleichen in Beispiel 1 beschriebenen Reaktionspuffer, 50 ug EcoRI-verdaute pRIT10903-DNA und 2,5 Einhei- ten der Nuciease Bal31 in einem Endvolumen von 500 μΐ. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EGTA bis zu einer Endkonzentration von 20 iv.M gestoppt. Die Reaktionsmischungen wurden auf Eis gestellt, mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert und mit Äthanol präzipitiert. Die Bal31-behandelten DNA-Proben wurden jeweils in 50 μΐ 10 mM Tromethamin-HCl-Puffer aufgenommen. 2,5 ug der DNA wurden mit der Endonuclease BstEII verdaut und auf einem 7,5 %igen Polyacrylamid-Gel mit dem EcoRI-BstEII-Verdau von pRIT10903, der ein 285 bp großes Fragment freisetzt, verglichen. Die Behandlung mit der Nuclease Bal31 75 Sekunden bei 30⁰C reduziert die Größe dieses EcoRI-BstEII-Fragments um 10 bis 60 bp. Es entsteht eine Serie von einzelnen DNA-Fragmenten, bei denen schätzungsweise 10, 30, 45 und 60 bp entfernt sind. Die Entfernung von 29 bp, ausgehend von der ursprünglichen FnuDII-Stelle, würde· zur Entfernung der gesamten HBsAg-Vorläufer-DNA und des HBsAg ATG-Codons führen.

2856 i 2

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Γ 5 ug der pRIT10903 DNA, die 75 Sekunden mit Bal31 behandelt worder, war, wurden mit 8 Einheiten der Nuclease Xhol verdaut, mit Phenol extrahiert und mit Äthanol präzipitiert. Diese DNA wurde dann mit 5 Einheiten der T4 DNA-Polymerase in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphaten inkubiert, um Einzelstrangbereiche an den Xhol- und Bal31-Enden aufzufüllen mit Phenol behandelt und mit Äthanol präzipitiert. Die DNA wurde dann mit 5 Einheiten der T4 DNA-Ligase 16 Stunden bei 16⁰C inkubiert. Die Ligationsmischung wurde schließlich verwendet, um koroetente Zellen des E. coli K12 Stammes MM294 zu transformieren und diese dann auf Ampicillin-Resistenz zu selektionieren, wie aus dem vorstehend angegebenen Verfahren von Cohen et al. bekannt ist. Etwa 2000 ampicillinresistente Kolonien pro ml wurden nach dem Ausplattieren erhalten. Aus 4 7 einzelnen Kolonien wurden Plasmide im Labormaßstab (vgl. Birnboim et al., a.a.O.) präpariert, von denen 23 eine Xhol-Stelle besitzen, Dies deutet darauf hin, daß die Auffüllreaktion an der ursprünglichen Xhol-Stelle und die Ligierung an ein 3'-Ende, das mit einem G-Rest endet, erfolgreich verlaufen ist. Diese 23 Plasmide wurden weiter mit Xhol und Xbal verdaut, um die Größe des kleinen Restriktionsfragmentes im Vergleich mit den ursprünglichen EcoRI-Xbal-Fragmenten aus pRIT10903 zu vergleichen.

Mehrere Plasmide wurden identifiziert, die schätzungsweise Deletionen von 25 bis 40 bp besitzen. Ein Plasmid, pRIT109i4, dessen Xhol^-Xbal-Fragment schätzungsweise eine Größe von 95 bis 100 bp besitzt, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT10914. DNA dieses Plasmides wurde durch CsCl-Ä'thidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und 25 ug einer solchen DNA wurden mit 140 Einheiten der Xbal-Endonuclease gespalten.

Die Xbal-Enden wurden mit χ- P-ATP markiert und die markierte DNA wurde mit 15 Einheitender Hindlll-Endonuclease ge-

SS6 i 2

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spalten. Das kleine 765 bp Hindlll-Xbal-Fragment wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution isoliert und nachfolgend durch Äthanol präzipitiert. Die Nucleotid-Sequenz an und im Bereich der Xhol-Steile wurde bestimmt, indem dieses Fragment von dem markierten Xbal-Ende aus nach Maxam und Gilbert sequenziert wurde. Die Sequenzdaten zeigten, daß die Xhol-Stelle an der ersten Base des zweiten Codons der HBsAg-codierenden Sequenz liegt.

Xhol

CTCGAGAAC

HBsAg Nucleotide

Nach Entfernung von Einzelstrangbereichen ist dieses Fragment daher zur Fusion mit der BamHI-Verlängerung des TDH3-Promotor-Fragmentes von pRIT10167 (Beispiel 1) geeignet.

Beispiel 7 Konstruktion der Plasmide pRIT12211, pRIT12209, pRIT12230 und PRIT12265

Das Plasmid pRIT10911, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde als Ausgangsmaterial für v/eitere Manipulationen verwendet, um gewünschte Restriktionsstellen einzuführen, wurde das Plasmid mit den Endonucleasen BamHI und Xbal gespalten und das ausgeschnittene Fragment durch ein 2275 bp großes BamHI-Xbal-Fragment aus pRIT10158 (Beispiel 4) ersetzt. Diese Manipulation führt zu dem Plasmid pRIT12211, in dem das Hindlll-BamHI TDH3 Promotor-Fragment neben einem BamHI-Xbal-Fragment liegt, das eine Xhol-Stelle enthält. Ferner enthält dieses Plasmid ein Xbal-Hindlll-Fragment, in dem die C-terminale Region der HBsAg-codierenden Sequenz und 128 bp der 3'-nichtcodierenden Sequenz mit der 1150 bp arg³-Transkriptions-Terminationsregion fusioniert ist. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT12211. Das Plasmid pRIT12211

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wurde mit den Endonucleasen Xhol und Xbal gespalten. Hierdurch wurde ein 1600 bp großes Fragment entfernt, das durch ein 94 bp großes Xhol-Xbal-Fragment der modifizierten HBsAg DNA aus pRIT10914, hergestellt gemäß Beispiel 5, ersetzt wurde. Dieses 94 bp große Fragment wurde nach der Doppelverdauung der pRIT10914 DNA mit Xhol und Xbal durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und anschließende Elektroelution aus dem entsprechenden Gelstückchen gereinigt und durch Äthanol präzipitiert. Das durch die Insertion des 94 bp großen Fragments entstandene Plasmid pRIT12209 (vgl. Fig. 8) wurde durch CsCl-Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. 50 ug dieser DNA wurden mit 90 Einheiten der BamHI-Endonuclease und 60 Einheiten der Xhol-Endonuclease verdaut, um die 990 bp große unwesentliche DNA zwischen dem TDH3 Promotor und der HBsAg-codierenden Region zu entfernen. Die DNA wurde dann mit Phenol extrahiert und anschließend mit Äthanol präzipitiert. 16 ug dieser DNA wurden 30 Minuten bei 30⁰C mit 20 Einhalten der Mungo Bohnen-Nuclease (PL Biochemicals) in einem Volumen von 125 μΐ inkubiert. Der verwendete Inkubationspuffer enthielt 30 mM Natriumacetat (pH 4,6), 250 mM Natriumchlorid, 1 mM Zinkchlorid und 5 % Glycerin. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,2 % gestoppt, und die DNA mit einem gleichen Volumen an Phenol extrahiert und anschließend mit Äthanol präzipitiert. Eine Teilmenge von 0,5 ug dieser mit Nungo Bohnen-Nuclease behandelten Probe wurde mit 2 Einheiten der T4 DNA-Lirgase 16 Stunden bei 16⁰C inkubiert und dann mit 2 Einheiten der Barm. .-Endonuclease gespalten, um jegliche V^ktormoleküle zu zerstören, die bisher unbehandelt geblieben sind. Diese Mischung wurde verwendet, um kcmpentente Zellen des E. coli K12 Stammes MM294 zu transformieren und anschließend auf Ampicillinresistenz gemäß Cohen et al., a.a.O., zu selektionieren. Etwa 2000 ampicillinresistente Kolonien pro ml Transformationsmischung wurden erhalten. Von 24 amplifizierten Kolonien wurden die Plasmide im Labormaßstab (gemäß

2 8 5 ό ί 2

- 62 dem Verfahren von Birnboim et al., a.a.O.) präpariert.

16 der 24 Plasmide ergaben nach Verdauung mit der Endonuclease Hindlll zwei DNA-Fragmente mit einer Größe von 2700 bp (pUC9-Vektor) und 3000 bp. Das 3000 bp große Fragment besitzt die für ein DNA-Fragment erwartete Größe, in dem die HBsAg-codierende Sequenz und die arg³-Terminationsregion an das TDH3 Promotor-Fragment ligiert ist.

Vier Plasmid-Kandidaten wurden für die weitere Untersuchung hergenommen. Die DNA eines jeden Plasmides wurde mit der Endonuclease Xbal gespalten, in einer Kinase-Reaktion mit y- P-ATP markiert, mit der Endonuclease Hindlll gespalten und durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt. Das 1190 bp große markierte Hindlll-Xbal-Fragment wurde .durch Elektroelution isoliert und durch Äthanol präzipitiert. Die Sequenz eines jeden isolierten Fragments wurde nach Maxam und Gilbert, a.a.O., bestimmt. Zwei Plasmide wurden gefunden,die die korrekte Sequenz ATGGAGAAC für eine perfekte Fusion zwischen der TDH3 Promotor-Region und dem HBsAg-Gen besitzen. Eines dieser Plasmide, pRIT12230, wurde für weitere Manipulationen verwendet. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT12230. Die DNA dieses Plasmids (pRIT12230) wurde mit der Endonuclease Hindlll gespalten und das 3000 bp große Fragment, in dem die HBsAg-codierende Sequenz fusioniert mit dem TDH3 Promotor vorliegt, in den Shuttle-Vektor XEp13 ligiert. Das resultierende Plasmid, pRIT12265, wurde nach dem von Ito et al., J. Bact. 153 (1983), 163, beschriebenen Verfahren in den Hefestamm DC5 (MATa, leu2-3, Ieu2-112, his3, cani-11) (erhalten von J. Broach (State University of N.Y., Stony Brook)eingeschleust. Dieser Hefestamm ist auch ohne Beschränkung von der American Type Culture Collection unter ATCC 20630 erhältlich.

f 2

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Beispiel 8 Konstruktion der Plasmide pRljT12288 und pRIT12322

Das Plasmid pRIT12230 (Beispiel 7) enthält 3'-downstream vom Stop-Codon des HBsAg-Strukturgens 128 bp, die nicht für HBV codieren.

Zur Entfernung dieser 128 bp wurden 25 ug von pRIT12230, hergestellt gemäß Beispiel 7, mit Accl und EcoRI verdaut. pRIT12230 enthält eine einzige Accl-Stelle, die in der codierenden Sequenz des S-Gens 7 Nucleotide vor dem TAA Stop-Codon liegt. Die verdaute DNA wurde auf einem 1 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und das gröllere 4200 bp große Vektor-Fragment aus dem Gel durch Elektroelution erhalten und durch Äthanol präzipitiert.

Künstliche 12 mer und 14 rner Einzelstrang-DNA-Linker-tfoleküle mit den folgenden Sequenzen wurden für die Insertion zwischen der Accl-und EcoRI-Stelle von pRIT12330 hergestellt: 5¹ ATACATTTAACG 3'

12 mer

3' TGTAAATTGCTTAA 5'

1 4 mer

Dies stellt die korrekten C-terminalen HBsAg-Codons und das TAA-Stop-Codon wieder her und liefert für den Zusatz von Transkriptions-Terrninationsfragmenten eine EcoRI-Stelle, die sonst nirgendwc in dem TDH3 Promotor oder den HBsAg-codierenden Sequenzen vorliegt.

100 pMol der synthetischen 12 mer und 100 pMol der synthetischen 14 mer Einzelstränge werden in einem Endvolumen von 10 bis 20 ul zusammengemischt, 15 Minuten bei 70⁰C erhitzt und dann innerhalb von 3 Stunden langsam auf Raumtemperatur

gg abgekühlt, um das Aneinanderlagern beider Stränge entlang ihrer komplementären Sequenzen zu erreichen. Zu

- 64 -

dieser "annealing"-Mischung werden 0,15 pMol (400 ng) des 4200 bp langen AccI-EcoRI-Fragments von pRIT12230, 10fach konzentrierter Ligationspuffer und ?. Einheiten der T4 DNA-Ligase gegeben.

Diese Mischung wird 4 Stunden bei 16⁰C inkubiert, sodann werden weitere 2 Einheiten der T4 TNA-Ligase zugesetzt. Hierauf wird die Mischung über Nacht auf Eis gestellt. Die Iigierte Mischung wird verwendet, um kompetente Zellen des

jQ Stammes MM294 zu transformieren und dann auf Ampicillin-Resistenz gemäß Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69 (1972). 2110, zu selektionieren. Plasmide werden von 12 oder mehr Einzelkolonien im Labormaßstab gemäß dem Verfahren von Birnboim und DoIy, Nucl. Acids Res., 7 (1979),

,,- 1513, präpariert und durch Reutriktions-Endonucleasenanalysiert. Plasmide mit der Insertion des Linkers zwischen der Accl und EcoRI-Stelle zeigen nach Verdauung mit Accl oder EcoRI eine einzelne 4200 bp große DNA-Bande. Die Richtigkeit der Linkerinsertion in einem solchen Plasmid kann

2Q durch die DNA-Sequenzierung ausgehend von der EcoRI-Stelle oder der Accl-Stelle nach dem chemischen Modifkationsverfahren von Maxam und Gilbert (Methods in Enzymology, 65 (1980), 499), nachgewiesen werden.

2g Um ein Transkriptions-Terminationsfragment zu beschaffen, wurde ein Plasmid mit dem AccI-EcoRI-Linker-Insert, erhalten wie vorstehend beschrieben, mit der Endonuclease EcoRI gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt (US-Patent 4 264 732). Das 2650 bp große Hindlll-Fragment von

_g0 pRIT10162, hergestellt gemäß Beispiel 3, wurde in die Hindlll-Stelle des Vektors pBR327 umkloniert. Es entstand das Plasmid pRIT12288. pBR327 ist aus Soberon et al., Gene, 9 (1980), 287 - 305, bekannt und kann wie in Beispiel 10 beschrieben, aus dem Plasmid pRIT12309,

_g5 das bei American Type Culture Collection unter ATCC 67187

28 5 ^f 2

- 65 -

erhältlich ist, hergestellt werden. Fig. 8 zeigt die Konstruktion von pRIT12288.

Das Hindlll-Fragment ist in pRIT12288 so orientiert, daß die arg³-Transkriptions-Terminationsregion neben den EcoRI- und Clal-Restriktionsstellen auf der pBR327-Hälfte liegt. Von pRlT12288 wird ein 1180 bp großes EcoRI-Fragment erhalten, das die arg³-Transkriptions-Terminationsregion enthält. Dieses Fragment wird an das beschriebene EcoRI-gespaltene und mit alkalischer Phosphatase behandelte pRIT12230-Derivat ligiert. Plasmide, die aus der Ligationsmischung hervorgehen, werden hinsichtlich der Insertion und der Orientierung des 1180 bp großen EcoRI-Fragments untersucht. Die Orientierung des Inserts kann durch Spaltung mit der Endonucleaae Hindlll bestimmt werden, die Fragmente einer Größe von 2880 und 2720 bp freisetzt, sofern das Insert die gewünschte Orientierung hat.

Ein Plasmid, pRIT12322, wurde konstruiert, ,in dem der Accl-EcoRI-Linker die 128 bp lange unerwünschte HBV-DNA ersetzt und in dem das 1180 bp lange EcoRI-Fragment von pRIT12288 in der richtigen Orientierung vorliegt, nämlich downstream der HBsAg-codierenden Sequenz. Ein 2900 bp großes Hindlll-Fragment kann aus pRIT12322 avgeschnitten werden, das die HBsAg-Expressionseinheit enthält, zu der der TDH3-Promotor, die HBsAg-codierende Sequenz und die arg³-Transkriptions-Terminationsregion gehört. Fig. 8 zeigt die Konstruktion von PRIT12322; vgl. auch Fig. 11, die eine Restriktionskarte von pRIT12232 zeigt und angibt, welche Tei-Ie davon von pRIT12288 und pRIT12230 stammen.

Beispiel 9 Konstruktion des Plasmids pRIT12329

Wie in Beispiel 8 beschrieben, enthält pRIT12322 ein 2900 bp

2 3 5 i I 2 '

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J· großes Hindlll-Fragment, das alle notwendigen Signalsequenzen für die Expression von HBsAg unter der Kontrolle des TDH3-Promotors enthält. Diese Expressionseinheit wurde in einen Hefe Shuttle-Vektor ligiert.

Die DNA des Shuttle-Vektors YEp13 wurde mit der Endonuclease Uindlll gespalten, mit al alischer Phosphatase behandelt und als Empfänger für das riinaill-Fragment aus pRIT12322, hergestellt gercäß Beispiel 8, verwendet. Ein Plasmid, PRIT12329, wurde isoliert, das rieben dem YEpI 3-Replikon auch das 2900 bp große Hindlll-Fragment mit der Expressionse.inheit, wie in Beispiel 8 beschrieben, enthält.

!5 BeispieliO

Konstruktion von pRIT12309, pRIT12314 und dem Expressions-Shuttle-Vektor pRIT12 544, der die komplette 2 Mikron Hefe-DNA enthält Das Plasmid pRIT12309 umfaßt die komplette 6318 bp große

2 Mikron Hefe-DNA-Sequenz, die in die EcoRI-Stelle des Plasmid-Vektors pBR327 kloniert ist. Die 6318 bp große 2 Mikron Hefe-DNA-Sequenz wurde aus dem Plasmid pCV19 erhalten, das von J. Broach, Princeton University, überlassen wurde. Das Plasmid pRIT12309 wurde in dem E. coli Stamm K12 MM924 gemäß Budapester Vertrag in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter ATCC 6 718 7 hinterlegt.Fig. 12 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT12309. Die Insertion der 2 Mikron DNA-Sequenz in eine der zwoi EcoRI-Stellen von pBR327 unterbricht die 2 Mikron A codierende Region und

führt dazu, daß das resultierende hybride Molekül pRIT12309 keine Α-Gen bzw. FLP-Funktion aufweist. Eine Beschreibung der 2 Mikron-Struktur und Punktion ist aus Broach J., "The Molecular Biology of the yeast Saccharomyces: Life cycle and Inheritance", 445 - 470, Strathern J.N., Jones E.W. und Broach J.R. (Herausg.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1981),bekannt.

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pBR327 ist aus Soberon et al., Gene, 9 (1980), 287-305, bekannt und wurde von F. Bolivar (Department of Molecular Biology, National University of Mexico, Mexico 20DF) erhalten. Einem Fachmann ist es bekannt, daß das Flasmid pBR 327 aus dem Plasmid pRIT12309 erhalten werden kann. Die pRIT12309 Plasmid-DNA wird aus dem E. coli Stamm, der in der American Type Culture Collection unter ATCC 67187 hinterlegt ist, durch eine der zahlreichen üblichen Verfahren isoliert, mit EcoRI gespalten und wieder ligiert. Die Ligationsmischung wird verwendet, um kompetente £. coli K12-Zellen zu transformieren und auf Ampicillin-oder Tetracyclin-Resistenz zu selektionieren. Eine beträchtliche Anzahl der transformierten Kolonien wird Plasmide enthalten, in denen nur die pBR327 Hälfte von pRIT12309 vorhanden ist, ohne eines der 2 Mikron DNA-Fragmente.

Das 2850 bp große Clal-Sall-Fragment, das die TDH3-arg"³-Expressionseinheit und flankierende pBR322-Sequenzen aus pRIT12290 (beschrieben in Beispiel 3) enthält, wurde in den Vektor pRIT12309 zwischen der Clal-und Sall-stelle umkloniert. Das resultierende Plasmid pRIT12314 wurde mit der Endonuclease Sail gespalten und mit dem 2218 bp großen SaII-Xhol-Fragment aus YEp13, das das Hefe LEU2-Gen enthält, ligiert. Fig. 13 zeigt ddη Herstellung von pRIT12314. YEp13 ist

von der American Type Cuicure Collection unter ATCC 3 7115 erhältlich. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente Zellen des Stammes JA221, die nach Cohen et al., a.a.O., präpariert, wurden, zu transformieren und auf Leucin-Unabhängigkeit und Ampicillin-Resistenz zu selektionieren.

Der Stamm JA221 ist von der American Type Culture Collection unter ATCC 33875 erhältlich.

8 5 6 12

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Ein Plasmid, pRIT12544, in dem das 2218 bp große Sall-Xhol LEU2-Genfragment in die Sall-Stelle von pRIT12314 inseriert wurde, wurde aus einem Klon dieser Transformation erhalten. Die Orientierung dieser Insertion ist so, b

daß die wieder entstandene Sall-Stelle auf jener Seite liegt, die der TDH3-arg³-Expressionseinheit am nächsten ist. Das Plasmid pRIT12544 ist ein E. coli Hefe-Shuttle-Vektor mit einer einzigen BamHI-und Smal-Stelle, die zwischen den TDH3-Promotor und arg^J-Transkriptions--Terminationsregionen liegen. Diese Restriktionsstellen eignen sich zur Insertion von DNA-Sequenzen, die unter der Kontrolle des TDH3-Promotors stehen sollen. Fig. 13 zeigt die Herstellung von pRIT12544.

Beispiel11

Konstruktion von pRIT12662 - ein E. coli Vektor, der die Pre S2-S-Expressionseinheit enthält (Fig. 16)

Das Plasmid pRIT12290, hergestellt gemäß Beispiel 3, wurde modifiziert, indem das synthetische BamHI-Eco-RI-

Verlängerungsfragment, das für die N-terminalen Aminosäuren der Pre S2-Region codiert, zwischen die TDH3-Promotor- und arg³-Terminator-t'ragmente ligiert wird. Dies wurde folgendermaßen durchgeführt: 25

Das Plasmid pRIT12290 wurde mit den Endonucleasen BamHI und EcoRI gespalten und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. 200 pMol des phosphorylierten synthetischen Verlängerungs-Fragments 30

GIn Trp

BamHI 5¹ GATC CAG TGG 3 t EcoRI

3 ' GTC ACCTTAA 5'

wurden mit 0,1 pMol des BamHI-EcoRI geschnittenen und dephosporylierten Plasmids pRIT12290 ligiert, indem eine Ein-

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heit (U) der T4 DNA-Ligase verwendet wurde. Mit der Li<?ationsmischung wurde der E. coli Stamm MM294 transformiert und auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Eine Transformante, die das gewünschte Plasmid mit dem synthetischen Verlängerungsfragment zwischen der BamHI- und EcoRI-Stelle besitzt, wurde identifiziert und isoliert. Das Plasmid wurde mit pRITI2621 bezeichnet. Im nächsten Schritt wurden die vier zusätzlichen Basenpaare (Kern der BamHI-Stelle) in pRIT12621 entfernt, um das ATG-Codon in Ablesephase mit

¹^ dem zweiten Codon des Pre S2--Region zu bringen. Im nächsten Schritt wurde ein EcoRI-Fragment, das den Rest der Pre S2-codierenden Region und die komplette S-codierende Region enthält, in die EcoRI-Stelle von pRITI2621ligiert. Es wurde die komplette Pre S2-S-codierende Sequenz erhalten. In diesem Stadium wurden die DNA-Manipulationen, die nachfolgend die Linearisieren, das Herbeiführen von Deletion und die Rezirkularisieren des Plasmids pRIT12621 umfassen, ohne Amplifikation durch Transformation der als Zwischenprodukt verwendeten Plasmide durchgeführt. Es wurde folgendermaßen verfahren:

30 pMol (120 ug) der pRIT12621 DNA wurden mit 120 Einheiten von BamHI linearisiert. Nach der Abtrennung des Restriktionsenzyms durch Phenolextraktion wurde das Plasmid durch Äthanol präzipitiert und in den entsprechenden Puffer aufgenommen, um die Einzelstrangbereiche der BamHI-Stelle mit 280 Einheiten der Mungo Bohnen-Nuclease zu verdauen. Die Nuclease wurde durch Phenolextraktion entfernt, der dann eine Äthanolpräzipitation folgte. Das so behandelte Plasmid wurde in dem

° Ligationspuffer resuspendiert und mit 10 Einheiten der T4 DNA-Ligase rezirkularisiert.

Der das ligierte Plasmid enthaltende Ansatz wurde mit Phenol extrahiert, mit Äthanol präzipitiert und in dem entsprechenden Puffer aufgenommen und mit dem Enzym EcoRI gespalten. Nach der Abtrennung der EcoRI-Endonuclease durch Phenolextraktion und Äthanol-Präzipitation wurden 0,05 pMol (0,2 ug der DNA)

2850 f 2

- 70 -

in dem Ligationspuffer resuspendiert und mit 0,4 pMol (0,2 ug) eines 838 bp großen EcoRI-Fragments, das aus pRIT12531 isoliert wurde und das die gesamte C-terminale codierende Region des Pre S2-S-Proteins enthält, ligiert.

Ein Plasmid, das im wesentlichen dem pRIT12581 ähnlich ist, kann folgendermaßen konstruiert werden. Der Vektor pUC9 (erhältlich bei Amersham und Pharmacia) wird mit der Endonuclease EcoRI verdaut und mit alkalischer Phosphatase (US-PS 4 264 731) behandelt. Das Plasmid pRIT10616 (ATCC 39131) wird mit EcoRI und Accl gespalten und das 826 pb große EcoRI-AccI-Fragment, das e ien Teil der Pre S2-S-codierenden Region enthält, durch präparative Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution erhalten. Etwa 0,4 pMol (0,2 ug) von diesem

¹^ Fragment werden mit etwa 10 pMol eines synthetischen Verlängerungsfragmentes, das die folgenden 12 bp besitzt und das, wie in Beispiel 8 beschrieben, durch Aneinanderlagern der beiden Einzelstränge entstanden ist, gemischt.

¹¹O

Tyr Stop

5' ATACATTTAACG 3 ·

ECORI 3' TGTAAATTGCTTAA 5'

Die vorstehend erhaltene Mischung wird mit T4 DNA-Ligase behandelt und dann mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten. Zu dieser so behandelten Mischung werden 0,2 ug des EcoRI-gespaltenen und mit alkali-

scher Phosphatase behandelten pUC9-Vektors, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, gegeben und die Mischung mit T4 DNA-Ligase behandelt. Mit dieser Mischung wurden kompetente Zellen des E. coli Sammtes K12 transformiert und auf

285<5 I 2 '

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Ampicillin-Resistenz selektioniert. Kolonien dieser Transformanten wurden auf die Anwesenheit eines Plasmids untersucht, das neben dem 2650 bp großen pUCg-Vektor-Fragments auch ein 838 bp großes EcoRI-Fragment besitzt. Dieses EcoRI-Fragment umfaßt ein 826 bp großes EcoRI-AccI-Pre S2-S-Fragment und

den 12 bp großen synthetischen AccI-EcoRI-Linker. Die Richtigkeit dieser so identifizierten Konstruktion kann durch DNA-Sequenzierung nach Maxam und Gilbert bewiesen v/erden. Vorzugsweise erfolgt die DNA-Sequenzierung, ausgehend von ,Q einer Restriktionsstelle, die nur im pUC9-Polylinkür einmal vorkommt.

Die Ligationsmischung, die die Plasmid-DNA von pRIT12621, behandelt wie vorstehend beschrieben, und das 838 bp große EcoRI-Fragment von pRIT12581 enthält, wurde verwendet, um den E. coli Stamm MM294 nach Cohen et al., a.a.O., zu transformieren. Eine Transformante, die ein Plasmid mit dem EcoRI-Fragment in richtiger Orientierung enthält, wurde identifiziert und das Plasmid als pRIT12662 bezeichnet (vgl. Fig.

2Q 1A und Fig. ¹⁴ ). Fig. 1A zeigt die Herstellung von PRIT12662, Fig. 14 zeigt ?ine Restriktionskarte von pRIT12662. Die Pre S2-Region von pRIT12662 wurde nach Maxam und Gilbert sequenziert, um den Leserahmen am N-Terminus zu überprüfen, der wie folgt aussieht:

Met Gin Trp Asn Ser AAAC AAAC AAA ATG CAG TGG AAT TCC

PTDH3 pre S2-S

modifizierte Region

285η 2

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Dem Fachmann ist es bekannt, daß der Vektor pRIT12662 auch verwendet werden kann, um weitere funktioneile DNA-Sequenzen durch geeignete in vitro Manipulationen des Vektors in die Pre S2-Region einzuführen. Die Pre S2-codierende Sequenz enthält die Restriktionsstellen für die EcoRI, Pstl und BamHI-Endonucleasen. Jede dieser Restriktionsstellen kann verwendet werden, um funktioneile DNA-Sequenzen, die für interessierende Peptide codieren, einzuführen und in Ablesephase Fusionen mit der Pre S2-Region zu schaffen. Solche Fusionen werden von dem Pre S2-eingeführte Sequenz-Pre S2-S-Typ sein. Diese Restriktionsstellen können auch in vitro durch das beispielsweise von Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, beschriebenenVerf ahren manipuliert werden, um andere Vektoren zu schaffen und andere Restriktionsstellen oder Leserahmen zur Insertion von funktioneilen DNA-Sequenzen zu liefern.

Beispiel 12

Konstruktion von pRIT12377 und pRIT12660, einem Hefeplasmid, das das Pre S2-S-Protein exprimiert

DNA des Plasmids pRIT12309, hergestellt gemäß Beispiel 10, wurde mit der Endonuclease Sail gespalten und mit einem 2218 bp großen XhoI-Sall-DNA-Fragment ligiert, das das Hefe LEU2-Gen enthält und das durch Verdauung von YEp13 und durch Reinigung aus einem Polyacrylamidgel erhalten wurde. Die Ligationsmischung wurde zur Transformation von Zellen des E. coli K12 Stammes JA221 verwendet und sodann auf Ampicillin-Resistenz und Leucin-Unabhängigkeit selektioniert. Der

gO Stamm JA221 ist von der American Type Culture Collection unter 33875 erhältlich. Aus einer transformierten Kolonie wurde das Plasmid pRIT12377 identifiziert, das das 2218 bp große LEU2 Xhol-Sall-Fragment in der Sall-Stelle von pRIT12309 enthält.

Ί Β S 6 1 2

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Die Orientierung des Fragments ist derartig, daß die wiedererhaltene Sall-Stelle auf je"ner Seite der pBR327 DNA vorliegt, auf der auch die Aval-Stelle liegt. Das Plasmid pRIT12377 ist ein E. ccli Hefe-Shuttle-Vektor, der die not-

^ wendigen Fun'^ijnen für die Selektion, Replikation und Stabilität in beiden Organismen besitzt.

Das 3050 bp Hindlll-Fragment von pRIT12662 (Beispiel ¹¹) / das die Pre S2-S-Expressionseinheit enthält, wurde durch

¹^ Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt, mit T4 Polymerase behandelt und in pRIT12377 ligiert. pRIT12377 war zuvor durch BamHI geöffnet worden und durch die T4 DNA-Polymerase behandelt worden. Diese Ligationsmischung wurde zum Transformieren von Zellen des E. coli Stamm MM294 verwendet. Die Zellen wurden sodann auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Eine E. coli Transformante, die das Plasmid pRIT1266Ö besitzt, wurde erhalten. Fig. 15 zeigt die Herstellung von pRIT12660.

Dieses Plasmid, pRIT12660, wurde verwendet, um zwei Stämme 20

von Saccharomyces cerevisiae, nämlich Stamm DC4 cir° und Stamm 10S44C cir" gemäß Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 79 (1978), 2157 - 2161, zu transformieren.

Beide Stämme, DC5 cir° und 10S44C cir°, wurden in der 25

American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 18. Aug. 1986 unter ATCC 20820 und ATCC 20818 hinterlegt.

Beispiel 13 Die Pre S2-Region in dem Plasmid pRIT12662

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Die Pre S2-Region in dem Plasmid pRIT12662 wurde nach Maxam und Gilbert seguenziert. Es wur.de gefunden, daß im Vergleich zu einem anderen Virus des adw2-Serotpys (Valenzuela et al.,

a.a.O., 1980 - Tabelle I, S. 11) vier Basenaustausche vor-5

liegen, die zu drei Aminosäureaustauschen fühmn. An der Position - 45 ein Alaninrest anstelle eines Threoninrestes, an der Position - 34 ein Phenylalaninrest anstelle eines Leucinrestes und an der Position - 11 ein Serinrest anstelle eines Isoleucinrestes. Der letzte Austausch betrifft 10

einen Rest, der bisher in allen bekannten Serotypen nicht verändert war (Lo et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 2 (1986) , 382 - 388).

15

Beispiel 14

Konstruktion des Plasmids pRIT12845, das in Hefe das Pre S1-Pre S2-S-Protein exprimiert

Im ersten Schritt wurde die TDH3-Promotorregion mit der

20

pre S1-N-terminalen Region aus dem HBV-Genom fusioniert.

Das Ausgangsmaterial war das Plasmid pRIT12792, das ein 495 bp großes Ncol-Xbal-Fragmenf besitzt, das die Pre S1-Pre S2-codierende Sequenz mit Ausnahme des letzten Aspara-

gincodons enthält. Die Ncol-Stelle überlappt das ATG-Codon 25

des Aminosäurerestes an der Stelle-163 der HBV-Pre S1-Sequenz. Die Sequenz des Ncol-Xbal-Fragmentes ist in Fig. gezeigt.

Ein im wesentlichen ähnliches Plasmid zu pRIT12792 ist 30

pRIT12793 (5940 bp),das bei der American Type Cultur Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 5. Sept. 1986 unter ATCC 67193 hinterlegt wurde. Aus dem Plasmid pRIT12793 kann ein 495 bp großes Ncol-Xbal-Fragment

erhalten werden, das die vollständige Pre S1- Pre S2-codie-35

rende Sequenz enthält. Dieses Fragment, das am 3'-Ende die

- 75 -

Sequenz ACGAACTAATAATCTAGA besitzt, unterscheidet sich von jenem in Fig. 18 gezeigten durch ein einziges Nucleotid. Dieses Nucleotid ist unterstrichen. In den folgenden Beispielen kann pRIT12792 durch pRIT12793 ersetzt werden. Die Ncol-Xbal-Fragmente, die in pRIT12792 und pRIT12793 enthalten sind, wurden durch in vitro-Manipulation der Pre S1- Pre S2-DNA-Region des Hepatitis B-Virusstammes (Serotyp adw), dessen DNA in pRIT10616 kloniert ist, erhalten. Das Plasmid pRIT10616 ist von der American Type Culture Collection unter ATCC 39131 erhältlich.

52 ug von pRIT12792 wurden mit den Restriktionsenzymen Ncol und Xbal gespalten und mitfftmgo Bohnen-Nuclease behandelt, um die 5'-überstehenden Enden zu entfernern. 600 ng (2 pMol) des behandelten und gereinigten 495 bp großen Ncol-Xbal-Fragmentes wurden mit 170 ng (0,02 pMol) des Vektors pRIT12314 ligiert. pRIT12314 war mit den Restriktionsenzymen BamHI und Smal geöffnet worden und ebenfalls mit Mungo Bohnen-Nuclease behandelt worden. pRIT12314 enthält das vollständige 2 Mikron DNA-Fragment von S. cerevisiae und eine Expressionseinheit, in der der TDH3-Promotor durch einen BamHI-Smal-EcoRI-Linker von der arg³-Terminationsregion getrennt ist.

BamHI EcoRI

Smal

ATGGATCCCCGGGAATTC ....

Promotor TDH₃ Terminationsregion ARG₃

Eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion von PRIT12314 ist in Beispiel 10 zu finden. Die vorstehend beschriebene Ligationsmischung wurde zur Transformation von E. coli, Stamm MM294, verwendet. Es wurde sodann auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Sechs Transformanten, die

285^12

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ein Plasmid enthalten, in dem das Pre S1- Pre S2-Fragment in richtiger Orientierung inseriert ist, wurden erhalten. Die Plasmide dieser Transformanten sind pRIT12843 (a .... f) (Fig. 16) .

Der zweite Schritt war die Inserierung der S-codierenden Region in jedes der Plasmide pRIT12843 (a .... f), um das vollständige Pre S1-S2-S-Gen zu erhalten.

Dies wurde folgendermaßen durchgeführt:

Die Plasmide pRIT12843 (a .... f) wurden jeweils mit den Enzymen BamHI und Sail geschnitten. Die BamHI-Stelle liegt am Beginn der Pre S2-Region, während die Sall-Stelle hinter

der arg³-Terminationsregion in der pBR327 DNA liegt. 15

80 ng (0,012 /uMel) des größten BamHI-Sall-Fragments (10 400 bp), das aus jedem Plasmid pRIT12843 (a .... f) isoliert wurde, wurden mit 300 ng (0,11 pMol) des kleinen BamHI-Sall-Fragmentes von pRIT12660 (Beispiel 12) ligiert. U

Das kleine (4800 bp) BamHI-Sall-Fragment von pRIT12660 enthält einen Teil der Pre S2-S-codierenden Sequenz, die ARG-Terminatio. Sequenzen und die LEU2-Hefesequenz. Nach Ligierung und Transformation von E. coli, Stamm MM294, mit jedem der Plasmide pRIT12843 (a .... f) gemäß Cohen et al., 25

a.a.O., wurden eine Reihe ampicillinresistenter Klone erhalten, die die bezeichneten Plasmide pRIT12845 (a .... f) tragen. Fig. 16 zeigt die Herstellung von pRIT12845 (a....f) Diese Plasmide wurden verwendet, um einzeln den Saccharo-

myces cerevisiae Stamm 10S44C cir° gemäß Ito ei al. zu 30

transformieren. Kulturen von einzelnen transformierten Klonen wurden mit dem AUSRIA-Test (Abbott) geteste¹. Rohzellextrakte aus aufgeschlossenen Hefezellen wurden in PBS, das 0,5 % Tween 20, 2 mM PMSF und 5 % Isopropanol enthält, resuspendiert. Aus jeder der sechs getrennten Transformationen [mit pRIT12845 (a .... fjj wurde eine Transformante ausge-

28 S6

- 77 -

^ wählt und getestet. Fünf der sechs getesteten Transformantan ergaben einen positiven AUSRIA-Test. .

Zur Feststellung, ob ein Protein, das im AUSRIA-Test eine S-verwandte Antigenität zeigte, die vollständige Größe hat, wurden Proben der oben beschriebenen Rohzellextrakte im Immunblot, wie in Beispiel 20 beschrieben, untersucht. Vier der fünf im AUSRIA-Test positiven Transformanten zeigten ein S-verwandtes Protein von etwa 39K. Eine Transformante (Extrakt a) zeigte ein S-verwandtes Protein von 23K. Das für die Expression des 39K Proteins im Extrakt (e) verantwortliche Plasmid wird pRIT12845 genannt; vgl. Fig. 16.

Beispiel 15

Fusion eines Peptids aus Proteinen des HTLVIII-Virus und der Pre S2-Region aus der Pre S2-S-Sequenz zur Herstellung neuer Hybrid-Partikel

Die Pre S2-Region einer HBV-Pre S2-codierenden Sequenz kann auch zur Fusion mit Peptidsequenzen anderer viraler Antigene verwendet werden, zu denen auch jene des als HIV, HTLV-III oder LAV bekannten Retrovirus gehören, das der Verursacher von AIDS ist.

Das klonierte Genom eines HIV-Virus ist aus Ratner L. et al. . Nature, 313 (1985), 277 -284, und Shaw G. et al., Science, 226(1984), 1165-1171, bekannt. Von diesem ge-

nomischen Klon können verschiedene Subfragmente als funktioneile DNA-Sequenzen erhalten werden, die für Peptide von Interesse codieren. Die Fusion von solchen funktioneilen Sequenzen mit der Pre S2-S-Sequenz kann zur Herstellung von neuen Hyhridpartikeln, die Epitope der HlV-Virusproteine

^° enthalten, genutzt werden. Solche Hybridpartikel können als Grundlage für einen Humanimpfstoff gegen das infektiöse HIV-Virus dienen.

285*12

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Folgende Peptidregionen sind vor Interesse: a) C7-Peptid

Diese Region umfaßt 45 Aminosäurereste; sie liegt unmittelbar an der Stelle, wo das Vorlaufer-Hüllprotein gespalten wird; vgl. Starcich B.R. et al., Cell, 45 (1986), 637 - 648.

b) Peptid 121

Diese Region besitzt eine relativ konservierte Aminosäuresequenz, die in mehreren retroviralen (transmembrane) Hüllproteinen vorliegt; vgl. Cianciolo G.J. et al., Science, 230 (1985), 453 - 455. Es wird vermutet, daß diese Sequenz an der durch das Retrovirus induzierten Immunsuppression beteiligt ist; vgl. Synderman R. und Cianciolo G.J., Immunol. Today, 5 (1984), 240.

c) "Dreesman Peptid"

Das synthetische Pepf.d entspricht der Aminosäuresequenz bis ^52 des glykosylierten Vorläufer-Hüllproteins von HIV. Dieses Peptid wurde von Kennedy R.C. et al., Science, 231 (1986), 1556 - 1559, verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. Das erhaltene Antiserum wurde verwendet, um die Erkennung von HIV-Hüllpro^.einen durch induzierte Antikörper zu antersuchen. Die erhaltenen Ergebnisse lassen vermuten, daß diese Region eine Immunantwort gegen das native Glykoprotein induzieren kann.

A. Fusion der DNA-Sequenz des C7-Peptides eines HTLV-III Isolate mit der Pre S2-S-Region von pRIT10911 Das Ausgangsmaterial war das Plasmid pBH10-R2, dap .as klonierte Genom des HIV-Isolates BH10 enthält. Dieses Plasmid wurde von R.C. Gallo, National Institutes of Health, Bethesda, MD, erhalten. Ein 3108 bp großes Sall-Xhol-Fragment, das den viralen Replikationsursprung enthält, wurde aus pBH10-R2 ausgeschnitten und zwischen der Sail und Xhol-Stelle von pUC18 kloniert. Es entsta id das Plasmid pRITi2901. ^ine Re-

2 S 5 ό ί 2

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striktionskarte dieses Sall-Xhol-Fragments ist in Fig. 19 gezeigt. Das Plasmid pUC18 ist von Norrander J. et al., üene, 26 (1983), 101 - 106, beschrieben und erhältlich von Pharmacia Inc., Piscataway, N.J..

Für rine Fusion wurde pRIT12901 mit den Endonucleasen BgIII und MboII gespalten und das entstandene 117 bp große Fragment durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution (vgl. Fig. 1B) isoliert. Die DNA dieses Fragments wurde zur Entfernung von überstehenden Einzelstrangbereichen mit Mungo Bohnen-Nuclease behandelt und dann mit dir DNA von pRIT10911 (vgl. Beispiel 5).ligiert, die mit BamHI gespalten und mit Mungo Bohnen-Nuclease behandelt worden war.

Das Plasmid pRIT1091 1 (hergestellt gemäß

Beispiel 5)ist ein pUC9-Derivat, das ein 3136 bp großes' Hindlll-Fragment einer Expressionseinheit enthält, in der ein 1050 bp großes Hindlll-BamHI-Hefeglycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (TDH3)-Promotor-Fragment (welches das ATG liefert) an der BamHI-Stelle mit einem 935 bp großen BamHI-Hpal-Fragment der HBV-DNA fusioniert ist. Dieses HBV-DNA-Fragment codiert für die 42 terminalen Aminosäuren der Pre S2-Region, die 226 Aminosäuren des S-Gens (Serotyp adw) und besitzt 128 bp der 3'-nichtcodierenden DNA. Das S-Gen wird durch ein 1150 bp großes Hefe-DNA-Fragment flankiert, das das arg³-Transkriptions-Terminationssignal enthält. pUC9 ist aus Vieira et al., Gene, 19 (1982), 259-268, bekannt. Aus die-

ser Ligationsmischung wurde das Plasmid pRIT12893 isoliert in dem das 117 bp große Bglll-MboII-Fragment von pRIT12901 in pRIT10911 inseriert worden war. Die Nucleotid-Seguenz im

2 8 5 6 f 2

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Bereich des Fusionspunktes des TDH3-Promotors und des Mungo Bohnen-Nuclease-behandelten .117 bp großen HTLV-III BgIII-MboII-Fragments wurde bestimmt. Es zeigte sich, daß 10 Nucleotide zuviel von dem Bglll-Ende des Fragments entfernt worden waren. Folgende Sequenz wurde erhalten:

5' ATGGAGGAGGAGATATGAGGGA 3'

in der das erste unterstrichene ATG-Codon jenes des TDH3-Promotors aus pRIT10911 ist und das zweite ein internes ATG-Co-

IQ don des C7-Peptidfragments ist. Das zweite ATG-Codon überlappt mit einem TGA-Terminationscodon. Dieses Terminationscodon liegt in dem gleichen Leserahmen wie das erste ATG-Codon. Die Bestimmung der DNA-Sequenz des 3'-Endes der Fusionsregion in pRIT12893 zeigte die korrekte Sequenz für die

des

in Abiesephase-Fusion / MboII, Mungo Bohnen-Nuclease-behandelten Endes des HTLV-III-Fragments · nd der Pre S2-Sequenz von pRIT10911, wie in Fig. 20 gezeigt.

Die DNA von pRIT12893 wurde dann mit der Endonuclease HindIII gespalten und das erhaltene 3250 bp große Fragment isoliert und durch Agarosegel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt. Das 3250 bp große Hindlll-Fragment wurde dann in die Hindlll-Stelle des Plasmids YEpI3 inseriert. Es entstand pRIT12894. Die DNA des Plasmids wurde dann zur 2g Transformation von Zellen der Hefestämme DC5 und 10S44C nach Ito et al. (vgl. unten) verwendet. Die Zellen wurden auf Leucin-Unabhängigkeit selektioniert.

ag Die Transkription und Translation in Hefezellen der C7--Pre S2-S-Fusions-DNA in pRIT12894 führt zur Synthese eines kleinen, aus 5 Aminosäure bestehenden Peptides, das an dem TDH3-ATG-Codon beginnt und an dem unterstrichenen TGA-Codon endet sowie eines C7-Pre S2-S-Fusionspeptides, das an dem zweiten ATG-Codon im Inneren der C7-Sequenz beginnt. Dieses Fusionsprodukt enthält 38 Aminosäurereste des C7-Peptids anstelle der

285(5 ί 2

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45 Aminosäurereste des intakten Bglll-MboII-Mungo, ßcnnen-Nuclease behandelten C7-Fragmentes. Andere Plasmide als pRIT12893, die aus derselben Ligationsmischung erhalten wurden, können untersucht und sequenziert werden, um festzuste.llen, ob sie eine Fusion tragen, die dem kompletten Fragment entspricht.

B. Fusion der DNA-Sequenz des Peptids 121 mit der Pre S2-S-Region von pRIT10911

Zur Fusion wurde die DNA von pRIT12901 (beschrieben in Teil A) mit den Endonucleasen Hhal -and Hindlll gespalten, um das in Fig. 19 gezeigte 230 bp große Fragment freizusetzen. Dieses Fragment wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution cereinigt und dann mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um überstehende Einzelstrangbereiche aufzufüllen.

Das so behandelte Fragment wurde mit der DNA von pRIT10911, die mit BamHI gespalten und mit Mungo Bohnen-Nuclease behandelt worden war, ligiert. Aus dieser Ligationsuischung wurde das Plasmid pRIT12897 erhalten, in das da? 230 bp Fragment der HIV-DNA im richtigen Leserahmen für die Fusion mit der Pre S2-Sequenz von pRIT10911 inseriert worden war (vgl. Fig. 21) Die DNA des Plasmids pRIT12897 wurde mit der Endonuclease Hindlll gespalten und das erhaltene 3365 bp große Fragment, das den TDH3-Promotor, die HIV-Pre S2-S-Fu·- sion und die arg³-Terminationsregion enthält, durch Agarosegel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt. Dieses 3365 bp große Fragment wurde in YEp13 ligiert, das mit der Endonuclease Hindlll gespalten worden war. Es entstand das Plasmid pRIT12898. Dieses Plasmid wurde zur Transformation von Zellen der Hefestämme DC5 und 10S44C nach Ito et al

(vgl. unten) verwendet. Die Zellen wurden auf Leucin_r Unabhängigkeit selektioniert.

C. Fusion der DNA-Sequenz des "Dreesman"-Peptids mit der Pre S2-Region von pRIT10911

2 8 5*12 '

- 82 - ^£

Ein synthetisches 60 bp Fragment mit der nachstehend angegebenen Sequenz wurde in an sich bekannter Weise hergestellt, nämlich durch Synthese zweier Einzelstränge und deren Aneinander lagerung:

5 ' GATCTCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGA 3 3 ' AGCTGTCCGGGCTTCCTTATCTTCTTCTTCCACCTCTCTCT 5 '

5' GACAGAGACAGATCCCCG 3

3' CTGTCTCTGTCTAGGGGCCTAC 5

Dieses Fragment hat am 5'-Ende BgIII und am 3'-Ende BamHI-überstehende Einzelstrangbereiche. Etwa 200 ng eines doppelsträngigen Fragments und 300 ng des mit BamHI gespaltenen Plasmids pRIT10911 wurden gemischt und ligiert. Aus dieser Ligationsmischung wurde das Plasmid pRIT12899 erhalten, in das das 60 bp große Fragment an der BamHI-Stelle von pRIT10911 so inseriert worden war, daß eine Fusion im Ableseraster entstanden war (vgl. Fig. 22). DNA von pRIT12899 wurde mit der Endonuclease Hindlll gespalten und das erhaltene 3200 bp große Hindlll-Fragment durch Agarosegel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt. Dieses Hindlll-Fragment wurde in die Hindlll-Stelle von YEp13 inseriert· Es entstand das Plasmid pRIT12900. Dieses Plasmid wurde dann zur Transformation, von Zellen der Hefestämme DC5 und 10S44C nach Ito et al. (vgl. unten) verwendet. Die Zellen wurden auf Leucin-Unabhängigkeit .selektioniert.

Beispiel 16

Expression von pRIT12894 und pRIT12898-codierten Fusionsproteinen

Die Plasmide YEp13, pRIT12363, pRIT10912, pRIT12894 oder pRIT12898 wurden in Saccharomyces cerevisiae DC-5 (a,

²³ 5 ^ ΐ 2

leu2-3, Ieu2-112, his , cani-11) und Saccharomyces cerevisiae 10S44C (pep4-3, leu2-3, Ieu2-112) eingebracht. Danach wurde

auf Leucin-Unabhängigkeit selektioniert. Die Hefestämme DC5 und 10S44C wurden von M. Crabeel vom Ceria In- ° stitut, Anderlecht, Belgien (vgl. auch Cabezon, T. et al., Proc. Nat:. Acad., Sei., USA, 81 (1984), 6594-6598, erhalten. Der Hefestamm DC5 wurde in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am <-. J'Jni 1982 unter ATCC 20630 hinterlegt. Der Hefestamm 10S44C wurde in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 18. August 1986 unter ATCC 20819 hinterlegt.

Die Hefestämme DC5 oder 10S44C, die entweder YEp13, pRIT12363, pRIT10912, pRIT12894 oder pRIT12898 enthalten, wurden getrennt in flüssigem Medium ohne Leucin (YNB + 80 ug/ml Histidin oder YNB) kultiviert und in der mittleren logphase qeerntet. Zellen von 1 oder 2 ml Kultur wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 50 ul 0,125M Tris-HCl (pH 6,8)-Puffer, der 20 % Glycerin, 4 % SDS_x 6 M Harnstoff und 10 % 2-Mercaptoäthanoi enthielt, resuspendiert. Nach einer Inkubation von 5 Minuten bei 100⁰C wurde die Probe in einem 12,5%igen Trenn-,-5%igem Schicht-Gel nach dem Verfahren von Laemmli (Nature, 227 (1971), 680) elektrophoretisch aufgetrennt. Zelluläre Proteine wurden durch die Protein-Immunoblot-Technik (vgl. Burnette, Anal. Biochem., 112 (1981), 195-203; Gershoni and Palade, Anal. Biochem., 131 (1983), 1-15; Towbin and Gordon, J. Immunol. Bethods, 72 (1984), 313-340) untersucht. Nachdem elektrischen Transfer der Proteine auf ein Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schü]l, 0,45 um) (Towbin et al., Proc.

Natl. Acad. Sei., USA, 76 (1979), 4350-4354), wurde das Filter 1 Stunde bei 37°C in 3 % gelatineenthaltendem PBS vorinkubiert. Nachfolgend wurde das Filter 5mal jeweils 5 Minuten mit PBS, das 0,1 % Tween 20 (Polyoxyäthylensorbitan-monolaurat) enthält, gewaschen und eine Hälfte des Filters 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einem monoklonalen Antikörper behandelt, der

5*12

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gegen ein denaturierungs- und reduktionsresistentes Epitop eines aus Menschen stammenden HBsAg gerichtet ist (monoklonaler Antikörper 6, erhalten von H. Thomas, Royal Free Hospital,

London, England)

5

Die Filter wurden jeweils 5 Minuten mit

PBS, 0,1 % Tween 20 gewaschen und mit einem zweiten biotinylierten Antimaus-Schafantikörper (Amersham) in PBS, 1 % Gelatine, 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Die Filter wurden wieder mi'; PBS, .0,1 % Tween 20, 5mal jeweils 5 Minuten gewaschen und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Streptavidin-biotinylierten Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Komplex (Amersham) behandelt. Die Filter wurden wieder 3mal jeweils 5 Minuten mit PBS, 0,1 % Tween 20, gewaschen und schließlich mit 30 μΐ H₂O₂ und HRP-Farbentwicklerreagens, das 30 mg 4-Chloro-naphthalin-1-ol (BioRad) in 10 ml Methanol und 50 ml PBS enthält, inkubiert. Die Molekulargewichte der Antigene wurden durch den Vergleich mit den vorher angefärbten Proteinmarkern Ovalbumin, Alphachymotrvpsinogen, beta-Lactoglobulin, Lysozym, Cytochrom C (BRL) abgeschätzt.

pRIT10912 ist in Beispiel 5 beschrieben. pRIT12894 und pRIT12898 sind in Beispiel 15 beschrieben. In pRIT12363 liegt das 2900 bp große Hindlll-Fragment von pRIT12322 (Beispiel 8), das das S-Gen von HBV fusioniert mit dem TDH3-Promotor enthält, in einem Hefeplasmid-Vektor vor, der identisch mit pRIT12377 (Beispiel 12) ist. pRIT12363 produziert HBsAg unter der Kontrolle des TDH3-Promotors.

Unter den gesamten zellulären Proteinen aus den Hefestämmen DC5 und 10S44C, die mit pRIT12894 transformiert wurden, wurde durch den Immunblot eine mit dem S-Protein verwandte Proteinbande identifiziert, die einem geschätzten Molekulargewicht von etwa 32 kd entspricht. E^.ie mit dem S-Protein verwandte Proteinbande mit geschätztem Molekulargewicht von etwa 45 kd wurde unter den gesamten zellulären Proteinen aus den Hefestämmen DC5 und 10S44C, die durch pRIT12898 trans-

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formiert wurden, gefunden. Unter den gesamten zellulären Proteinen aus dem Hefestamm DC5, der durch pRIT10912 transformiert wurde, wurde ein mit dem S-Protein verwandte Proteinbande mit einem geschätzten Molekulargewicht von etwa 29 kd gefunden.

Rohextrakte von Zellen des Hefestammes DC5, die entweder pRIT12363, pRIT10912 oder pRIT12894 enthalten, wurden aus Zellen hergestellt, die in einem Selektivmedium (200 ml YNB oder YNB + 80 uq/ml Histidin) bis zum Ende der log-Phase kultiviert wurden. Die Zellen wurden sodann durch Zentrifugation gesammelt und in 10 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,4), der 0,5 % Tween 20 Polyoxyäthylensorbitan-monolaurat), 1 mM MPSF

(Phenylmethylsulfonylfluorid) und 2,5 % Isopropanol enthält, resuspendiert. Die Zellen wurden aufgeschlossen, indem sie zweimal durch eine French-Presse bei einem Druck von (1,38 χ 10 Pa) (20 000 psi) geführt wurden. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 30 OOOxg abzentrifugiert. Die Gesamtprotein-Konzentration des flüssigen Überstandes (Rohzellextrakt) wurde nach einem von Lowry et al. (J. Biol. Chem., 193 (1951), 265-275), beschriebenen Verfahren mit Rinderserumalbumin als Standard gemessen. Die Anwesenheit von HBsAg wurde durch Anwendung eines Radioimmun-Test-Kits (AUSRIA II, Abbott

Laboratories, North Chicago, Illinois) untersucht.

Die Immunblot-Analyse dieser Rohextrakte wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt.

Um die Natur dieser im RIA- und ELISA-Test positiven Strukturen zu unter ' ^n, wurde 1 ml der Rohzellextrakte mit 1,5M Cäsiumchlorid in 50 mM Natriumphosphat (pH 7,4) gemischt und 40 Stunden bei 40 000 xg in einem Beckman SW50.1 Rotor zentrifugiert.

Jie Cäsiumchlorid-Gleichgewichtszentrifugation der Rohextrakte und die Bestimmung der HBsAg-verwand-

3 K A ί Ο j ο ο ι Ι

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ten Antigenität in den Cäsiumchlorid-Fraktionen durch den AUSRIA-^Test zeigten das Antigen in einer Bande mit der Schwimmdichte von etwa 1,2 g/cm³. Dieses Ergebnis wurde durch die Immunblot-Analyse der Cäsiumchlorid-Fraktionen bestätigt.

Diese Ergebnisse zeigten, daß das 32 kd Fusionsprotein, das in Zellen des Hefestammes DC5, die pRIT12894 tragen, produziert wird, in Partikel eingebaut wird, die ähnlich dem 22 nm großen HBsAg-Partikel aus Humahserum sind. Aus der Höhe der Aktivität jener Partikel in dem AUSRIA-Test, _un(j dar Intensität der Reaktion des 32 kd Proteins in der Immunblot-Analyse, kann geschlossen werden, daß die S-Determinanten dieser Partikel durch die C7-Sequenzen teilweise blockiert

oder deformiert werden.

Aus diesen Ergebnissen wird geschlossen, daß Hefezellen der Stämme DC5 und 10S44C, die entweder mit pRIT12894 oder pHIT12898 transformiert sind, spezifisch ein Fusionspro-

tein mit einem Molekulargewicht von etwa 32 kd oder 45 kd synthetisieren, die beide ein S-Epitop tragen.

Dem Fachmann ist bekannt, daß hybride Partikel, die HIV-

Virus-Peptid-Epitope tragen, aus Kulturen von Hefezellen, 25

die mit pRIT12894, pRIT12898 oder pRIT12900 transformiert sind, durch übliche Methoden isoliert und gereinigt werden können. Solche gereinigten Partikel können dann zusammen mit einem Adjuvans, wie Al(OH)₃ oder AlPO. als Humanimpfstoff verwendet werden. Die bevorzugte Dosis liegt im Be-,

reich von 1 bis 1000 ug Protein und wird durch übliche Prüfungen bestimmt. Die Erfindung umfaßt auch andere Peptidregionen von viralem HIV-Protein, die mit der Pre S2-S-Region von HBV-codierenden Sequenzen fusioniert werden können, um

hybride Partikel zu bilden, die ein HIV-Epitop von Interesse 35

zeigen.

2 8 S 6 I 2

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Beispiel 1 7

Verwendung von Pre S1-Vektoren' zur Insertion von funktioneilen DNA-Seguenzen

Das Ausgangsmaterial ist das in Beispiel ¹⁴ beschriebene Plasmid pRIT12793. Das Plasmid enthält die Pre S1- Pre S2-codierende Sequenz auf einem 495 bp großen Ncol-Xbal-Fragment. Das Plasmid _PRIT12793 wird mit der Restriktionsendonuclease Ncol gespalten, mit T4 DNA-Polymerase zum Auffüllen der überhängenden Einzelstränge behandelt und mit Xbal Endonuclease nachgeschnitten. Das so behandelte Ncol-Xbal-Fragment wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt und in den Vektor pUC12 inseriert der mit den Endonucleasen Smal und Xbal gespalten war. Der Klonierungsvektor pUC12 ist erhältlich bei Amersham (Little Chalfont, Bucks, United Kingdom) und Pharmacia (Piscataway, NJ). Das Plasmid pRITX wird gemäß Fig. 23 erhalten. In der Pre S1- Pre S2-Region des Plasmids pRITX überlappt die einzige Ncol-Stelle das ATG-Startcodon der Pre S1-Region. Eine Xbal-Stelle ist direkt daneben und downstream des TAA-Stopcodons am C-Terminus der Pre S2-codierenden Sequenz vorhanden. Die einzige BstX-Restriktionsstelle ist nahe des N-terminalen Endes der Pre S1-codierenden Region.

Dem Fachmann ist bekannt, daß der Vektor pRITX oder ähnliche derivatisierte Vektoren, die die Pre S1-32-Sequenzen enthalten, zur Inserierung an der BstXI-Stelle von weiteren funktionellen DNA-Sequenzen, die für interessierende Peptide codieren, verwendet v/erden können, um diese Sequen-

Ablesephase zen in / mit der Pre S1-Region zu fusionieren.

Darüber hinaus können funktioneile DNA-Sequenzen nach der Doppelverdauung von pRITX und Derivaten mit BstX und BamHI oder EcoRI und Pstl und der Entfernung des größeren Teils

2 a 5 6\ 2

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der Pre S1-codierenden Region und des N-terminalen Teils der Pre S2-Sequenz zwischen die entsprechenden Restriktionsstellen eingeführt werden. Solche Fusionen werden vom Typ Pre SI-eingeführte funktioneile DNA-Pre S2-Sequenzen sein.

Sind einmal solche Fusionen gemacht, können sie in andere Plasmide einrekombiniert werden, die den Rest der Pre £Ί-Pre S2-Sequenzen und jene Sequenzen enthalten, die für die Stabilität und Replikation in E. coli und Saccharomyces cerevisiae (vgl. Beispiel 1²) notwendig sind.

Beispiel 18

Impfstoffhersteilung

Ein Impfstoff wird folgendermaßen hergestellt: zu einer gepufferten wäßrigen Lösung von 3 % Aluminiumhydroxid (1OmM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,8; sterilisiert durch Filtration) werden erfindungsgemäß hergestellte Partikel in gleichem Puffer unter Rühren bis zu einer Endkonzentration des Polypeptids von 100 ug/ml und des Aluminiums (Al ⁺) von 0,5 mg/ml zugegeben. Der pH wird auf 6,8 gehalten. Die Mischung wird über Nacht bei 0⁰C stehengelassen. Thimersol wird bis zu einer Endkonzentration von 0,005 % zugegeben. Der pH wird überprüft und, wenn nötig, wieder auf 6,8 eingestellt.

Claims (7)

1. .205*1 2

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   Patentanspruch

   1. Verfahren zur Herstellung eines HIV-Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, da/9 man ein HIV-Gen, das für das entsprechende Oberflächenprotein codiert, oder einen Teil des Gens in Ablesephase an das 3'-Ende mindestens eines Teils der Pre S2-Region des HBV-Genoms ligiert, wobei dieser Teil so gro/J ist, da/3 er für ein immunogenes Protein codiert, dieses Fusions-DNA-Molekül an eine Expressionskontrollsequenz eines Expressionsvektors funktionell Iigiert, das erhaltene rekombinante DNA-Molekül in einen eukaryontichen Wirtsorganismus in einem Kulturmedium züchtet, aus dem Zell-Lysat oder Kulturmedium das rekombinante Oberflächenprotein bzw. das Hybridpartikel isoliert und mit üblichen Trägern und/oder Hilfsstoffen zu Dosierungseinheiten konfektioniert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da/3 man zur Herstellung des rekombinanten HlV-Oberflächenproteins bzw. Hybridpartikels die für das HIVC7-Protein, das Peptid 121 oder das Dreesman-Peptid codierende Sequenz verwendet.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da/3 als Expressionskontrollsequenz der TDH3-Promoter verwendet wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als eukaryontischer Wirt eine Hefezelle verwendet wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, da/3 als Hefen solche der Gattung Saccharomyces verwendet werden.

   - 90 -
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, da/3 als Hefen solche der Art Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces carlsbergensis verwendet werden.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, da/3 als Hefen solche des Stammes DC5, DC5 cir", 10S44C oder 10S44C cir" verwendet werden.