DE3586960T3

DE3586960T3 - Expression in Hefezellen, von biologisch aktiven Analoga eines Wachstumsfaktors, abstammend von Blutplättchen

Info

Publication number: DE3586960T3
Application number: DE3586960T
Authority: DE
Inventors: Mark Joseph Murray; James Darrel Kelly
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1984-10-12
Filing date: 1985-10-10
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2005-10-11
Also published as: EP0177957B2; AU4845485A; DE3588218D1; EP0177957A3; ATE84312T1; DE3588218T2; JPS62278A; NL990016I1; JPH10117790A; EP0177957B1; NL990016I2; AU638010B2; JP3145968B2; LU90408I2; AU5488590A; DE3586960D1; DE487116T1; CA1340846E; CA1340212C; EP0177957A2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von PDGF-Analoga im allgemeinen und insbesondere auf die Expression biologisch aktiver PDGF-Analoga in Hefe.
Stand der Technik
Es ist gezeigt worden, daß der menschliche Plättchen-abgeleitete Wachstumsfaktor (platelet derived growth factor – PDGF) im Serum das vorherrschende mitogene Protein für mesenchymal abgeleitete Zellen ist. Dies ist durch vielzählige Untersuchungen der Induktion entweder der Zellvermehrung oder der DNA-Synthese (einer Vorbedingung für die Zellteilung) in kultivierten glatten Muskelzellen, Fibroblasten und Gliazellen durch Plättchenextrakte oder durch gereinigten PDGF gut dokumentiert (Ross et al., PNAS 71: 1207, 1974; Kohler und Lipton, Exp. Cell Res. 87: 297, 1974; Westermark und Wasteson, Exp. Cell Res. 98: 170, 1976; Heldin et al., J. Cell. Physiol. 105: 235, 1980; Raines und Ross, J. Biol. Chem. 257: 5154, 1982). Weiterhin ist PDGF ein potentes Chemoattraktanz für Zellen, die für PDGF als Mitogen empfänglich sind (Grotendorst et al., J. Cell Physiol. 113: 261, 1982; Seppa et al., J. Cell Biol. 92: 584, 1982). Es ist nicht allgemein der Fall, daß Mitogene auch als chemotaktische Mittel wirken. Infolge seiner mitogenen Aktivität ist PDGF als wichtiger Bestandteil eines definierten Mediums für das Wachstum von Säugetierzellen in Kultur nützlich, wodurch es zu einem wertvollen Forschungsreagenz mit vielfältigen Anwendungen bei der Untersuchung der Animalzellbiologie wird.
In vivo zirkuliert PDGF normalerweise in den α-Granula der Plättchen gespeichert. Eine Verletzung der arteriellen Endothelialauskleidung führt dazu, daß die Plättchen sich an das exponierte Bindegewebe anheften und ihre Granula freisetzen. Man nimmt an, daß das freigesetzte PDGF chemotaktisch Fibroblasten und glatte Muskelzellen zur Verletzungsstelle anzieht und ihre fokale Proliferation als Teil des Wundheilungsprozesses induziert (Ross und Glomset, N. England Journal of Medicine 295: 369, 1976).
Es ist postuliert worden, daß als Teil dieser Antwort auf eine Verletzung der von den Plättchen freigesetzte PDGF eine ursächliche Rolle für die Entwicklung von proliferativen Läsionen bei Atherosklerose spielen könnte (Ross und Glomset, ibid.), die eine der Hauptursachen für myocardiale und cerebrale Infarkte sind. Die Prophylaxe- und Behandlungsstrategien der Atherogenese sind in der Vergangenheit eng auf die Verringerung von Risikofaktoren für die Krankkeit gerichtet worden, beispielsweise Senkung des Blutdruckes in hypertonen Subjekten und Verringerung erhöhter Cholesterinspiegel in Hypercholesterinämie-Patienten.
Neuere Untersuchungen haben gezeigt, daß eine der beiden Proteinketten von PDGF und das mutmaßliche transformierende Protein des Affensarkomavirus (SSV), eines akut transformierenden Retrovirus, sich aus den gleichen oder eng verwandten zellulären Genen entwickelt zu haben scheinen. Insbesondere eine Computeranalyse einer Aminosäureteilsequenz von PDGF hat gezeigt, daß eine weitgehende Homologie mit dem Genprodukt p28^sis von SSV besteht (Doolittle, Waterfield und Johnsson, ibid.). Weiterhin haben jüngere Studien gezeigt, daß p28^sis und PDGF sowohl antigenische als auch strukturelle Ähnlichkeiten aufweisen (Robbins et al., Nature 305: 605, 1983; Niman, Nature 307: 180, 1984).
Obwohl zuvor Versuche unternommen worden sind, das v-sis-Gen in einem transformierten Mikroorganismus zu exprimieren, z.B. der in Devare et al., (Cell 36: 43, 1984) zusammengefaßte, sind diese bei der Produktion mitogenen Materials nicht erfolgreich gewesen. Kürzlich ist die Herstellung von p28^sis als Fusionsprotein in E. coli beschrieben worden (Wang et al., J. Biol. Chem. 259: 10645, 1984). Dieses Protein scheint mit PDGF um die Bindung an die PDGF-Rezeptorstellen zu konkurrieren. Obwohl von SSV-transformierten Nagetierzellen gezeigt worden ist, daß diese eine mitogene Aktivität ähnlich der von PDGF aufweisen (Deuel et al., Science 221: 1348, 1983; Owen et al., Science 225: 54, 1984), ist es nicht klar, ob diese Aktivität die Folge eines Genproduktes von SSV (d.h., p28^sis) ist. Außerdem stellen mit einer Vielzahl von von SSV verschiedenen Viren transformierte Zellen ein PDGF-ähnliches Mitogen im Kulturmedium her (Bowen-Pope et al., PNAS 81: 2396, 1984).
Obgleich natürliches PDGF aus menschlichem Plasma oder Plättchen als Ausgangsmaterial isoliert werden kann, handelt es sich um ein kompliziertes und teures Verfahren, was teilweise auf die begrenzte Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials zurückzuführen ist. Außerdem ist es infolge seines extrem geringen Vorkommens und seiner biochemischen Eigenschaften schwierig, PDGF mit hoher Ausbeute von anderen Serumbestandteilen zu reinigen. Weiterhin ist mit der therapeutischen Verwendung von Produkten, die aus menschlichem Blut erhalten werden, das Risiko verbunden, Krankheiten infolge einer Kontamination mit beispielswei se Hepatitis-Virus, Cytomegalie-Virus oder dem Erreger des Acquired Immune Deficiency Syndroms (AIDS) zu übertragen.
Angesichts der klinischen Verwendbarkeit von PDGF bei der Behandlung von Verletzungen, bei denen die Heilung eine Proliferation von Fibroblasten oder glatten Muskelzellen erfordert, und angesichts seines Wertes als bedeutendem Bestandteil eines definierten Mediums für das Wachstum von Säugetierzellen in Kultur, ist die Erzeugung von brauchbaren Mengen eines dem authentischen PDGF ähnlichen Proteinmoleküles, das eine mitogene Aktivität besitzt, offensichtlich von unschätzbarem Wert.
Außerdem würde die Fähigkeit, relativ große Mengen von PDGF zu erzeugen, ein nützliches Werkzeug für die Aufklärung der vermutlichen Rolle des v-sis-Proteins, p28^sis, im Tumorbildungsprozess darstellen.
Weiterhin wäre, da die lokale Anhäufung von glatten Muskelzellen in der Intimaschicht der arteriellen Zellwand wesentlich für die Entwicklung atherosklerotischer Läsionen ist (Ross und Glomset, ibid.), eine Strategie für die Prophylaxe und Behandlung von Atherosklerose, die Proliferation glatter Muskelzellen zu supprimieren. Die Fähigkeit, große Mengen PDGF zu erzeugen, wäre für die Entwicklung von Inhibitoren oder das Ausarbeiten spezieller Ansätze zur Verhinderung oder Störung der in vivo-Aktivität von PDGF in Individuen mit Atherosklerose nützlich.
Offenbarung der Erfindung
Kurz gesagt offenbart die vorliegende Erfindung eine DNA-Konstruktion, die fähig ist, die Expression und Sekretion biologisch aktiver PDGF-Analoga in Hefezellen zu steuern. Die DNA-Konstruktion enthält einen Transkriptionspromotor, dem stromabwärts ein Gen folgt, das für ein Protein mit im wesentlichen der gleichen Struktur und/oder mitogenen Aktivität wie PDGF kodiert, und eine Signalsequenz, die fähig ist; die Sekretion des Proteines aus der Hefezelle zu steuern. Das Gen kann das v-sis-Gen oder ein Derivat des v-sis-Genes des Affensarkomaviruses oder eines Teils davon sein, das für ein Protein mit biologischer Aktivität kodiert. Weiterhin kann das Derivat des v-sis-Genes ein Teil des v-sis-Genes sein, das im wesentlichen mit der B-Kette von PDGF homolog ist. Zusätzlich kann das Gen das menschliche cDNA-Gen für PDGF oder Teile davon sein, das bzw. die für ein Protein mit biologischer Aktivität kodiert bzw. kodieren.
In einer weiteren Ausführungsform offenbart die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen biologisch aktiver PDGF-Analoga durch Einführen einer DNA-Konstruktion in einen Hefewirt, wobei die DNA-Konstruktion fähig ist, die Expression und Sekretion biologisch aktiver PDGF-Analoga in Hefezellen zu steuern. Die DNA-Konstruktion enthält einen Transkriptionspromotor, dem stromabwärts ein Gen folgt, das für ein Protein mit im wesentlichen der gleichen Struktur und/oder mitogenen Aktivität wie PDGF kodiert, und eine Signalsequenz, die zum Steuern der Sekretion des Proteines aus der Hefezelle fähig ist. Im Anschluß an das Einführen der DNA-Konstruktion in den Hefewirt umfaßt das Verfahren das Wachsenlassen des Hefewirtes in einem entsprechenden Medium und anschließend das Isolieren des Proteinproduktes des Genes aus dem Hefewirt. Mit einer solchen DNA-Konstruktion transformierte Hefewirtszellen sind ebenso offenbart.
Die DNA-Konstruktion enthält einen Transkriptionspromotor, dem stromabwärts ein Gen folgt, das für ein Protein mit im wesentlichen der gleichen Struktur und/oder mitogenen Aktivität wie PDGF kodiert, und eine Signalsequenz, die zum Steuern der Sekretion des Proteins aus der Hefezelle fähig ist, wobei der Promotor und die Signalsequenz aus Hefe stammen.
Gemäß der Erfindung ist die eukaryontische Zelle eine Hefezelle, und die DNA-Konstruktion wird besser als extrachromosomales Element bezeichnet.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung werden unter Hinweis auf die folgende ausführliche Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen offensichtlich.
Figurenbeschreibung
1A ist eine schematische Restriktionskarte des proviralen Genomes von SSV.
1B zeigt die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz, für die der v-sis-Bereich des SSV-Genomes kodiert.
2 veranschaulicht die Konstruktion eines Plasmides, das den MFα1-Promotor und die stromaufwärts vom v-sis-Gen gelegene Sekretionssignalsequenz enthält.
3 veranschaulicht die Konstruktion des Plasmides p192.
4 veranschaulicht die Oligonukleotid-gesteuerte Deletionsmutagenese der aminoterminalen 66 v-sis-Codons.
5 zeigt die Konstruktion des Plasmides p270.
6 veranschaulicht die Insertion von v-sis-Expressionseinheiten stromaufwärts vom TPI-Terminator.
7 veranschaulicht das Ersetzen des MFα1-Promotors durch den TPI-Promotor und Einbeziehen der VS2α-Konstruktion in den Vektor pCPOT.
8 veranschaulicht die Konstruktion des Plasmides pTVS2αT.
9 veranschaulicht die Konstruktion einer B-Ketten-Expressionseinheit VSB und ihre Einführung in den Vektor pMPOT2.
10 zeigt die elektrophoretische und daran anschließende Hybridisierungsanalyse der aus einem Hefewirt iso lierten Gesamt-RNA, wobei der Hefewirt mit verschiedenen Plasmiden transformiert worden ist und mit einem Nicktranslatierten v-sis-Genfragment hybridisiert (probed) wird.
11 zeigt die Ergebnisse eines ELISA von konzentrierten Kulturmedien der Hefetransformanten, die die Hefeplasmide pVSα, pVS2α, p117-2 und pCPOT enthalten.
12 ist eine Dosis-Wirkungs-Kurve der mitogenen Aktivität aus konzentrierten Kulturmedien von Hefetransformanten, die die Plasmide pVSα und p117-2 enthalten, im Vergleich mit gereinigtem PDGF.
13 ist eine Dosis-Wirkungs-Kurve der Bindung an den PDGF-Rezeptor mit Medienkonzentraten von Hefetransformanten, die die Plasmide pVSαm, pVS2αm, pVSBm und pMPOT2 enthalten, im Vergleich mit authentischem PDGF.
14 ist eine Dosis-Wirkungs-Kurve der mitogenen Aktivität von Mediumkonzentraten von Hefetransformanten, die die Plasmide pVSαm, pVS2αm, pVSBm und pMPOT2 enthalten im Vergleich mit authentischem PDGF.
15 ist eine graphische Darstellung, die die mitogene Aktivität des von VSB kodierten Proteins nach Fraktionierung durch Polyacrylamidgelelektrophorese zeigt.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Für das Verständnis der vorliegenden Erfindung mag es hilfreich sein, vor deren weiterer Erläuterung bestimmte Ausdrücke, die im folgenden verwendet werden, zu definieren.
Polypeptid: Ein Polymer aus Aminosäuren.
Leseraster: Die Anordnung von Nukleotidcodons, die für einen nicht unterbrochenen Bereich von Aminosäuren kodieren. Während der Translation einer mRNA muß das korrekte Leseraster beibehalten werden. Beispielsweise kann die Sequenz GCUGGWGUAAG in drei Leseraster oder Phasen translatiert werden, was davon abhängt, ob man mit dem G, dem C oder dem U beginnt, und dies kann daher drei verschiedene Peptidprodukte ergeben. Die Translation einer Matrize beginnt mit einem AUG-Codon, geht weiter mit Codons für spezifische Aminosäuren und endet mit der Translation eines der Translations-Terminationscodons.
Kodierende Sequenz: DNA-Sequenzen, die im entsprechenden Leseraster direkt für die Aminosäuren eines Proteins kodieren.
Komplementäre DNA oder cDNA: Ein DNA-Molekül oder eine Sequenz, die entsprechend den auf einer mRNA-Matrize vorhandenen Sequenzen enzymatisch synthetisiert worden ist.
Sekretions-Signalsequenz: Der Teil eines Genes, der für ein Signalpeptid kodiert. Ein Signalpeptid ist die Aminosäuresequenz eines sekretorischen Proteins, die seine Translokation in den Sekretionsweg der Zelle signalisiert. Signalpeptide treten im allgemeinen am Beginn (Amino-Terminus) eines Proteines auf und sind 20 bis 40 Aminosäuren lang mit einem Bereich von 9 bis 10 hydrophoben Aminosäuren in ihrer Mitte. Das Signalpeptid wird sehr oft während des Sekretionsprozesses proteolytisch vom Protein abgespalten.
Zelloberflächen-Rezeptor: Ein Proteinmolekül an der Oberfläche einer Zelle, das mit einem Molekül, das sich der Zelloberfläche nähert, spezifisch interagiert oder dieses bindet. Sobald der Rezeptor das erkannte Molekül gebunden hat, bewirkt dies spezifische Veränderungen in der Physiologie der Zelle.
Mitogen: Ein Molekül, das Zellen dazu anregt, eine Mitose einzugehen. Mitose ist eine asexuelle somatische Zellteilung, die zu zwei Tochterzellen führt, deren jede die gleiche Anzahl von Chromosomen wie die Elterzelle hat.
Transformation: Das Verfahren, den Genotyp einer Empfängerzelle oder eines Mikroorganismus stabil und vererbbar durch das Einführen gereinigter DNA zu verändern. Dies wird normalerweise durch eine Veränderung im Phänotyp des Empfängerorganismus nachgewiesen.
Transkription: Der Prozess der Erzeugung einer mRNA-Matrize von einem Strukturgen.
Expression: Der Prozess zum Erzeugen eines Polypeptides, ausgehend von einem Strukturgen, wobei dieser Prozess eine Kombination von Transkription und Translation ist. Ein Expressionsvektor ist eine von einem Plasmid abgeleitete Konstruktion, die so konzipiert ist, daß die Expression eines von dem Vektor getragenen Genes ermöglicht wird.
Plasmid: Eine extrachromosomale doppelsträngige DNA-Sequenz, die ein intaktes "Replikon" umfaßt, so daß das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in einem einzelligen Organismus vorliegt, können die Charakteristika dieses Organismus als ein Ergebnis der Expression von DNA-Sequenzen des Plasmides verändert oder transformiert werden. Beispielsweise transformiert ein das Gen für die Tetracyclinresistenz (tet^R) tragendes Plasmid eine zuvor Tetracyclin-empfindliche Zelle in eine Zelle, die dagegen resistent ist.
Hefepromotor: DNA-Sequenzen stromaufwärts eines Hefegenes, die seine Transkription fördern.
Biologische Aktivität: Einige Funktionen oder ein Satz von Aktivitäten, die von einem Molekül in einem biologischen Zusammenhang gezeigt werden (d.h., in einem Organismus oder einem in vitro Abbild). Im Fall von PDGF umfassen diese biologischen Aktivitäten die Bindung an Zelloberflächen-Rezeptormoleküle, das Induzieren von Chemotaxis und das Induzieren einer Mitogenese bei empfänglichen Zelltypen.
Wie oben bereits gesagt, ist gezeigt worden, daß der menschliche Plättchen-abgeleitete Wachstumsfaktor (PDGF) ein vorherrschendes mitogenes Protein im Serum ist. Es ist bekannt, daß PDGF aus zwei Polypeptidketten, einer A-Kette und einer B-Kette, zusammengesetzt ist, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden, um so ein biologisch aktives Molekül zu bilden. Die A-Kette und 8-Kette alleine scheinen keine mitogene Aktivität aufzuweisen (Raines und Ross, ibid.), und Versuche, die Aktivität durch Reoxidation reduzierter Polypeptide zu rekonstituieren, sind erfolglos gewesen. Kürzlich ist gezeigt worden, daß die Aminosäuresequenz der B-Kette im wesentlichen homolog mit einem Teil des v-sis-Genproduktes, p28^sis, ist (Doolittle et al., Science 221: 275, 1983; Waterfield et al., Nature 304: 35, 1984; und Johnsson et al., Embo 3: 921, 1984). Die Homologie zwischen diesen beiden Proteinen weist stark darauf hin, daß sie sich von dem gleichen oder eng verwandten zellulären Genen ableiten.
Auf der Grundlage der Tatsache, daß bekannt war, daß biologisch aktives PDGF äquimolare Mengen der A- und B-Kette enthält, und daß vorhergehende Versuche, die v-sis-Sequenzen in E. coli zu exprimieren, nicht zu mitogenem Material geführt haben, wäre es nicht zu erwarten gewesen, daß die Expression nur eines Teiles des v-sis-Genes, der einem Teil des PDGF-Genes homolog ist, zu einem Molekül mit mitogener Aktivität führen würde. Die vorliegende Erfindung betrifft im Gegensatz zu den oben festgehaltenen Versuchen die Expression des v-sis-Genes oder von Teilen davon in Abwesenheit heterologer Sequenzen, so daß die exprimierten Moleküle mit der B-Kette von PDGF stärker verwandt sind. Weiterhin ist das erfindungsgemäße Expressionssystem so ausgelegt, daß das Genprodukt über einen eukaryontischen Sekretionsweg erzeugt werden kann. Dies ermöglicht, daß die exprimierten Proteinmoleküle sauber prozessiert und zusammengesetzt werden, so daß sie biologische Aktivität aufweisen. Die vorliegende Erfindung führt daher im. Gegensatz zu früheren Bemühungen zur Sekretion von PDGF-Analoga, die biologisch aktiv sind.
In seiner aktiven Form ist PDGF ein hitzestabiles Protein, das aus Arten heterogener Größe von zwischen 28000 und 31000 Dalton zusammengesetzt ist, wobei jede dieser individuellen Arten bei der Stimulation der DNA-Synthese aktiv ist (Raines und Ross, ibid.; Deuel et al., J. Biol. Chem. 256: 8896, 1981; Antoniades, PNAS 78: 7314, 1981).
Wo individuelle Arten mit Molekulargewichten von 27000, 28500, 29000 und 31000 Dalton isoliert und untersucht worden sind, ist festgestellt worden, daß sie eine vergleichbare mitogene Aktivität und Aminosäurezusammensetzung haben (Raines und Ross ibid.). Diese Arten zeigen weiterhin eine weitgehende Homologie der tryptischen Peptide. Die leichten Größenvariationen zwischen den Arten beruhen wahrscheinlich auf Unterschieden der Kohlehydratzusammensetzung und der Proteolyse.
Durch Untersuchungen von PDGF, der häufig aus plättchenreichem menschlichem Plasma gereinigt worden ist, erscheint es wahrscheinlich, wie oben gesagt, daß PDGF aus zwei Polypeptidketten, einer A-Kette (14000 Dalton) und einer B-Kette (16000 Dalton) zusammengesetzt ist, die über Disulfidbindungen miteinander unter Bildung eines biologisch aktiven Dimermoleküles verbunden sind (Raines & Ross, Deuel et al., Antoniades, ibid.). Die in der Literatur zu findende PDGF-Nomenklatur ist nicht einheitlich (Doolittle et al., Waterfield et al., Raines und Ross, Johnsson et al., ibid.). Die Nomenklatur von Johnsson et al., (ibid.), bei der die beiden in reinem PDGF gefundenen Polypeptide als "A-Kette" und "B-Kette" bezeichnet werden, ist übernommen worden. Die B-Kette hat Homologien mit p28^sis und war zuvor als "Peptid I" (Waterfield et al., ibid.) oder "1a" (Doolittle et al., ibid.) bezeichnet worden. Die A-Kette war zuvor als "Peptid II" (Waterfield et al., ibid.) oder "2a" (Doolittle et al., ibid.) bezeichnet worden. Aus einer partiellen Aminosäuresequenz von PDGF abgeleitete Daten weisen darauf hin, daß die beiden Polypeptidketten (A-Kette und B-Kette) einige Homologie aufweisen (Doolittle et al., ibid., Waterfield et al., ibid., und Johnsson et al., ibid., Antoniades und Hunkapiller, Science 220: 963, 1983). Die A-Kette oder B-Kette allein scheinen keinerlei mitogene Aktivität aufzuweisen, und Versuche, die Aktivität durch Reoxidation der reduzierten Polypeptide zu rekonstituieren, sind nicht erfolgreich gewesen (Raines und Ross, ibid.).
Das v-sis-Gen ist, wie oben erwähnt, das transformierende Gen des Affensarkomavirus (SSV). Das v-sis-Gen ist kloniert und seine DNA-Sequenz bestimmt worden (Devare et al., PNAS 79: 3179, 1982; Devare et al., PNAS 80: 731, 1983). Die Analyse der Sequenz ergab ein offenes Leseraster, das für ein 28000 Dalton Protein kodieren könnte, das als p28^sis bezeichnet wurde. Im Anschluß daran wurde ein solches Protein in SSV-infizierten Zellen identifiziert (Niman, ibid.; Robbins, ibid.). Es wurde festgestellt, daß die vorhergesagte Aminosäuresequenz des v-sis-Genproduktes, p28^sis, einen hohen Grad von Homologie mit der tatsächlichen Aminosäuresequenz eines Teiles der B-Kette von PDGF hat (Johnsson, ibid.). Die Homologie der PDGF-Kette mit dem v-sis-Genprodukt beginnt bei Aminosäure 67 von p28^sis, einem Serin, und setzt sich über ungefähr 109 Aminosäuren bis zu einem Threoninrest bei Aminosäure 175 fort. Die Aminosäuresequenzen, die dem mit der B-Kette homologen Bereich von p28^sis vorangehen oder folgen, stimmen weder mit der A- noch mit der B-Kette von reifem PDGF überein (Johnsson, ibid.). Außerdem ist gezeigt worden, daß PDGF und p28^sis antigenisch ähnlich sind (Niman, ibid.; Robbins, ibid.). Das v-sis-Genprodukt, p28^sis, ein Protein von ungefähr 225 Aminosäuren, scheint in SSV-infizierten Zellen proteolytisch zu einem Protein zu ungefähr 20000 Dalton (p28^sis) prozessiert zu werden (Niman, ibid.; Robbins, ibid.). Dieses 20000 Dalton Protein kann mit einem Antiserum gegen PDGF immunpräzipitiert werden.
Wie oben bereits festgehalten, haben vorhergehende Versuche, v-sis-Sequenzen in Prokaryonten zu exprimieren, kein biologisch aktives Material ergeben. Weiterhin sind das v-sis-Genprodukt p28^sis sowie PDGF selbst sezernierte Säugetierproteine. Um biologisch aktives Material zu erhalten, verwendet die vorliegende Erfindung den Sekretionsweg von Hefezellen zur Expression des v-sis-Genes und von Derivaten des v-sis-Genes. Expression und Sekretion des v-sis-Genproduktes von einer Hefezelle ermöglichen Prozessieren und Zusammensetzen, was zu Molekülen mit nativer und aktiver Konformation führt.
Ein leicht manipulierbarer und gut charakterisierter Eukaryont ist die Hefezelle. Aus diesem Grund wurde Hefe als eine angemessene eukaryontische Zelle im Rahmen der vorliegenden Erfindung ausgewählt.
Dementsprechend wurden das v-sis-Gen und Fragmente davon, die für die 109 Aminosäuren mit Homologie zur PDGF-B-Kette kodieren, in einen Hefepromotor enthaltende extrachromosomale Hefeelemente insertiert, die zum Steuern der Expression biologisch aktiver PDGF-Analoga fähig sind. Erfindungsgemäß folgt dem Hefepromotor stromabwärts ein Fragment des v-sis-Genes, das für ein Protein mit im wesentlichen der gleichen Struktur und/oder mitogenen Aktivität wie PDGF kodiert.
Gene, die für ein Protein mit im wesentlichen der gleichen Struktur und/oder mitogenen Aktivität wie PDGF kodieren, umfassen das v-sis-Gen oder ein Derivat des v-sis-Genes des Affensarkomavirus (SSV) oder Teile davon oder das menschliche cDNA-Gen für PDGF oder Teile davon. Besonders bevorzugt sind DNA-Sequenzen, die für im wesentlichen mit der B-Kette von PDGF homologe Polypeptide kodieren. Die in extrachromosomalen Elementen zu verwendenden Gene können unter Anwendung von rekombinanter DNA-Technologie isoliert werden.
Das menschliche PDGF-cDNA-Gen kann aus einer menschlichen cDNA-Bank isoliert werden, die aus einer entsprechenden Quelle für Boten-RNA hergestellt worden ist, indem das v-sis-Gen oder ein Fragment davon als Hybridisierungssonde verwendet wird. Eine bevorzugte mRNA-Quelle sind die menschlichen Endothelialzellen aus der Umbilicalvene. Diese Zellen können in vitro für kurze Zeiträume kultiviert werden und von ihnen ist bekannt, daß sie PDGF in das Kulturmedium sezernieren (DiCorleto und Bowen-Pope, PNAS 80: 1919, 1983). Die Identität dieses cDNA-Gens als dessen, das für PDGF kodiert, kann durch DNA-Sequenzierung verifiziert werden.
Promotoren, die in Hefe verwendet werden können, umfassen den Hefe-α-Faktor-(MFα1-)Promotor und den Hefetriosephosphatisomerase (TPI-Promotor). Promotoren können außerdem von anderen Hefegenen, z.B. Alkoholdehydrogenase 1 (ADH1), Alkoholdehydrogenase 2 (ADH2), erhalten werden.
Die hier beschriebenen Konstruktionen waren so gewählt, daß das v-sis-Genprodukt aus der Hefezelle in das Medium sezerniert werden würde. Dies wurde durch Verwendung von Sekretionssignalsequenzen des Hefe-Mating-Pheromon α-Faktors erreicht (Kurjan und Herskowitz, Cell 30: 933, 1982; Julius et al., Cell 36: 309, 1984; und Brake et al., PNAS 81: 4642, 1984), obwohl andere Signalsequenzen ebenfalls verwendet werden können. Um die Effizienz der Transkriptionstermination und Polyadenylierung von mRNA sicherzustellen, wurde eine Hefeterminatorsequenz, beispielsweise der Triosephosphatisomerase-Terminator, zugefügt (Alber und Kawasaki, J. Molec. Genet. Appl. 1: 419, 1982).
Sobald ein entsprechendes DNA-Fragment, das das Gen von Interesse enthält, identifiziert worden ist, wird es mit einem entsprechenden Promotor und einer Sekretions-Signalsequenz ligiert. Verfahren zum Ligieren von DNA-Fragmenten sind ausführlich beschrieben worden (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982); der Fachmann weiß, wie sie durchgeführt werden. Nach der Herstellung der v-sis-Expressionskonstruktionen werden diese Konstruktionen in Hefeexpressionsvektoren inseriert.
Für die ursprünglichen Expressionskonstruktionen wurde das replizierende Plasmid YEp13, das einen Replikations ursprung und einen selektierbaren Marker, das LEU2-Gen enthält, verwendet. Die Verwendung des selektierbaren Markers LEU2 in Hefezellen, die hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Leucinsynthese defekt sind, erlaubt die positive Selektion solcher Zellen, die das LEU2-Plasmid enthalten, auf der Grundlage deren Fähigkeit, auf einem Leucinfreien Wachstumsmedium zu wachsen. Obwohl diese Konstruktionen die Expression eines Produktes mit einiger mitogener Aktivität steuerten, ist es bevorzugt, einen Expressionsvektor zu verwenden, der stabiler in der Wirtszelle behalten wird, um eine höhere mitogene Aktivität pro Kultur zu erzeugen.
In dieser Hinsicht geeignete Hefeexpressionsvektoren sind die Plasmide pCPOT und pMPOT2, die das für das glycolytische Enzym Triosephosphatisomerase kodierende Gen (POT1-Gen) aus Schizosaccharomyces pombe enthalten. Das Einbeziehen des POT1-Genes stellt die stabile Beibehaltung des Plasmides in einer entsprechenden Wirtszelle infolge seiner Fähigkeit, die in dieser Wirtszelle vorhandene entsprechende Gendeletion zu komplementieren, sicher. Zusätzlich wurde der MFα1-Promotor durch den Saccharomyces cerevisiae TPI-Promotor ersetzt, mit der Absicht, die Transkription und Expression weiter zu steigern.
Nach der Herstellung der DNA-Konstruktion mit in einem entsprechenden Vektor eingebautem TPI-Promotor, α-Faktor Sekretionssignalsequenz, entsprechenden Segment des v-sis-Genes oder des menschlichen cDNA-Genes für PDGF und TPI-Terminator, wird die Konstruktion in einem Hefewirt mit einer TPI-Deletion transformiert. Verfahren für die Transformation von Hefe sind in der Literatur gut bekannt.
Die transformierten Hefezellen können durch Wachstum auf konventionellem Glucose-haltigem Komplexmedium selektioniert werden, wenn der Vektor pCPOT verwendet wird. Ein gebräuchliches Medium, beispielsweise YEPD (20 g Glucose, 20 g Bacto-Pepton, 10 g Hefeextrakt pro Liter) kann verwendet werden. Nach der Selektion werden die eine v-sis-Expressionskonstruktion enthaltenden Transformanten auf konventionellem Komplexmedium bis zur stationären Phase wachsen gelassen, die Zellen werden entfernt und das Medium konzentriert. Unter Beachtung der Tatsache, daß authentisches humanes PDGF ein stark kationisches und hydrophobes Protein ist (Raines und Ross, ibid.; Antoniades, ibid., Deuel et al., 1981, ibid.), wurde erwartet, daß das vermutete Hefeprodukt ähnliche Eigenschaften aufweisen würde, was erlauben würde, es auf einer hydrophoben Chromatographiematrix, beispielsweise C8-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden), zu konzentrieren.
Unter Verwendung einer Vielzahl von Tests wird gezeigt, daß Wachstumsmedien von Hefekulturen, die v-sis-Derivate exprimieren, biologische Aktivitäten besitzen, die identisch mit denen von authentischem humanen PDGF sind.
Die Zellkulturtechniken haben sich in den letzten Jahren beträchtlich verbessert und ebenso die Anzahl und die Arten von Säugetierzellen, die in Kultur wachsen. Zentraler Punkt dieser Fortschritte ist ein besseres Verständnis der Nährstofferfordernisse (d.h., Hormone und Wachstumsfaktoren) kultivierter Zellen (Barnes und Sato, Cell 22: 649, 1980). Die zum Wachstum in Kultur fähigen Typen von Zellen können grob in zwei Gruppen eingeteilt werden: normale und transformierte. Sogenannte "normale" Zellen sind im allgemeinen in Kultur nicht unsterblich, sie bilden keine Tumoren, wenn sie in Tiere injiziert werden, und sie behalten ihren normalen diploiden Karyotyp. Normale Zellen können außerdem viel von ihrem differenzierten Charakter in Kultur beibehalten. Zur Kategorie normaler Zellen gehören jene, die nur eine bestimmte Anzahl von Generationen in Kultur wachsen, genannt "Zellstämme" oder "primäre Kulturen". Einige normale Zellinien können unbegrenzt in Kultur wachsen, obwohl sie nicht alle Kriterien der Transformation erfüllen. Transformierte Zellen werden für das Wachstum in Kultur immortalisiert, haben typischerweise ihren differenzierten Phänotyp verloren und karyotypische Aberrationen erlitten. Sie können für ihr Wachstum von einer Verankerung unabhängig sein und Tumoren induzieren, wenn sie in entsprechende Wirtstiere injiziert werden. Zellen jeder dieser Kategorien, die in vitro wachsen und PDGF-Rezeptoren besitzen, werden in Kultur auf die erfindungsgemäßen PDGF-Analoga reagieren.
Die folgenden Beispiele werden kurz zusammengefaßt. BEISPIEL I zeigt die Konstruktion eines v-sis-Subclones von pSSV-11 in dem E. coli Replikationsplasmid pUC13, im folgenden genannt pVSIS/Pst. BEISPIEL II zeigt die Konstruktion des Plasmides pVSα, das die Ligation von v-sis mit dem MFα1-Promotor und der Sekretionssignalsequenz umfaßt. BEISPIEL III zeigt die Oligonukleotid-gesteuerte Deletionsmutagenese der ersten 195 Basenpaare des v-sis-Genes unter Verwendung einer Technik, die den einzelsträngigen Bakteriophagen M13 anwendet, um die ersten 66 Aminosäuren des v-sis-Genproduktes, p28^sis, zu eliminieren, die nicht zu der B-Kette von PDGF homolog sind. Ein resultierender Phage mit der korrekten Deletion wurde m11vs2α benannt. BEISPIEL IV zeigt den Einbau von v-sis-bezogenen Konstruktionen, beschrieben in Beispiel II und III, in den Hefereplikationsvektor YEp13 und das Zufügen von Hefe-TPI-Terminatorsequenzen. Anschließend wurden VS2α-Sequenzen in das Plasmid pCPOT inseriert, was die stabile Beibehaltung des Plasmides in der Wirtszelle sicherstellt. Dieses Plasmid wurde p117-2 genannt. Dieses Beispiel zeigt außerdem die Konstruktion des Plasmides pVSB und des Expressionsvektors pMPOT2. BEISPIEL V zeigt die Transformation von Hefewirtszellen mit den Plasmiden YEpVSα, YEpVS2α, p117-2 und den Kontrollplasmiden p270 und pCPOT und eine anschließende Transkriptionsanalyse.
BEISPIEL VI zeigt die Konzentration der verwendeten Hefewachstumsmedien aus Kulturen, die die v-sis-exprimieren den Transformanten enthalten, und deren anschließende Analyse auf PDGF-ähnliches Material mittels ELISA, Radiorezeptor- und Mitogenesetests. Es werden klare Beweise vorgelegt, daß diese Hefemedien, die die hier beschriebenen v-sis-verwandten Genprodukte enthalten, biologische Aktivitäten besitzen, die mit denen von authentischem humanen PDGF identisch sind.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie einzuschränken.
BEISPIELE
Sofern nicht anders angegeben, wurden standardisierte molekularbiologische Verfahren verwendet.
Restriktionsendonukleasen und andere DNA-modifizierende Enzyme (d.h., T₄ Polynukleotidkinase, alkalische Phosphatase aus Kälbern, Klenow DNA-Polymerase) wurden von Betheda Research Laboratories, New England Biolabs, Boehringer-Mannheim oder Collaborative Research bezogen und wie vom Hersteller vorgeschlagen verwendet, wenn es nicht anders angegeben ist. Der Phage M13 und die pUC-Plasmidvektoren sowie die entsprechenden Wirtsstämme wurden von den Bethesda Research Laboratories erhalten. E. coli-Kulturen wurden mit dem Calciumchlorid-Verfahren nach Dagert und Ehrlich (Gene 6: 23, 1979) transformiert. Hefekulturen wurden wie von Beggs (Nature 275: 104, 1978) beschrieben, transformiert. Plasmid-DNA und M13-DNA in replikativer Form (RF-DNA) wurden nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Research 7: 1513, 1979) aus E. coli-Transformanten hergestellt. Einzelsträngige M13-Phagen-DNA wurde wie von S. Anderson (Nucleic Acids Research 13: 3015, 1981) beschrieben, hergestellt. DNA-Fragmente wurden nach dem Verfahren von J. Langridge et al., (Analyt. Biochem. 103: 264, 1980) aus Agarosegelen extrahiert. Die DNA-Sequenzierung wurde mit dem Didesoxy-Verfahren an M13-Matrizen (Messing, Meth. in Enzymology 101: 20, 1983) durchgeführt.
BEISPIEL I
Subklonieren von V-SIS aus pSSV-11
Das retrovirale SSV-Genom wurde aus unproduktiv mit SSV-11 infizierten normalen Rattennieren-(NRK-)Zellen kloniert, die SSV in ihr Genom integriert hatten (Devare et al., 1982, ibid.). Die SSV-DNA wurde als ein 5,8 Kilobasen (kb) Eco RI-Fragment isoliert und anschließend in das Plasmid pBR322 inseriert, was zu dem Klon pSSV-11 führte. Dieser Klon wurde von S. Aaronson (National Institutes of Health, Bethesda, MD) erhalten.
1A zeigt eine schematische Restriktionskarte des 5,8 Kilobasen Provirusgenomes von SSV. Es sind nur die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung relevanten Restriktionsstellen angegeben. Die offenen Kästchen bezeichnen den für p28^sis kodierenden Bereich des v-sis-Genes.
1B zeigt die Mukleotidsequenz des v-sis-Genes und einige flankierende SSV-Sequenzen. Das v-sis-Gen ist 19 Nukleotide 3' von mutmaßlichen ATG-Initiationscodon des Hüllen-(env-)Genes von SSV inseriert (Devare et al., 1982, ibid.). Es wird angenommen, daß Transkription und Translation der v-sis-Sequenzen durch SSV-Sequenzen ge steuert werden, was zu einem env-sis-Fusionsprotein führt. Die in 1B gezeigte Nukleotidsequenz ist im Vergleich zu der von Devare et al., 1982 (ibid.) publizierten Sequenz korrigiert. Die Korrekturen umfassen die von Devare et al., 1983 (ibid.) und den Erfindern vorgenommenen Korrekturen. Das ursprüngliche Numerierungsschema von Devare et al., (1982, ibid.) wird zum Erleichtern von Bezugnahmen beibehalten. Die den Restriktionsstellen in 1A zugewiesenen Nummern sind aus 1B.
Ein Subklon von pSSV-11 (2), der einen Teil des v-sis-Genes enthielt, wurde im replizierenden E. coli-Plasmid pUC13 (Vieira und Messing, Gene, 19: 259, 1982; und Messing Meth. in Enzymology 101: 20, 1983) konstruiert. 5 Mikrogramm (μg) pSSV-11 wurden mit der Restriktionsendonuklease PstI verdaut und das 1,2 kb Fragment, das die mit 454–1679 numerierte Sequenz enthielt (1), über Agarosegelelektrophorese (0,9%) gereinigt und aus dem Gel mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) und Butanol (Langridge et al., ibid.) extrahiert. 2 μg pUC13 wurden ebenfalls mit PstI verdaut, Phenol/Chloroform (CHCl₃)-extrahiert und Ethanol (EtOH)-präzipitiert. 40 ng des 1,2-kb v-sis-Fragmentes und 50 ng des PstI geschnittenen pUC13 wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 40 Einheiten (E) T₄ DNA-Ligase ligiert. Die Ligationsmischung wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm JM83 (Messing, Recombinant DNA Technical Bulletin, NIH Publication No. 79-009, 2, No. 2, 43–48, 1979) in Gegenwart von 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-galactosid (X-gal) und Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) verwendet. Die aus ampicillinresistenten weißen Kolonien hergestellte Plasmid-DNA wurde mit PstI verdaut, um die Gegenwart des Insert zu verifizieren, und das resultierende Plasmid wurde pVSIS/Pst genannt.
BEISPIEL II
Konstruktion des Plasmides pVSα
A. Herstellung von V-SIS für die Fusion mit MFα1
600 μg des Plasmides pSSV-11 (2) wurden mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und PvuII in 200 Mikrolitern (μl) 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM Tris pH 7,5 (mittlerer Salzpuffer) und 100 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA), über Nacht bei 37°C verdaut. Die Verdauprodukte wurden auf einem 1,1%igen Agarosegel elektrophoretisiert und das 1100 Basenpaar (bp) Bam HI-PvuII-Fragment (2) ausgeschnitten, extrahiert und EtOH-präzipitiert. Das DNA-Pellet wurde in 75 μl HphI-Puffer gelöst, dem 20 μl BSA 1 mg/ml und 5 μl HphI zugesetzt wurden. Nach Übernachtverdau bei 37°C wurde die Mischung auf einem 1,25% Agarosegel elektrophoretisiert und das 396 bp HphI-Pvu-II-Fragment aus dem Gel isoliert und EtOH-präzipitiert. Das DNA-Pellet wurde in 30 μl Klenow-Puffer (6 mM Tris pH 7,5, 6 mM MgCl₂, 60 mM NaCl) gelöst und die 3' überhängenden Nukleotide an der HphI-Spaltstelle durch 5 min Behandlung mit 5 E Klenow-Polymerase bei 37°C entfernt. 1 μl einer Mischung, die alle 4 Desoxyribonukleotide, jeweils 1 mM, enthielt, wurde zugesetzt und die Reaktionsmischung weitere 10 min inkubiert. Nach Phenol/-CHCl₃/Ether-(Et₂O-)Extraktion und EtOH-Präzipitation wurde das DNA-Pellet in 30 μl mittlerem Salzpuffer gelöst und mit 5 E BglII 3 Stunden bei 37°C verdaut. Die DNA wurde auf einem 1,25% Agarosegel elektrophoretisiert und das 269 bp HphI-BglII-Fragment extrahiert und EtOH präzi pitiert. Die HphI-Spaltterminus dieses mit Klenow-Enzym stumpfendig gemachten Fragmentes beginnt mit der Trinukleotidsequenz
5'ATG..... (2)
3'TAC.....
B. MFα1-Promotor und Sekretions-Leitfragment
Plasmid p192 (3) umfaßt einen Teil des Genes für den Hefe-Mating-Pheromon α-Faktor (MFα1-Gen) in das bakterielle Plasmid pUC13 (Vieira und Messing, ibid.; und Messing, Meth. in Enzymology 101: 20, 1983) kloniert. Das Klonieren des MFα1-Genes aus einer Genombank ist von Kurjan und Herskowitz (ibid.) beschrieben worden. Das Gen wurde in diesem Labor auf ähnliche Weise isoliert, wobei als Ausgangsmaterial eine Hefegenombank aus Partial-Sau3A-Fragmenten, die in die BamHI-Stelle von YEp13 (Nasmyth und Tatchell, Cell 19: 753, 1980) kloniert worden waren, verwendet wurde. Aus dieser Genbank wurde ein Plasmid isoliert, das α-Faktor in einem diploiden Stamm einer für die mat α2-34 Mutation homozygoten Hefe exprimierte (Manney et al., J. Cell Biol. 96: 1592, 1983). Der Klon enthielt ein Insert, das mit dem MFα1-Gen, das von Kurjan und Herskowitz (ibid.) charakterisiert worden ist, überlappte. Dieses Plasmid, bekannt als pZA2 (3), wurde mit EcoRI geschnitten und das 1700 bp-Fragment, enthaltend das MFα1-Gen, wurde gereinigt. Dieses Fragment wurde dann in die EcoRI-Stelle von pUC13 subkloniert, um das Plasmid p192 zu erzeugen.
15 μg Plasmid p192 wurden in 30 μl mittlerem Salzpuffer mit 20 Einheiten HindIII über Nacht bei 37°C verdaut. Die Reaktionsmischung wurde mit Klenow-Puffer auf 60 μl verdünnt und die 4 Desoxyribonukleotide jeweils bis zu einer Endkonzentration von 50 μM zugefügt. Der eiskalten Mischung wurden 10 Einheiten Klenow-Polymerase zugefügt und die Inkubation 12 min bei 15°C fortgesetzt. Nach einer Phenol/CHCl₃/Et₂O-Extraktion wurde die wäßrige Phase durch Lyophilisieren auf ein Volumen auf 10 μl konzentriert und mit 20 Einheiten EcoRI 70 min bei 37°C verdaut. Die Produkte wurden auf einem 0,9% Agarosegel elektrophoretisiert und das (stumpfendige) 1,2 kb EcoRI-Hind-III MFα1-Fragment extrahiert und EtOH-präzipitiert. Dieses DNA-Fragment enthält den Transkriptionspromotor und die Sekretions-Signalsequenzen von MFα1.
C. Herstellung von v-sis 3'-Sequenzen und des Klonierungsvektors pUC12; Fragment-Ligation
20 μg des Plasmides pVSIS/Pst wurden mit BglII und XbaI in 40 μl mittlerem Salzpuffer verdaut. Eine anschließende Elektrophorese über 1% Agarose, Extraktion der DNA und EtOH-Präzipitation führten zu einem gereinigten v-sis BglII-XbaI-Fragment von 756 bp (2). Das E. coli-Replikationsplasmid pUC12 (5 μg) wurde mit EcoRI und XbaI verdaut und wie oben gelgereinigt (2).
Gemäß 2 wurden äquimolare Mengen der 4 oben beschriebenen DNA-Fragmente, eingestellt auf 10 ng des 296 bp HphI-BglII v-sis-Fragmentes, in 15 μl Ligasepuffer (6 mM Tris pH 7,6, 6,6 mM MgCl₂, 0,4 mM ATP, 2 mM Spermidin, 20 mM DTT und 100 μg/ml BSA) gemischt und mit 40 Einheiten T₄ DNA-Ligase über Nacht bei 14°C ligiert. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur gebracht, weitere 150 Einheiten T₄-Ligase zugefügt und weitere 10 h inku biert. 7 μl der Ligationsmischung wurden zur Transformation von E. coli K-12 RR1 (ATCC #31343; Bolivar, E. et al., Gene 2: 95, 1977) verwendet und Ampicillinresistente Transformanten selektioniert. Aus 12 dieser bakteriellen Kolonien wurde Plasmid-DNA hergestellt und mit XbaI verdaut. 2 Klone gaben eine Bande von ca. 2,2 kb, die aus einer sauberen Fragmentgegenüberstellung (2) vorhergesagt worden war. Die weitere Analyse dieser Bande durch BglII-XbaI-Restriktionskartierung ergab erwartete Banden von ungefähr 1,5 kb von der MFα1/v-sis-Fusion und 760 bp für das BglII-XbaI v-sis-Fragment. Die DNA-Sequenzanalyse verifizierte die gewünschte Nukleotidsequenz an der MFα1/v-sis-Verbindung. Das resultierende Plasmid wurde pVSα genannt.
BEISPIEL III
Oligonukleotid-gesteuerte Deletionsmutagenese von 66 aminoterminalen v-sis-Codons
Die Homologie zwischen dem v-sis-Protein p28^sis und PDGF beginnt bei Aminosäure 67 von p28^sis einem Serinrest, der dem NH₂-terminalen Rest der PDGF B-Kette (Johnsson, ibid.) entspricht.
Die proteolytische Prozessierung des primären MFα1-Translationsproduktes geschieht bei dem Lys-Arg-Spaltsignal 85 Aminosäuren vom Initiator-Methionin entfernt (Kurjan und Herskowitz, ibid.). Es wurde ein v-sis-Derivat konstruiert, bei dem die ersten 66 Codons von p28^sis entfernt worden waren, so daß der Serinrest 67 von v-sis dem MFα1 Lys-Arg-Prozessierungssignal unmittelbar folgte.
Bezugnehmend auf 4: ungefähr 40 ng des Gel-gereinigten 2,2 kb XbaI-Fragmentes von pVSα wurden mit 120 ng XbaI-verdauter, mit alkalischer Phosphatase behandelter M13mp11-DNA (Messing, Meth. in Enzymology, ibid.) ligiert. Die Ligationsmischung wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm JM101 (ATCC 33876) in Gegenwart von X-gal und IPTG verwendet. Die isolierten weißen Plaques wurden gepickt und zur Infektion von 3 ml Kulturen JM101-Zellen im log-Phasen Wachstumsstadium verwendet. Es wurde DNA in replikativer Form (RF-DNA) hergestellt und Klone identifiziert, die das Insertionsfragment in der gleichen Orientierung trugen, wie die positive (+) Strangform des einzelsträngigen reifen Phagen. Aus einem solchen Klon wurde einzelsträngige Phagen-DNA hergestellt und m11VSα bezeichnet.
Um die Codons 1 bis 66 von v-sis genau zu entfernen, wurde eine Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese im wesentlichen nach dem "2 Primer-Verfahren" von Zoller (Zoller et al., Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course. Cold Spring Harbor Laboratory, 1983) durchgeführt. Das Oligonukleotid ZC 130 (3'AGAAACCTATTTTCCTCGGACCCA 5') wurde auf einem Applied Biosystems 380-A DNA-Syntheseapparat synthetisiert. 50 pMole ZC 130 wurden in 10 μl Kinasepuffer (BRL) mit 4 Einheiten T₄ Polynukleotidkinase 45 min bei 37°C kinasiert. Das Enzym wurde durch 10 min Erhitzen auf 65°C inaktiviert.
Ein halbes pMol m11VSα wurde mit einem pMol kinasiertem ZC 130 und 1,5 pMole des universellen Sequenzierungs-Primers (BRL) unter Verwendung der beschriebenen Bedingungen (Zoller et al., ibid.) hybridisiert, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierungs-(Annealing)-Mischung zu nächst 10 min auf 65°C erhitzt wurde, 10 min auf 37°C gebracht wurde und dann schnell in Eis gekühlt wurde. Die hybridisierte Mischung wurde dann wie von Zoller et al., (ibid.) beschrieben mit Klenow-Polymerase behandelt, um zirkuläre Duplex-DNA zu erzeugen. Teile der Verlängerungsmischung wurden zur Transformation von E. coli K-12 JM101-Zellen verwendet. Die resultierenden Phagenplaques wurden auf eine präzise Deletion durch Übertragung auf Nitrozellulosefilter und anschließende Hybridisierung mit ³²P-phosphoryliertem ZC 130 bei 65°C durchmustert. Korrekt nebeneinander angeordnete Sequenzen bildeten bei den angewendeten stringenten Hybridisierungstemperaturen stabile Duplexe mit der radioaktiven Probe. Ungefähr 1% der durchmusterten Transformanten zeigte in der Autoradiographie positive Signale. 10 Klone wurden Plaque-gereinigt und die RF-DNA für eine Restriktionsenzymanalyse hergestellt. 5 Isolate zeigten die erwartete Größenzunahme von 195 bp auf 1450 bp beim HindIII-BglII-Fragment 4) Die DNA-Sequenzanalyse der beiden Isolate bestätigte, daß eine korrekte Fusionsverbindung vorgenommen worden war, wodurch der korrekte Translationsleserahmen beibehalten wurde. Einer dieser Phagen wurde m11VS2α genannt.
BEISPIEL IV
Hefe-Expressionsvektoren
A. Konstruktion der Plasmide YEpVSα und YEpVS2α
Der Hefe-Replikationsvektor YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121, 1979) wurde als Expressionsvehikel für die in den Beispielen II und III beschriebenen v-sis-abgeleiteten Konstruktionen verwendet. YEp13 ist ein extrachromosoma les Multicopy-Plasmid, das einen 2μ-Replikationsursprung und das LEU2-Gen aus Hefe enthält. Dies erlaubt in Hefestämmen, die ein defektes chromosomales LEU2-Gen besitzen, für das Plasmid zu selektionieren, wenn die Hefe auf synthetischem Medium ohne Leucin wachsen gelassen wird. Das Anfügen von Hefe-Terminatorsequenzen an in Hefe exprimierte fremde Gene stellt eine effiziente Transkriptions-Termination und Polyadenylierung der mRNA sicher. Die v-sis Expressionseinheiten VSα und VS2α wurden in Nachbarschaft zum TPI-Teminatorfragment angeordnet, das zuvor in YEp13 kloniert worden war (siehe unten).
Das Plasmid p270 (siehe 5) enthält den Transkriptions-Terminatorbereich des Hefetriosephosphatisomerase-(TPI-Genes). Es wurde auf die folgende Weise konstruiert. Das Hefe TPI-Terminatorfragment wurde aus dem Plasmid pFG1 (Alber und Kawasaki, ibid.) erhalten. Es umfaßt den Bereich vom vorletzten Aminosäurecodon des TPI-Genes bis zur EcoRI-Stelle, die ungefähr 700 Basenpaare stromabwärts liegt. Diese einzige EcoRI-Stelle von pFG1 wurde durch eine BamHI-Stelle ersetzt, indem das Plasmid zuerst mit EcoRI geschnitten wurde, dann die Enden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) stumpfendig gemacht wurden, synthetische BamHI-Linker (CGGATCCA) zugefügt wurden und religiert wurde, um das Plasmid p136 zu erzeugen. Der TPI-Terminator wurde dann aus p136 als ein XbaI-BamHI-Fragment ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde in YEp13 (Broach et al., ibid.) ligiert, das zuvor mit XbaI und BamHI linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid ist als p213 bekannt. Aus dem TPI-Terminatorbereich von p213 wurde dann die HindIII-Stelle durch Verdauen des Plasmides mit HindIII, stumpfendig machen der entstehenden Enden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und rezirkularisieren des linearen Moleküles unter Verwendung von T₄ DNA-Ligase entfernt. Das resultierende Plasmid ist p270.
Alternativ kann p270 konstruiert werden, indem das Plasmid pM220 (siehe unten) mit XbaI und BamHI verdaut wird, das TPI-Terminatorfragment (ungefähr 700 bp) gereinigt wird und dieses Fragment in mit XbaI und BamHI verdauten YEp13 inseriert wird.
Bezugnehmend auf 6: die DNA des Plasmides p270 wurde mit XbaI verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, um die Religierung der kohäsiven Vektorenden zu verhindern. Die v-sis Expressionseinheiten VSα und VS2α wurden durch XbaI-Verdau und Agarosegelreinigung von pVSα bzw. m11vs2α hergestellt. Jedes der isolierten Fragmente wurde mit einer annähernd äquimolaren Menge Phosphatase-behandeltem Vektor p270 in Gegenwart von 40 Einheiten T₄ DNA-Ligase ligiert und die Ligationsmischungen in E. coli K-12 RR1 transformiert. Aus ampicillinresistenten Kolonien wurde Plasmid-DNA hergestellt und eine Restriktionsenzymanalyse durchgeführt, um Klone zu identifizieren, die den TPI-Terminator in Nachbarschaft zu der v-sis-Sequenz aufwiesen. Die Gegenwart von 3,3 kb oder 3,1 kb BglII-Fragmenten nach der Gelelektrophorese wies auf die korrekte Orientierung von YEpVSα bzw. YEpVS2α hin.
B. Insertion der VS2α Expressionseinheit in pCPOT
Um eine maximale Proteinproduktion aus einer Hefekultur zu erreichen, ist es wünschenswert, Expressionsvehikel zu verwenden, die in der Wirtszelle stabil beibehalten werden. Das Plasmid pCPOT ist ein solches bevorzugtes Expressionsvehikel.
E. coli HB101, transformiert mit pCPOT, ist bei der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungs-Nr. 39685 hinterlegt worden. Das Plasmid pCPOT umfaßt das 2μ-Genom (Hartley und Donelson, Nature 286: 860, 1980), E. coli Plasmid pBR322 Replikations- und Selektionssequenzen und die für das glycolytische Enzym Triosephosphatisomerase (POT1) kodierenden DNA-Sequenzen aus Schizosaccharomyces pombe. Die Gegenwart des POT1 Genes in pCPOT sichert die stabile Beibehaltung des Plasmides in einem entsprechenden Wirtshintergrund während des Wachstums auf nichtselektivem Medium unter Verwendung von Glucose als Kohlenstoffquelle.
Der S. cerevisiae TPI-Promotor wurde zur Kontrolle der Expression von VS2α-Sequenzen in pCPOT verwendet. Plasmid pM220 enthält den TPI-Promotor an die MFα1-Signalsequenz fusioniert. Mit pM220 transformierter E. coli RR1 ist bei der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungs-Nr. 39853 hinterlegt.
Bezugnehmend auf 7 wurde Plasmid pM220 wurde mit BglII und BamHI verdaut, durch ein 0,9% Agarosegel elektrophoretisiert, und das 2,2 kb TPI-Promotor/MFα1-Genfragment extrahiert. Das gereinigte Fragment wurde mit PstI verdaut und das resultierende 1 kb BglII-PstI-Fragment wie oben Agarosegel-gereinigt. Plasmid YEpVS2α wurde mit PstI und BamHI verdaut und das 1,8 kb MFα1/v-sis/TPI-Terminator-Fusionsfragment Gel-isoliert. Plasmid pCPOT wurde mit BamHI verdaut, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, Phenol/CHCl₃-extrahiert, dann durch Elektrophorese über Agarose gereinigt, aus dem Gel extrahiert und EtOH-präzipitiert.
Annähernd äquimolare Mengen der 3 oben beschriebenen isolierten Fragmente (7) wurden über Nacht bei 12°C ligiert und die Ligationsmischung zur Transformation von E. coli K-12 Stamm DH1 (Hanahan, D. und Meselson, M., J. Mol. Biol. 166: 577, 1983) auf Ampicillinresistenz verwendet. Aus den Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und Analysen von Restriktionsspaltungen verwendet, um die Orientierung der Insertfragmente zu bestätigen. Die Gegenwart des ungefähr 1500 bp Bam HI-SalI-Fragmentes weist darauf hin, daß die kohäsiven BamHI-Enden des TPI-Terminatorfragmentes wie in 7 gezeigt angeordnet sind. Die entgegengesetzte Orientierung würde zu einer BamHI/BglII-Fusion führen, die durch BamHI nicht spaltbar ist, und würde daher nicht dieses Fragment ergeben. Das 800 bp SphI-Fragment wies darauf hin, daß der TPI-Promotor und das v-sis-Fragment an der PstI-Stelle (7) sauber fusioniert sind. Dieses Plasmid wurde p117-2 genannt.
C. Konstruktion des Plasmides pVSB
Weil das von pVS2α kodierte Produkt größer ist als die authentische menschliche PDGF B-Kette und weil ein kleineres Produkt zu höheren Expressionsspiegeln in einer transformierten Hefewirtszelle führen könnte, wurde ein Vektor konstruiert, der die v-sis-Sequenz von pVS2 mit verkürztem 3'-Ende enthielt. Das Polypeptid, für das diese Sequenz kodiert, umfaßt die Aminosäuren 67 bis 175 von p28^sis und ist zu der B-Kette von PDGF homolog.
Ein diese "B-Ketten"-Sequenz enthaltender Expressionsvektor wurde konstruiert, indem Elemente aus der pVS2α-Expressionseinheit mit einem v-sis-Teilgen und einem synthetischen doppelsträngigen DNA-Fragment, das für die Aminosäuren 158 bis 175 von p28^sis kodiert, kombiniert wurden. Das synthetische Fragment war so entworfen, daß es für viele der 13 v-sis-Codons, die es ersetzt, bevorzugte Hefecodons einführt, und daß es ein Stop-Codon am Ende der kodierenden Sequenz bereitstellt. Die Konstruktion dieses Vektors ist in den 8 und 9 gezeigt.
Das Plasmid YEpVS2α wurde mit PstI und BamHI verdaut und das 1,8 kb Fragment, das den MFα1-Teil, v-sis und TPI-Terminatorsequenzen umfaßte, durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Das Plasmid pIC19R (erhältlich von Dr. J. Lawrence Marsh, University of California, Irvine), das den in Karte 1 gezeigten Polylinker in die HindIII-Stelle von pUC19 (Norrander et al., Gene 26: 101–106, 1983) inseriert enthält, wurde mit PstI und BamHI verdaut, und das Vektorfragment wurde Gel-gereinigt und mit dem 1,8 kb Fragment aus pVS2α verbunden, um das Plasmid pVS2αT zu erzeugen.
KARTE 1
Das Plasmid pM220 wurde mit BglII und PstI verdaut und das ungefähr 1 kb Fragment, umfassend den TPI-Promotor und den 5'-Anteil der MFα1-Sequenz, wurde isoliert und in BglII- und PstI-verdauten pIC19R kloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit ClaI und PstI verdaut und das TPI-Promotor-MFα1-Fragment Gel-gereinigt. Das Plasmid pVS2αT wurde dann mit ClaI und PstI geschnitten und mit dem TPI-Promotor-MFα1-Fragment verbunden. Die korrekte Konstruktion wurde anhand der Gegenwart eines 2,6 kb ClaI-BamHI-Fragmentes identifiziert und wurde mit pTVS2αT bezeichnet.
10 μg von Plasmid pVSα wurden mit XmaI und SphI vollständig verdaut. Das resultierende ca. 4,9 kb Vektorfragment, das auch das meiste der v-sis-Sequenz umfaßt, wurde durch Agarosegelelektrophorese, Extraktion der DNA und EtOH-Präzipitation gereinigt.
Um einen neuen 3'-Terminus für die v-sis-Sequenz bereitzustellen, wurde ein doppelsträngiges DNA-Fragment aus auf einem Applied Biosystems Modell 380-A DNA-Syntheseapparat synthetisierten Oligonukleotiden konstruiert. 0,7 pMol des Oligonukleotides ZC299 (Tabelle 1) wurden mit einer äquimolaren Menge des Oligonukleotides ZC300 in einem Volumen von 10 μl, enthaltend 40 mM NaCl, 5 min bei 65°C erhitzt.
Tabelle 1
Die Mischung wurde dann 5 min bei 37°C inkubiert und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. 0,2 pMol des gereinigten 4,9 kb Vektorfragmentes wurden hinzugefügt, die Mischung 18 h bei 12°C ligiert und zur Transformation von E. coli HB101 (ATCC 33694) auf Ampicillinresistenz verwendet. Aus Ampicillin-resistenten Kolonien wurde DNA hergestellt und mit BglII und XbaI verdaut. Nach der Elektrophorese durch Agarose wurde der gewünschte Klon (bekannt als pVSαB) anhand des Verlustes eines ca. 750 bp BglII-XbaI-Fragmentes und des Erscheinens von zwei kleineren Fragmenten von ca. 500 und 260 bp identifiziert.
Ungefähr 8 μg des Plasmides pTVS2αT wurden vollständig mit XbaI in einem Volumen von 10 μl verdaut. Das Volumen wurde mit BglII-Puffer auf 40 μl erhöht, 6 Einheiten BglII wurden zugefügt und die Mischung bei 37°C inku biert. Nach 15 und 30 min wurden 10 μl Aliquots entfernt und einem Stop-Puffer mit 50 mM EDTA zugefügt; die verbleibenden 20 μl wurden nach 45 min gestoppt. Die resultierende Mischung wurde durch Elektrophorese durch 0,7% Agarose getrennt. Das ca. 4,6 kb BglII-XbaI-Vektorfragment wurde ausgeschnitten, aus dem Gel extrahiert und EtOH-präzipitiert. Plasmid pVSαB wurde mit BglII und XbaI verdaut, und das ca. 260 bp Fragment, das den synthetischen 3'-Terminus und das Stop-Codon enthielt, wurde durch Elektrophorese über Agarose, anschließende Extraktion aus dem Gel und EtOH-Präzipitation isoliert.
Das 4,6 kb BglII-XbaI-Vektorfragment aus pTVS2αT und das 260 bp BglII-XbaI-Fragment aus pVSαB wurden in Gegenwart von T₄ DNA-Ligase 7 h bei Raumtemperatur ligiert. Die Reaktionsmischung wurde zur Transformation von E. coli HB101 auf Ampicillinresistenz verwendet. Aus den Transformanten wurde DNA hergestellt und die Gegenwart des gewünschten Inserts bestätigt, indem auf eine 550 bp PstI-XbaI-Bande auf einem Agarosegel durchmustert wurde. Ein Plasmid, mit der korrekten Konfiguration wurde als pVSB bezeichnet.
D. Konstruktion von pMPOT2
Für die Expression von v-sis-Abkömmlingen in Hefe wurde ein stabiler Expressionsvektor, umfassend die REP1, REP2, REP3 und ori-Sequenzen aus der Hefe 2 μ-DNA und das Schizosaccharomyces pombe-Triosephosphatisomerase-(POT1-Gen) konstruiert. Das POT1-Gen sorgt für die Plasmidbeibehaltung in einem transformierten Hefewirt, der auf einem Komplexmedium wächst, wenn ein solcher Wirt für die Triosephosphatisomerase defekt ist.
Das POT1-Gen wurde aus dem Plasmid pFATPOT erhalten. S. cerevisiae Stamm E18, transformiert mit pFATPOT, ist bei der ATCC mit der Hinterlegungs-Nr. 20699 hinterlegt worden.
Das Plasmid kann aus den Wirtszellen durch gebräuchliche Verfahren gereinigt werden. Die POT1-Sequenz wurde aus pFATPOT durch Verdau des Plasmides mit SalI und BamHI entfernt. Dieses ca. 1600 bp Fragment wurde dann mit pIC19R ligiert, das zuvor durch Verdau mit SalI und BamHI linearisiert worden war. Die BamHI-, PstI- und SalI-Stellen im resultierenden Plasmid wurden in zwei Schritten zerstört, um das Plasmid pICPOT* zu erzeugen. Die PstI- und SalI-Stellen wurden durch Schneiden mit PstI und SalI entfernt; die Enden wurden durch Verdau des PstI-3'-Überhanges mit DNA-Polymerase I (KlenowFragment) und Auffüllen des SalI-5'-Überhangs mit Klenow-Fragment stumpf endig gemacht. Die stumpfen Enden wurden dann ligiert. Die BamHI-Stelle wurde durch Schneiden des Plasmides mit BamHI, Auffüllen der Enden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Religieren der stumpfen Enden entfernt.
Die 2μ-Sequenzen wurden aus den Plasmiden YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121–133, 1979) und C1/1 erhalten. C1/1 wurde aus pJDB248 (Beggs, Nature 275: 104–109, 1978) durch Entfernen der pMB9-Sequenzen durch Partialverdau mit EcoRI und Ersetzen durch EcoRI-geschnittenen pBR322 konstruiert. Die REP3- und ori-Sequenzen wurden aus YEp13 durch Verdau mit PstI und XbaI und Gelreinigung entfernt. REP2 wurde aus C1/1 durch Verdau mit XbaI und SphI und Gelreinigung erhalten. Die beiden Fragmente wurden dann mit pUC18 (Norrander et al., Gene 26: 101–106, 1983), das zuvor mit PstI und SphI linearisiert worden war, verbunden, um das Plasmid pUCREP2,3 zu erzeugen. REP1 wurde aus C1/1 durch Verdau mit EcoRI und XbaI und Gelreinigung des 1704 bp-Fragmentes erhalten. Das EcoRIXbaI-Fragment wurde in pUC13 kloniert, das mit EcoRI und XbaI linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid wurde pUC13 + REP1 genannt. Das pUC13 + REP1- Plasmid wurde mit HindII geschnitten und in Gegenwart von EcoRI-Linkern (erhalten von Bethesda Research Laboratories) ligiert. Das REP1-Gen wurde dann als ein EcoRIFragment von ungefähr 1720 bp entfernt. Dieses EcoRIFragment wurde in pIC7 (das die in Karte 1 gezeigte Polylinkersequenz in die HindIII-Stelle von pUC8 inseriert enthält) kloniert, wobei pIC7 zuvor mit EcoRI und XbaI linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid wurde pICREP1#9 genannt.
Um abschließend den Expressionsvektor pMPOT2 zu konstruieren, wurde pICPOT* mit einem HindIII-Partialverdau und einem vollständigen SstI-Verdau linearisiert. Plasmid pUCREP2,3 wurde mit HindIII und SstI geschnitten und das REP2, REP3 und die ori-Sequenzen enthaltende Fragment wurde Gel-gereinigt und mit dem linearisierten pICPOT* verbunden. Das resultierende Plasmid, umfassend REP2, REP3, ori, POT1 und amp^r-Sequenzen, wurde pMPOT1 genannt. REP1 wurde dann aus pICREP1#9 als ein BglII-NarI-Fragment entfernt und mit pMPOT1 ligiert, das mit BglII und NarI gespalten worden war. Das Produkt dieser Ligation war pMPOT2 (hinterlegt bei der ATCC, Hinterlegungs-Nr. 20744). Plasmid pMPOT2 wurde mit ClaI und BamHI verdaut, und das Vektorfragment wurde wie oben gereinigt.
E. Insertion von v-sis-Expressionseinheiten in pMPOT2
1. Insertion der VSα-Expressionseinheit in pMPOT2
Ungefähr 10 μg des Plasmides pVSα wurden mit BstEII in einem Volumen von 20 μl vollständig verdaut. 5 Einheiten PstI wurden zugefügt, die Mischung wurde 30 min inkubiert und die Reaktion durch Zufügen von EDTA abgebrochen. Die abgekühlte Reaktionsmischung wurde sofort über ein 1% Agarosegel elektrophoretisiert und die ca. 800 bp Partial-PstI-BstEII-Bande (die das meiste der MFα1-Preprosequenz und den 5'-Teil von v-sis enthält) wurde ausgeschnitten, aus dem Gel extrahiert und EtOH präzipitiert.
Plasmid pTVS2αT wurde vollständig mit PstI und BstEII verdaut und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Das resultierende ca. 4,8 kb Vektorfragment und das 800 bp PstI-BstEII-Fragment wurden in Gegenwart von T₄ DNA-Ligase 6 h bei Raumtemperatur ligiert, und die Ligationsmischung zur Transformation von E. coli HB101 auf Ampicillinresistenz verwendet. Es wurde ein Plasmid identifiziert, das ein ca. 1450 bp BglII-Fragment enthielt, das auf die Gegenwart des Inserts hinwies. Das Plasmid wurde pTVSα genannt.
Plasmid pTVSα wurde vollständig mit ClaI und BamHI verdaut und das ca. 2,9 kb Fragment, das die VSα-Sequenzen enthält, wurde durch Elektrophorese über Agarose, Extraktion aus dem Gel und EtOH-Präzipitation isoliert. Das ca. 2,9 kb ClaI-BamHI-VS-Fragment wurde mit ClaI- und BamHI-verdautem pMPOT2, wie für pVS2αm (siehe unten) be schrieben, ligiert. Ein 2,9 kb ClaI-BamHI-Insert enthaltendes Plasmid wurde identifiziert und pVSαm genannt.
2. Insertion einer VS2α-Expressionseinheit in MPOT2
Das Plasmid pTVS2αT wurde vollständig mit ClaI und BamHI in BamHI-Puffer verdaut. Der Puffer wurde auf Hochsalz eingestellt (Maniatis et al., ibid.) und die DNA vollständig mit PvuI verdaut, das die Vektorsequenzen zweimal schneidet und die Auflösung des ca. 2,7 kb ClaI-BamHI-Fragmentes, das die VS2α-Sequenzen enthält, auf einem Agarosegel erlaubt. Dieses Fragment wurde durch 0,9% Agarose elektrophoretisiert, extrahiert und EtOH-präzipitiert. Das Fragment wurde dann mit ClaI-BamHI-verdautem pMPOT2 in Gegenwart von T₄ DNA-Ligase 20 h bei 13°C ligiert. Die ligierte DNA wurde zur Transformation von E. coli HB101 auf Ampicillinresistenz verwendet, und aus den resultierenden Kolonien wurde Plasmid-DNA hergestellt. Es wurde ein Plasmid identifiziert, das das 2,7 kb ClaI-BamHI-VS2α-Fragment enthielt; dieses wurde pVS2αm genannt.
3. Insertion der VSB-Expressionseinheit in pMPOT2
Plasmid pVSB wurde mit ClaI und BamHI verdaut, das 2,2 kb Fragment, das die "B-Ketten"-Expressionseinheit enthielt, durch Agarosegelelektrophorese und EtOH-Präzipitation gereinigt. Die Fragmente wurden dann über Nacht bei Raumtemperatur in Gegenwart von T₄ DNA-Ligase ligiert und die Reaktionsmischung zur Transformation von E. coli HB101 auf Ampicillinresistenz verwendet. Aus den Trans formanten wurde DNA hergestellt und die Gegenwart des Inserts durch Verdau mit ClaI und BamHI und Agarosegelelektrophorese verifiziert. Der resultierende Expressionsvektor wurde pVSBm genannt.
BEISPIEL V
Hefetransformation und Analyse der v-sis-Transkription
S. cerevisiae Stamm E8-11c (MAT αleu2-3, 112 pep 4-3; eine haploide Segregante der Kreuzung E2-7B [ATCC 20689] x GK 100 [ATCC 20689]) wurde mit den Plasmiden YEpVSα, YEpVS2α, p270, p117-2 und pCPOT transformiert. Die Transformanten wurden selektioniert und in synthetischem Medium ohne Leucin gehalten.
S. cerevisiae Stamm E11-3c (ATCC Hinterlegungs-Nr. 20727) (MAT α pep4-3 tpi1) wurde mit den Plasmiden pCPOT und p117-2 transformiert. Die Transformanten wurden selektioniert und in YEPD gehalten.
Mit Bezug auf 8 wurde die Gegenwart von mit v-sis in Zusammenhang stehenden mRNA-Transkripten durch elektrophoretische und anschließende Hybridisationsanalyse vom Gesamt-RNA bestätigt. Die Gesamt-DNA aus den oben beschriebenen Transformanten in Stamm E8-11c wurde durch Guanidiniumthiocyanat-Extraktion, wie von Maniatis et al. (ibid.) beschrieben, mit den folgenden Modifikationen hergestellt: 100 ml Kulturen wurden zu einer Dichte von 1 × 10⁸ Zellen/ml wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und dreimal mit H₂O gewaschen, 2 ml Guanidiniumlyselösung wurden zugefügt, gefolgt von 0,5 mm Glaskugeln bis gerade unterhalb des Meniskus. Die Röhrchen wurden dreimal 1 min heftig geschüttelt (vortexed), wobei zwischendurch auf Eis gekühlt wurde. Die Lösung wurde abpipettiert und die RNA durch Zentrifugation über CsCl₂, wie beschrieben (Maniatis et al., ibid.), isoliert.
15 μg RNA aus den Plasmidtransformanten p270, YEpVSα, YEpVS2α, pCPOT und p117-2 wurden glyoxyliert, über ein 0,9% Agarosegel elektrophoretisiert und auf Nitrozellulose übertragen, wie von Thomas (PNAS 77: 5201, 1980) beschrieben. Das gereinigte PstI-v-sis-Fragment aus pVSIS/Pst wurde Nick-translatiert und mit der Filter-gebundenen RNA hybridisiert, und die hybridisierende Spezies durch Autoradiographie nachgewiesen (10). Transkriptbanden von ca. 1900 bp aus YEpVSα, ca. 1650 bp aus YEpVS2α, und ca. 1700 bp aus p117-2 bestätigten die Transkription der v-sis-Fusionskonstruktionen und die Verwendung der Transkriptionsstart- und -stopsignale in den Konstruktionen. In den Negativkontrollen p270 und pCPOT wurden keine v-sis-verwandten Transkripte nachgewiesen.
Die Plasmide pVSαm, pVS2αm, pVSBm und pMPOT2 wurden zur Transformation von S. cerevisiae Stamm E18 verwendet. Stamm E18 ist diploid, erzeugt durch Kreuzen der Stämme E11-3c (ATCC Nr. 20727) und Δtpi 29. Δtpi 29 wird durch Unterbrechen des TriosephosphatisomeraseGenes von Stamm E2-7B (ATCC Nr. 20689) erzeugt, im wesentlichen wie von Rothstein (Meth. in Enzymology 101: 202–210, 1983) beschrieben.
BEISPIEL VI
Analyse sis-verwandter Produkte, die von Hefe exprimiert wurden, und Tests für biologische Aktivität
A. Konzentration des Hefe-Kulturmediums
Die YEp13- und pCPOT-abgeleitete v-sis-Konstruktionen enthaltenden Transformanten wurden in entsprechenden Medien bei 30°C (1,2 Liter Kulturen) bis zur stationären Phase auf einem Rotationsschüttler mit einer Bewegung von 220 rpm wachsen gelassen. Die Kulturen wurden geerntet, die Zellen mittels Zentrifugation entfernt und das Medium auf einer C-8 Sepharose-Säule (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden), die Moleküle mit hydrophober Natur bindet, konzentriert. Authentisches humanes PDGF ist ein hochkationisches und hydrophobes Protein (Heldin et al., PNAS 76: 3722, 1979, Raines und Ross, ibid.). Von dem sis-verwandten vermuteten Hefeprodukt wurde angenommen, daß es ähnliche Eigenschaften aufweise. Der mutmaßliche hydrophobe Charakter des sis-Produktes wurde zugrundegelegt, um es aus dem Hefemedium zu konzentrieren, in das es zu erwartenderweise sezerniert werden sollte. An die C-8-Säule gebundene Moleküle wurden von der Matrix mit geeigneten hydrophoben Lösungsmittels eluiert.
Die gebrauchten Wachstumsmedien von den Kulturen der transformierten Hefen wurden auf 5% EtOH eingestellt und über eine 8 ml C-8 Sepharosesäule mit einer Flußrate von 2 bis 3 ml/min gegeben. Die Säule wurde dann mit 100 ml 5% EtOH in 20 mM Ammoniumbicarbonat (NH₄HCO₃) gewaschen. Das gebundene Material wurde mit 20% Propanol in 20 mM NH₄HCO₃ eluiert und das Eluat in 1 bis 2 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden auf ihren Proteingehalt durch die Lichtabsorption bei 280 nm getestet (A₂₈₀ von 1,4 = 1,0 mg Protein/ml) oder nach dem Verfahren von Lowry et al., (J. Biol. Chem. 193: 265, 1951). Die konzentrierten Fraktionen wurden vereinigt, lyophilisiert und dann in 500 bis 700 μl PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4) resuspendiert.
Von der Transformante p117-2 im Stamm E11-3c, die unter POT1-Selektion (mit Glucose als Kohlenstoffquelle) wachsen gelassen worden war, wurde angenommen, daß sie signifikant höhere Spiegel von PDGF-ähnlichem Material in das Medium produzieren würde; sie wurde daher nach Dialyse der Medien gegen PBS ohne Konzentration analysiert.
Medienproben von den Transformanten pVSαm, pVS2αm, pVSBm und pMPOT2 wurden durch Adsorption an CM-Sephadex und Elution mit 1M NaCl in 1M Essigsäure, pH 4,5, konzentriert. Die konzentrierten Medien wurden gegen 0,1 M Essigsäure, pH 7 dialysiert und die Menge von PDGF-ähnlichem Material in den Konzentraten mittels ELISA bestimmt.
B. Nachweis von PDGF-ähnlichem Material durch Enzym-gebundenen Immunadsorptionstest (ELISA)
Die Expression von PDGF-ähnlichen Molekülen durch Hefetransformanten wurde mittels ELISA untersucht und durch Vergleich mit einer Standardkurve, die mit gereinigtem humanen PDGF (Raines und Ross, ibid.) entwickelt worden war, quantifiziert. Eine typische Standardkurve wurde wie folgt hergestellt:
Gereinigtes humanes PDGF, 2,5 ng/ml in PBS, wurde über Nacht mit Immulon II (Dynatech Laboratories, Inc.) Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (100 μl/Vertiefung) bei 4°C inkubiert. Diese Überzugslösung wurde entfernt und pro Vertiefung 100 μl 0,1% Kaninchenalbumin in PBS zugefügt und die Platten 1 h bei 37°C inkubiert. Proben von gereinigtem PDGF (0,1 bis 40 ng/ml) wurden getrennt mit Ziege-anti-PDGF IgG (5 μg/ml) in PBS, das 0,05% Tween 20 und 1 mg/ml Kaninchenalbumin (RSA) enthielt, inkubiert. Die Mikrotiterplatten wurden fünfmal mit 0,9% NaCl, 0,05% Tween 20 gewaschen, gespült, und den Mikrotitervertiefungen wurden 100 μl jeder Testlösung zugefügt und 2 h bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden wie zuvor gewaschen, und Peroxidase-konjugiertes Schweine-anti-Ziegen IgG (Tago, Inc.), verdünnt 1 : 1000 in PBS, das 0,05% Tween 20 und 1 mg/ml RSA enthielt, wurde für 2 h bei 37°C zugesetzt. Die Platten wurden wie zuvor gewaschen und frisch zubereitetes 0,04% o-Phenylendiamin, enthaltend 0,012% Wasserstoffperoxid (H₂O₂) (100 μl/Vertiefung) wurde 50 min bei Raumtemperatur zugefügt und die Reaktion nach 50 min durch Zusatz von 4N H₂SO₄ (50 μl/Vertiefung) gestoppt. Die Adsorbtion bei 492 nm wurde unter Verwendung eines Dynatech Plattenablesegerätes (Scanner) bestimmt. Jeder Testpunkt wurde dreifach gemessen und als Mittelwert +/- Standardabweichung aufgetragen. C-8-Eluate der Hefe-Kulturmedien und unkonzentrierte Medienproben wurden in PBS verdünnt, getestet wie beschrieben und mit der PDGF-Standardkurve verglichen. Tabelle 2 ist eine Zusammenfassung der Testergebnisse für eine repräsentative Serie von Experimenten. 11 zeigt einen ELISA eines Bereiches von gemessenen C-8-Eluat-Probenvolumen, was zur Erzeugung einer Dosis-Wirkungs-Kurve führt, die mit einer Standardkurve für gereinigtes PDGF verglichen wird.
Die rohen ELISA Daten für die MPOT-Konstruktionen sind nicht gezeigt, sind jedoch in den Radiorezeptor- und Mitogenesetestdaten, wie in 13 und 14 gezeigt, eingebaut.
C. Radiorezeptortest (RRA) für PDGF
Der Radiorezeptortest für PDGF (Bowen-Pope und Ross, J. Biol. Chem. 257: 5161, 1982) ist ein spezifisches und empfindliches (0,2 bis 2 ng/ml PDGF) Verfahren zum Nachweisen biologisch aktiven PDGF-ähnlichen Materials in Hefe. In diesem Test wird das PDGF-ähnliche Material auf seine Fähigkeit zur Kompetition mit gereinigtem, radiomarkiertem ¹²⁵J-PDGF um Bindungsstellen von PDGF-Rezeptoren auf den Zelloberflächen getestet. Die Ergebnisse werden durch Vergleich mit einer Standardkurve interpretiert, die mit gereinigtem, unmarkiertem PDGF erzeugt wird. Der Vergleich der mit anderen Testverfahren (z.B., ELISA) erhaltenen Ergebnisse, ergibt zusätzlich zur Quantifizierung des gebundenen Materials einen Hinweis auf die Stärke der Rezeptor/Ligand-Wechselwirkung. Der Test wird wie folgt durchgeführt: Subkonfluente Einfachschichten diploider humaner Fibroblasten werden durch Plattieren von 1,5 × 10⁴ Zellen pro 2 cm² Kulturvertiefung in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM), supplementiert mit 1% Humanplasma-abgeleitetem Serum (PDS) in Costar Lochplatten (cluster trays) mit 24 Vertiefungen hergestellt. Die Kulturen werden auf ein Eistablett gestellt und einmal mit eiskalter Bindungsspüllösung (Ham's Medium F-12, gepuffert bei pH 7,4 mit 25 mM HEPES und supplementiert mit 0,25% BSA) gewaschen. 1 ml der Testsubstanz im Bindungsmedium wird pro Vertiefung zugesetzt und die Kulturen in einem gekühlten Raum auf einer oszillierenden Plattform 3 bis 4 h inkubiert. Die Tabletts werden dann auf Eis gestellt, abgesaugt und einmal mit kalter Bindungsspüllösung gespült und 1 h wie oben mit 1 ml Bindungsmedium pro Vertiefung, enthaltend 0,5 ng/ml ¹²⁵J-PDGF, inkubiert. Die Markierung wird durch 4 Spülungen mit Bindungsmedium terminiert und Zell-assoziiertes ¹²⁵J-PDGF durch Extraktion mit Solubilisierungspuffer bestimmt. Standardkurven werden unter Verwendung von 0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, und 0,8 ng gereinigtes PDGF pro ml erhalten und die Testproben mit diesen Werten verglichen.
Die mittels RRA für Hefe C-8-Eluate und 1X Medienproben erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Zusätzlich wurde die Bindung an den PDGF-Rezeptor von CM-Sepharose Mediumkonzentraten aus Hefetransformanten, die die Plasmide pVSαm, pVS2αm, pVSBm und pMPOT2 enthielten, mit authentischem PDGF verglichen. Die Ergebnisse wurden durch Vergleich mit einer Standardkurve, die mit gereinigtem unmarkiertem PDGF erhalten worden war, interpretiert, wie in 13 gezeigt wird. Es wird gezeigt, daß die Medien aus mit v-sis-Konstruktionen transformierten Kulturen mit ¹²⁵J-PDGF um die Bindung an den PDGF-Rezeptor konkurrieren. Medien von Hefezellen, die mit pMPOT2 transformiert sind, konkurrieren nicht mit radiomarkiertem PDGF um die Rezeptorbindung.
D. Mitogenese-Test
Die Fähigkeit von PDGF, die DNA-Synthese und das Zellwachstum in Kultur zu stimulieren, war die Grundlage für seine Definition und Entdeckung. Der Einbau von ³H-Thymidin in DNA kultivierter Zellen, die für PDGF empfänglich sind (Raines und Ross, Meth. in Enzymology 109: im Druck) ist ein bevorzugtes Verfahren, um die biologische Aktivität in Hefe erzeugter PDGF-ähnlicher Moleküle zu zeigen.
Testproben in 10 mM Essigsäure (100 μl/Vertiefung) wurden ruhenden Kulturen von Maus 3T3-Zellen in 2 cm² Costar Kulturschalen mit 24 Vertiefungen (2 bis 3 × 10⁸ Zellen/-Vertiefung in 1 ml) zugefügt. Ruhende Testkulturen können erhalten werden, indem die Zellen in 10% Serum ausgesät werden und ihnen erlaubt wird, das Medium in 4 bis 5 Tagen zu erschöpfen. Die Testproben werden nach 20 h aus den Vertiefungen entfernt und durch 0,5 ml frisches Medium, enthaltend 2 μCi/ml [³H]-Thymidin und 5% (v/v) Kälberserum, pro Vertiefung ersetzt. Nach einer zusätzlichen 2-stündigen Inkubation bei 37°C werden die Zellen geerntet, indem das Medium abgesaugt wird, die Zellen zweimal jeweils mit 1 ml eiskalter 5%iger TCA (Trichloressigsäure) gewaschen werden, das TCA-unlösliche Material in 0,8 ml 0,25N NaOH unter Mischen solubilisiert wird und 0,6 ml dieser Lösung in 5 ml-Aquasol in einem Flüssig-Scintillations-Zähler gezählt werden. Der Grad der Stimulation im Vergleich mit Kontrollvertiefungen (100 μl 10 mM Essigsäure allein) wird bestimmt (normalerweise Maximalstimulierung 30 bis 50-fach) und mit einer Standardkurve, die unter Verwendung gereinigter PDGF-Präparate erhalten wurde, verglichen.
Tabelle 2 zeigt die im Mitogenesetest für in Hefe produziertes PDGF-ähnliches Material erhaltenen Ergebnisse und vergleicht die Aktivitäten des PDGF-ähnlichen Materials, wie sie mit den oben beschriebenen Testverfahren gemessen worden ist. 12 zeigt die durch konzentrierte Medien von pll7-2-transformiertem E11-3c und pVSα-transfor miertem E8-l1c hervorgerufene mitogene Antwort im Vergleich zu der mit gereinigtem humanem PDGF erhaltenen Antwort.
Tabelle 2
Zusätzlich wurde die durch CM-Sephadex-Konzentrate der Hefetransformanten mit den Plasmiden pVSαm, pVS2αm, pVSBm und pMPOT2 hervorgerufene mitogene Antwort mit der mit authentischem PDGF erhaltenen verglichen. Mit Bezug auf 14 stimulierten die Medien von mit den v-sis-Konstruktionen transformierten Kulturen die Aufnahme von ³H-Thymidin durch ruhende 3T3-Zellen. Wie oben festgestellt, wird die Aufnahme von ³H-Thymidin durch ruhende 3T3-Zellen als Hinweis auf die mitogene Stimulation angesehen. Die Medien von Hefezellen, die mit pMPOT2 transformiert waren, zeigten keine mitogene Aktivität.
Die Daten stellen einen klaren Beweis dar, daß die Wachstumsmedien aus den hier konstruierten Hefestämmen biologische Aktivitäten besitzen, die mit denen authentischen humanen PDGF's identisch sind. Weiterhin sind diese Aktivitäten in nicht-konzentrierten (1x) Medien von dem p117-2 transformierten Stamm E11-3c, der unter POT1-Selektion wachsen gelassen worden ist, leicht nachweisbar.
Die VSB-Präparation wurde weiter durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und anschließend Mitogenesetest des Gel-fraktionierten Materials charakterisiert. 90% der mitogenen Aktivität von VSB wird aus der 30 Kilodalton Region des Geles zurückgewonnen (15). Dies weist darauf hin, daß diese Expressionseinheit ein sehr homogenes und wahrscheinlich voll prozessiertes Material erzeugt. In diesem Sinn ist das VSB-Protein den oben beschriebenen VS2α- und VSα-Proteinen überlegen, die sehr heterogen sind. Zusätzlich ist das VSB-Material ein positives Chemoattraktanz, was darauf hinweist, daß es das volle Spektrum der biologischen PDGF-Aktivitäten besitzen kann.
Angesichts des Vorstehenden wird allgemein anerkannt werden, daß, obwohl zum Zweck der Veranschaulichung besondere Ausführungsformen der Erfindung beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Dementsprechend ist die Erfindung nur durch die nachfolgenden Ansprüche eingeschränkt.

Claims

DNA-Konstruktion, die zur Steuerung der Expression und Sekretion biologisch aktiver PDGF-Analoga in eukaryontischen Zellen fähig ist, wobei die DNA-Konstruktion einen Transkriptions-Promotor enthält, dem stromabwärts ein Gen folgt, das für ein Protein mit im Wesentlichen der gleichen Struktur und mitogenen Aktivität wie PDGF codiert, und eine Signalsequenz, die die Sekretion des Proteins aus der eukaryontischen Zelle steuert, wobei die eukaryontische Zelle eine Hefezelle ist und der Promotor und die Signalsequenz aus Hefe stammen.
DNA-Konstruktion nach Anspruch 1, wobei das Gen das v-sis-Gen aus Affensarkomavirus oder ein Derivat davon ist und für ein Protein mit biologischer Aktivität codiert.
DNA-Konstruktion nach Anspruch 2, wobei das Derivat des v-sis-Genes des Affensarkomavirus der Teil des v-sis-Genes ist, der für ein im Wesentlichen mit der B-Kette von PDGF homologes Protein codiert.
DNA-Konstruktion nach Anspruch 1, wobei das Gen das humane cDNA-Gen für PDGF oder Teile davon ist, das für ein Protein mit biologischer Aktivität codiert.
Verfahren zum Herstellen biologisch aktiver PDGF-Analoga, umfassend: – das Einführen einer DNA-Konstruktion, die zur Steuerung der Expression und Sekretion biologisch aktiver PDGF-Analoga in eukaryontischen Zellen in der Lage ist, in eine eukaryontische Wirtszelle, wobei die DNA-Konstruktion einen Transkriptions-Promotor enthält, dem stromabwärts ein Gen folgt, das für ein Protein mit im Wesentlichen der gleichen Struktur und mitogenen Aktivität wie PDGF codiert, und eine Signalsequenz, die zur Steuerung der Sekretion des Proteins aus der eukaryontischen Wirtszelle fähig ist; – das Wachsenlassen der eukaryontischen Wirtszelle in einem angemessenen Medium; und – das Isolieren des Proteinproduktes des Genes aus der eukaryontischen Wirtszelle, wobei die eukaryontische Zelle eine Hefezelle ist, und der Promotor und die Signalsequenz aus Hefe stammen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Gen das v-sis-Gen aus Affensarkomavirus oder ein Derivat davon ist, das für ein Protein mit biologischer Aktivität codiert.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Derivat des v-sis-Genes aus Affensarkomavirus der Teil des v-sis-Genes ist, der für ein im Wesentlichen mit der B-Kette von PDGF homologes Protein codiert.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Gen das humane cDNA-Gen für PDGF oder Teile davon ist, das für ein Protein mit biologischer Aktivität codiert.
Hefezelle, transformiert mit einer DNA-Konstruktion gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
Hefezelle gemäß Anspruch 9, wobei die DNA-Konstruktion das Plasmid pVSBm ist, das die folgenden Bestandteile umfasst: (a) einen bakteriellen Replikationsursprung und einen selektierbaren Macker; (b) einen Hefe-Replikationsursprung; (c) ein S. pombe POT1 Gen (selektierbarer Marker für Hefe); (d) einen S. cerevisiae TPI-Promotor; (e) eine Alpha-Faktor Sekretionsleitsequenz (secretory leader sequence); (f) ein Gen, das für ein Protein mit im Wesentlichen der gleichen Struktur und mitogenen Aktivität wie PDGF codiert; und (g) den S. cerevisiae TPI-Terminator.
DNA-Konstruktion, die zur Replikation in Hefe fähig ist und den Hefe-Triosephosphatisomerase-Promotor enthält, wobei dem Hefepromotor stromabwärts die Signalsequenz des für den Hefe "mating pheromone"-Alpha-Faktor codierenden Genes folgt, und wobei der Signalsequenz stromabwärts der Teil des v-sis-Genes, der für ein im Wesentlichen mit der B-Kette von PDGF homologes Protein codiert, und der Hefe-Triosephosphatisomerase-Terminator folgen.
Plasmid pVSBm, umfassend die folgenden Bestandteile: (a) einen bakteriellen Replikationsursprung und einen selektierbaren Marker; (b) einen Hefe-Replikationsursprung; (c) ein S. pombe POT1-Gen (selektierbarer Marker für Hefe); (d) einen S. cerevisiae TPI-Promotor; (e) eine Alpha-Faktor Sekretionsleitsequenz; (f) ein Gen, das für ein Protein mit im Wesentlichen der gleichen Struktur und mitogenen Aktivität wie PDGF codiert; und (g) den S. cerevisiae TPI-Terminator.
DNA-Konstruktion, die zur Steuerung der Expression und Sekretion biologisch aktiver PDGF-Analoga in Hefezellen fähig ist, wobei die DNA-Konstruktion einen Transkriptions-Promotor enthält, dem stromabwärts eine für ein im Wesentlichen mit der B-Kette von PDGF homologes Protein codierende DNA-Sequenz folgt, wobei das Protein im Wesentlichen die gleiche Struktur und mitogene Aktivität wie PDGF hat, und eine Signalsequenz, die die Sekretion des Proteins aus der Hefezelle steuert, wobei der Promotor und die Signalsequenz aus Hefe stammen.
Verfahren zum Herstellen biologisch aktiver PDGF-Analoga, umfassend: – das Einführen einer DNA-Konstruktion, die zur Steuerung der Expression und Sekretion biologisch aktiver PDGF-Analoga in Hefezellen fähig ist, in eine Hefe-Wirtszelle, wobei die DNA-Konstruktion einen Transkriptions-Promotor enthält, dem stromabwärts eine für ein im Wesentlichen mit der B-Kette von PDGF homologes Protein codierende DNA-Sequenz folgt, wobei das Protein im Wesentlichen die gleiche Struktur und mitogene Aktivität wie PDGF hat, und eine Signalsequenz, die die Sekretion des Proteins aus der Hefe-Wirtszelle steuert; – das Züchten der Hefe Wirtszelle in einem angemessenen Medium; und – das Isolieren des Proteinproduktes des Genes aus der Hefe-Wirtszelle, wobei der Promotor und die Signalsequenz aus Hefe stammen.