DE3587697T2 - Klonierung und Expression von HTLV-III DNS. - Google Patents

Klonierung und Expression von HTLV-III DNS.

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Description

    Technische Gebiete
  • Diese Erfindung liegt auf dein Gebiet der Molekularbiologie und Virologie und betrifft insbesondere das humane T-Zell- Leukämievirus - Typ III (HTLV-III).
    • Hintergrund
  • Der Begriff humanes T-Zell-Leukämie-Lymphomvirus (HTLV) bezieht sich auf eine einzigartige Familie von T-Zell-trophischen Retroviren. Diese Viren spielen eine bedeutende Rolle in der Pathogenese von bestimmten T-Zell-Neoplasmen. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind drei HTLV-Typen bekannt. Eine Untergruppe der Familie, HTLV-Typ I (HTLV-I), steht in Beziehung mit der Ursache von adulten T-Zell-Leukämie-Lymphomen (ATLL) die in bestimmten Regionen von Japan, der Karibik und Afrika vorkommen. HTLV-Typ II (HTLV-II) ist aus einem Patienten mit einer T-Zell-Variante der Haarzellleukämie isoliert worden. M. Popovic et al., Detection, Isolation and Continuous Production of Cytopathic Retroviruses (HTLV-III) from Patients with AIDS and Pre-AIDS. Science, 224 : 497-500 (1984)
  • HTLV-Typ III (HTLV-III) ist aus vielen Patienten mit dem erworbenen Immundefektsyndrom (AIDS) isoliert worden. HTLV-III bezieht sich auf das Prototypvirus, das aus AIDS-Patienten isoliert wurde. Gruppen, für die ein hohes Risiko für AIDS berichtet wurde, schließen homosexuelle oder bisexuelle Männer; intravenöse Drogenverwender und haitianische Immigranten in den Vereinigten Staaten ein. Hemophile, die gepoolte Blutprodukte von Spendern erhalten, und Empfänger zahlreicher Bluttransfusionen besitzen ebenfalls ein Risiko. Die klinischen Manifestationen von AIDS umfassen starke, unerklärliche Immunschwäche, die im allgemeinen die Abnahme an T-Helfer-Lymphozyten aufweist. Diese können von malignen Erkrankungen und Infektionen begleitet sein. Die Mortalitätsrate für Patienten mit AIDS ist hoch. Eine weniger schlimme Form von AIDS existiert ebenfalls, bei der Lymphadenopathie und verringerte T-Helfer-Zellzahlen vorkommen können; hierbei tritt jedoch nicht das verherende Krankheitsbild von voll ausgebildetem AIDS auf. Es können Individuen vorkommen, die als AIDS-erkrankt im frühen Stadium klassifiziert werden (Prä-AIDS), die diese Anzeichen zeigen. Es ist gegenwärtig nicht möglich vorherzusagen, wer von diesen die schlimmeren Symptome entwickeln wird.
  • Viele der Hinweise machen HTLV-III als das etiologische Agenz des infektiösen AIDS verantwortlich. Erstens, es gibt eine schlüssige Epidemiologie; mehr als 95% der Patienten mit AIDS besitzen für HTLV-III Spezifische Antikörper. Zweitens, es ist die reproduzierbare Identifizierung und Isolierung von Virus bei dieser Krankheit gelungen; mehr als 100 Varianten an HTLV-III sind aus AIDS-Patienten isoliert worden. Drittens, es ist eine Übertragung der Krankheit auf normale, gesunde Individuen festgestellt worden, die Bluttransfusionen mit infiziertem Spenderblut erhielten.
  • Von HTLV-III ist gezeigt worden, daß es mehrere Eigenschaften mit HTLV-I und HTLV-II teilt, aber auch, daß es morphologisch, biologisch und in den Antigeneigenschaften davon unterscheidbar ist. R.C. Gallo et al., Frequent Detection and Isolation of Cytopathic Retroviruses (HTLV-III) from Patients with AIDS and at Risk for AIDS. Science, 224 : 500-503 (1984). Zum Beispiel ist von HTLV-III gezeigt worden, daß es in seinen Antigeneigenschaften mit HTLV-I und HTLV-II verwandt ist, indem die Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen HTLV-I und HTLV-II Kernproteine, p24 und p19, und Hüllantigene gezeigt wurde, und durch Untersuchungen der Nuklein- Säure-Kreuzhybridisierung mit klonierten HTLV-I und HTLV-II DNAs. Jedoch im Gegensatz zu HTLV-I und HTLV-II fehlt ihm die Fähigkeit, T-Zellen aus normalem Nabelschnurblut und Knochenmark in vitro zu infizieren und zu transformieren, und es zeigt den zytopathischen Effekt nur auf infizierte Zellen.
  • Wie das RNA-Genom anderer Retroviren enthält das RNA-Genom von HTLV-III drei Gene, die für virale Proteine kodieren: 1) Das gag-Gen, das für die inneren Strukturproteine (Nukleokapsid oder Kern) kodiert; 2) das pol-Gen, das für die auf RNA gerichtete DNA-Polymerase (reverse Transkriptase) kodiert; und 3) das env-Gen, das für die Hüllglykoproteine des Virions kodiert. Weiterhin enthält das HTLV-III-Genom eine als Px bezeichnete Region, die zwischen dem env-Gen und dem 3' LTR lokalisiert ist, die an dem funktionellen Abtöten des Virus beteiligt zu sein scheint.
  • Zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist AIDS vor dem Auftreten von klinischen Manifestationen immer noch schwierig zu diagnostizieren. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist kein Verfahren zur Prävention der Krankheit verfügbar. Die Behandlung von AIDS-Kranken ist im allgemeinen nicht erfolgreich, und die Opfer leiden an den verheerenden Wirkungen, die HTLV-III auf den Körper zeigt.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Erfindung beruht auf der Klonierung von HTLV-III-DNA in rekombinanten Vektor-Wirtssystemen durch den Anmelder, die immunologisch reaktionsfähige HTLV-III-Polypeptide exprimieren kann. Basierend auf der Klonierung von HTLV-III- DNA in Systemen, die immunologisch reaktionsfähige Polypeptide exprimieren, hat der Anmelder nützliche Verfahren zur Diagnose, der Behandlung und Prävention von AIDS entwickelt. Der Anmelder hat Verfahren zum Nachweis von HTLV-III und Antikörpern gegen HTLV-III in Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Speichel, Samen) und nützliche Verfahren zur Immuntherapie (z. B. Impfung und passive Immunisierung gegen AIDS) entwickelt. Weiterhin hat der Anmelder Verfahren zum Herstellen von HTLV-III DNA-Sonden und RNA-Sonden entwickelt, die zum Nachweis von HTLV-III in Körperflüssigkeiten geeignet sind. Mit Hilfe dieser rekombinanten DNA-Verfahren sind Polypeptide hergestellt worden, die von einem Segment des HTLV-III- Genoms kodiert werden. Die Polypeptide, die von einem 1,1 Kb EcoRI Restriktionsfragment aus HTLV-III-cDNA kodiert werden, sind hergestellt worden. Die exprimierten Polypeptide sind isoliert worden. Diese Polypeptide sind immunologisch reaktionsfähig mit Seren aus Patienten mit AIDS und mit Antikörpern gegen HTLV-III, und sie sind daher geeignet bei dem Testen von Blut oder anderen Körperflüssigkeiten auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen HTLV-III. Deshalb stellt die Erfindung des Anmelders nicht nur ein Verfahren zur Diagnose von AIDS bereit, sondern auch zur Verhinderung der Transmission der Krankheit durch Blut oder Blutbestandteile, die HTLV-III beherbergen, auf Andere. Letzteres ist insbesondere wertvoll bei dem Testen von Spenderblut, bevor es transfundiert oder eingesetzt wird, um Blutbestandteile zu erzeugen (z. B. Faktor VIII für die Behandlung von Hämophilie; Faktor IX).
  • Verfahren werden bei der Herstellung von Antikörpern, einschließlich monoklonaler Antikörper, gegen das Virus eingesetzt. Solche Antikörper bilden die Grundlage für Immunoassays und diagnostische Techniken zum direkten Nachweis von HTLV-III in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Speichel, Samen usw. Neutralisierende Antikörper gegen das Virus können verwendet werden, um gegen die Krankheit passiv zu immunisieren.
  • Die Klonierung von HTLV-III-DNA durch den Anmelder in solchen rekombinanten Vektor-Wirtssystemen stellt ebenfalls die Grundlage zur Bestimmung der Nukeotidsequenz von HTLV-III- DNA dar. Die DNA-Sonden sind im wesentlichen homolog zu der 1,1- Kb-EcoRI-DNA, die einzigartig ist für das HTLV-III-Genom. Die DNA-Sonden stellen ein weiteres Verfahren zum Nachweis von HTLV-III in Blut, Speichel oder anderen Körperflüssigkeiten bereit. RNA-Sonden, die Regionen enthalten, welche für das HTLV-III-Genom einzigartig sind, können ebenfalls hergestellt und zum Nachweis von HTLV-III in Körperflüssigkeiten verwendet werden.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Fig. 1 zeigt eine Darstellung der HTLV-III-DNA. Fig. 1a zeigt Stellen, an denen das Genom von dem Restriktionsenzym SstI gespalten wird, und Fig. 1b zeigt die Fragmente des HTLV-III-Genoms, die durch die Einwirkung der Restriktionsenzyme Kpn, EcoRI und Hind III erzeugt werden.
  • Fig. 2 ist eine Darstellung von HTLV-III-DNA. Fig. 2a zeigt die Lage von Restriktionsenzymspaltstellen in dem Genom, und Fig. 2b zeigt die Lage von DNA-Inserts in dem HTLV-III-Genom in Klonen mit einem offenen Leseraster. (+) und (-) zeigen die Reaktivität bzw. fehlende Reaktivität der Fusionsproteine, exprimiert von mit den ORF-Vektoren transformierten Zellen, mit Seren aus AIDS-Patienten an.
  • Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz der HTLV-III-DNA und die vorhergesagte Aminosäureseuquenz der vier längsten offenen Leseraster. Restriktionsenzymspaltstellen sind oberhalb der Nukleotidseguenz angegeben.
  • Fig. 4 stellt einen Immunblot dar, der die Position von HTLV-III-env-beta-Galaktosidase-Fusionsproteinen auf einem SDS-Polyacrylamidgel zeigt.
  • Fig. 5 zeigt Stellen, an denen das Genom von dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten wird, und die Konstruktion des rekombinanten Plasmids, das HTLV-III-DNA enthält.
  • Fig. 6 zeigt einen Immunblot, der die Positionen von Peptiden auf Nitrozelluloseblots zeigt, die von bakteriellen Zellen erzeugt wurden, die mit rekombinanten Konstrukten ompA1-R-6; ompA2-R-7 und ompA3-R-3 transformiert waren, in die ein 1,1 Kb EcoRI-HTLV-III-cDNA-Restriktionsfragmet eingefügt worden war. Fig. 6a zeigt die Nukleotidsequenz des opmA-Signalpeptids und die relevante Region der rekombinanten Plasmide ompA1-R-6; ompA2-R-7 und ompA3-R-3.
  • Fig. 7 zeigt einen Immunblot, der die Blockierung der Reaktion zwischen HTLV-III-Antigenen und einem AIDS-Serum durch Lysate von E. coli zeigt, das das rekombinante HTLV-III-DNA- Plasmid ompA1-R-6 enthält (Spuren 1 bis 5), und zeigt die fehlende Blockierung der Reaktion durch Lysate von E. coli- Kontrollzellen (Spuren 6 bis 10).
  • Fig. 8 zeigt einen Immunblot, der die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern in Seren gesunder Individuen (Spuren 1 bis 3) und aus AIDS-Patienten (Spuren 4 bis 11) gegen das Peptid anzeigt, das von dem 1,1 Kb EcoRI-HTLV-Iii- Restriktionsfragment der HTLV-III-cDNA kodiert wird. Gereinigtes HTLV-III-Virus (Serie A) oder Gesamtzelllysate des Bakterienklons ompA1-R-6 (O1R6) wurden mit den Serumproben umgesetzt.
  • Fig. 9 stellt den ein offenes Leseraster enthaltenden Expressionsvektor pMRI00, enthaltend HTLV-III-DNA, dar.
  • Fig. 10 stellt Lambda-CI-HTLV-III-beta-Galakosidase-Fusionsproteine dar. Fig. 10a zeigt einen Immunblot, der die Position der Lambda-CI-HTLV-III-beta-Galakosidase Fusionsproteine auf einem SDS-Polyacrylamidgel zeigt, und Fig. 10b zeigt die immunologische Reaktion solcher Proteine mit Seren aus AIDS-Patienten.
    • Bestes Verfahren zum Ausführen der Erfindung
  • Trotz der Ähnlichkeiten zwischen HTLV-III und den weiteren Virusmitgliedern der HTLV-Rinderleukämievirus (BLV)-Familie unterscheidet sich die Biologie und Pathologie von HTLV-III doch beträchtlich. Zum Beispiel wurde nur eine relativ geringe Homologie in dem Genom von HTLV-III gefunden, wenn diese mit den HTLV-I oder HTLV-II-Genomen verglichen wurde. Eine Infektion mit HTLV-III führt oft zu einer drastischen Immunsupression (AIDS), was eine Folge der Entfernung der OKT4(+)-Zellpopulation ist. Dieser Effekt ist eher das Spiegelbild eines verstärkten zytopathischen anstatt eines transformierenden Effekts der HTLV-III-Infektion auf die OKT4(+)-Zellen in in vitro-Lymphozytenkulturen. Im Gegensatz dazu führt die Infektion mit HTLV-I zu einer niedrigen Insidenz von T-Zell-Leukämielymphomen (einer OKT4(+ )-Zellmalignität). Es gibt auch Hinweise auf einen gewissen Grad an Immundefizienz in HTLV-I-Patienten. Eine Infektion primärer Lymphozyten in Kultur durch HTLV-I und -II führt zur invitro-Transformation von überwiegend OKT4(+)-Zellen. Ein zytopathischer Effekt der HTLV-I-Infektion auf Lymphozyten ist offensichtlich, aber der Effekt ist nicht so deutlich wie für HTLV-III beobachtet.
  • HTLV-III unterscheidet sich von HTLV-I und -II auch in dem Ausmaß der infektiösen Virionproduktion in vivo und in vitro. Hohe Titer an zellfreien, infektiösen Virionen können aus dem Samen und Speichel von AIDS-Patienten und dem Überstand von mit HTLV-III infizierten Kulturen erhalten werden. Sehr wenige, wenn überhaupt, zellfreie infektiöse Virionen können aus erwachsenen T-Zell-Leukämie-Lymphom(ATL-)- Patienten oder aus mit HTLV-I oder -II infizierten Kulturen gewonnen werden.
  • Das Hüllglykoprotein ist das Hauptantigen, das von Antiseren von AIDS-Patienten erkannt wird. In dieser Hinsicht ähnelt HTLV anderen Retroviren, für die das Hüllglykoprotein typischerweise das am stärksten antigene virale Polypeptid darstellt. Weiterhin sind die neutralisierenden Antikörper im allgemeinen gegen das Hüllglykoprotein des Retrovirus gerichtet. 88 bis 100% der Serumproben von AIDS-Infizierten enthalten Antikörper, die mit Antigenen von HTLV-III reaktionsfähig sind; die hauptsächliche immunologische Reaktivität war gegen p41 gerichtet, dem vermutlichen Hüllantigen von HTLV-III. Antikörper gegen Kernproteine sind auch in Seren von AIDS-Patienten nachgewiesen worden, aber diese erscheinen als Indikator der Infektion nicht so wirkungsvoll wie die Anwesenheit von Antikörpern gegen Hüllantigen.
  • Die Charakterisierung des p41-Antigens von HTLV-III zeigte sich als schwierig, da die Virushülle während des Verfahrens zur Virusinaktivierung und -reinigung teilweise zerstört wird. Diese Erfindung bietet eine Antwort auf das dringende Bedürfnis, diese antigene Komponente des HTLV-III-Virus zu charakterisieren und die Anwesenheit und Identität von weiteren viralen antigenen Komponenten auf verschiedenen Wegen zu bestimmen. Sie stellt Produkte bereit, wie HTLV-III- Polypeptide, Antikörper gegen die Polypeptide und RNA- und DNA-Sonden, wie auch Verfahren zu deren Herstellung. Diese dienen als die Grundlage für Screening-, diagnostische und therapeutische Produkte und Verfahren.
  • Diese Erfindung betrifft HTLV-III-Polypeptide, die durch Translation einer rekombinanten DNA-Sequenz, die für HTLV-III-Proteine kodiert, hergestellt werden. Auf diese Weise hergestellt Polypeptide, die mit Serum von AIDS- Patienten oder Antikörpern gegen HTLV-III immunologisch reaktionsfähig sind, werden als rekombinante, mit Hilfe von DNA hergestellte, immunologisch reaktionsfähige HTLV-III- Polypeptide bezeichnet. Sie schließen die Polypeptide ein, die durch Translation der rekombinanten DNA-Sequenzen, die sich in einem 1,1 Kb EcoRI-Restriktionsfragment von HTLV- III-cDNA befinden, hergestellt werden.
  • Die von dieser Region des HTLV-III kodierten Polypeptide können in immunchemischen Tests zum Nachweis von Antikörpern gegen HTLV-III- und HTLV-VIII-Infektionen verwendet werden. Diese Verfahren können in der Diagnose von AIDS hilfreich sein. Weiterhin können sie auch zum Testen von Blut vor dessen Verwendung zur Transfusion oder zur Produktion von Blutbestandteilen (z. B. Faktor VIII für die Behandlung von Hämophilie) verwendet werden. Die Verfügbarkeit von Testverfahren wird das Risiko der AIDS-Übertragung verringern.
  • Der Nachweis von mit den Polypeptiden reaktionsfähigen Antikörpern kann mit Hilfe einer Anzahl etablierter Methoden durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein immunologisch reaktionsfähiges HTLV-III-Polypeptid auf einer Festphase (wie Polystyrolkügelchen oder einen anderen festen Träger) fixiert werden. Die Festphase wird dann mit der auf Antikörper gegen HTLV-III zu testenden Blutprobe inkubiert. Nach einer angemessenen Inkubationsperiode werden die Festphase und die Blutprobe getrennt. An die Festphase gebundener Antikörper kann mit markiertem Polypeptid oder mit einem markierten, gegen Humanimmunglobolin gerichteten Antikörper nachgewiesen werden.
  • Die HTLV-III-Polypeptide können in einem Impfstoff zur Prävention von AIDS verwendet werden.
  • Die Polypeptide können auch verwendet werden, um Antikörper, einschließlich monoklonale Antikörper, gegen die HTLV-III- Polypeptide herzustellen. Diese Antikörper können in immunchemischen Tests für den direkten Nachweis des Virus in Körperflüssigkeiten (wie Blut, Speichel und Samen) verwendet werden. Tests, die monoklonale Antikörper gegen spezielle HTLV-III antigene Determinanten verwenden, werden falsch positive Ergebnisse verringern, wodurch die Genauigkeit der Tests auf das Virus verbessert werden. Antikörper gegen das Virus können auch in der Immuntherapie nützlich sein. Zum Beispiel können Antikörper verwendet werden, um passiv gegen das Virus zu immunisieren.
  • Die Verfahren zur Herstellung der Polypeptide sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung, wie auch diagnostische Verfahren, basierend auf diesen Polypeptiden.
    • HTLV-III-Polyeptide
  • Verfahren der genetischen Manipulation werden verwendet, um ein 15 kd Peptid zu isolieren, das von einem 1,1 Kb EcoRI- HTLV-III-Restriktionsfragment der HTLV-III-DNA kodiert wird. Diese Verfahren werden ebenfalls verwendet, um die Fragmente, die für die Polypeptide kodieren, zu sequenzieren. Die in die Wirtszell-DNA integrierten Provirusgene werden molekular kloniert, und die Nukleotidsequenz der klonierten Proviren werden bestimmt.
  • Eine E. coli-Expressionsbank von HTLV-III-DNA wird hergestellt. Das HTLV-III-Genom wird kloniert und dann werden mit Restriktionsenzymen Schnitte in das klonierte HTLV-III- Genom eingeführt, um DNA-Fragmente herzustellen (Fig. 1 und 2). HTLV-III-DNA-Fragmente von ungefähr 200 bis 500 Bp werden aus einem Agarosegel isoliert, am Ende aufgefüllt mit T&sub4;-Polymerase und mit Linker-DNA ligiert. Die mit dem Linker ligierte DNA wird dann mit einem Restriktionsenzym behandelt, aus Agarosegel gereinigt und in einen Expressionsvektor kloniert. Beispiele für die verwendeten Expressionsvektoren sind: OmpA, pIN (A, B und C), lambda pL, T7, lac, Trp, ORF und lambda gt11. Weiterhin können Vektoren für Säugerzellen verwendet werden, wie pSV28pt, pSV2neo, pSVdhfr und VPV-Vektoren, und Hefevektoren, wie GALI und GAL10.
  • Die bakteriellen Vektoren enthalten die Lac-kodierenden Sequenzen, in die HTLV-III-DNA eingefügt werden kann zur Erzeugung von β-Galaktosidase-Fusionsprotein. Die rekombinanten Vektoren werden dann in Bakterien (z. B. E. coli) eingeführt; solche Zellen, die einen Vektor enthaltend HTLV- III-DNA aufnehmen, werden als transformiert bezeichnet. Die Zellen werden dann abgesucht, um Zellen zu identifizieren, die transformiert worden sind und das Fusionsprotein exprimieren. Zum Beispiel werden die Bakterien auf Macconkey- Agarplatten ausplattiert, um den Phenotyp des Klons zu verifizieren. Wenn funktionelle β-Galaktosidase hergestellt wird, erscheint die Kolonie rot.
  • Bakterienkolonien werden auch mit HTLV-III-DNA-Sonden abgesucht, um Klone zu identifizieren, die die interessierende DNA-Region enthalten. Klone, die positiv sind, wenn sie mit der DNA-Sonde abgesucht werden, und positiv sind auf den MacConkey-Agarplatten, werden isoliert.
  • Diese Identifizierung von Zellen, die die HTLV-III-DNA-Sequenzen enthalten, macht es möglich, HTLV-III-Polypeptide herzustellen, die mit einem HTLV-III spezifischen Antikörper immunologisch reagieren. Die Zellen der ausgewählten Kolonien werden in Kultur unter solchen Bedingungen gehalten, die die Expression des hybriden Proteins erlauben. Das Zellprotein wird dann auf herkömmliche Weise erhalten. Zum Beispiel kann die Kultur zentrifugiert und das erhaltene Zellpellet aufgebrochen werden. Von den Wirtszellen sezernierte Polypeptide könne aus dem Zellkulturüberstand (ohne Zerstörung der Zellen) erhalten werden.
  • Das gesamte zelluläre Protein wird mit Hilfe eines SDS-Polyacrylamidgelelektrpphoreselaufs analysiert. Die Fusionsproteine werden an einer Position auf dem Gel identifiziert, die kein weiteres Protein enthält. Westernblot-Analysen werden ebenfalls mit solchen Klonen durchgeführt, die nach dem Absuchen positiv waren. Solche Analysen werden mit Serum von AIDS-Patienten durchgeführt mit dem Ergebnis, daß es möglich ist, solche Klone zu identifizieren, die HTLV-III-β- Galaktosidase-Fusionsproteine (Antigene) exprimieren, die mit dem HTLV-III spezifischen Antikörper kreuzreagieren.
  • Lambda-&sub1;&sub0;-Klone, die die HTLV-III-DNA tragen, werden von der replizierenden Form des Virus kloniert. Während sich das Retrovirus repliziert, wird doppelsträngige DNA hergestellt. Die klonierte HTLV-III-DNA wird mit dem Restriktionsenzym SstI gespalten (Fig. 1a). Da es innerhalb des LTR der HTLV- III-DNA zwei SstI-Erkennungsstellen gibt, ist eine LTR-Region nicht vorhanden in der klonierten DNA-Sequenz, die aus dem lambda-&sub1;&sub0;-Vektor entfernt wurde. Als ein Ergebnis fehlt ein kleines (ungefähr 200 Bp) Fragment der HTLV-III-DNA.
  • Die erhaltene DNA wird linearisiert und Fragmente werden erzeugt, indem die linearisierte genomische DNA, die die env- Genregion umfaßt, mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten wird (Fig. 1b). Die erhaltenen 1,1 Kb EcoRI-EcoRI-Fragmente werden mit Hilfe von Gelelektrophorese und Elektroelution isoliert. Diese Fragmente werden willkürlich geschert, um kleinere Fragmente zu erzeugen. Die so hergestellten Fragmente werden von dem Agarosgel abgetrennt, und DNA-Fragmente zwischen ungefähr 200 bis 500 Bp werden eluiert.
  • Die eluierten 200 bis 500 Bp DNA-Fragmente werden an den Enden mit Hilfe von E.-coli-T&sub4;-Polymerase aufgefüllt, und die stumpfen Enden werden in einen offenen Leseraster (ORF) eines Expressionsvektors, wie pMR100, ligiert. Diese Ligation kann an der SmaI-Stelle des pMR100-Vektors erfolgen, der zwei Promotor-Regionen, hybridkodierende Sequenzen des lambdacl-Gens und lacI-Lac2-Genfusionssequenzen enthält. In dem Vektor liegen diese Sequenzen nicht im Leseraster; als Ergebnis ist der Vektor nicht produktiv. Die HTLV-III-DNA wird in den Vektor eingefügt; die richtigen DNA-Fragmente korrigieren das Leseraster mit dem Ergebnis, daß CI-HTLV- III-β-Galaktosidase-Fusionsproteine erzeugt werden. Die Expression des Hybrids ist unter der Kontrolle des lac-Promotors. Basierend auf der Sequenz von pMR100 scheint es so zu sein, daß, falls ein in die 5mal-Stelle kloniertes DNA- Fragment-Insert ein geeignetes Leseraster zwischen dem lambdaCI-Genfragment und dem lac-Z-Fragment erzeugen soll, das eingefügte DNA-Fragment keine Stopcodons in dem Leseraster enthalten darf, der von dem Raster des lambdacI-Gens vorgegeben ist.
  • Die rekombinanten PMR100-Vektoren werden dann in E. coli eingeführt. Die Bakterien werden auf MacConkey-Agarplatten ausplattiert, um den Phenotyp der Klone zu verifizieren. Falls funktionelle β-Galaktosidase hergestellt wird, erscheint die Kolonie rot. Die Kolonien werden auch mit HTLV- III-DNA-Sonden zu dem Zweck abgesucht, solche Klone, enthaltend das Insert, zu identifizieren. Klone, die nach Absuchen mit der DNA-Sonde positiv sind und auf den Macconkey-Agarplatten positiv sind, werden isoliert.
  • Die Zellen von diesen ausgewählten Kolonien werden in Kultur genommen. Die Kultur wird abzentrifugiert und das Zellpellet aufgebrochen. Das gesamte zelluläre Protein wird mit Hilfe eines SDA-Polyacrylamidgellaufs analysiert. Die Fusionsproteine werden an einer Position auf dem Gel identifiziert, die kein weiteres Protein enthält (Fig. 4).
  • Westernblot-Analysen werden ebenfalls mit den als positiv aufgefundenen Klonen durchgeführt. Seren aus AIDS-Patienten werden verwendet, die es somit erlauben, solche Klone zu identifizieren, die mit dem HTLV-III Spezifischen Antikörper kreuzreagierende HTLV-III-β-Galaktosidase-Fusionsproteine exprimieren. Nach diesem Verfahren wurden tausend Klone abgesucht; 6 waren positiv.
  • Wegen der Natur des PMR100-Klonierungsvehikels sollte ein produktives DNA-Insert auch als Teil eines längeren Fusionspolypeptids exprimiert werden. Rekombinante Klone, die das HTLV-II1-env-Gen enthalten, wurden mit Hilfe der Koloniehybridisierung identifiziert. Die Produktion von längeren Fusionspolypeptiden, die eine funktionelle β-Galaktosidase- Aktivität beherbergen, wurde durch phenotypische Identifizierung auf MacConkey-Agarplatten verifiziert; ebenso durch β-Galaktosidase-Enzymtests und durch die Analyse auf 75% SDS-Polyacrylamidgelen. Die immunologische Reaktivität der größeren Proteine mit Antikörpern gegen HTLV-III wurde anhand von Westernblot-Analysen unter Verwendung von Serum von AIDS-Patienten ermittelt. Diese großen Fusionsproteine reagierten auch mit Anti-B-Galaktosidase- und Anti-CI-Antiserum. Dieser Befund steht in Einklang mit der Hypothese, daß sie Proteine von CI-HTLV-III-LacIZ darstellen.
  • Das Insert-Fragment von HTLV-III mit dem offenen Leseraster wird weiterhin analysiert durch DNA-Sequenzanalysen. Da eine der zwei BamHI-Stellen, die die SmaI-Klonierungsstelle in pMR100 flankieren, während dem Klonierungsschritt zerstört wird, werden positive Klone mit den Restriktionsenzymen HindIII und ClaI gespalten, um das eingeführte HTLV-III- DNA-Fragment freizusetzen. Die HTLV-III-ORF-Inserts werden aus der Fusionsrekombinanten isoliert und in M13-Klonierungsvektoren mp18 und mp19, gespalten mit HindIII und AccI, zum Sequenzieren kloniert. DNA-Sequenzen der positiven ORF-Klone werden dann bestimmt.
  • Fragmente an HTLV-III-DNA von ungefähr 200 bis 500 Bp werden dann aus dem Agarosegel isoliert, an den Enden mit T&sub4;-Polymerase aufgefüllt und an EcoRI-Linker ligiert. Die an die EcoRI-Linker legierte DNA wird dann mit EcoRI behandelt, aus dem 1% Agarosegel gereinigt und in einen Expressionsvektor, lambda gt11, kloniert. Dieser Vektor enthält lacZ-genkodierende Sequenzen, in die die Fremd-DNA zur Erzeugung von β-Galaktosidase-Fusionsprotein eingefügt werden kann. Die Expression des Hybridgens ist unter der Kontrolle des Lac- Repressors. Das Lac-Repressorgen, lac I, ist auf einem separaten Plasmid pMC9 in der Wirtszelle, E. coli Y1090, enthalten. Serum von AIDS-Patienten wurde verwendet, um die lambdagt11-Bank aus HTLV-III-genomischer DNA, enthaltend 1,5·10&sup4; rekombinante Phagen, abzusuchen. Beim Absuchen von 5000 Rekombinanten wurden 100 unabhängige Klone isoliert, die starke Signale erzeugten. Die positiven rekombinanten DNA-Klone wurden weiterhin hinsichtlich ihrer Spezifischen Genexpression charakterisiert. Kaninchen-Hyperimmunserum gegen P24 wurde ebenfalls zum Identifizieren der gag-genspezifischen Klone verwendet. Nick-translatierte DNA-Proben spezieller HTLV-III-Gene, insbes. das gag-Gen, env-Gen und Px-Gen, wurden verwendet, um die positiven, immunreaktiven Klone in spezielle Genregionen einzugruppieren.
  • Rekombinante Klone, die starke Signale mit AIDS-Serum ergaben und Insert-DNA enthalten, die die HTLV-III-gag-, -pol-, -sor- und -env-lor-Genregionen enthalten, wurden durch Kartieren der Inserts mit Restriktionsenzymen und durch DNA-Sequenzanalyse ausführlich untersucht.
    • Bestimmen der Nukleotidseguenz von HTLV-III-DNA
  • Gentechnologische Verfahren werden eingesetzt, um die Nukleotidsequenz der HTLV-III-DNA zu ermitteln. Eine Technik, die zur Sequenzermittlung eingesetzt werden kann, ist eine Schrotschuß/Zufall-Sequenziermethode. HTLV-III wird willkürlich zu Fragmenten mit ungefähr 300 bis 500 Bp Größe geschert. Die Fragmente werden kloniert, z. B. mit Hilfe von m13, und die Kolonien werden abgesucht, um solche mit einem HTLV-III-DNA-Fragment-Insert zu identifizieren. Die Nukleotidsequenz wird dann erstellt, wobei mehrere Analysen ,Überlappungen in der Sequenz erzeugen. Beide Stränge der HTLV- III-DNA werden sequenziert, um die Orientierung zu ermitteln. Restriktionskartierung wird verwendet, um die erzeugten Sequenzdaten zu überprüfen.
  • Die Nukleotidsequenz eines klonierten HTLV-III-Genoms (BH10) ist in Fig. 3 gezeigt, in der die Position von gag-Protein p17 kodierenden Sequenzen und der N-Terminus von gag p24 und der C-Terminus von gag p15 (der mit dem N-Terminus des Mol- Proteins überlappt) angegeben sind. Die offenen Leseraster (ORF) für pol, sor und env-lor sind ebenfalls angegeben. Die Sequenz der restlichen 182 Bp der HTLV-III-DNA, die nicht in Klon BH10 vorhanden sind (umfassend einen Teil von R, U5, der tRNA-Primer-Bindungsstelle und einen Teil der Leader- Sequenz), wurde aus Klon HXB2 erhalten. Die Sequenzen der zusätzlichen Klone (BH8 und BH5) sind ebenfalls gezeigt. Restriktionsenzymspaltstellen sind oberhalb der Nukleotidsequenz aufgelistet; in Klon BH8, aber nicht in Klon BH10, vorhandene Stellen befinden sich in Klammern. Deletionen ([]) bei Nukleotiden 251, 254, 5671 und 6987 bis 7001 sind angegeben. Die Nukleotidpositionen (auf der rechten Seite einer jeden Zeile) beginnen mit der Transkriptionsinitiationsstelle. Die Aminosäurereste sind für die vier längsten offenen Leseraster nummeriert, in jedem Fall beginnend nach dem vorhergehenden Terminationskodon, außer für lag , das von dem ersten Methioninkodon an nummeriert ist (rechts neben jeder Zeile). Eine vorgeschlagene Peptidspaltstelle (V) und mögliche Asparagin-assoziierte Glykosilierungsstellen (*) sind für das offene Leseraster env-lor gezeigt. Die Sequenzen in dem von Klonen BH8 und BH10 stammenden LTR, aufgelistet am Beginn der Figur, stammen von dem 3'-Teil eines jeden Klons und sind vermutlich identisch zu denen in dem 5'-LTR der integrierten Kopien dieser viralen Genome.
  • Klon HXB2 stammte aus einer rekombinanten Phagenbank aus XbaI gespaltener DNA aus HTLV-III-infizieten H9-Zellen, kloniert in lambdaJ1. H9-Zellen sind humane Leukämiezellen, die mit einem Pool aus HTLV-III aus Blut von AIDS-Patienten infiziert sind, F. Wong-Staal, Nature, 321. November 1984. Klone des Klonierungsvektors BH10, BH8 und BH5 stammten aus einer Bank aus SstI-verdauter DNA aus dem Hirt-Überstand von HTLV-III-infizierten H9-Zellen, kloniert in lambdagtWes. lambdaB. Beide Banken wurden mit cDNA-Sonden abgesucht, die ausgehend von Virion-RNA mit Hilfe von Oligo.dT als einem Primer synthetisiert wurde. Klone BH8, BH5 und Teile von HXB1 wurden sequenziert, wie von Maxam und Gilbert beschrieben (1980) Maxam, A.M. and Gilbert, Co. Methods in Enzymology. 65 : 499 bis 560. Klon BH10 wurde nach dem Verfahren von Sanger sequenziert, welches modifiziert war durch die Verwendung von Oligonukleotiden als Primer, die komplementär zu der M13-Insertsequenz sind, und unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase 1 oder reverser Transkriptase als Polymerase.
    • Herstellen von RNA, RNA-Sonden und DNA-Sonden, die für HTLV-III spezifisch sind
  • DNA-Sequenzen, die ein vollständiges Gen oder ein Segment eines Gens von HTLV-III darstellen, werden in einen Vektor, wie einen T7-Vektor, eingefügt. Bei dieser Ausführungsform hat der Vektor den Tceu-Promotor von dem Promotor des T-Zellgens 10 und DNA-Sequenzen, die für elf Aminosäuren des Proteins des T-Zellgens 10 kodieren
  • Die Vektoren werden dann zum Transformieren von Zellen, wie E. coli, verwendet. Der T7-Vektor verwendet die T7-Polymerase, die die RNA-Bildung katalysiert und nur den T7-Promotor erkennt, was die Stelle ist, wo RNA-Polymerasen zur Initiation der Transkription binden. Die T&sup7;-Polymerase erkennt nicht den E. coli-Promotor. Als Ergebnis steuert der T7-Vektor die Herstellung von RNA, die komplementär zu dem HTLV- III-DNA-Insert ist, wenn HTLV-III-DNA-Sequenzen hinter dem Promotor eingefügt werden und Polymerase-Gene des T7-Vektors, die diese unter Ausschluß von weiteren Signalen erkennt, und ein Terminator unmittelbar hinter den HTLV-Ili- DNA-Sequenzen angeordnet wird.
  • Die Ermittlung der Nukleotidsequenz der HTLV-III-DNA stellt ebenfalls die Grundlage für die Herstellung von DNA-Sonden dar. Sowohl RNA-Sonden wie auch DNA-HTLV-III-Sonden müssen charakteristische Bereiche des HTLV-III-Genoms enthalten, um zum Nachweis von HTLV-III in Körperflüssigkeiten brauchbar zu sein. Es gibt relativ geringe Homologie zwischen dem HTLV-III-Genom und den HTLV-I- und -II-Genomen, und die Sonden enthalten Bereiche, die für HTLV-III charakteristisch sind (d. h. die nicht mit HTLV-I oder -II geteilt werden).
  • Virale RNA oder DNA können zum Nachweisen von HTLV-III in, z. B. Speichel, verwendet werden, von dem bekannt ist, daß er sehr hohe Konzentrationen des Virus enthält. Dies kann beispielsweise mit Hilfe eines Dot-Blots erfolgen, wobei die Speichelprobe denaturiert wird, auf Papier aufgetragen und dann mit einer der Sonden untersucht wird. Falls Speichel als die Testflüssigkeit verwendet wird, ist der Nachweis von HTLV-III deutlich schneller und leichter als in dem Fall, in dem Blut getestet wird.
    • Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die mit den HTLV-III-Polypeptiden reaktionsfähig sind
  • Monoklonale Antikörper, die mit HTLV-III-Polypeptiden reaktionsfähig sind, werden von antikörperproduzierenden Zellinien hergestellt. Die Antikörperproduzierenden Zellinien können Hybridomzellinien sein, die allgemein als Hybridome bekannt sind. Die Hybridzellen werden durch Fusion von Zellen gebildet, die einen Antikörper gegen das HTLV-III-Polypeptid herstellen, und einer immortalisierenden Zelle, d. h. einer Zelle, die der Hybridzelle eine langfristige Stabilität als Gewebekultur verleiht. Bei der Herstellung der Hybridzellinien kann der erste Fusionspartner - die antikörper-produzierende Zelle - eine Milzzelle eines Tieres sein, das gegen das HTLV-III-Polypeptid immunisiert worden ist. Alternativ dazu kann die antikörperproduzierenden Zelle eine isolierte B-Zelle darstellen, die Antikörper gegen ein HTLV- III-Antigen herstellt. Die Lymphozyten können aus der Milz, dem peripheren Blut, den Lymphknoten oder anderem Gewebe erhalten werden. Der zweite Fusionspartner - die immortalisierte Zelle - kann eine lymphoplastoide Zelle oder eine Plasmazytomzelle, wie eine Myelomzelle, sein, die selbst eine antikörperproduzierende Zelle aber auch maligne ist.
  • Mäusehybridomas, die monoklonale Antikörper gegen HTLV-III- Polypeptide erzeugen, werden hergestellt durch die Fusion von Mausmyelomzellen und Milzzellen aus Mäusen, die gegen das Polypeptid immunisiert wurden. Zum Immunisieren der Mäuse kann einer Vielzahl von verschiedenen Immunisierungsprotokollen gefolgt werden. Zum Beispiel können die Mäuse Primär- und Auffrischimmunisierungen mit dem gereinigten Polypeptid erhalten. Die Fusionen werden mit Hilfe von Standardverfahren durchgeführt (Köhler and Milstein, (1975) Nature (London) 256. 495 bis 497; Kennet, R. , (1980) in Monoclonal Antibodies (Kennet et al., Herausgeber, Seiten 365 bis 367, Plenum Press, New York).
  • Die Hybridome werden dann auf die Produktion von Antikörper getestet, die mit dem Polypeptid reaktionsfähig sind. Dies kann mit Hilfe von aus dem Stand der Technik bekannten Testverfahren erfolgen.
  • Eine andere Möglichkeit zur Herstellung der antikörperproduzierenden Zellinien ist die Transformation von antikörper-produzierenden Zellen. Zum Beispiel kann ein B-Lymphozyt, der von einem gegen das HTLV-III-Polypeptid immunisierten Tier erhalten wird, mit einem Virus, wie dem Epstein-Barr-Virus im Falle von humanen B-Lymphozyten, infiziert und transformiert werden, um eine immortalisierte antikörperproduzierende Zelle zu ergeben. Siehe z. B. Kozbor and Rodor (1983) Immunology Today 4 (3), Seite 72 bis 79. Alternativ dazu kann der B-Lymphozyt durch ein transformierendes Gen oder ein transformierendes Genprodukt transformiert werden.
  • Die monoklonalen Antikörper gegen das HTLV-III-Polypeptid könne in großen Mengen hergestellt werden, indem die antikörper-produzierenden Hybridome in die Bauchfellhöhle von Mäusen eingespritzt werden, und nach einer angemessenen Zeit wird die Aszitesflüssigkeit, die sehr hohe Titer an homogenem Antikörper enthält, isoliert und Isolieren des monoklonalen Antikörpers daraus. Xenogene Hybridome sollten in bestrahlte oder thymuslos Nacktmäuse injiziert werden. Alternativ können die Antikörper hergestellt werden durch Kultivieren von Zellen, die das HTLV-III-Polypeptid in vitro herstellen und Isolieren der ausgeschiedenen monoklonalen Antikörper aus dem Zellkulturmedium. Die nach diesen Verfahren hergestellten Antikörper können in Diagnose-Assays (z. B. Nachweis von HTLV-III in Körperflüssigkeiten) und in der passiven Immuntherapie verwendet werden. Die mit den HTLV- III-Polypeptiden reaktionsfähigen Antikörper stellen die Grundlage für diagnostische Tests zum Nachweis von AIDS oder der Anwesenheit von HTLV-III in biologischen Flüssigkeiten (z. B. Blut, Samen, Speichel) und zur passiven Immuntherapie dar. Zum Beispiel ist es möglich, Anti-p41 herzustellen, dieses an eine Festphase mit Hilfe herkömmliche Techniken anzuheften, und die zu testende Körperflüssigkeit mit dem immobilisierten Antikörper in Kontakt zu bringen. Auf diese Weise kann HTLV-III (Antigen) in der Körperflüssigkeit nachgewiesen werden; diese Verfahren führt zu weit weniger falsch-positiven Testergebnissen als Tests, bei denen Antikörper gegen HTLV-VIII nachgewiesen wird.
  • Im Folgenden wird die Erfindung weiter anhand der Beispiele erläutert.
    • BEISPIEL 1 Herstellen von beschallten DNA-Fragmenten
  • 10 ug an gelgereinigten HTLV-III-Restriktionsfragmenten wurden beschallt bis zu einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 500 Bp. Nach Beschallen wurde die DNA über eine eine DEAE-Zellulosesäule in 0,1·TBE gegeben, um das Volumen zu verringern. Die DEAE-gebundene DNA wurde mit 5 ml 0,2 M NaCl-TE (2 M NaCl, 10 mm Tris HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) gewaschen und dann mit 1 M NaCl-TE eluiert und mit Ethanol gefällt. Die Größenverteilung der beschallten DNA wurde dann auf einem 1,2% Agarosegel ermittelt. DNA-Fragmente mit der gewünschten Länge (200 bis 500 Bp) wurden dann aus dem Gel eluiert. T4-DNA-Polymerase wurde dann verwendet, um die bei dem Beschallungsverfahren erzeugten Einzelstrang-DNA-Enden aufzufüllen und/oder abzuschneiden. Die DNA-Fragmente wurden mit T4-Polymerase in der Abwesenheit von zugesetzten Nukleotiden für 5 Minuten bei 37ºC inkubiert, um Nukleotide vom 3'-Ende zu entfernen, und anschließend wurden sämtliche 4 Nukleotidvorläufer auf eine Endkonzentration von 100 uM zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde weitere 30 Minuten inkubiert, um die am 5'-Ende überhängenden Einzelstränge zu reparieren. Die Reaktion wurde durch Hitze-Inaktivierung des Enzyms bei 68ºC für 10 Minuten gestoppt. Die DNA wurde einmal mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und in TE resuspendiert.
    • BEISPIEL 2 Klonieren von zufällig gescherten DNA-Fragmenten
  • Die beschallten, mit stupfen Enden versehenen HTLV-III-DNA- Fragmente wurden in die SmaI-Stelle des ORF-Expressionsvektors pMR100 ligiert und in Wirtszellen LG90 mit Hilfe herkömmlicher Transformationsverfahren transformiert. Der β-Galaktosidase positive Phenotyp der Transformanden wurde identifiziert durch Ausplattieren der transformierten Zellen auf Ampicillin-(25 ug/ml) -enthaltenden McConkey-Agarplatten und Untersuchen des Phenotyps nach 20 Stunden bei 37ºC.
    • BEISPIEL 3 Analyse von Hybridprotein
  • Zehn Milliliter Proben von Zellen von einer gesättigten Übernachtkultur, die in Ampicillin-(25 ug/ml)-haltigem L-Medium kultiviert worden war, wurden zentrifugiert, das Zellpellet wurde in 500 ul eines 1,2-fach konzentrierten Laemmli-Probenpuffers resuspendiert. Die Zellen wurden durch Vortexen resuspendiert und für 3 Minuten bei 100ºC gekocht. Das Lysat wurde dann wiederholt durch eine 22-Gauge-Nadel gepreßt, um die Viskosität des Lysats zu erniedrigen. Ungefähr 10 ul der Proteinproben wurden elektrophoretisch aufgetrennt auf 7,5% SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid)-Gelen.
  • Der elektrophoretische Transfer der Proteine aus den SDS- PAGE-Gelen auf Nitrozellulosepapier wurde durchgeführt gemäß Towbin et. al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 1979, 4350 ff). Nach dem Transfer wurde der Filter für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert in einer Lösung aus 5% (w/v) fettfreier Milch in PBS, enthaltend 0,1% Antifoam A und 0,0001% Merthiolat, um alle verfügbaren Proteinbindungsstellen abzusättigen. Die Reaktionen mit AIDS-Antiseren wurden in dem gleichen Milchpuffer ausgeführt , enthaltend 1% AIDS-Patienten-Antiseren, die mit E. coli-Lysat präabsorbiert worden waren. Die Reaktionen wurden in einer zugeschmolzenen Plastiktüte bei 4ºC für 18 bis 24 Stunden auf einem Rotationsschüttler durchgeführt. Auf diese Inkubation folgend wurde der Filter jeweils bei Raumtemperatur dreimal für 20 Minuten in einer Lösung gewaschen, enthaltend 0,5% Deoxycholsäure, 0,1% M NaCl, 0,5% Triton X-100, 10 mM Phosphatpuffer pH 7,5 und 0,1 mM PMSF.
  • Um die Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen sichtbar zu machen, wurde die Nitrozellulose dann mit dem zweiten Ziege-Antihuman-Antikörper, der mit ¹²&sup5;J jodiert worden war, inkubiert. Die Reaktion mit dem jodierten Antikörper wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten in dem gleichen Milchpuffer, der für den ersten Antikörper verwendet worden war, durchgeführt. Die Nitrozellulose wurde dann, wie zuvor beschrieben gewaschen, und bei -70ºC unter Verwendung eines Kodak-XAR5- Films mit einer Verstärkerfolie exponiert.
    • BEISPIEL 4 Absuchen der HTLV-III-ORF-Bank mit Hilfe der Koloniehybridisierung
  • E. coli-LG90-Transformanden wurden mit HTLV-III-DNA-Sonden, die die interessierenden DNA-Bereiche enthielten (z. B. HTLV- III-gag-, -env- oder -PX-genspezifische Sequenzen), abgesucht. Die Kolonien wurden auf Nitrozellulosefilter kultiviert und gemäß dem Verfahren von Grunstein und Hogness abgesucht, indem eine nick-translatierte HTLV-III-DNA als Hybridisierungssonde eingesetzt wurde.
  • Das DNA-Fragment wurde im allgemeinen durch Restriktionsendonukleasespaltung herausgeschnitten, gelgereinigt und ³²P-markiert bis zu einer spezifischen Aktivität von 0,5·10&sup8; Cpm/ug durch Nick-Translation (Rigby, P.W.J. et. al. Journal Molecular Biology 113, 237 (1977)). Duplikate von Nitrozellulosefiltern mit daran fixierter DNA wurden prähybridisiert mit 6·SSC (0,9 M NaCl/0,09 M Natriumzitrat, pH 7,0), 5· Denhardt's-Lösung (Denhardt's-Lösung: Jeweils 0,02% von Polyvinylpyrrolidon, Ficoll und Rinderserumalbumin), 10 ug denaturierter, beschallter E. coli-DNA pro ml bei 55ºC für 3 bis 5 Stunden. Die Filter wurden dann in eine frische Probe der gleichen Lösung eingebracht, der die denaturierte Hybridisierungssonde zugesetzt worden war. Die Hybridisierung wurde bei 68ºC für 16 Stunden gestattet. Die Filter wurden wiederholt gewaschen in 0,3·SSC bei 55ºC und dann mit einem Röntgenfilm exponiert.
    • BEISPIEL 5 Mit Hilfe von rekombinanter DNA hergestelltes Peptid von HTLV-III, das mit Seren von Patienten mit AIDS immunologisch reaktionsfähig ist
  • Ein Expressionsvektor, PIN-III-ompA (ompA) wurde verwendet.
  • ompA besitzt den Lipoprotein (das in E. coli am häufigsten vorkommende Protein)-Genpromotor (1pp) und den lacUV5-Promotor-Operator (Fig. 5). ompA-Vektoren enthalten ebenfalls das DNA-Segment, das den lac-Repressor kodiert, der es erlaubt, die Expression der eingefügten DNA durch Induktoren des lac-Operons, wie IPTG, zu regulieren. Die ompA-Klonierungsvehikel enthalten drei einmal vorkommende Restriktionsenzymstellen EcoRI, HindIII, Bam HI in allen drei Leserastern und ermöglichen die Insertion der DNA in jede dieser Restriktionsstellen.
  • Verschiedene Restriktionsfragmente wurden aus dem rekombinanten Klon lambdaBH10 herausgeschnitten, der ein 9 Kb langes HTLV-III-DNA-Insert in der SstI-Stelle des Vektors lambdagtWES-lambdaB enthält. Diese Restriktionsfragmente wurden dann in die opmA-Vektoren in sämtlichen drei Leserastern eingefügt und zum Transformieren von E. coli-JA221- Zellen verwendet. Die Transformanden wurden zunächst nach HTLV-III-DNA abgesucht mit Hilfe der in situ-Koloniehybridisierung und der Verwendung von nick-translatierten HTLV- III-DNA-Sonden. Die positiven Klone wurden dann auf Expression von HTLV-III antigenen Peptiden abgesucht unter Verwendung von HTLV-III-spezifischen Antikörpern. Dafür wurden Lysate von E. coli-Zellen, die HTLV-III-DNA-rekombinante Plasmide enthielten, auf 12,5% SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und im Elektroblotverfahren auf Nitrozellulosefilter übertragen. Die Filter wurden dann zunächst mit gut charakterisierten Seren aus AIDS-Patienten inkubiert und danach mit ¹²&sup5;J-markierten Ziege-Antihuman-IgG-Antikörpern. Die gewaschenen Filter wurden autoradiographiert, um Peptide zu identifizieren, die mit Anti-HTLV-III-Antikörpern reaktionsfähig sind.
  • Es wurden mehrere Gensegmente aufgezeigt, die für Peptide kodieren, die eine Immunreaktion mit Anti-HTLV-III-Antikörpern zeigen. Unter diesen befindet sich ein 1,1 Kb EcoRI- Restriktionsfragment. Dieses Fragment wurde in opmA-Vektoren in sämtliche drei Leseraster eingefügt (Fig. 5). Die Zellen wurden bei 37ºC kultiviert in L-Medium, enthaltend 100 mg/ml Ampicillin, bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,2. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellkulturen in zwei Aliquots aufgeteilt. Einem Aliquot wurde IPTG mit einer Endkonzentration von 2 mM zugesetzt (induziert). IPTG wurde dem anderen Aliquot nicht zugesetzt (nicht induziert). Bei der IPTG-Induktion erzeugten sämtlich drei Plasmidkonstrukte (als ompA&sub1;-R-6 (O1R6), ompA&sub2;-R-7 (O2R7) und ompA&sub3;-R-3 (O3R3) bezeichnet) ein 15 Kd Peptid, das stark reagiert mit Anti-HTLV-III-Antikörpern in Seren von AIDS-Patienten (Fig. 6, Spur 1, gereinigte HTLV- III-Virionen; Spuren 2 und 3, O1R6 nicht iduziert und induziert; Spuren 4 und 5, O2R7 nicht induziert und induziert; Spuren 6 und 7, O3R3 nicht induziert und induziert). Diese Reaktivität wird nicht nachgewiesen, wenn Seren von Normalindividuen verwendet werden.
  • Die DNA-Sequenzdaten des HTLV-III-Genoms zeigen an, daß es innerhalb des pol-Gens, das sich am 5'-Ende des EcoRI-Fragments befindet, ein offenes Leseraster befindet. Die DNA-Sequenzanalysen der drei rekombinanten Konstrukte O1R6, O2R7 und P3R3 bestätigten, daß jedes dieser Rekombinanten einen verschiedenen Leseraster des HTLV-III-Plusstrangs, gekoppelt an die kodierende Sequenz eines jeden Vektors, besitzt. Nur in O3R3 ist der Leseraster der eingefügten DNA in Phase mit demjenigen, der durch das Signalpeptid in dem ompA-Vektor vorgegeben ist; in O1R6 und O2R7 ist die DNA des Pol-Gensegments außer Phase (Fig. 6a).
  • Eine 6 Bp Ribosomenbindungsstelle, AAGGAG (Shine-Dalgarno- Sequenz), ist bei Nukleotidposition 24 bis 29 lokalisiert, und ein Initiationskodon, ATG, ist 11 Bp stromabwärts lokalisiert (Position 41 bis 43). Das von sämtlichen drei Rekombinanten synthetisierte 15 Kd Peptid scheint von den Transkripten unter Verwendung von diesem internen Startkodon translatiert zu werden. Falls dies stimmt, beginnt das Peptid am ATG, das bei Position 41 bis 43 lokalisiert ist, und endet an dem Stop-Kodon bei Position 446 bis 448, wobei ein Peptid von 135 Aminosäureresten hergestellt wird, das von dem 3'-Endsegment des pol-Gens von HTLV-III kodiert wird.
  • Zusätzlich zu dem 15 Kd Peptid produziert das O3R3-Konstrukt, in dem das Leseraster des HTLV-III-DNA-pol-Gens in Phase ist mit dem von dem Vektor vorgegebenen, zwei weitere Peptide von ungefähr 19 Kd und 16,5 Kd Größe (Fig. 6). Es ist möglich, daß das 19 Kd Peptid weitere 35 Aminosäurereste enthält, von denen 21 von dem Signalpeptid stammen, das von dem ompA&sub3;-Vektor kodiert wird, und 14 werden von der eingefügten HTLV-III-DNA selbst kodiert. Das 16,5 Kd Peptid kann das prozessierte 19 Kd Peptid darstellen, bei dem das Signalpeptid abgespalten ist.
  • Die O1R6- und O2R7-Konstrukte stellen auch ein weiteres Peptid von ungefähr 17,5 Kd her (Fig. 6), das mit Seren aus AIDS-Patienten schwach reagiert. Der Ursprung dieses Peptids ist unklar. Das 1,1 Kb EcoRI-Fragment enthält eine zweite potentielle kodierende Region, die als das kurze offene Leseraster (SOR) bezeichnet wird, die sich von Nukleotidposition 360 bis 965 erstreckt (Fig. 5). Vier der fünf AUG- Methionin-Kodons in dieser Region befinden sich nahe an dem 5'-Ende dieses offenen Leserasters. Dieses DNA-Segment könnte für Peptide von 192, 185, 177 oder 164 Aminosäurereste kodieren. Jedoch gibt es am 5'-Ende dieses offenen Leserasters keine deutlich erkennbare Ribosomenbindungsstelle
  • Es gibt weitere Hinweise, die die Schlußfolgerung stützen, daß das 15 Kd Peptid tatsächlich von dem pol-Gen stammt. Erstens, die Deletion des 3'-Endes des StuI-EcoRI-Fragments aus dem 1,1 Kb EcoRI-Insert von O1R6, O2R7 und O3R8 (Fig. 5) beeinflußt nicht die Synthese des 15 Kd Peptids. Zweitens, Klone, die nur das 5'-Ende, das EcoRI-NdeI-Fragment, enthalten, produzieren dennoch das gleiche 15 Kd Peptid. Schließlich erzeugten mehrere rekombinante Klone, die verschiedene DNA-Fragmente, mit der in das offene Leseraster des Klonierungsvektors pMR100 richtig eingefügten SOR-kodierenden Sequenz enthielten, LamdaCI-HTLV-III-β-Galaktosidase-Dreifachfusionsproteine, die nur eine sehr geringe immunologische Reaktionsfähigkeit mit Anti-HTLV-III-Antikörpern in Seren aus AIDS-Patienten besitzen.
  • Signifikante immunologische Reaktivität gegen das von dem viralen pol-Gen stammende 15 Kd Peptid wurde mit Seren von AIDS-Patienten nachgewiesen. Die Identität dieses immunologisch reaktionsfähigen Peptids bezüglich des Bandenmusters von HTLV-III-Virion-Antigen in SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurde mit Hilfe eines Kompetition-Inhibition-Immunassays ermittelt. Gereinigte HTLV-III-Virionen wurden mit SDS behandelt, elektrophoretisch aufgetrennt und mit Hilfe des Elektroblotverfahrens auf Nitrozellulose übertragen. Identische Filterstreifen, enthaltend zerstörte HTLV-III-Virionen, wurden mit gut charakterisiertem Serum aus einem AIDS-Patienten in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Lysaten von O1R6, O2R7 oder Klonen von Kontrollbakterien inkubiert. Die spezifische Immunreaktion zwischen den in Seren des AIDS-Patienten vorhandenen Anti-HTLV-III-Antikörpern und den geblotteten Virion-Proteinen wurde sichtbar gemacht mit Hilfe von 125 J-markiertem Ziege-Antihuman-Antikörper Wie in Fig. 7 gezeigt, blockieren Lysate von O1R6 die immunologische Reaktivität des viralen p31-Proteins mit dem AIDS-Serum, während Lysate von Kontrollzellen dies nicht tun. Dieses Ergebnis legt nahe, daß das durch das 3'-Ende des viralen pol-Gens kodierte rekombinante 15 Kd Peptid auch einen Teil eines anderen Virion-Proteins, p31, darstellt, im Gegensatz zu der von einigen geteilten Ansicht, daß das p31 ein zelluläres Protein ist, das mit den HTLV-III-Virionen mitgereinigt wird.
  • Die weite Verbreitung von Antikörpern gegen das 15 Kd Peptid in den Seren von AIDS-Patienten wurde ebenfalls ermittelt. In Westernblot-Analysen, in denen das Lysat von O1R6 als die Antigenquelle verwendet wurde, wurde eine Reihe von Seren, die von AIDS-Patienten und normalen gesunden Individuen stammen, getestet. Alle 20 AIDS-Seren und keine der 8 normalen Kontrollen reagierte mit dem 15 Kd Peptid. Representative Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt. Diese Daten zeigen an, daß die meisten, wenn nicht alle, AIDS-Patienten Antikörper gegen das virale p31-Protein herstellen.

Claims (20)

1. HTLV-III-Polypeptid, exprimiert von Zellen, die mit einem rekombinanten Vektor transformiert wurden, der HTLV-III DNA enthält, wobei das Polypeptid in bezug auf Seren von Personen mit erworbenem Immundefektsyndrom oder Seren mit Antikörpern gegen HTLV-III immunologisch reaktiv ist; wobei die HTLV-III DNA (a) ein EcoRI Restriktionsfragment von ungefähr 1,1 Kb darstellt und eine Nukleotidsequenz aufweist, die sich ungefähr vom Nukleotid 4228 aus bis ungefähr zum Nukleotid 5327 der HTLV-III DNA gemäß Fig. 3 erstreckt; oder (b) ein Äquivalent der genannten DNA darstellt, das für ein immunologisch funktionelles Äquivalent des Polypeptids kodiert.
2. Isolierte DNA gemäß Anspruch 1 (a) oder (b), die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
3. Rekombinationsvektor, der HTLV-III DNA gemäß Anspruch 1 (a) oder (b) enthält und nach Insertion in eine Wirtszelle zur Expression eines Polypeptids nach Anspruch 1 in der Lage ist.
4. pMR 100 Vektor, der HTLV-III DNA gemäß Anspruch 1 (a) oder (b) enthält und nach Insertion in eine Wirtszelle zur Expression eines Polypeptids nach Anspruch 1 in der Lage ist.
5. Hybridprotein, das ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 enthält, welches mit einem Indikatorpolypeptid wie z. B. Beta-Galactosidase verbunden ist.
6. DNA-Sonde, die eine DNA-Sequenz enthält, welche im wesentlichen homolog zu der für ein Polypeptid nach Anspruch 1 kodierenden DNA gemäß Anspruch 1 (a) oder (b) ist.
7. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1, das folgende Schritte aufweist:
(a) Schneiden der HTLV-III DNA zur Herstellung von DNA-Fragmenten;
(b) Einfügen der DNA-Fragmente in einen Expressionsvektor zur Herstellung eines Rekombinationsvektors;
(c) Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit dem Rekombinationsvektor; und
(d) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, geeignet zur Expression des Polypeptids, für das die inserierte HTLV-III DNA kodiert.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Schneide-Schritt beinhaltet:
(a) Schneiden der HTLV-III DNA mittels Restriktionsendonukleasen zur Herstellung von Restriktionsfragmenten der DNA oder
(b) Scheren der HTLV-III DNA zur Herstellung von DNA- Fragmenten.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei der Expressionsvektor pMR 100 ist.
10. Monoklonaler Antikörper, der gegenüber einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 spezifisch ist.
11. Immuntest zum Nachweis von HTLV-III, bei dem Antikörper gemäß Anspruch 10 eingesetzt werden.
12. Sandwichartiger immunradiometrischer Test zum Nachweis von HTLV-III, bei dem ein immobilisierter Antikörper gemäß Anspruch 10, der mit HTLV-III-Polypeptid reagiert, und ein löslicher Antikörper gemäß Anspruch 10, der mit HTLV-III-Polypeptid reagiert, eingesetzt werden.
13. Testsystem, enthaltend einen Antikörper gemäß Anspruch 10, der spezifisch mit HTLV-III-Polypeptid reagiert, das an eine feste Phase gebunden ist, sowie einen markierten löslichen Antikörper gemäß Anspruch 10, der spezifisch mit HTLV-III-Polypeptid reagiert.
14. In-vitro-Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HTLV-III in Körperflüssigkeit, das folgende Schritte aufweist:
(a) Kontaktieren eines Immunadsorbens, das Polypeptid gemäß Anspruch 1 aufweist und an eine feste Phase gebunden ist, mit einer Körperflüssigkeit bis Antikörper gegen HTLV-III- Polypeptid in der Körperflüssigkeit an das Polypeptid der festen Phase binden;
(b) Trennen des Immunadsorbens von der Körperflüssigkeit;
(c) Kontaktieren des Immunadsorbens mit markiertem Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder markiertem Antikörper gegen menschliches Immunglobulin; und
(d) Bestimmen der Menge des markierten Polypeptids, das an das Immunadsorbens gebunden ist, als Nachweis von Antikörpern gegen HTLV-III.
15. System zum Nachweis des Vorhandenseins von Antikörpern gegen HTLV-III in Körperflüssigkeit enthaltend:
(a) ein Immunadsorbens, das HTLV-III-Polypeptid gemäß Anspruch 1 enthält, welches an eine feste Phase gebunden ist; und
(b) markiertes HTLV-III-Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder einen markierten Antikörper gegen menschliches Immunglobulin.
16. Verfahren zum Nachweis von HTLV-III-Nukleinsäure in Körperflüssigkeit (z. B. einem Zellysat), das folgende Schritte aufweist:
(a) Adsorbieren der in Körperflüssigkeit enthaltenen Nukleinsäure auf einem Adsorbens;
(b) Denaturieren der adsorbierten Nukleinsäure;
(c) Kontaktieren der adsorbierten Nukleinsäure mit einer HTLV-III DNA-Sonde gemäß Anspruch 6; und
(d) Nachweisen, ob die Sonde mit der adsorbierten Nukleinsäure hybridisiert.
17. Hybridoma-Zellinie, die Antikörper produziert, welche gegenüber einem HTLV-III-Polypeptid gemäß Anspruch 1 spezifisch sind.
18. Polypeptid gemäß Anspruch 1 zur therapeutischen Verwendung, z. B. zur Impfung.
19. Verwendung monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 10 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Immuntherapie von erworbenem Immundefektsyndrom
20. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Impfung gegen erworbenes Immundefektsyndrom.
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