DE69233080T2

DE69233080T2 - Rekombinanter hiv-spezifischer impfstoff aus poxviru

Info

Publication number: DE69233080T2
Application number: DE69233080T
Authority: DE
Inventors: Enzo Paoletti; James Tartaglia; I. William COX; Robert Gallo; Genoveffa Franchini
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Connaught Technology Corp
Current assignee: Connaught Technology Corp; US Government
Priority date: 1991-06-14
Filing date: 1992-06-12
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2012-06-13
Also published as: EP1156102A1; ATE241696T1; JPH06508037A; AU716480B2; CA2110489A1; AU6564596A; AU712431B2; DK0592546T3; EP0592546B1; EP0592546A1; AU6564696A; DE69233080D1; AU672581B2; AU2259792A; EP0592546A4; WO1992022641A1; JP3504659B2

Description

Diese Anmeldung ist eine Teilforführungsanmeldung einer gemeinsamen schwebenden Anmeldung mit der Serien-Nr. 07/715.921, die am 14. Juni 1991 eingereicht wurde und die hierin durch Bezugnahme enthalten ist. Bezug wird auch genommen auf die gemeinsame schwebende Anmeldung mit der Serien-Nr. 07/847.951, die am 6. März 1992 eingereicht wurde und die ebenfalls hierin durch Bezugnahme enthalten ist.
BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Pockenvirus und Verfahren für dessen Herstellung und Verwendung. Im Besonderen betrifft die Erfindung ein rekombinantes Pockenvirus, wobei das Virus Genprodukte eines Immunschwächevirus-Gens exprimiert, und immunogene Mittel, die eine Immunantwort gegen Immunschwächevirus-Infektionen hervorrufen, wenn sie einem Wirt verabreicht werden.
Einige Veröffentlichungen werden in dieser Anmeldung durch Bezugnahme erwähnt. Die vollständige Zitierung dieser Bezugnahmen ist am Ende der Beschreibung zu finden, die den Ansprüchen voransteht. Diese Bezugnahmen beschreiben den Stand der Technik, zu dem diese Erfindung gehört.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Vaccinia-Virus und in jüngster Zeit andere Pockenviren wurden für das Einfügen und die Expression von fremden Genen verwendet. Das grundlegende Verfahren des Einfügens fremder Gene in ein lebendes infektiöses Pockenvirus beinhaltet die Rekombination zwischen Pockenvirus-DNA-Sequenzen, die ein fremdes genetisches Element in einem Spenderplasmid flankieren, und homologen Sequenzen, die in einem Helfer-Pockenvirus vorliegen (Piccini et al., 1987).
Insbesondere werden die rekombinanten Pockenviren in zwei Schritten konstruiert, die im Stand der Technik bekannt sind und zu den Verfahren zur Herstellung synthetischer Rekombinanten des Vaccinia-Virus analog sind, die in den U.S.-Patenten mit den Nrn. 5.110.587, 4.769.330, 4.772.848 und 4.603.112 beschrieben sind, deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme enthalten sind. In dieser Hinsicht wird auch Bezug genommen auf die gemeinsamen schwebenden U.S.-Anmeldungen mit den Serien-Nrn._, eingereicht am 4. Mai 1992, und 537.890, die am 14. Juni 1990 eingereicht wurde, die ebenfalls hierin durch Bezugnahme enthalten sind.
Als erstes wird die DNA-Gensequenz, die in das Virus eingefügt werden soll, insbesondere ein offener Leserahmen einer Quelle, die kein Pockenvirus ist, in ein E. coli-Plasmid-Konstrukt inseriert, in das DNA eingefügt wurde, die zu einem Bereich der DNA des Pockenvirus homolog ist. Davon getrennt wird die DNA-Gensequenz, die eingefügt werden soll, an einen Promotor ligiert. Die Promotor-Gen-Verknüpfung wird derart in dem Plasmid-Konstrukt positioniert, dass die Promotor-Gen-Verknüpfung an beiden Enden durch DNA flankiert ist, die zu einer DNA-Sequenz homolog ist, die eine Region der Pockenvirus-DNA flankiert, die einen nicht-essentiellen Locus enthält. Das resultierende Plasmid-Konstrukt wird dann durch Wachstum in E. coli-Bakterien amplifiziert (Clewell, 1972) und isoliert (Clewell et al., 1969; Maniatis et al., 1986).
Als zweites wird das isolierte Plasmid, das die DNA-Gensequenz enthält, die eingefügt werden soll, gemeinsam mit dem Pockenvirus in eine Zellkultur transfiziert, z. B. Hühnerembryo-Fibroblasten. Die Rekombination zwischen der homologen Pockenvirus-DNA in dem Plasmid bzw. dem viralen Genom stellt ein Pockenvirus bereit, das durch die Anwesenheit von fremden DNA-Sequenzen in einer nicht-essentiellen Region seines Genoms modifiziert ist. Der Begriff "fremde" DNA bezeichnet exogene DNA, insbesondere DNA aus einer Quelle, die kein Pockenvirus ist und die Genprodukte codiert, die gewöhnlich von dem Genom nicht hergestellt werden, in das die exogene DNA eingebracht wird.
Genetische Rekombination ist im Allgemeinen der Austausch homologer Bereiche von DNA zwischen zwei DNA-Strängen. In bestimmten Viren kann RNA DNA ersetzen. Homologe Bereiche von Nucleinsäuren sind Bereiche von Nucleinsäuren (DNA oder RNA), die die gleiche Sequenz von Nucleotidbasen besitzen.
Genetische Rekombination kann naturgemäß während der Replikation oder der Herstellung neuer viraler Genome innerhalb der infizierten Wirtszelle stattfinden. Somit kann eine genetische Rekombination zwischen viralen Genen während des viralen Replikationszyklus auftreten, der in einer Wirtszelle stattfindet, die mit zwei oder mehr verschiedenen Viren oder anderen genetischen Konstrukten co-infiziert wurde. Ein Abschnitt einer DNA eines ersten Genoms wird bei der Herstellung des Abschnitts des Genoms eines zweiten co-infizierten Virus, bei dem die DNA homolog zu der des ersten viralen Genoms ist, austauschbar verwendet.
Es kann jedoch auch eine Rekombination zwischen Abschnitten der DNA in unterschiedlichen Genomen stattfinden, die nicht vollständig homolog sind. Wenn ein solcher Abschnitt von einem ersten Genom homolog ist zu einem Abschnitt eines anderen Genoms, bis auf die Anwesenheit von zum Beispiel einem genetischen Marker oder einem eine antigene Determinante codierenden Gen, der oder das in einen Bereich der homologen DNA eingefügt ist, kann eine Rekombination noch immer stattfinden, und die Produkte dieser Rekombination sind dann durch die Anwesenheit dieses genetischen Markers oder Gens in dem rekombinanten viralen Genom nachweisbar.
Die erfolgreiche Expression der eingefügten genetischen DNA-Sequenz durch das modifizierte infektiöse Virus erfordert zwei Bedingungen. Erstens, die Inserierung muss in eine nicht-essentielle Region des Virus erfolgen, damit das modifizierte Virus lebensfähig bleibt. Die zweite Bedingung für die Expression der eingefügten DNA ist die Anwesenheit eines Promotors in angemessener Beziehung mit der eingefügten DNA. Der Promotor muss derart platziert werden, dass er stromaufwärts der DNA-Sequenz lokalisiert ist, die exprimiert werden soll.
In den vergangenen Jahren wurde in dem Bereich der medizinischen Virologie viel Aufmerksamkeit auf die eskalierende Inzidenz des erworbenen Immunschwäche-Syndroms (AIDS) gerichtet, das durch das menschliche Immunschwächevirus (HIV) verursacht wird. HIV-1 ist ein Mitglied der Virusfamilie Retroviridae und spezifischer der Lentivirus-Unterfamilie. Dieses virale System wurde zusammen mit anderen verwandten Viren wie HIV-2 und Affen-Immunschwächevirus (SIV) hinsichtlich deren Molekularbiologie, Immunologie und Pathogenese eingehend untersucht, mit der Bemühung, sichere und wirkungsvolle Impfstoffe und antivirale Therapien zu entwickeln. Zwei hauptsächliche Hindernisse haben die Entwicklung von HIV-Impfstoff-Kandidaten jedoch begleitet. Als erstes existiert zum Beispiel eine beträchtliche Sequenz-Heterogenität zwischen HIV-Isolaten, und zweitens liegt ein Mangel an Information betreffend schützende Immunität vor. Infizierte Individuen entwickeln einen Antikörper (Starcich et al., 1986; Weiss et al., 1985) und CD8⁺-T-Zell-Antworten gegen HIV (Walker et al., 1987; Plata et al., 1987); sie werden jedoch nicht geschützt, da sie anschließend AIDS entwickeln.
Das Vaccinia-Virus wurde weitreichend eingesetzt, um einige HIV-Genprodukte zu exprimieren, um deren biochemische, funktionelle und immunologische Eigenschaften, insbesondere zellvermittelte Antworten, zu untersuchen. Unter Verwendung dieser spezifischen Reagenzien wurden in seropositiven Individuen zellvermittelte cytotoxische Aktivitäten gegen die Hülle (Riviere et al., 1989; Walker et al., 1987; Koup et al., 1989), die Kernproteine (gag) (Riviere et al., 1989; Koup et al., 1989, Nixon et al., 1988), pol (Walker et al., 1989; Walker et al., 1988) und die nef-Genprodukte (Riviere et al., 1989) nachgewiesen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die HIV-Gene enthalten, sowohl zellvermittelte als auch humorale Immunantworten in kleinen Labortieren (Chakrabarti et al., 1986; Hu et al., 1986; Rautman et al., 1989; Michel et al., 1988), Makakken (Zarling et al., 1986), Schimpansen (Hu et al., 1987) und besonders in Menschen (Zagury et al., 1988; Koff et al., 1989) auslösen. Bis jetzt wurden nur begrenzte Impfungs/Schutzstudien in Primaten beschrieben, bei denen Vaccinia-Virus-Rekombinanten verwendet wurden, die Genprodukte von HIV und verwandten Viren exprimieren.
Die Impfung von Primaten mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, das das Hüll-Glycoprotein von AIDS-verursachenden Retroviren exprimiert, hat humorale und zellvermittelte Immunantworten ausgelöst und mehr bedeutsam, hat einen Schutz gegen HIV-Infektion gewährleistet (Zagury et al., 1988; Hu et al., 1989). In den Ergebnissen, die von Hu et al. beschrieben wurden, wurde eine Vaccinia-Virus-Rekombinante verwendet, die das Hüll-Glycoprotein des Affen-AIDS-Retrovirus (SRV-2) exprimiert, um Fettschwanz-Makakken (Macaca nemestrina) zu impfen. Alle immunisierten Tiere entwickelten sowohl SRV-spezifische zellvermittelte als auch humorale Immunantworten, einschließlich neutralisierender Antikörper und Antikörper, die ADCC gegen SRV-2-infizierte Zellen vermitteln. Die Tiere wurden intravenös mit 5 × 10³ TCID₅₀ des SRV-2/W einer Challenge unterworfen. Die einer Challenge unterworfenen Kontrolltiere (nicht geimpft) wurden zwei Wochen nach Challenge virämisch, und diejenigen, die nicht serokonvertierten, starben sieben Wochen nach der Behandlung. Sehr bedeutsam ist, dass alle einer Challenge unterworfenen Tiere, denen zuvor die Vaccinia-Virus-env-Rekombinante inokuliert worden war, gesund und virusfrei blieben und ausschließlich gegen das Hüll-Antigen seropositiv waren.
In einem Pilot-Experiment im Menschen wurden HIV-seronegative Individuen mit einer Vaccinia-Virus/HIV-1-Hüll-Rekombinante geimpft. Diese primäre Inokulierung resultierte in einer schwachen immunologischen Antwort (Zagury et al., 1988). Diese primären Antworten wurden nachfolgend mit verschiedenen Protokollen verstärkt. Die Verwendung einer intravenösen Injektion von Paraformaldehyd-fixierten autologen Zellen, die in vitro mit der Vaccinia-Virus-HIV-Rekombinante infiziert worden waren, stellte jedoch den bedeutsamsten Verstärkungseffekt bereit. Mit diesem Immunisierungsprotokoll wurden anamnestische Immunantworten gegen das Hüll-Antigen erreicht, die aus gruppenspezifischen neutralisierenden Antikörpern, cytotoxischen T-Lymphocyten und einer verzögerten Hypersensitivität bestanden (Zagury et al., 1988). In klinischen Tests, die in den Vereinigten Staaten durchgeführt wurden und in denen ein rekombinantes Vaccinia-Virus verwendet wurde, das das HIV-env-Gen exprimiert (HIVAV-le; Bristol-Meyers), entwickelten Individuen, die die Rekombinante erhielten, T-Zell-proliferative Antworten gegen HIV (Koff et al., 1989). Die Intensität dieser Antworten wurde jedoch durch vorherige Exposition gegen Vaccinia-Virus beeinflusst. Als Folge davon entwickelten Individuen, die gegen Vaccinia-Virus immun waren, eine schwache und transiente T-Zell-Antwort, wohingegen in Individuen, die nicht immun gegen Vaccinia-Virus waren, eine starke Antwort gegen das HIV-Hüll-Antigen beobachtet wurde (zusammengefasst in einer Übersicht von Koff et al., 1989). Diese Ergebnisse sind ermutigend und haben den Beweis bereitgestellt, dass vor der Exposition gegen HIV in Menschen ein Immunstatus erhalten werden kann, wobei ein Pockenvirus-basiertes Immunisierungsvehikel verwendet wurde.
Ein faszinierendes Potential hinsichtlich der HIV-1-Impfung wird durch die Expression des HIV-1-gag-Produktes durch das Vaccinia-Virus, entweder alleine oder in Kombination mit dem Hüll-Glycoprotein, bereitgestellt. Einige Laboratorien haben gezeigt, dass die Expression von gag- oder gag/pol-Sequenzen durch das Vaccinia-Virus in der Produktion nicht-infektiöser Partikel resultiert (Hu et al., 1990; Shioda et al., 1990; Karacostas et al., 1989). Die Analyse der mit der Vaccinia-Virus-Rekombinanten infizierten Zellen durch Elektronenmikroskopie offenbarte Retrovirus-ähnliche Partikel, die in Form von Knospen aus der Plasmamembran austraten, und extrazelluläre Formen, die von Partikeln, die in HIV-1-infizierten Zellen beobachtet werden, nicht unterscheidbar waren. Biochemisch sind diese Partikel ebenfalls ähnlich zu nativen HIV-1-Partikeln. Darüber hinaus erzeugten Nager und Schimpansen, die mit einer Vaccinia-Virus-HIV-gag-Rekombinante inokuliert wurden, sowohl humorale als auch zellvermittelte Immunantworten gegen die HIV-1-Kern-Antigene (Hu et al., 1990).
Die Co-Expression des HIV-1-Hüll-Glycoproteins mit den Kernproteinen durch Vaccinia-Virus in Säugerzellen resultierte auch in der Zusammensetzung und Freisetzung von HIV-1-Partikeln (Haffar et al., 1990). Diese typischen Typ C-Retrovirus-Partikel enthielten sowohl die Hüll-Glycoproteine (gp120 und gp41) als auch die gag-Proteine (p24, p17, p55 und p39). Von diesen Proteinen wurde auch beschrieben, dass sie in diesen rekombinant hergestellten Partikeln im gleichen Verhältnis, wie in HIV-1-Virionen beobachtet, vorliegen. Die Herstellung dieser nicht-infektiösen HIV-Partikel, entweder in gereinigter Form oder synthetisiert in einem Geimpften, der mit einer multivalenten Vaccinia-Virus-Rekombinante inokuliert wurde, kann wertvolle "Komplettvirus"-Impfstoffe gegen HIV bereitstellen. Dies ist besonders attraktiv, da der Schutz gegen das Lentivirus SIV gezeigt wurde, indem komplette inaktivierte Viruspräparationen verwendet wurden (Murphy-Corb et al., 1989; Derosiers et al., 1989).
Die vorstehend besprochenen Beispiele zeigen die potentielle Verwendung von Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die HIV-Antigene exprimieren, um angemessene immunologische Antworten zu induzieren, die zum Schutz notwendig sind. Eine hauptsächliche Sorge bei der Verwendung von lebenden viralen Impfstoffen ist jedoch die Frage der Sicherheit. Komplikationen aus der Immunisierung mit Vaccinia-Virus sind manchmal dokumentiert worden, besonders in abwehrgeschwächten Individuen und haben einige Einwände gegen deren Akzeptanz als Impfstoff-Kandidaten aufkommen lassen (Behbehani et al., 1983; Lane et al., 1969). Kürzlich sind jedoch wesentliche Schritte gemacht worden, die viralen Virulenzfaktoren zu verstehen, mit der Hoffnung, Stämme zur Verwendung als Immunisierungsvehikel modifizieren zu können (Tartaglia et al., 1990). Mit mehr Relevanz für die Entwicklung von Vaccinia-Virus-basierten HIV-Impfstoff-Kandidaten für die Immunprophylaxe und Immuntherapie von AIDS sind die Gene identifiziert worden, die für die produktive Replikation von Vaccinia-Virus in menschlichen Zellsystemen verantwortlich sind (Gillard et al., 1986; Perkus et al., 1990). Die potentielle Verwendung von Vaccinia-Virus-Vektoren ohne diese Gene stellt einen nicht replizierenden Vektor-Impfstoff-Kandidaten bereit, der angemessene HIV- Antigene auf eine Art und Weise bereitstellen kann, dass sie eine schützende Immunantwort auslösen.
Ein anderer Ansatz zur Erzeugung sicherer und wirkungsvoller Pockenvirus-basierter HIV-Impfstoff-Kandidaten verwendet Vogelpockenvirus-Vektoren (d. h. Kanarienvogel-Pockenvirus und Hühner-Pockenvirus), um angemessene HIV-Antigene zu exprimieren. Diese Viren sind natürlicherweise wirtspezifisch und replizieren ausschließlich in Vogelarten produktiv. Aus diesem Grund existiert ein eingebauter Sicherheitsfaktor für deren Verwendung in Menschen, besonders in abwehrgeschwächten Individuen. In dieser Hinsicht sind diese Viren gentechnisch verändert worden, um das Tollwut-G-Glycoprotein zu exprimieren, und es konnte gezeigt werden, dass verschiedene Nicht-Vogelarten vor lebendem Tollwut-Befall geschützt werden konnten (Taylor et al., 188a; 1991).
Man ist sich bewusst, dass die Bereitstellung eines Immunschwächevirus-rekombinanten Pockenvirus und einer immunogenen Zusammensetzung, die eine immunologische Antwort gegen Immunschwächevirus-Infektionen induziert, wenn sie einem Wirt verabreicht wird, insbesondere eine Zusammensetzung, die eine verstärkte Sicherheit hat, einen hochgradig wünschenswerten Fortschritt gegenüber dem gegenwärtigen Stand der Technik darstellen würde.
GEGENSTÄNDE DER ERFINDUNG
Es ist deshalb ein Gegenstand dieser Erfindung, rekombinante Pockenviren, wobei diese Viren Genprodukte eines Immunschwächevirus exprimieren, und ein Verfahren zur Herstellung solcher rekombinanten Pockenviren bereitzustellen.
Es ist ein zusätzlicher Gegenstand dieser Erfindung, die Clonierung und Expression von Immunschwächevirus-codierenden Sequenzen, insbesondere menschliche Immunschwächevirus (HIV)- und Affen- Immunschwächevirus (SIV)-codierende Sequenzen, in einem Pockenvirus-Vektor bereitzustellen.
Es ist ein anderer Gegenstand dieser Erfindung, eine immunologische Zusammensetzung bereitzustellen, die verstärkte Sicherheit hat und die in der Lage ist, eine immunologische Antwort gegen Immunschwächevirus-Infektionen zu induzieren, wenn sie einem Wirt verabreicht wird.
Diese und andere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Erwägung des Nachfolgenden leichter ersichtlich sein.
AUSSAGE DER ERFINDUNG
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Pockenvirus, das eine DNA-Sequenz eines Immunschwächevirus integriert enthält, insbesondere von HIV oder SIV, wobei diese in einer nicht essentiellen Region des Pockenvirus-Genoms vorliegt. Das Pockenvirus ist vorteilhafterweise ein Vaccinia-Virus oder ein Vogelpocken-Virus wie ein Hühner-Pockenvirus oder Kanarienvogel-Pockenvirus.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung exprimiert das rekombinante Pockenvirus Genprodukte des fremden Immunschwächevirus-Gens, insbesondere eines HIV- oder SIV-Gens.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Impfstoff zur Auslösung einer immunologischen Antwort in einem Wirtstier, das mit dem Impfstoff inokuliert wurde, wobei dieser Impfstoff einen Träger und ein rekombinantes Pockenvirus beinhaltet, das in einer nicht essentiellen Region DNA eines Immunschwächevirus, insbesondere HIV oder SIV, enthält. Das in dem erfindungsgemäßen Impfstoff verwendete Pockenvirus ist vorteilhafterweise ein Vaccinia-Virus oder ein Vogel- Pockenvirus wie ein Hühner-Pockenvirus oder Kanarienvogel-Pockenvirus.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Es wird ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung vorhanden sein, indem man auf die begleitenden Zeichnungen verweist:
1 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pSD460 zur Deletion des Thymidinkinase-Gens und zur Erzeugung des rekombinanten Vaccinia-Virus vP410;
2 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pSD486 zur Deletion der hämorrhagischen Region und zur Erzeugung des rekombinanten Vaccinia-Virus vP553;
3 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pMP494Δ zur Deletion der ATI-Region und zur Erzeugung des rekombinanten Vaccinia-Virus vP618;
4 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pSD467 zur Deletion des Hämagglutinin-Gens und zur Erzeugung des rekombinanten Vaccinia-Virus vP723;
5 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pMPCSKIΔ zur Deletion des Gen-Clusters [C7L-K1L] und zur Erzeugung des rekombinanten Vaccinia-Virus vP804;
6 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pSD548 zur Deletion der großen Untereinheit, Ribonucleotid-Reduktase und zur Erzeugung von rekombinantem Vaccinia-Virus vP866 (NYVAC);
7 zeigt die cytotoxische Antwort von Milzzellen von Mäusen, immunisiert mit Vaccinia-Virus- oder Kanarienvogel-Pockenvirus-Vektoren (NYVAC, ALVAC) oder mit Vaccinia-Virus- oder Kanarienvogel-Pockenvirus-Rekombinanten, die HIV IIIB-env (vP911, vCP112) exprimieren;
8 zeigt die Spezifität des cytotoxischen T-Lymphocyten-Antigen-Rezeptors für die hypervariable V3-Schleife von gp120 des HIV II B, jedoch nicht für die V3-Schleife von HIV MN oder SF2;
9 zeigt die Antikörper-Antworten auf HIV III B-gp120 von Mäusen, die mit den Vektoren (NYVAC, ALVAC) oder mit der Vaccinia-Virus-Rekombinante vP911 oder der Kanarienvogel-Pockenvirus-Rekombinante vCP112 immunisiert wurden, die HIV-1-env exprimieren (ein umgekehrtes Dreieck gibt den Zeitpunkt der Verabreichung einer zweiten Inokulierung an);
10 zeigt die Sensitivität der cytotoxischen Effektor-Zellen aus den Milzen von Mäusen, die mit vCP112 immunisiert wurden, für Antikörper gegen cytotoxische T-Lymphocytenzell-Oberflächen-Antigene Thy1.2 und Lyt 2.2; und
11 zeigt die Cytotoxizität in Prozent gegenüber einer in vitro-Stimulation von PBMC.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer zahlreichen Vorteile wird anhand der nachfolgenden Beispiele erhalten werden, die zur Veranschaulichung bereitgestellt werden.
In den Beispielen werden die nachfolgenden Verfahren und Materialien eingesetzt.
DNA-CLONIERUNG UND -SYNTHESE
Plasmide werden nach Standardverfahren konstruiert, durchmustert und gezüchtet (Maniatis et al., 1982; Perkus et al., 1985; Piccini et al., 1987). Restriktionsendonucleasen wurden von GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD; New England Biolabs, Beverly, MA; und Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, erhalten. Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase wurde von Boehringer Mannheim Biochemicals erhalten. BAL-31-Exonuclease und Phage T4-DNA-Ligase wurden von New England Biolabs erhalten. Die Reagenzien wurden verwendet, wie von den verschiedenen Anbietern angegeben.
Synthetische Oligo desoxyribonucleotide wurden mit einem Biosearch 8750- oder einem Applied Biosystems 380B-DNA-Synthese-Automaten, wie früher beschrieben, hergestellt (Perkus et al., 1989). DNA-Sequenzierung wurde nach dem Didesoxy-Ketten-Terminierungsverfahren durchgeführt (Sanger et al., 1977), wobei Sequenase (Tabor et al., 1987), wie früher beschrieben (Guo et al., 1989), verwendet wurde. DNA-Amplifizierung mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Sequenz-Verifizierung (Engelke et al., 1988) wurde unter Verwendung von handelsüblich synthetisierten Oligonucleotid-Primern und dem GeneAmp DNA-Amplifikationsreagenz-Kit (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) mit einem automatischen Perkin Elmer Cetus-DNA-Thermo-Cycler durchgeführt. Überschüssige DNA-Sequenzen wurden mit Hilfe von Restriktionsendonuclease-Spaltung, gefolgt von einer unvollständigen Spaltung mit BAL-31-Exonuclease und Mutagenese aus den Plasmiden deletiert (Mandecki, 1986), wobei synthetische Oligonucleotide verwendet wurden.
ZELLEN, VIRUS UND TRANSFEKTION
Die Abstammung und die Bedingungen der Züchtung des Kopenhagen-Stammes von Vaccinia-Virus ist bereits zuvor beschrieben worden (Guo et al., 1989). Die Erzeugung rekombinanter Viren durch Rekombination, in situ-Hybridisierung auf Nitrocellulose-Filter und Durchmusterung nach B-Galactosidase-Aktivität erfolgen, wie früher beschrieben (Panicali et al., 1982; Perkus et al., 1989).
Das parentale Kanarienvogel-Pockenvirus (Rentschler-Stamm) ist ein Impfstamm für Kanarienvögel. Der Impfstamm wurde aus einem Wildtyp-Isolat erhalten und über mehr als 200 serielle Passagen in Hühnerembryo-Fibroblasten abgeschwächt. Eine Haupt-Virusaussaat wurde vier aufeinander folgenden Plaque-Aufreinigungen auf Agar unterzogen, und ein Plaque-Clon wurde anhand von fünf zusätzlichen Passagen amplifiziert, wonach das Stammvirus als das parentale Virus bei den in vitro-Rekombinationstests verwendet wurde. Das Plaque-aufgereinigte Kanarienvogel-Pockenvirus-Isolat wird als ALVAC bezeichnet.
Der Stamm des Hühner-Pockenvirus (FPV), der mit FP-1 bezeichnet wird, ist zuvor beschrieben worden (Taylor et al., 1988a). Es handelt sich um einen abgeschwächten Impfstamm, der für die Impfung von Tage-alten Hühnern zweckmäßig ist. Der parentale Virusstamm Duvette wurde in Frankreich als ein Geflügel-Pockenvirus-Maßstab aus einem Huhn erhalten. Das Virus wurde durch ungefähr 50 aufeinanderfolgende Passagen in embryoenthaltenden Hühnereiern, gefolgt von 25 Passagen in Hühnerembryo-Fibroblastenzellen abgeschwächt. Das Virus wurde vier aufeinanderfolgenden Plaque-Aufreinigungen unterzogen. Ein Plaque-Isolat wurde in primären CEF-Zellen weiter amplifiziert und ein Stamm-Virus etabliert, das als TROVAC bezeichnet wurde.
NYVAC-, ALVAC- und TROVRC-virale Vektoren und ihre Derivate wurden vermehrt, wie früher beschrieben (Piccini et al., 1987; Taylor et al., 1988a, b). Vero-Zellen und Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) wurden vermehrt, wie früher beschrieben (Taylor et al., 1988a, b). P815 Maus-Mastocytom-Zellen (H-2^d) wurden von ATCC (#TIB64) erhalten und in Eagle-MEM gehalten, das mit 10% fötalem Kälberserum CFBS und 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin angereichert worden war.
Mäuse
Weibliche BALB/cJ (H-2^d)-Mäuse wurden von The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) gekauft und wurden mit Maus-Futter und Wasser ad libitum gehalten. Alle Mäuse wurden im Alter von 6–15 Wochen verwendet.
Medien
Testmedium für immunologische Tests wurde aus RPMI 1640-Medium, das mit 10% FBS, 4 mM L-Glutamin, 20 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonat), 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol, 100 IU Penicillin pro ml und 100 μg/ml Streptomycin angereichert worden war, zusammengesetzt. Stim-Medium war aus minimalem essentiellem Eagle-Medium zusammengesetzt, das mit 10% FBS, 4 mM L-Glutamin, 10^–4 M 2-Mercaptoethanol, 100 IU Penicillin pro ml und 100 μg Streptomycin pro ml ergänzt worden war.
Radioimmun-Präzipitationsanalyse
Zelleinzelschichten wurden in Methionin-freiem, modifiziertem Eagle-Medium (MEM met-) mit 10 PFU pro Zelle infiziert. Zwei Stunden nach Infektion wurden 20 μCi/ml [³⁵S]-Methionin in MEM (-met) zugegeben, das 2% dialysiertes fötales Kälberserum (Flow) enthielt. Die Zellen wurden 15 Stunden nach Infektion geerntet, indem sie in Lysepuffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,2 mg/ml PMSF, 1% NP40, 0,01 Natriumazid) und 50 μl Aprotinin resuspendiert und in Eppendorf-Reaktionsgefäße hineingeschabt wurden, und das Lysat wurde durch 20 Minuten Zentrifugation bei 4°C geklärt. Ein Drittel des Überstandes einer Petrischale mit 60 mm Durchmesser wurde mit 1 μl normalem menschlichem Serum und 100 μl Protein A-Sepharose CL-4B (SPA) (Pharmacia) 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 1 Minute Zentrifugation wurde der Überstand 90 Minuten bei 4°C mit Immunseren, die spezifisch HIV-1, HIV-2 oder SIV-Proteine erkennen, und 100 μl SPA inkubiert.
Das Pellet wurde viermal mit Lysepuffer und zweimal mit Lithiumchlorid/Harnstoff-Puffer (0,2 M LiCl₂, 2 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, pH 8) gewaschen, und die ausgefällten Proteine wurden in 60 μl Laemmli-Puffer gelöst (Laemmli, 1970). Nach 5 Minuten Erhitzen bei 100°C und 1 Minute Zentrifugation wurden die Proteine in einem SDS-10% Polyacrylamidgel aufgetrennt und einer Fluorographie unterzogen.
Inokulierungen
Mäuse wurden intravenös mit 5 × 10⁷ Plaquebildenden Einheiten (PFU) in 0,1 ml Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung über die laterale Schwanzvene beimpft.
Milzzell-Präparationen
Nach Euthanasie durch zervikale Dislokation wurden die Milzen der Mäuse aseptisch in ein steriles Plastikgefäß übertragen, das balancierte Hanksalzlösung enthielt. Vereinzelte Milzen oder vereinte Milzen, die von einer einzigen experimentellen Gruppe abstammten, wurden zu Einzelzell-Suspensionen verarbeitet, indem ein Zyklus von 1 Minute in einem Stomacher-Mixer durchgeführt wurde. Die Milzzell-Suspensionen wurden je nach Erfordernis mehrere Male entweder in Assay-Medium oder Stim-Medium gewaschen. Mit Hilfe eines Coulter-Zählgeräts oder durch Trypanblau-Farbstoffausschluss, wobei ein Hämacytometer und ein Mikroskop verwendet wurden, wurden die Milzzellen gezählt.
Seren
Die Mäuse wurden mit Äther leicht anästhesiert, und aus dem retro-orbitalen Plexus wurde Blut gesammelt. Das Blut von Mäusen, die eine experimentelle Gruppe umfassten, wurde vereinigt, und man ließ es gerinnen. Das Serum wurde gesammelt und bei –70°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
In vitro-Stimulation zur Erzeugung von sekundären cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL)
Die vereinigten Milzzellen syngener, unbehandelter experimentellen Gruppen (Responder) wurden auf 5 × 10⁶ pro ml in Stim-Medium verdünnt. Die Milzzellen genidentischer, naiver Mäuse (Stimulatoren) wurden auf 1 × 10⁷ Zellen pro ml verdünnt und 1 Stunde bei 37°C in Gewebekultur-Medium, das 2% FBS enthielt, mit dem entsprechenden Pockenvirus, bei einer m. o. i. von 25 PFU/Zelle, infiziert. Nach der Infektion wurden die Stimulator-Zellen einige Male in Stim-Medium gewaschen und mit Stim-Medium auf 1 × 10⁶ Zellen/ml verdünnt. 5 ml der Stimulator-Zellen und 5 ml der Responder-Zellen wurden in eine 25 cm³-Gewebekulturschale gegeben und 5 Tage aufrecht bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Am Tag des Tests wurden die Milzzellen mehrere Male in Assay-Medium gewaschen und in einem Hämacytometer in Trypanblau gezählt, wobei ein Mikroskop verwendet wurde.
Zielzell-Präparation
Für eine Pockenvirus-spezifische CTL-Aktivität wurden Gewebekultur-Zellen über Nacht durch Inkubation von 1 × 10⁷ Zellen/ml in Gewebekultur-Medium, das 2% FBS enthielt, bei einer m. o. i. von 25 PFU/Zelle 1 Stunde bei 37°C infiziert. Nach der Inkubation wurden die Zellen auf zwischen 1–2 × 10⁶ Zellen/ml mit Gewebekultur-Medium, enthaltend 10% FBS, verdünnt und bis zur Verwendung weiter bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Für eine HIV-spezifische CTL-Aktivität wurden Gewebekultur-Zellen über Nacht mit 20 μg/ml Peptid HBX2 (American Biotechnologies, Cambridge, MA), SF2 (American Biotechnologies, Cambridge, MA) oder MN (American Biotechnologies, Cambridge, MA), entsprechend der V3-Schleifen-Region des gp120 der HIV-1-Isolate III_B, –SF2 bzw. - MN, inkubiert. Am Tag des Tests wurden die Ziele einige Male durch Zentrifugation in Assay-Medium gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen in ungefähr 100 μCi Na₂ ⁵¹CrO₄ (⁵¹Cr) resuspendiert. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37° C wurden die Zellen mindesten dreimal durch Zentrifugation in Testmedium gewaschen, in einem Hämacytometer gezählt und in Testmedium auf 1 × 10⁵/ml verdünnt.
Cytotoxizitätstests
Für primäre CTL-Tests wurden frisch präparierte Milzzellen mit Assay-Medium auf 1 × 10⁷ Zellen/ml verdünnt. Für sekundäre CTL-Tests (nachfolgend entweder einer in vivo-Inokulierung oder einer in vitro-Stimulation) wurden die Milzzellen auf 2 × 10⁶/ml in Assay-Medium verdünnt. 1/10 ml der Milzzell-Suspension wurde auf ⁵¹Cr-markierte Zielzellen in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden (EXP) gegeben. In den meisten Fällen wurden die Milzzellen, die auf primäre CTL-Aktivität getestet werden sollten, vor der Zugabe der Zielzellen in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte weiter zweifach verdünnt. Als ein Maß für die spontane Freisetzung von ⁵¹Cr (SR) wurden Zielzellen ausschließlich in Assay-Medium inkubiert. Um die maximale Freisetzung von ⁵¹Cr (MAX) zu bestimmen, wurden Zielzellen bewusst zu Beginn des Tests lysiert, indem 0,1 ml 10% Natriumdodecylsulfat zu den entsprechenden Vertiefungen zugegeben wurde. Um den Test auszulösen, wurden die Mikrotiterplatten 2 Minuten bei 200 × g zentrifugiert und 4 oder 5 Stunden bei 37° C und 5% CO₂ inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Kulturüberstände jeder Vertiefung gesammelt, wobei das Skatron Supernatant Collection System verwendet wurde. Freigesetztes ⁵¹Cr wurde mit einem Beckman 5500B-Gamma-Zähler bestimmt. Der prozentuale Wert der spezifischen Cytotoxizität wurde anhand der Zählwerte nach der folgenden Formel bestimmt: % CYTOTOXIZITÄT = (EXP-MAX)/(MAX-SR) × 100
Verminderung von T-Helferzellen und cytotoxischen T- Lymphocyten unter Verwendung von monoclonalem Anti-CD4 und monoclonalem Anti-CD8
Milzzell-Suspensionen wurden in Cytotoxicitätsmedium (RPMI 1640, enthaltend 0,2% BSA und 5 mM HEPES), das eine 1 : 5-Verdünnung von anti-CD4 (monoclonaler Antikörper 172.4) oder eine 1 : 200 Verdünnung von anti-CD8 (monoclonaler Antikörper anti-Lyt 2.2) und eine 1 : 16 Verdünnung des Cedar Lane Low-Tox-Kaninchenkomplements enthielt, auf eine Dichte von 10⁷/ml verdünnt. Entsprechende Kontrollen für die einzelnen Komponenten (Komplement, anti-CD4, anti-CD8) wurden mit eingeschlossen.
Anti-HIV-1-gp160-ELISA
Die Vertiefungen von ELISA-Platten (Immulon II) wurden über Nacht bei 4°C mit 100 ng gereinigtem HIV-1-gp160 (Immuno) in Carbonatpuffer, pH 9,6 beschichtet. Die Platten wurden dann mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, die 0,05 Tween 20 enthielt (PBST). Die Platten wurden dann 2 Stunden bei 37°C mit PBST, das 1% Rinder-Serumalbumin (BSA) enthielt, blockiert. Nach Waschen mit PBST wurden die Seren anfänglich 1 : 20 mit PBST, das 0,1% BSA enthielt (Verdünnungspuffer), verdünnt. Die Seren wurden weiter in den Vertiefungen der ELISA-Platte aufeinanderfolgend 2-fach verdünnt. Die Platten wurden 2 Stunden bei 37°C inkubiert und mit PBST gewaschen. Meerrettich-Peroxidasekonjugierte Kaninchen-anti-Maus-Immunglobuline (DAKO) wurden in Verdünnungspuffer 1 : 2.000 verdünnt und in die Vertiefungen der ELISA-Platten gegeben und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach Waschen mit PBST wurde OPD (o-Phenylendiamindihydrochlorid) in Substratpuffer zugegeben, und man ließ die Farbe etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur entwickeln. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von 2,5 molarer H₂SO₄ beendet. Mit einem Bio-Tek EL-309 ELISA-Lesegerät wurde die Absorption bei 490 nm bestimmt. Der Serum-Endpunkt wurde als die Umkehrung der Verdünnung definiert, wobei ein Absorptionswert von 1,0 erhalten wurde.
Lymphocyten-Proliferationstests
Einzelzell-Suspensionen der Milzzellen einzelner Mäuse wurden in Assay-Medium auf 2 × 10⁶/ml verdünnt, und 0,1 ml wurden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden gegeben, die ausschließlich Assay-Medium, 1,5 oder 10 μg des HIV-1-Peptids T1, 1,5 oder 10 μg des HIV-1-Peptids T2 und 1 oder 10 μg gereinigtes HIV-1-gp160 (Immuno) enthielten. Die Zellen wurden 5 Tage bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. In jede Vertiefung wurden während der letzten 6 Stunden der Inkubation 1,0 μCi [³H]-Thymidin zugegeben, und dann wurde auf Beckman Ready Filters abgeerntet, wobei ein Cambridge PHD-Zellernter verwendet wurde. Die Filterscheiben wurden in einem Flüssig-Scintillationszähler trocken gezählt. STIMULATIONSINDEX = CPMsexp/CPMsMEDIUM
Beispiel 1 - Abgeschwächter Vaccinia-Impfstoff-Stamm NYVAC
Um einen neuen Vaccinia-Impfstoff-Stamm NYVAC (vP866) zu entwickeln, wurde der Kopenhagen-Impfstoff-Stamm des Vaccinia-Virus durch die Deletion von 6 nicht essentiellen Bereichen des Genoms modifiziert, die bekannte oder potentielle Virulenzfaktoren codieren. Die aufeinanderfolgenden Deletionen sind nachfolgend detailliert beschrieben. Alle Bezeichnungen von Vaccinia-Restriktionsfragmenten, offenen Leserahmen und Nucleotidpositionen beruhen auf der Terminologie, die in Goebel et al. (1990a, b) berichtet wurde.
Die Deletionsloci wurden auch gentechnisch so verändert, dass sie Empfängerloci für die Einfügung von fremden Genen darstellen.
Die Regionen, die aufeinanderfolgend in NYVAC deletiert wurden, sind im Nachfolgenden aufgelistet. Ebenso aufgelistet sind die Abkürzungen und die offenen Leserahmen-Bezeichnungen für die deletierten Regionen (Goebel et al., 1990a, b) und die Bezeichnung der Vaccinia-Rekombinante (vP), die alle Deletionen enthält, wobei die Deletion wie folgt spezifiziert ist:

(1) Thymidinkinase-Gen (TK; J2R) vP410;
(2) Hämorrhagische Region (u; B13R + B14R) vP553;
(3) A-Typ Einschlusskörper-Region (ATI; A26L) vP618;
(4) Hämagglutinin-Gen (HA; A56R) vP723;
(5) Wirtsbereich-Genregion (C7L-K1L) vP804; und
(6) Große Untereinheit der Ribonucleotid-Reduktase (I4L) vP866 (NYVAC).

Wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, kann jede dieser Regionen oder jede Kombination davon, entweder alleine oder in Kombination mit anderen Stellen, eine Stelle für die Einfügung exogener DNA eines Immunschwächevirus, von Immunschwächeviren oder von einem solchen Virus oder von solchen Viren und anderer exogener DNA sein, um eine zweckmäßige Rekombinante zu erhalten.
(1) Konstruktion des Plasmids pSD460 für die Deletion des Thymidinkinase-Gens (J2R)
Bezugnehmend auf 1 enthält das Plasmid pSD406 das Vaccinia-HindIII J-Fragment (Pos. 83.359–83.377), cloniert in pUC8. pSD406 wurde mit HindIII und PvuII gespalten und das 1,7 kb-Fragment von der linken Seite des HindIII J-Fragments in pUC8 cloniert, das mit HindIII/SmaI gespalten worden war, wobei pSD447 erzeugt wurde. PSD447 enthält das gesamte Gen von J2R (Pos. 83.855–84.385). Das Inititationscodon ist innerhalb einer NlaIII-Restriktionsschnittstelle enthalten, und das Terminierungscodon ist innerhalb einer SspI- Restriktionsschnittstelle enthalten. Die Richtung der Transkription ist in 1 durch einen Pfeil angezeigt.
Um einen flankierenden linken Arm zu erhalten, wurde ein 0,8 kb-HindIII/EcoRI-Fragment aus pSD447 isoliert, dann mit NlaIII gespalten, und es wurde ein 0,5 kb-HindIII/NlaIII-Fragment isoliert. Anelierte synthetische Oligonucleotide MPSYN43/MPSYN44 (SEQ ID NR: 1/SEQ ID NR: 2)
wurden mit dem 0,5 kb-HindIII/NlaIII-Fragment in das pUC18-Vektorplasmid ligiert, das mit HindIII/EcoRI gespalten worden war, wobei das Plasmid pSD449 erzeugt wurde.
Um ein Restriktionsfragment zu erhalten, das einen rechten flankierenden Vaccinia-Arm und pUC-Vektorsequenzen enthält, wurde pSD447 mit SspI (partiell) innerhalb der Vaccinia-Sequenzen und mit HindIII an der pUC/Vaccinia-Verknüpfung gespalten und ein 2,9 kb-Vektorfragment isoliert. Dieses Vektorfragment wurde mit den anelierten synthetischen Oligonucleotiden MPSYN45/MPSYN46 (SEQ ID NR: 3/SEQ ID NR: 4) ligiert,
wobei pSD459 erzeugt wurde.
Um die linken und rechten flankierenden Arme in einem Plasmid miteinander zu kombinieren, wurde aus pSD449 ein 0,5 kb-HindIII/SmaI-Fragment isoliert und mit dem pSD459-Vektorplasmid ligiert, das mit HindIII/SmaI gespalten worden war, wobei das Plasmid pSD460 erzeugt wurde. pSD460 wurde als Spender-Plasmid für die Rekombination mit dem parentalen Wildtyp-Vaccinia-Virus Kopenhagen, Stamm VC-2 verwendet. Die ³²P-markierte Sonde wurde mit Hilfe von Primer-Extension synthetisiert, wobei MPSYN45 (SEQ ID NR: 3) als Matrize und das komplementäre 20mer-Oligonucleotid MPSYN47 (SEQ ID NR: 5) (5'-TTAGTTAATTAGGCGGCCGC-3') als Primer verwendet wurden. Das rekombinante Virus vP410 wurde durch Plaque-Hybridisierung identifiziert.
(2) Erzeugung des Plasmids pSD486 zur Deletion der hämorrhagischen Region (B13R + B14R)
Jetzt bezugnehmend auf 2 enthält das Plasmid pSD419 das Vaccinia-SalI-G-Fragment (Pos. 160.744– 173.351), cloniert in pUC8. pSD422 enthält das zu dem rechten SalI-J-Fragment (Pos. 173.351–182.746) aufeinanderfolgende Vaccinia SalI-Fragment, cloniert in pUC8. Um ein Plasmid zu erzeugen, das bezüglich der hämorrhagischen Region, u, B13R– B14R (Pos. 172.549–173.552) deletiert ist, wurde pSD419 als Quelle für den linken flankierenden Arm verwendet und pSD422 als Quelle für den rechten flankierenden Arm verwendet. Die Richtung der Transkription für die u-Region ist in 2 durch einen Pfeil angezeigt.
Um unerwünschte Sequenzen aus pSD419 zu entfernen, wurden Sequenzen links der NcoI-Stelle (Pos. 172.253) durch Spaltung von pSD419 mit NcoI/SmaI entfernt, gefolgt von der Erzeugung glatter Enden mit Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase und Ligierung, wobei das Plasmid pSD476 erzeugt wurde. Ein rechter flankierender Vaccinia-Arm wurde durch Spaltung von pSD422 mit HpaI am Terminierungscodon von B14R und durch Spaltung mit NruI 0,3 kb rechts davon erhalten. Dieses 0,3 kb-Fragment wurde isoliert und mit einem 3,4 kb HincII-Vektorfragment ligiert, das aus pSD476 isoliert worden war, wobei das Plasmid pSD477 erzeugt wurde. Die Lokalisation der partiellen Deletion der Vaccinia u-Region in pSD477 ist durch ein Dreieck angezeigt. Die verbleibenden codierenden B13R Sequenzen in pSD477 wurden durch Spaltung mit ClaI/HpaI entfernt, und das resultierende Vektorfragment wurde mit den anelierten synthetischen Oligonucleotiden SD22mer/SD20mer (SEQ ID NR: 6/SEQ ID NR: 7)
ligiert, wobei pSD479 erzeugt wurde. pSD479 enthält ein Initiationscodon (unterstrichen), gefolgt von einer BamHI-Stelle. Um E. coli-Beta-Galactosidase in dem B13–B14 (u) Deletionslocus unter der Kontrolle des u-Promotors zu platzieren, wurde ein 3,2 kb BamHI-Fragment, das das Beta-Galactosidase-Gen (Shapira et al., 1983) enthielt, in die BamHI-Stelle von pSD479 eingefügt, wobei pSD479BG erzeugt wurde. pSD479BG wurde als Spenderplasmid für die Rekombination mit Vaccinia-Virus vP410 verwendet. Rekombinantes Vaccinia-Virus vP533 wurde als ein blauer Plaque in Anwesenheit des chromogenen Substrats X-Gal isoliert. In vP533 ist die B13R-B14R-Region deletiert und durch Beta-Galactosidase ersetzt.
Um Beta-Galactosidase-Sequenzen von vP533 zu entfernen, wurde das Plasmid pSD486 verwendet, ein Derivat von pSD477, das an der u-Deletionsverknüpfung eine Polylinker- Region, jedoch kein Initiationscodon enthält. Als erstes wurde das ClaI/HpaI-Vektorfragment aus pSD477, auf das sich vorstehend bezogen wurde, mit den anelierten synthetischen Oligonucleotiden SD42mer/SD40mer (SEQ ID NR: 8/SEQ ID NR: 9)
ligiert, wobei das Plasmid pSD478 erzeugt wurde. Als nächstes wurde die EcoRI-Stelle an der pUC/Vaccinia-Verknüpfung durch Spaltung von pSD478 mit EcoRI zerstört, gefolgt von der Erzeugung glatter Enden mit Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase und Ligierung, wobei das Plasmid pSD478E- erzeugt wurde. pSD478E- wurde mit BamHI und HpaI gespalten und mit den anelierten synthetischen Oligonucleotiden HEM5/HEM6 (SEQ ID NR: 10/SEQ ID NR: 11)
ligiert, wobei das Plasmid pSD486 erzeugt wurde. pSD486 wurde als Spenderplasmid für die Rekombination mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vP533 verwendet, wobei vP553 erzeugt wurde, das als ein klarer Plaque in Anwesenheit von X-Gal isoliert wurde.
(3) Erzeugung des Plasmids pMP494Δ zur Deletion der ATI-Region (A26L)
Jetzt bezugnehmend auf 3 enthält pSD414 das SalIB-Fragment, cloniert in pUC8. Um unerwünschte DNA-Sequenzen auf der linken Seite der A26L-Region zu entfernen, wurde pSD414 innerhalb der Vaccinia-Sequenzen (Pos. 137.079) mit XbaI und an der pUC/Vaccinia-Verknüpfung mit HindIII gespalten, dann wurden mit Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase glatte Enden erzeugt, und wurde danach ligiert, woraus das Plasmid pSD483 resultierte. Um unerwünschte Vaccinia-DNA-Sequenzen auf der rechten Seite der A26L-Region zu entfernen, wurde pSD483 mit EcoRI (Pos. 140.665 und an der pUC/Vaccinia-Verknüpfung) gespalten und ligiert, wobei das Plasmid pSD484 erzeugt wurde. Um die A26L codierende Region zu entfernen, wurde pSD484 mit NdeI (partiell) etwas stromaufwärts des A26L-ORF (Pos. 139.004) und mit HpaI (Pos. 137.889) etwas stromabwärts des A26L-ORF gespalten. Das 5,2 kb-Vektorfragment wurde isoliert und mit den anelierten synthetischen Oligonucleotiden ATI3/ATI4 (SEQ ID NR: 12/SEQ ID NR: 13)
ligiert, wobei die Region stromaufwärts von A26L rekonstruiert wurde und das A26L ORF durch eine kurze Polylinker-Region ersetzt wurde, die die Restriktionsschnittstellen BglII, EcoRI und HpaI, wie vorstehend angegeben, enthielt. Das resultierende Plasmid wurde mit pSD485 bezeichnet. Da die BglII- und EcoRI-Restriktionsschnittstellen in der Polylinker-Region von pSD485 nicht einzigartig sind, wurden unerwünschte BglII- und EcoRI-Stellen aus dem Plasmid pSD483 (vorstehend beschrieben) durch Spaltung mit BglII (Pos. 140.136) und mit EcoRI an der pUC/Vaccinia-Verknüpfung entfernt, gefolgt von der Erzeugung glatter Enden mit Klenow-Fragment von E. coli- Polymerase und Ligierung. Das resultierende Plasmid wurde mit pSD489 bezeichnet. Das 1,8 kb-ClaI (Pos. 137.198)/EcoRV (Pos. 139.048)-Fragment aus pSD489, das den A26L-OFR enthält, wurde durch den entsprechenden 0,7 kb-Polylinker ersetzt, der das ClaI/EcoRV-Fragment von pSD485 enthält, wobei pSD492 erzeugt wurde. Die BglII- und EcoRI-Stellen in der Polylinker-Region von pSD492 sind einzigartig.
Eine 3,3 kb BglII-Kassette, die das E. coli-Beta-Galactosidase-Gen (Shapira et al., 1983) unter der Kontrolle des 11 kDa-Vaccinia-Promotors enthält (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990), wurde in die BglII-Restriktionsschnittstelle des pSD492 eingefügt, wobei pSD493 KBG erzeugt wurde. Das Plasmid pSD493 KBG wurde für die Rekombination mit dem Helfervirus vP553 verwendet. Das rekombinante Vaccinia-Virus, vP581, das die Beta-Galactosidase in der A26L-Deletionsregion enthält, wurde in Anwesenheit von X-Gal als ein blauer Plaque isoliert.
Um ein Plasmid zur Entfernung der Beta-Galactosidase-Sequenzen aus dem rekombinanten Vaccinia-Virus vP581 zu erzeugen, wurde die Polylinker-Region des Plasmids pSD492 durch Mutagenese deletiert (Mandecki, 1986), wobei das synthetische Oligonucleotid MPSYN177 (SEQ ID NR: 14) (5'-AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTTTATATAACTTATTTTTTGAATATAC-3') verwendet wurde. In dem resultierenden Plasmid pMP494Δ ist die Vaccinia-DNA deletiert, die die Positionen [137.889-138.937], einschließlich des gesamten A26L-ORF, umfasst. Die Rekombination zwischen pMP494Δ und der Beta-Galactosidaseenthaltenen Vaccinia-Rekombinante vP581 resultierte in der Vaccinia-Deletionsmutante vP618, die in Anwesenheit von X-Gal als ein klarer Plaque isoliert wurde.
(4) Erzeugung des Plasmids pSD467 zur Deletion des Hämagglutinin-Gens (A56R)
Jetzt bezugnehmend auf 4 kreuzt das Vaccinia-SalI-G-Restriktionsfragment (Pos. 160.744–173.351), die HindIII A/B-Verknüpfung (Pos. 162.539). pSD419 enthält das Vaccinia-SalI-G-Fragment in pUC8 cloniert. Die Richtung der Transkription für das Hämagglutinin (HA)-Gen ist durch einen Pfeil in 4 angezeigt. Vaccinia-Sequenzen, die von HindIII B stammen, wurden durch Spaltung von pSD419 mit HindIII innerhalb von Vaccinia-Sequenzen und an der pUC/Vaccinia-Verknüpfung, gefolgt von einer Ligierung, entfernt. Das resultierende Plasmid pSD456 enthält das HA-Gen, A56R, flankiert von 0,4 kb Vaccinia-Sequenzen auf der linken Seite und 0,4 kb Vaccinia-Sequenzen auf der rechten Seite. A56R-codierende Sequenzen wurden durch Spaltung von pSD456 mit RsaI (partiell; Pos. 161.090) stromaufwärts von A56R-codierenden Sequenzen und mit EagI (Pos. 162.054) nahe dem Ende des Gens entfernt. Das 3,6 kb-RsaI-EagI-Vektorfragment aus pSD456 wurde isoliert und mit anelierten synthetischen Oligonucleotiden MPSYN59 (SEQ ID NR: 15), MPSY62 (SEQ ID NR: 16), MPSYN60 (SEQ ID NR: 17) und MPSYN61 (SEQ ID NR: 18)
ligiert, wobei die DNA-Sequenzen stromaufwärts des A56R-ORF rekonstruiert wurden und der A56R-ORF mit einer Polylinker-Region, wie vorstehend angezeigt, ersetzt wurde. Bei dem resultierenden Plasmid handelt es sich um pSD466. Die Vaccinia-Deletion in pSD466 umfasst die Positionen [161.185– 162.053]. Die Deletionsstelle in pSD466 ist durch ein Dreieck in 4 angezeigt.
Eine 3,2 kb-BglII/BamHI (partiell)-Kassette, die das E. coli-Beta-Galactosidase-Gen (Shapira et al., 1983) unter der Kontrolle des 11 kDa-Vaccinia-Promotors (Bertholet et al., 1985; Guo et al., 1989) enthält, wurde in die BglII-Stelle des pSD466 eingefügt, wobei pSD466KBG erzeugt wurde. Das Plasmid pSD466KBG wurde für die Rekombination mit dem Helfer-Virus vP618 verwendet. Das rekombinante Vaccinia-Virus vP708, das die Beta-Galactosidase in der A56R-Deletion enthält, wurde in Anwesenheit von X-Gal als ein blauer Plaque isoliert.
Beta-Galactosidase-Sequenzen wurden aus vP708 deletiert, wobei das Spender-Plasmid pSD467 verwendet wurde. pSD467 ist identisch mit pSD466, mit Ausnahme dass EcoRI-, SmaI- und BamHI-Schnittstellen durch Spaltung von pSD466 mit EcoRI/BamHI gefolgt von Erzeugung glatter Enden mit Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase und Ligierung aus der pUC/Vaccinia-Verknüpfung entfernt worden waren. Die Rekombination zwicken vP708 und pSD467 resultierte in einer rekombinanten Vaccinia-Deletionsmutante vP723, die in Anwesenheit von X-Gal als ein klarer Plaque isoliert wurde.
(5) Erzeugung des Plasmids pMPCSK1Δ zur Deletion von offenen Leserahmen [C7L-K1L]
Jetzt bezugnehmend auf 5 wurden die nachfolgenden Vaccinia-Clone zur Erzeugung von pMPCSKIΔ verwendet. pSD420 ist SalI-H, cloniert in pUC8. pSD435 ist KpnI-F, cloniert in pUC18. pSD435 wurde mit SphI gespalten und religiert, wobei pSD451 erzeugt wurde. In pSD451 wurden DNA-Sequenzen auf der linken Seite der SphI-Schnittstelle (Pos. 27.416) in HindIII-M entfernt (Perkus et al., 1990). pSD409 ist HindIII-M, cloniert in pUC8.
Um ein Substrat zur Deletion des [C7L-K1L]-Genclusters aus Vaccinia bereitzustellen, wurde E. coli-Beta-Galactosidase zuerst in den Vaccinia M2L-Deletionslocus (Guo et al., 1990; Mandecki; 1986) wie folgt eingefügt. Um die BglII-Schnittstelle in pSD409 zu eliminieren, wurde das Plasmid mit BglII innerhalb von Vaccinia-Sequenzen (Pos. 28.212) und mit BamHI an der pUC/Vaccinia-Verknüpfung gespalten, dann ligiert, wobei das Plasmid pMP409B erzeugt wurde. pMP409B wurde an der einzigen SphI-Schnittstelle (Pos. 27.416) gespalten. M2L-codierende Sequenzen wurden durch Mutagenese entfernt (Guo et al., 1990; Mandecki, 1986), wobei synthetische Oligonucleotide verwendet wurden.
Das resultierende Plasmid pMP409D enthält eine einzige BglII-Schnittstelle, die, wie vorstehend angezeigt, in den M2L-Deletionslocus eingefügt worden war. Eine 3,2 kb-BamHI (partiell)/BglII-Kassette, die das E. coli-Beta-Galactosidase-Gen (Shapira et al., 1983) unter der Kontrolle des 11 kDa-Promotors enthält (Bertholet et al., 1985), wurde in pMP409D eingefügt, das mit BglII gespalten worden war. Das resultierende Plasmid pMP409DBG (Guo et al., 1990) wurde als Spender-Plasmid für die Rekombination mit dem Helfer-Vaccinia-Virus vP723 verwendet. Das rekombinante Vaccinia-Virus vP784, das die Beta-Galactosidase in den M2L-Deletionslocus eingefügt enthält, wurde in Anwesenheit von X-Gal als ein blauer Plaque isoliert.
Ein Plasmid, das für Vaccinia-Gene [C7L-K1L] deletiert war, wurde in pUC8 zusammengesetzt, das mit SmaI, HindIII gespalten und mit dem Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase in glatte Enden überführt worden war. Der linke flankierende Arm, der aus Vaccinia-HindIII-C-Sequenzen besteht, wurde durch Spaltung von pSD420 mit XbaI (Pos. 18.628), gefolgt von der Erzeugung von glatten Enden mit Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase und Spaltung mit BglII (Pos. 19.706) erhalten. Der rechte flankierende Arm, der aus Vaccinia-HindIII-K-Sequenzen besteht, wurde durch Spaltung von pSD451 mit BglII (Pos. 29.062) und EcoRV (Pos. 29.778) erhalten. Das resultierende Plasmid pMP581CK ist für Vaccinia-Sequenzen zwischen der BglII-Schnittstelle (Pos. 19.706) in HindIII-C und der BglII-Schnittstelle (Pos. 29.062) in HindIII-K deletiert. Die Stelle der Deletion von Vaccinia-Sequenzen im Plasmid pMP581CK ist durch ein Dreieck in 5 angezeigt.
Um überschüssige DNA an der Vaccinia-Deletionsverknüpfung zu entfernen, wurde das Plasmid pMP581CK an den NcoI-Schnittstellen innerhalb der Vaccinia-Sequenzen (Pos. 18.811; 19.655) gespalten, mit Bal-31-Exonuclease behandelt und einer Mutagenese unterzogen (Mandecki, 1986), wobei das synthetische Oligonucleotid MPSYN233 (SEQ ID NR: 20) 5' TGTCATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT-3', verwendet wurde. Das resultierende Plasmid pMPCSKIΔ ist für Vaccinia-Sequenzen von 18.805–29.108 deletiert, wobei 12 offene Vaccinia-Leserahmen [C7L-K1L] umfasst sind. Die Rekombination zwischen pMPCSKIΔ und der Beta-Galactosidase enthaltenden Vaccinia-Rekombinante vP784 resultierte in der Vaccinia-Deletionsmutante vP804, die in Anwesenheit von X-Gal als ein klarer Plaque isoliert wurde.
(6) Erzeugung des Plasmid pSD548 zur Deletion der großen Untereinheit, Ribonucleotidreduktase (I4L)
Jetzt bezugnehmend auf 6 enthält das Plasmid pSD405 Vaccinia-HindIII-I (Pos. 63.875–70.367), cloniert in pUC8. pSD405 wurde mit EcoRV innerhalb von Vaccinia-Sequenzen (Pos. 67.933) und mit SmaI an der pUC/Vaccinia-Verknüpfung gespalten und ligiert, wobei das Plasmid pSD518 erzeugt wurde. pSD518 wurde als Quelle für alle Vaccinia-Restriktionsfragmente verwendet, die für die Konstruktion von pSD548 verwendet wurden.
Das Vaccinia-I4L-Gen erstreckt sich von Position 67.371 bis 65.059. Die Richtung der Transkription von I4L ist durch einen Pfeil in 6 angezeigt. Um ein Vektor-Plasmid-Fragment zu erhalten, das für einen Teil der codierenden I4L-Sequenzen deletiert ist, wurde pSD518 mit BamHI (Pos. 65.381) und HpaI (Pos. 67.001) gespalten und unter Verwendung des Klenow-Fragments der E. coli-Polymerase in glatte Enden überführt. Dieses 4,8 kb-Vektorfragment wurde mit einer 3,2 kb-SmaI-Kassette ligiert, die das E. coli-Beta-Galactosidase-Gen (Shapira et al., 1983) unter der Kontrolle des 11 kDa-Vaccinia-Promotors enthält (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990), was in dem Plasmid pSD524KBG resultierte. pSD524KBG wurde als Spender-Plasmid für die Rekombination mit dem Vaccinia-Virus vP804 verwendet. Das rekombinante Vaccinia-Virus vP855, das die Beta-Galactosidase in einer partiellen Deletion des I4L-Gens enthält, wurde in Anwesenheit von X-Gal als ein blauer Plaque isoliert.
Um Beta-Galactosidase und den Rest des I4L-ORF aus vP855 zu entfernen, wurde das Deletionsplasmid pSD548 erzeugt. Die linken und rechten flankierenden Vaccinia-Arme wurden voneinander getrennt in pUC8 zusammengesetzt, wie nachstehend in Einzelheiten dargestellt und schematisch in 6 präsentiert.
Um ein Vektorplasmid zu konstruieren, das den linken flankierenden Vaccinia-Arm annimmt, wurde pUC8 mit BamHI/EcoRI gespalten und mit den anelierten synthetischen Oligonucleotiden 518A1/518A2 (SEQ ID NR: 21/SEQ ID NR: 22)
ligiert, wobei das Plasmid pSD531 erzeugt wurde. pSD531 wurde mit RsaI (partiell) und BamHI gespalten, und ein 2,7 kb-Vektor-Fragment wurde isoliert. pSD518 wurde mit BglII (Pos. 64.459)/RsaI (Pos. 64.994) gespalten und ein 0,5 kb-Fragment isoliert. Die beiden Fragmente wurden miteinander ligiert, wobei pSD537 erzeugt wurde, das den vollständigen flankierenden Vaccinia-Arm links der codierenden I4L-Sequenzen enthält.
Um ein Vektorplasmid zu erzeugen, das den rechten flankierenden Vaccinia-Arm annimmt, wurde pUC8 mit BamHI/EcoRI gespalten und mit den anelierten synthetischen Oligonucleotiden 518B1/518B2 (SEQ ID NR: 23/SEQ ID NR: 24)
ligiert, wobei das Plasmid pSD532 erzeugt wurde. pSD532 wurde mit RsaI (partiell)/EcoRI gespalten, und ein 2,7 kb-Vektor-Fragment wurde isoliert. pSD518 wurde mit RsaI innerhalb von Vaccinia-Sequenzen (Pos. 67.436) und mit EcoRI an der Vaccinia/pUC-Verknüpfung gespalten, und ein 0,6 kb-Fragment wurde isoliert. Die beiden Fragmente wurden zusammenligiert, wobei pSD538 erzeugt wurde, das den vollständigen flankierenden Vaccinia-Arm rechts der codierenden I4L-Sequenzen enthält.
Der rechte flankierende Vaccinia-Arm wurde als ein 0,6 kb EcoRI/BglII-Fragment aus pSD538 isoliert und in das pSD537-Vektorplasmid ligiert, das mit EcoRI/BglII gespalten worden war. In dem resultierenden Plasmid pSD539 wurde der I4L-ORF (Pos. 65.047–67.386) durch eine Polylinker-Region ersetzt, die auf der linken Seite mit 0,6 kb Vaccinia-DNA und auf der rechten Seite mit 0,6 kb-Vaccinia-DNA flankiert ist, alles in einem pUC-Hintergrund. Die Stelle der Deletion innerhalb der Vaccinia-Sequenzen ist in 6 durch ein Dreieck angezeigt. Um eine mögliche Rekombination von Beta-Galactosidase-Sequenzen in dem pUC-abstammenden Teil von pSD539 mit Beta-Galactosidase-Sequenzen in dem rekombinanten Vaccinia-Virus vP855 zu vermeiden, wurde die Vaccinia I4L-Deletionskassette aus pSD539 in pRC11 übertragen, ein pUC-Derivat, aus dem alle Beta-Galactosidase-Sequenzen entfernt und durch eine Polylinker-Region ersetzt worden waren (Colinas et al., 1990). pSD539 wurde mit EcoRI/PstI gespalten, und das 1,2 kb-Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde in pRC11 ligiert, das mit EcoRI/PstI gespalten worden war (2,35 kb), wobei pSD548 erzeugt wurde. Rekombination zwischen pSD548 und der Beta-Galactosidase enthaltenden Vaccinia-Rekombinante vP855 resultierte in der Vaccinia-Deletionsmutante vP866, die in Anwesenheit von X-Gal als ein klarer Plaque isoliert wurde.
DNA des rekombinanten Vaccinia-Virus vP.866 wurde durch Restriktionsspaltung, gefolgt von Elektrophorese in einem Agarosegel, analysiert. Die Restriktionsmuster waren wie erwartet. Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) (Engelke et al., 1988) unter Verwendung von vP866 als Matrize und Primern, die die vorstehend detailliert dargestellten 6 Deletionsstellen flankierten, erzeugten DNA-Fragmente von den erwarteten Größen. Die Sequenzanalyse der durch PCR erzeugten Fragmente um die Regionen der Deletionsverknüpfungen bestätigten, dass die Verknüpfungen wie erwartet waren. Das rekombinante Vaccinia-Virus vP866, das die 6 gentechnisch erzeugten Deletionen, wie vorstehend beschrieben, enthielt, wurde als Vaccinia-Impfstoffstamm "NYVAC" bezeichnet.
Beispiel 2 - Expression von HIV-Genprodukten durch wirtsspezifische Pockenviren
Dieses Beispiel beschreibt die Erzeugung von wirtsspezifischen Pockenviren, die HIV-Genprodukte exprimieren. Die verwendeten Vektoren sind NYVAC, ALVAC und TROVAC.
ALVAC und NYVAC-Rekombinanten, die HIV-1 (IIIB), V3-Schleife und Epitop 88 enthalten
Ein 150 bp-Fragment, das die V3-Schleife (Aminosäuren 299–344; Javeherian et al., 1989; La Rosa et al., 1990) von HIV-1 (IIIB) umfasst, wurde durch PCR erhalten, wobei die Oligonucleotide HIV3BL5 (SEQ ID NR: 25) (5'-ATGGTAGAAATTAATTGTAC-3') und HIV3BL3 (SEQ ID NR: 26) (5'-ATCATCGAATTCAAGCTTATTATTTTGCTCTACTAATGTTAC-3') mit pHXB.2D (III) als Matrize (bereitgestellt von Dr. R. C. Gallo, NCI-NIH, Bethesda, MD) verwendet wurden. Die Oligonucleotide HIV88A (SEQ ID NR: 27) (5'-ATGAATGTGACAGAAAATTTTAACATGTGG AAAAATGTAGAAATTAATTGTACAAGACCC-3') und HIV88B (SEQ ID NR: 28) (5'-GGGTCTTGTACAATTAATTTCTACATTTTTCCACATGTTAAAATTTTCTGTCACATTC AT-3') wurden aneliert, wobei ein doppelsträngiges Fragment erzeugt wurde, das das HIV-1-Epitop 88 (Aminosäuren 95–105, Shaffermann et al., 1989) enthält. Das 150 bp-V3-enthaltende PCR-Fragment, das das Epitop und das 42 bp-Fragment enthält, das die 88-Epitop-Sequenzen umfasst, wurden durch PCR aufgrund der Existenz von komplementären Sequenzen miteinander fusioniert. Die Reaktionen wurden durchgeführt, indem die Oligonucleotide HIV88C (SEQ ID NR: 29) (5'-AGTAATGTGACAGAAAATTTTAAC-3') und HIV3BL3 verwendet wurden. Das 192 bp-Fragment, das durch PCR erhalten wurde, enthält die Epitop 88-Sequenzen fusioniert stromaufwärts der V3-Schleifen-Sequenzen. Ein Terminationscodon (TAA) wurde in das Oligonucleotid HIV3BL3P eingebaut, um die Translation des offenen Leserahmens zu terminieren, und ein Initiationscodon wurde in das Oligonucleotid HIV88C integriert, das als Start für die Translation dienen soll, um das Epitop 88/v3-Schleifen-Fusionsprotein zu exprimieren. Zusätzlich wurde das Oligonucleotid HIV3BL3 so synthetisiert, dass am 3'-Ende des 192 bp-PCR-Fragments eine EcoRI-Restriktionsschnittstelle existierte.
Der Insekten-Pockenvirus-Promotor, 42 kDa (früh), wurde mit Hilfe von PCR erzeugt, wobei die Oligonucleotide RG273 (SEQ ID NR: 30) (5'-AGGCAAGCTTTCAAAAAAATATAAATGATTC-3') und RG274 (SEQ ID NR: 31) (5'-TTTATATTGTAATTATATATTTTC-3') mit dem Plasmid pAM12 als Matrize verwendet wurden. Das 108 bp-Fragment, das den 42 kDa-Promotor enthält, wurde so synthetisiert, dass eine HindIII-Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende enthalten war. Das 42 kDa-Promotor-enthaltende Segment wurde vor der Ligation mit dem Epitop 88/V3-Fragment, das mit EcoRI gespalten worden war, und pRW831, das mit HindIII und EcoRI gespalten worden war, mit Kinase behandelt und mit HindIII gespalten. Das resultierende Plasmid wurde als pC5HIVL88 bezeichnet. Dieses Plasmid wurde in in vitro-Rekombinationstests mit CPpp als Helfervirus eingesetzt, um vCP95 zu erzeugen. Die ALVAC-Rekombinante vCP95 enthält Epitop 88/V3-Schleife in dem C5-Locus ohne ORF von CPpp.
Das Plasmid pC5HIVL88 wurde mit HindIII und EcoRI gespalten, um ein 300 bp-Fragment freizusetzen, das die vorstehend beschriebene Epitop 88/V3-Expressionskassette enthält. Dieses Fragment wurde aus einem LMP-Agarosegel ausgeschnitten und mit Phenol-Extraktion (zweimal) und Ether-Extraktion (einmal) isoliert. Das isolierte Fragment wurde unter Verwendung des Klenow-Fragments der E. coli-DNA-Polymerase in Anwesenheit von 2 mM dNTPs in glatte Enden überführt. Das Fragment mit glatten Enden wurde mit pSD550VC ligiert, das mit SmaI gespalten worden war, wobei das Plasmid pHIVL88VC erhalten wurde. Dieses Plasmid wurde mit vP866 als Helfervirus verwendet, um vP878 zu erzeugen. vP878 enthält die Epitop 88/V3-Schleifen-Kassette in dem I4L-Locus ohne ORF von vP866.
ALVAC- und NYVAC-basierte Rekombinanten, die das HIV-1 (IIIB)-Hüll-Glycoprotein exprimieren.
Eine Expressionskassette, die aus dem HIV-1 (IIIB)-env-Gen in 3'-Nachbarschaft zu dem Vaccinia-Virus H6-Promotor (Guo et al., 1989; Taylor et al., 1988a, b) zusammengesetzt ist, wurde mit Hilfe der ALVAC- und NYVAC-Vektoren zur Expression von gp160 von HIV-1 gentechnisch rekombiniert. Ein 1,4 kb-Fragment wurde aus pHXB.2D (III) amplifiziert (bereitgestellt von Dr. R. C. Gallo, NCI-NIH, Bethesda, MD), wobei die Oligonucleotide HIV3B1 (SEQ ID NR: 32) (5'-GTTTTAATTGTGGAGGGGAATTCTTCTACTGTAATTC-3') und HIV3B5 (SEQ ID NR: 33) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTATAGCAAAATCCTTTC-3') verwendet wurden. Dieses Fragment enthält den 3'-Teil des env-Gens. Die PCR-Amplifikation mit diesen Primern platzierte ein frühe Transkription-Terminations-TSNT-Sequenz-Motiv des Vaccinia-Virus im Anschluss an die codierende Sequenz und entfernte das T5NT-Motiv, das an Position 6.146–6.152 lokalisiert war (Ratner et al., 1985), ohne die Aminosäuresequenz zu verändern. Dieser Austausch (T nach C) erzeugt eine EcoRI-Schnittstelle (GAATTC) an dieser Position. Dieses 1,4 kb-Fragment wurde mit EcoRI (5'-Ende) und XbaI (3'-Ende) gespalten und in das EcoRI- und XbaI-gespaltene pBS-SK (Stratagene, La Jolla, CA) eingefügt. Das resultierende Plasmid wurde als pBSHIVENV1,5 bezeichnet. Die Nucleotid-Sequenzanalyse dieses Fragments zeigte, dass die Sequenz vollständig korrekt war, mit Ausnahme einer T nach C-Transition an Position 7.048. Diese Transition wurde wie folgt korrigiert: mit Hilfe von PCR wurde ein 250 bp-Fragment erhalten, wobei die Oligonucleotide HIV3B1 (SEQ ID NR: 32) (5'-GTTTTAATTGTGGAGGGGAATTCTTCTACTGTAATTC-3') und HIV3B17 (SEQ ID NR: 34) (5'-TGCTACTCCTAATGGTTC-3') mit pHXB.2D (III) als Matrize verwendet wurden. Dieses Fragment wurde mit BglII und EcoRI gespalten. Das Fragment wurde in pBSHIV3B1,5 eingefügt, das zuvor mit BglII und EcoRI gespalten worden war und substituierte somit die Region mit dem unkorrekten Nucleotid, wobei das Plasmid pBSHIV3B3P erhalten wurde.
PCR wurde verwendet, um ein 150 bp-Fragment zu erhalten, das den 5'-Bereich des env-Gens enthält, wobei die Oligonucleotide HIV3B9 (SEQ ID NR: 35) (5'-CATATGCTTTAGCATCTGATG-3') und HIV3B10 (SEQ ID NR: 36) (5'-ATGAAAGAGCAGAAGACAGTG-3') mit pHXB.2D (III) als Matrize verwendet wurden. PCR wurde ebenfalls verwendet, um ein 128 bp-Fragment zu erzeugen, das den Vaccinia-Virus H6-Promotor aus pC3FGAG enthält, wobei die Oligonucleotide W6K5P (SEQ ID NR: 37) (5'-ATCATCGGTACCGATTCTTTATTCTATAC-3') und VVH63P (SEQ ID NR: 38( (5'-TACGATACAAACTTAACGG-3') verwendet wurden. Beide Fragmente wurden mit KpnI gespalten, und das 150 bp-Fragment wurde vor der gemeinsamen Einfügung dieser Fragmente in pBS-SK, der mit KpnI gespalten worden war, mit einer Kinase behandelt. Das rsultierende Plasmid wurde als pBSH6HIV3B5P bezeichnet.
PCR wurde verwendet, um ein 600 bp-Fragment aus pHXB.2D (III) zu erzeugen, wobei die Oligonucleotide HIV3B2 (SEQ ID NR: 39) (5'-GAATTACAGTAGAAGAATTCCCCTCCACAATTAAAAC-3') und HIV3B7 (SEQ ID NR: 40) (5'-CAATAGATAATGATACTAC-3') verwendet wurden. Dieses Fragment wurde mit EcoRI gespalten und mit einer Kinase behandelt. PCR wurde auch verwendet, um mit der gleichen Matrize, aber mit den Oligonucleotiden HIV3B6 (SEQ ID NR: 41) (5'-GTATTATATCAAGTTTATATAATAATGCATATTC-3') und HIV3B8 (SEQ ID NR: 42) (5'-GTTGATGATCTGTAGTGC-3') ein 500 bp-Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wurde mit KpnI gespalten. Diese Fragmente entsprechen zusammen den Nucleotiden 5.878–6.368 (Ratner et al., 1985). Die gentechnische Modifikation dieser Fragmente mit diesen Primern entfernt auch eine T5NT-Sequenz, die zwischen den Nucleotiden 6.322 bis 6.328 positioniert ist, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern. Diese beiden Fragmente wurden in pBSHIV3B3P eingefügt, das mit KpnI und EcoRI gespalten worden war. Dieses Plasmid wurde als pBSHIV3BP2768 bezeichnet.
Das Plasmid pBSH6HIV3B5P wurde mit KpnI gespalten, um ein 360 bp-Fragment freizusetzen, das den H6-Promotor und den 5'-Bereich (150 bp) des HIV-1-env-Gens enthält. Dieses KpnI-Fragment wurde in pBSHIV3B3P2768 ligiert, das mit KpnI gespalten worden war, wobei das Plasmid pBSHIV3BEII erhalten wurde. Ein 2,8 kb-Fragment wurde aus pBSHIV3BEII durch Spaltung mit XbaI, gefolgt von einer partiellen Spaltung mit KpnI, erhalten. Dieses Fragment wurde in glatte Enden überführt und in SmaI-gespaltenes pSD550 eingefügt. Das Plasmid pI4LH6HIV3B wurde erzeugt und in Rekombinations-Experimenten mit vP866 als Helfervirus verwendet. So wurde vP911 erzeugt, das das HIV-1-env-Gen im I4L-Locus des NYVAC-Genoms enthält.
Um das HIV-1-env-Gen in einen ALVAC-Vektor zu inserieren, wurde pBSHIV3BEAII mit NruI und XbaI gespalten. Das erhaltene 2,7 kb-Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase in Anwesenheit von 2 mM dNTPs in glatte Enden überführt. Dieses Fragment enthält das gesamte HIV-1-env-Gen in unmittelbarer 3'-Nachbarschaft zu den am meisten 3'-positionierten 21 bp (zur NruI-Restriktionsschnittstelle) des Vaccinia H6-Promotors. Dieses Fragment wurde an ein 3,1 kb-Fragment ligiert, das durch Spaltung von pRW838 mit NruI und EcoRI mit nachfolgender Überführung in glatte Enden mit Klenow erhalten wurde. Das von pRW838 stammende Fragment enthält die homologen Arme, die vom Kanarienvogel-Pockenvirus stammen, um das fremde Gen in den C5-Locus zu dirigieren. Es enthält auch die am weitesten 5'-gelegenen 100 bp des H6-Promotors. Deshalb resultierte die Ligierung dieser Fragmente in einem Inserierungs-Plasmid, das eine Expressionskassette für das HIV-1-env-Gen enthält, und wurde als pC5HIV3BE bezeichnet. Dieses Plasmid wurde für in vitro Rekombinations-Experimente mit ALVAC als Helfervirus verwendet, wobei vCP112 erzeugt wurde.
NYVAC-basierende Rekombinanten, die HIV-1 (IIIB)-gp120 exprimieren.
Das Plasmid pBSHIV3BEAII wurde mit EcoRI und XbaI gespalten, um ein 4,3 kb-Fragment freizusetzen. Dieses Fragment enthält den Vaccinia-Virus H6-Promotor, gekoppelt an das HIV-1-env-Gen, bis Nucleotid 6.946 (Ratner et al., 1985). Das 4,3 kb-Fragment wurde an ein 300 bp EcoRI/XbaI-gespaltenes, durch PCR-erhaltenes Fragment gekoppelt, das dem 3'-Bereich der codierenden gp120-Sequenz entspricht. Das 300 bp-PCR-Fragment wurde mit pHXB.2D (III) als Matrize unter Verwendung der Oligonucleotide HIV1-120A (SEQ ID NR: 43) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTATGGTTCAATTTTTACTACTTTTATATTATATATTTC-3') und HIV1-120B (SEQ ID NR: 44) (5'-CAATAATCTTTAAGCAAATCCTC-3') erhalten. Die Ligierung des 4,3 kb-XbaI/EcoRI-Fragments und des 300 bp-Xbal/EcoRI-Fragments ergab das Plasmid pBSHIVB120.
Ein 1,6 kb-KpnI/XbaI-Fragment wurde aus pBSHIVB120 erhalten, indem zunächst das Plasmid mit XbaI linearisiert wurde, gefolgt von einer partiellen KpnI-Spaltung. Das 1,6 kb-Fragment wurde durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase in Anwesenheit von 2 mM dNTPs in glatte Enden überführt. Dieses Fragment wurde in pSD541 eingefügt, das mit SmaI gespalten worden war, um pATIHIVB120 zu erhalten. Dieses Plasmid wurde bei in vitro-Rekombinations-Experimenten verwendet, um vP921 zu erzeugen. Diese Rekombinante enthält den Bereich des HIV-1-env-Gens, der gp120 codiert, in dem ATI-Locus von NYVAC.
Um die Echtheit der HIV-1-Genprodukte zu überprüfen, die von vP911, vP921 und vCP112 exprimiert werden, wurden Immunpräzipitationsanalysen durchgeführt.
Lysate, die aus den infizierten Zellen erhalten wurden, wurden auf HIV-1-env-Genexpression analysiert, wobei vereinigtes Serum von HIV-1-seropositiven Individuen verwendet wurde (erhalten von Dr. Genoveffa Franchini, NCI-NIH, Bethesda, MD). Das Serum wurde mit vP866-infizierten Vero-Zellen präadsorbiert. Das präadsorbierte menschliche Serum wurde in einer Übernacht-Inokulierung bei 4°C an Protein A-Sepharose gebunden. In einigen Fällen wurde ein monoclonales Antiserum, das spezifisch für gp120 ist (Dupont), als primäres Serum und ein Ratte-anti-Maus als sekundärer Antikörper verwendet. Nach dieser Inkubationsperiode wurde das Material viermal mit 1 × Puffer A gewaschen. Lysate, die mit normalem menschlichen Serum und Protein A-Sepharose geklärt worden waren, wurden dann über Nacht bei 4°C mit dem menschlichen Serum aus seropositiven Individuen, das an Protein A-Sepharose gebunden war, inkubiert. Im Anschluss an die Übernacht-Inkubationsperiode wurden die Proben viermal mit 1 × Puffer A und zweimal mit LiCl₂-/Harnstoff-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden durch die Zugabe von 2 × Laemmli-Puffer (125 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin; 10% 2-Mercaptorethanol) und 5 Minuten Kochen von den Immunkomplexen dissoziiert. Proteine wurden in einem 10% Dreyfuss-Gelsystem (Dreyfuss et al., 1984) fraktioniert, fixiert und mit 1 M Na-salicylat für die Fluorogaphie behandelt.
Die Ergebnisse der Immunpräzipitation unter Verwendung von Serum, das aus HIV-1-seropositiven Individuen vereinigt wurde, zeigten die spezifische Präzipitation der reifen gp120- und gp41-Formen des gp160-Hüll-Glycoproteins aus vP9ll-infizierten Zelllysaten. In Zelllysaten, die mit dem parentalen Virus infiziert wurden (NYVAC; vP866), können keine solchen spezifischen Genprodukte nachgewiesen werden. Die spezifische Präzipitation von gp120 wurde auch in vP921-infizierten Zelllysaten gefunden.
Die Immunfluoreszenz-Analyse mit den gleichen Seren veranschaulichte, dass die gp160- und gp120-Arten, die von vP911 bzw. vP921 exprimiert wurden, auf der Oberfläche infizierter Zellen vorlagen.
Die Immunpräzipitation wurde auch mit vCP112-infizierten CEF-Zellen durchgeführt. Keine HIV-spezifischen Polypeptide wurden aus Zellen, die mit dem parentalen ALVAC-Virus infiziert worden waren und aus nicht-infizierten CEF-Zellen, mit einem monoclonalen Antikörper präzipitiert, der gegen die extrazelluläre Domäne von gp120 gerichtet ist. Aus vCP112 infizierten Zellen wurden jedoch 2 HIV-spezifische Polypeptidarten präzipitiert. Diese Arten zeigten ein Laufverhalten mit offensichtlichen Mobilitäten von 160 kDa und 120 kDa, entsprechend dem Vorläufer-env-Genprodukt bzw. der reifen extrazellulären Form.
Ein rekombinantes Vaccinia-Virus, das HIV-gp120 exprimiert, löst primäre HIV-spezifische cytotoxische T-Lymphocyten-Aktivität aus.
Nachfolgend der iv-Verabreichung von 5 × 10⁷ PFU der Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP878, vP911 oder vP921 oder als eine Kontrolle von NYVAC, dem Vektor, wurde CTL-Aktivität in der Milz von BALB/c-Mäusen gegenüber syngenen P815-Zellen bewertet, die über Nacht mit dem Peptid HBX2 inkubiert worden waren (Tabelle 1). Eine schwache, jedoch signifikante (P<0,05) primäre CTL-Aktivität wurde in den Milzen der Mäuse erzeugt, denen vP921 verabreicht wurde, das HIV-gp120 exprimiert. Kein anderes rekombinantes Vaccinia-Virus und auch nicht der Vektor waren in der Lage, eine primäre HIV-spezifische CTL-Aktivität auszulösen. Dies beruhte nicht auf einer nicht angemessenen Infektion, da jede Gruppe von Mäusen, denen ein Vaccinia-Virus verabreicht wurde, mit einer primären Vaccinia-spezifischen CTL-Aktivität antwortete. Nicht immunisierte Kontrollmäuse antworteten auf keines der Ziele.
Rekombinante Pockenviren, die HIV-env-Peptide exprimieren, erzeugen HIV-spezifische cytotoxische Gedächtnis-T-Lymphocyten
Mindestens einen Monat nach einer einzelnen Inokulierung mit einem der rekombinanten Vaccinia-Viren wurden Milzzellen der Maus in vitro mit syngenen, unbehandelten Milzzellen stimuliert, die zuvor mit NYVAC oder mit jedem der HIV-rekombinanten Vaccinia-Viren infiziert worden waren (Tabelle 2). Eine starke HIV-spezifische CTL-Aktivität wurde ausschließlich in den Milzzell-Kulturen von Mäusen nachgewiesen, die mit vP878, vP911 und vP921 immunisiert worden waren, die in vitro durch Zellen erneut stimuliert wurden, die mit einem der gleichen Vaccinia-Virus-HIV-Rekombinanten (vP878, vP911 oder vP921) infiziert worden waren. Die Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die HIV-gp120 oder – gp160 exprimierten, waren besser dazu in der Lage, Gedächtnis-CTLs zu erzeugen, als die Vaccinia-Virus-Rekombinante, die ausschließlich die V3-Schleife fusioniert mit dem 88-Epitop exprimiert. Keine HIV-spezifische Gedächtnis-CTL-Aktivität konnte durch nicht-immunisierte Kontroll- oder NYVAC-immunisierte Milz-Zellen ausgelöst werden. Das Fehlen HIV-spezifischer CTL-Aktivität bei Vektor-immunisierten Mäusen konnte nicht einer schwachen Immunisierung zugeschrieben werden, da nach in vitro-Stimulation mit Milzzellen, die mit irgendeinem der verwendeten Vaccinia-Viren infiziert worden waren, Vaccinia-spezifische Gedächtnis-CTL-Aktivität vorlag.
In einer ähnlichen Studie wurde die Fähigkeit einer Kanarienvogel-Pockenvirus-Rekombinante, die die V3-Schleifen-Region fusioniert an das 88-Epitop (vCP95) exprimiert, überprüft, HIV-spezifische Gedächtnis-CTLs zu erzeugen (Tabelle 3). Drei Wochen nachfolgend einer einzelnen Inokulierung von 10⁸ PFU von vCP95 oder des Kanarienvogel- Pockenvirus-Vektors, CPpp, wurden HIV-spezifische Gedächtnis-CTL-Antworten mit denjenigen verglichen, die durch das rekombinante Vaccinia-Virus-Analog vP878 ausgelöst wurden. Vaccinia- und Kanarienvogel-Pockenvirus-CTL-Antworten wurden als Kontrollen für eine angemessene Immunisierung einbezogen. Ausschließlich Milzzellen aus vP878- und vCP95-immunisierten Mäusen produzierten HIV-spezifische Gedächtnis-CTL-Aktivität, die durch vP878 stimuliert werden konnte. Die Unfähigkeit von vCP95, vorliegende Gedächtnis-CTLs zu funktionellen cytolytischen CTLs zu stimulieren, kann mit den verwendeten in vitro-Bedingungen in Bezug gesetzt werden, die auf der Grundlage der Verwendung von Vaccinia-Virus-Rekombinanten maximiert wurden. Trotzdem war vCP95 vollständig dazu in der Lage, signifikant HIV-spezifische Gedächtnis-CTLs in den Milzen der immunisierten Mäuse zu erzeugen.
Charakterisierung der in vitro-stimulierten cytotoxischen Zellen
Es ist absehbar, dass die Zellen, die Cytotoxizität gegen die HIV-Peptid-gepulsten Zielzellen vermitteln, eine Population unspezifischer Effektor-Zellen repräsentieren, die nicht mit CTLs verwandt sind, wie natürliche Killerzellen. Um dies zu testen, wurden den Milzzellen von Mäusen, die mit vP921 immunisiert und in vitro mit vP921-infizierten Milzzellen erneut stimuliert worden waren, T-Lymphocyten entzogen, die Oberflächen-Antigene tragen, die charakteristisch sind für T-Helfer-Lymphocyten (CD4) oder für cytotoxische T-Lymphocyten (CD8), und gegen V3-Schleifen-Peptid-gepulste Zielzellen getestet (Tabelle 4). Wie zuvor, erzeugten nur vP921-immunisierte Mäuse Gedächtnis-HIV-spezifische CTL-Aktivität, die in vitro mit vP921 infizierten syngenen Milzzellen stimuliert werden konnte. Obwohl die Komplement-Präparation (C') und monoclonaler anti-CD4 und anti-C8 einige toxische Wirkungen produzierten, waren ausschließlich bei Kulturen, bei denen CD8-tragende Zellen (anti-CD8 + C') vermindert waren, auch HIV-spezifische cytotoxische Effektor-Zellen vermindert. Somit besaßen die Zellen, die eine cytolytische Aktivität gegen die HIV-Peptidgepulsten Zielzellen vermitteln, CD8-Antigene auf ihren Zellmembranen, ein Merkmal von MHC-Klasse I eingeschränkten CTLs.
Die Spezifität der CTL-Antigen-Rezeptor-Erkennung der V3-Schleifen-Region von HIV-gp120
T-Lymphocyten-Antigen-Rezeptoren sind ausnehmend sensitiv für kleine Veränderungen in der primären Aminosäuresequenz des Epitop-Fragments. Die V3-Schleifen-Region von HIV-gp120 ist hypervariabel und unterscheidet sich immunologisch unter den HIV-Isolaten. Die Hypervariabilität beruht auf Substitutionen und Additionen von nur einigen wenigen Aminosäuren. Um die Spezifität von cytotoxischen Zellen zu testen, die durch HIV-Vaccinia-Virus-Rekombinanten erzeugt wurde, wurde die Suszeptibilität für CTL-Aktivität von P815-Zielzellen verglichen, die mit den der V3-Schleifen-Region entsprechenden Peptiden der HIV-Isolate III_B, SF2 und MN gepulst worden waren. Ausschließlich die Immunisierung mit vP911 und vP921 induzierte HIV-spezifische primäre CTL-Aktivität (Tabelle 5). Darüber hinaus beschränkte sich die HIV-spezifische CTL-Aktivität ausschließlich auf P815-Zielzellen, die mit dem Peptid gepulst wurden, das der V3-Schleife von HIV-Isolat III_B entspricht. Ähnliche Ergebnisse wurden mit in vitro-stimulierter, HIV-spezifischer sekundärer CTL-Aktivität erhalten, die durch Immunisierung mit den Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP878, vP911 und vP921 induziert wurde (Tabelle 6). Somit erkennen HIV-spezifische CTLs, hervorgerufen durch rekombinante Vaccinia-Viren, die verschiedene Portionen des env-Gens des HIV-Isolates III_B erkennen, ausschließlich Ziel-Epitope, die von dem gleichen antigenen Isolat abstammen.
Lymphocyten-Proliferations-Antworten auf HIV-Epitope, nachfolgend der Immunisierung mit Vaccinia-Virus-HIV-Rekombinanten
Lymphocyten-Proliferation auf Antigene ist ein in vitro-Korrelat der zellvermittelten Immunität. Die Präsentation des geeigneten Antigens induziert zelluläre Proliferation in der Immunpopulation von Zellen, die Rezeptoren für das Antigen exprimieren. Die Initiierung und Fortführung von Proliferation erfordert die Beteiligung von T-Helfer-Lymphocyten mit Hilfe von löslichen Mediatoren. Um die zellvermittelte Immunität auf HIV-Antigene in Mäusen zu bewerten, die mit rekobminanten Vaccinia-Viren immunisiert worden waren, die HIV-Antigene exprimieren, wurden Milzzellen von Mäusen, die 27 Tage zuvor immunisiert worden waren, 5 Tage lang mit Peptiden inkubiert wurden, die den T-Helfer-Lymphocyt-Epitopen der Bezeichnung T₁ und T₂ entsprechen, sowie mit gereinigtem HIV-gp160 (Tabelle 7). Keine proliferativen Antworten auf die T-Helferzell-Epitope T₁ und T₂ wurden in irgendeiner der Milzzell-Kulturen beobachtet. Die Milzzellen von Mäusen, die zuvor mit vP921 immunisiert worden waren, reagierten jedoch heftig auf HIV-gp160, was durch den Einbau von [³H]-Thymidin bestimmt wurde. Ein Stimulationsindex (SI) von >2,0 wird als Indikativ für Immunität angesehen. Somit löste die Inokulierung von Mäusen mit vP921 eine zellvermittelte Immunität gegen HIV-gp160 aus.
Antikörper-Antworten von Mäusen, die mit Vaccinia-Virus-HIV-Rekombinanten inokuliert worden waren
Um die humoralen Antworten auf HIV zu bewerten, wurden Mäuse am Tag 0 mit einer der Vaccinia-Virus-HIV-Rekombinanten immunisiert und erhielten eine zweite Immunisierung nach 5 Wochen. Den Mäusen wurde in verschiedenen Intervallen bis 9 Wochen nach der initialen Immunisierung But entnommen. Vereinigte Seren aus jeder Behandlungsgruppe wurden durch ELISA auf Antikörper gegen HIV getestet, wobei gereinigtes gp160 als Antigen verwendet wurde (Tabelle 8). Primäre Antikörper-Antworten waren im Allgemeinen gering, aber nachweisbar, wobei die höchsten Spiegel durch vP911 induziert wurden. Nach der zweiten Immunisierung stiegen die Antikörper-Titer von Mäusen, die mit vP911 und vP921 immunisiert worden waren, an und erreichten einen Gipfel nach 7 Wochen mit Titern von über 4.600 bzw. 3.200, bevor diese nach 9 Wochen leicht abnahmen. Somit waren zwei Vaccinia-Virus-HIV-Rekombinanten, vP911 und vP921, in der Lage, eine signifikante Antikörper-Antwort zu induzieren.
Tabelle 1. Primäre CTL-Aktivität von Milzzellen aus Mäusen, die mit Vaccinia-Virus-Rekombinanten immunisiert worden waren, gegen Vaccinia-Virus infizierte Ziele und gegen Ziele, die mit dem Peptid, das der V3-Schleifen-Region von HIV-1-gp120 entspricht, gepulst worden waren.
Tabelle 2 Sekundäre CTL-Aktivität von Milzzellen, nachfolgend der in vitro-Stimulation mit Vaccinia-Virus-Rekombinanten
Tabelle 3. Anamnestische CTL-Antworten der Milzzellen von Mäusen, denen eine einzige Inokulierung von rekombinantem Vaccinia- oder Kanarienvogel-Pockenvirus verabreicht wurde, die die V3-Schleife von HIV-gp120 exprimieren.
Tabelle 4. Verringerung cytotoxischer Aktivität mit monoclonalen Antikörpern gegen CD8 plus Komplement
Tabelle 5. Spezifität der primären CTL-Aktivität für die V3-Schleife des HIV-1-Isolates III_B, gefolgt von einer einzelnen Inokulierung mit HIV-rekombinanten Vaccinia-Viren
Mäusen wurde eine einzelne iv-Inokulierung der angegebenen Vaccinia-Virus-Rekombinanten verabreicht, und 7 Tage später wurden sie auf CTL-Aktivität gegen P815-Ziele und P815-Ziele getestet, die mit einem von drei Peptiden gepulst worden waren, die der V3-Schleifen-Region der HIV-1-Isolate III_B, SF2 und MN entsprechen. Es sind nur die 100 : 1-Daten gezeigt, obwohl bei Effektor zu Zielzell-Verhältnissen von 100 : 1, 50 : 1 und 25 : 1 getestet wurde.
* P<0,05 vs entsprechende Kontrollen, Student-t-Test.
Tabelle 6. Spezifität der sekundären CTL-Aktivität für die V3-Schleife des HIV-1-Isolates III_B, nachfolgend einer einzelnen Inokulierung mit HIV-rekombinanten Vaccinia-Viren.
Beispiel 3 Expression des HIV-1 (ARV-2- oder SF-2-Stamm)-env-Gans in ALVAC-, TROVAC- und NYVAC-Vektoren Plasmid-Konstruktionen
Der Lambda-Clon, der das gesamte HIV-1 (ARV-2- oder SF-2-Stamm)-Genom enthält, wurde von J. Levy bereitgestellt und wurde zuvor beschrieben (Sanchez-Pescador et al., 1985). Die env-Sequenzen wurden in pUC13 subcloniert, wobei das Plasmid pMP7MX373 erzeugt wurde, das die Sequenzen von –1 bezüglich des Initiationscodons (ATG) des env-Genprodukts bis 715 bp stromabwärts des Terminationscodons (TAA) des env-Gens enthält. Diese env-Sequenzen wurden aus pMP7MX373 durch Spaltung mit EcoRI und HindIII ausgeschnitten und in den Plasmidvektor pIBI25 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) eingefügt, wobei das Plasmid pIBI25env erzeugt wurde.
Das rekombinante Plasmid pIBI25env wurde verwendet, um kompetente E. coli CJ236 (dut- ung-)-Zellen zu transformieren. Von Phagen, die aus der Infektion der transformierten E. coli CJ236-Zellen mit dem Helferphagen MG408 stammen, wurde einzelsträngige DNA isoliert. Diese einzelsträngige Matrize wurde in in vitro-Mutagenese-Reaktionen (Kunkel et al., 1985) mit dem Oligonucleotid MUENVTI2 (SEQ ID NR: 45) (5'-AGAGGGGAATTCTTCTACTGCAATACA-3') verwendet. Mutagenese mit diesem Oligonucleotid erzeugt eine T nach C-Transition und zerstört das T5CT-Motiv an Nucleotidposition 6.929–6.935 des ARV-2-Genoms (Sanchez-Pescador et al., 1985). Diese Mutation verändert nicht die Aminosäuresequenz des env-Gens und erzeugt eine EcoRI-Schnittstelle, die verwendet wurde, um nach mutierten Plasmid-Clonen zu durchmustern. Die Bestätigung der Sequenz wurde durch das Didesoxynucleotid-Kettenterminierungsverfahren durchgeführt (Sanger et al., 1977). Das resultierende mutierte Plasmid wurde als pIBI25mutenv11 bezeichnet.
Aus pIBI25mutenv11 wurde ein 1,45 kb BglII-Fragment hergestellt. Dieses Fragment enthielt die mutierten env-Sequenzen. Es wurde verwendet, um das entsprechende nichtmutierte Fragment in pIBI25env zu substituieren. Das resultierende Plasmid wurde als pIBI25mutenv8 bezeichnet. Mit pIBI25mutenv8 wurden weitere Modifikationen durchgeführt. In vitro-Mutagenese wurde durchgeführt, um die Sequenz, die das rex-Protein codiert und die LTR-Sequenz (LTR-Region) vom 3'-Ende des Gens zu entfernen und um die vermeintlichen Aminosäuren 583–599 der immunsupprimierenden (IS)-Region (SEQ ID NR: 46: Leu-Gln-Ala-Arg-Val-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Arg-Asp-Gln-Gln-Leu) zu deletieren (Klasse et al., 1988). Diese Reaktionen wurden mit der einzelsträngigen Matrize, die von pIBI25mutenv8 abstammt, mit den Oligonucleotiden LTR2 (SEQ ID NR: 47) (5'-TTGGAAAGGCTTTTGGCATGCCACGCGTC-3') und MUENSVISR (SEQ ID NR: 48) (5'-ACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTAGGGATTT GGGGTTGCTCT-3') durchgeführt. Mutierte Clone wurden durch Hybridisierung und Restriktionsanalyse identifiziert. Ein Clon, so mutiert, dass sowohl die IS- als auch die LTR-Region deletiert waren, und ein anderer, bei dem die LTR-Region deletiert war, wurden durch Nucleotid-Sequenzanalyse überprüft und mit pIBI25mut3env40 bzw. pIBI25mut2env22 bezeichnet.
Ein 3,4 kb-SmaI/HindIII-Fragment, das das gesamte env-Gen enthielt, wurde von pIBI25mut3env40 und von pIBI25mut2env22 erhalten und in pCPCV1 und pFPCV2 eingefügt, die zuvor mit SmaI/HindIII gespalten worden waren. Das Plasmid pCPCV1 ist ein Inserierungs-Plasmid, das die Erzeugung von ALVAC-Rekombinanten ermöglicht, wobei die Inserierung im C3-Locus auftritt. Das Plasmid pFPCV2 ist ein Inserierungs-Plasmid, das die Erzeugung von TROVAC-Rekombinanten ermöglicht, wobei die Inserierung in dem F7-Locus erfolgt. Die Plasmide pCPCV1 und pFPCV2 wurden zuvor in der internationalen PCT-Veröffentlichung Nr. WO89/03429 beschrieben, die am 20. April 1989 veröffentlicht wurde.
Das Oligonucleotid PCRVECNS (SEQ ID NR: 49) (5'-CCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAAGTGAAGGGGACCAGG-3') wurde für in vitro-Mutagenese-Reaktionen gemäß dem Verfahren von Mandecki (1986) verwendet, um eine genaue ATG : ATG-Konstruktion mit dem VVH6-Promotor und den env-Sequenzen herzustellen. Potentielle Mutanten wurden auf Verlust der SmaI-Schnittstelle durchmustert. Plasmid-Clone ohne eine Smal-Schnittstelle wurden identifiziert und durch Nucleotid-Sequenzanalyse kontrolliert. Richtig mutierte Plasmid-Clone wurden identifiziert und mit pCPenvIS+ oder pCPenvIS- und pFPenvIS+ oder pFPenvIS bezeichnet.
Die HIV-1 env-Gene wurden aus pCPenvIS durch Spaltung mit NruI und HindIII ausgeschnitten. Die zwei env-Fragmente von 2,5 kb (envIS+) bzw. 2,4 kb (envSI–) wurden isoliert und durch Umsetzung mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase in Anwesenheit von 2 mM dNTPs in glatte Enden überführt. Diese Fragmente wurden mit dem 3,5 kb-Fragment ligiert, das durch Spaltung von pSIVenvVV mit NruI und PstI, mit einem nachfolgenden Schritt zur Herstellung glatter Enden mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase in Anwesenheit von 2 mM dNTPs, erhalten wurde. Das Plasmid pSIVenvVV enthält die SIV-env-Gen-Expressionskassette, reguliert durch den Vaccinia-Virus-H6-Promotor im ATI-Inserierungslocus. Spaltung von pSIVenvVV mit NruI und PstI schneidet die gesamten SIV-env-codierenden Sequenzen und die am weitesten 3'-gelegenen 20 bp des Promotorelements heraus. Ligierung an die env-IS– und env-IS+ -Fragmente führt zur Wiederherstellung der 20 bp des H6-Promotors und inseriert das HIV-1-env-Gen in das ATI-Inserierungs-Plasmid. Die resultierenden Plasmide wurden als pAR5W+ bzw. pAR6W– für env-IS+ bzw. env-IS– bezeichnet.
In vitro-Rekombination und Reinigung der Rekombinanten
Die Rekombination wurde durchgeführt, indem sowohl für ALVAC- als auch für TROVAC-Rekombinanten Plasmid-DNA durch Calciumphosphat-Präzipitation wie früher beschrieben (Piccini et al., 1987) in infizierte Zellen eingebracht wurde. Die Plasmide pCPenvIS+ und pCPenvIS- wurden verwendet, um die Rekombinanten vCP61 bzw. vCP60 herzustellen. Die Plasmide pFPenvIS+ und pFPenvIS– für die Rekombinanten vFP63 bzw. vFP62. Die Plasmide pAR5W+ und pAR6VV– wurden in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit vP866 als Helfervirus verwendet, wobei vP939 bzw. vP940 erhalten wurden. Rekombinante Plaques wurden nach Hybridisierung mit einer ³²P-markierten env-spezifischen Sonde durch Autoradiographie ausgewählt und dreimal in Serie einer Passage unterworfen, wie zuvor beschrieben (Piccini et al., 1987), um Reinheit zu gewähren.
Expression des HIV-1-env-Gens
Sechs verschiedene rekombinante Viren wurden hergestellt, wobei das HIV-env-Gen des ARV-2- oder SF-2-Stammes stromabwärts von einem frühen-späten Vaccinia-Promotor, H6, eingefügt wurde. Zur Vereinfachung werden die beiden ALVAC-basierten rekombinanten Viren, vCP61 und vCP60, als CPIS+ und CPIS– bezeichnet, die beiden TROVAC-basierten Rekombinanten, vFP63 und vFP62, als FPIS+ und FPIS– und die zwei NYVAC-basierten Rekombinanten, vP939 und vP940, als VV– bzw. VV+.
Alle Konstrukte waren präzise, insofern, dass das ATG-Initiationscodon des HIV-1-env-Gens dem ATG des Vaccinia-H6-Promotors überlagert war. Darüber hinaus wurde sämtliche nicht relevante genetische Information 3' des Terminations-Codons eliminiert. CPIS–, FPIS– und W– wurden alle durch Deletion einer 51 bp-Region erhalten, die den Aminosäuren 583–599 entspricht, die nahe dem 5'-Bereich des gp41-Genprodukts lokalisiert sind. Diese Region hat Homologie mit den vermeintlichen immunsupprimierenden Bereichen (Klasse et al., 1988; Ruegg et al., 1989a, b), die in dem Transmembran-Polypeptid von anderen Retrovirus-Glycoproteinen auftreten (Cianciolo et al., 1985; Ruegg et al., 1989a, b).
In CEF-, Vero- und MRC-5-Zelleinzelschichten wurden mit allen 6 rekombinanten Viren Expressionsanalysen durchgeführt. Wie vorstehend beschrieben, wurden Radioimmun-Präzipitationsexperimente durchgeführt, wobei vereinigte Seren von HIV-seropositiven Individuen verwendet wurden. Alle sechs Rekombinanten steuerten die Synthese des HIV-1-gp160-Hüllprotein-Vorläufers. Die Effektivität, gp160 zu gp120 und gp41 zu prozessieren, variierte jedoch zwischen den Zelltypen und wurde auch durch die Deletion der immunsupprimierenden Region beeinflusst. Die Erkennung von gp41 durch die vereinigten Seren von HIV-seropositiven Individuen variierte ebenfalls zwischen dem Virus-Hintergrund und dem Zelltyp.
Beispiel 4 Expression des HIV-2 (ISSY-Stamm)-env-Gans in NYVAC
Expression von gp160
Die Oligonucleotide HIV25PA (SEQ ID NR: 50) (5'-ATGAGTGGTAAAATTCAGCTGCTTGTTGCCTTTCTGCTAACTAGTGCTTGCTTA-3') und HIV25PB (SEQ ID NR: 51) (5'-TAAGCAAGCACTAGTTAGCAGAAAGGCAAC AAGCAGCTGAATTTTACCACTCAT-3') wurden aneliert, um die initialen 54 bp der env-codierenden Sequenz des HIV-2-ISSY-Stammes (Franchini et al., 1989) zu erzeugen. Dieses Fragment wurde am 3'-Ende an ein 129 bp-Fragment fusioniert, das durch PCR mit den Oligonucleotiden H65PH (SEQ ID NR: 52) (5'-ATCATCAAGCTTGATTCTTTATTCTATAC-3') und H63PHIV2 (SEQ ID NR: 53) (5'-CAGCTGAATTTTACCACTCATTACGATACAAACTTAACG-3') erhalten wurde, wobei pTP15 (Guo et al., 1989) als Matrize verwendet wurde. Die Fusion dieser beiden Fragmente wurde mit Hilfe von PCR durchgeführt, wobei die Oligonucleotide HIV25PC (SEQ ID NR: 54) (5'-TAAGCAAGCACTAGTTAG-3') und H65PH (SEQ ID NR: 52) verwendet wurden. Das erhaltene 174 bp-PCR-Fragment wurde mit HindIII und SacI gespalten und in pBS-Sk (Stratagene, La Jolla, CA) eingefügt, das mit HindIII und SacI gespalten worden war. Das resultierende Fragment wurde als pBSH6HIV2 bezeichnet. Die Inserierung wurde durch Nucleotid-Sequenzanalyse überprüft.
Der 3'-Bereich des HIV-2-env-Gens wurde ebenfalls durch PCR erhalten. In dieser Reaktion wurde ein 270 bp-Fragment mit den Oligonucleotiden HIV2B1 (SEQ ID NR: 55) (5'-CCGCCTCTTGACCAGAC-3') und HIV2B2 (SEQ ID NR: 56) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTACAGGAGGGCAATTTCTG-3') amplifiziert, wobei pISSY-KPN (bereitgestell von Dr. Genoveffa Franchini, NCI-NIH, Bethesda, MD) als Matrize verwendet wurde. Dieses Fragment wurde mit BamHI und XbaI gespalten. Das 150 bp-Fragment, das aus dieser Spaltung erhalten wurde, enthielt ein 5'-BamHI- und ein 3'-XbaI-kohäsives Ende. Das Fragment wurde gentechnisch verändert, um ein T5NT-Sequenzmotiv zu erhalten, von dem bekannt ist, dass es als frühes Transkriptions-Terminationssignal des Vaccinia-Virus erkannt wird (Yuen et al., 1987), gefolgt von dem Terminationscodon (TAA).
Die Mehrheit des HIV-2-env-Gens wurde aus pISSY-KPN durch Spaltung mit SacI und BamHI erhalten. Das 2,7 kb-Fragment, das durch diese Spaltung erzeugt wurde, wurde mit dem 150 bp-BamHI/XbaI-Fragment, das dem 3'-Ende des Gens entspricht, in pBS-SK, das zuvor mit SacI und XbaI gespalten worden war, gemeinsam eingefügt. Das resultierende Plasmid wurde als pBSHIV2ENV bezeichnet.
Das 174 bp-SpeI/HindIII-Fragment aus pBSH6HIV2 und das 2,5 kb-SpeI/XbaI-Fragment aus pBSHIV2ENV wurden in pBS-SK ligiert, das mit HindIII und XbaI gespalten worden war, wobei pBSH6HIV2ENV erhalten wurde. Die 2,7 kb-HindIII/XbaI-Inserierung aus pBSH6HIV2ENV wurde isoliert und mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase in Anwesenheit von 2 mM dNTP in glatte Enden überführt. Das Fragment mit glatten Enden wurde in einen pSD541VC-Inserierungs-Vektor eingefügt, der mit SmaI gespalten worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pATIHIV2ENV bezeichnet. Dieses Plasmid wurde für in vitro-Rekombinations-Experimente mit vP866 (NYVAC) als Helfervirus verwendet, wobei vP920 erhalten wurde.
Um zu bestimmen, ob vP920 authentisches HIV-2-gp160 exprimiert, wurden Immunpräzipitationsanalysen durchgeführt.
Lysate von den infizierten Zellen wurden auf HIV-2-env-Genexpression analysiert, wobei vereinigtes Serum aus HIV-2-seropositiven Individuen (erhalten von Dr. Genoveffa Franchini, NCI-NIH, Bethesda, MD) verwendet wurde. Die Seren wurden mit vP866-infizierten Vero-Zellen präadsorbiert. Die präadsorbierten menschlichen Seren wurden in einer Übernacht-Inkubation bei 4°C an Protein A-Sepharose gebunden. Nach dieser Inkubationsperiode wurde das Material 4 × mit 1 × Puffer A gewaschen. Die Lysate, die mit normalen menschlichen Seren und Protein A-Sepharose geklärt worden waren, wurden dann über Nacht bei 4°C mit den menschlichen Seren von seropositiven Individuen inkubiert, die an Protein A-Sepharose gebunden waren. Nach der Übernacht-Inkubationsperiode wurden die Proben 4 × mit 1 × Puffer A und 2 × mit einem LiCl₂/Harnstoff-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden durch die Zugabe von 2 × Laemmli-Puffer (125 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol) und 5 Minuten Kochen von den Immunkomplexen dissoziiert. Die Proteine wurden in einem 10% Dreyfuss-Gelsystem (Dreyfuss et al., 1984) fraktioniert, fixiert und mit 1 M Na-Salicylat für die Fluorographie behandelt.
Menschliche Seren von HIV-2-seropositiven Individuen präzipitierten spezifisch das HIV-2-gp160-Hüll- Glycoprotein aus vP920-infizierten Zellen. Darüber hinaus wurde die Authentizität des exprimierten HIV-2-env-Genprodukts bestätigt, da das gp160-Polyprotein in die reifen gp120- und gp41-Proteinarten prozessiert wird. Aus scheininfizierten Zellen oder Zellen, die mit dem parentalen Virus vP866 infiziert worden waren, wurden keine HIV-spezifischen Proteinarten präzipitiert. Die richtige Expression des HIV-2-env durch vP920 wurde ebenfalls durch die Beobachtung gestützt, dass das Genprodukt in einem Immunfluoreszenz-Test an der Oberfläche von vP920-infizierten Zellen exprimiert wird.
Expression von gp120
Das Plasmid pBSH6HIV2, das den Vaccinia-Virus-H6-Promotor, fusioniert an das 5'-Ende des HIV-2-env-Gens enthält, wurde mit SpeI und HindIII gespalten, um das 180 bp-Fragment freizusetzen, das diese Sequenzen enthält. Dieses Fragment wurde gemeinsam mit dem 1,4 kb-SpeI/XbaI-Fragment von pBSHIV2120A in pBS-SK ligiert, das mit HindIII und XbaI gespalten worden war, wobei pBSHIV2120B erhalten wurde.
Das Plasmid pBSHIV2120A wurde erhalten, indem initial der 3'-Bereich der gp120-codierenden Sequenz durch PCR erhalten wurde. Die PCR wurde unter Verwendung der Oligonucleotide HIV2120A (SEQ ID NR: 57) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTATCTCTTATGTCTCCCTGG-3') und HIV2120B (SEQ ID NR: 58) (5'-AATTAACTTTACAGCACC-3') mit pISSY-KPN als Matrize durchgeführt. Das mit PCR erhaltene Fragment wurde mit EcoRI und XbaI gespalten, wobei ein 300 bp-Fragment erhalten wurde, das ein 5'-EcoRI-kohäsives Ende und ein 3'-XbaI-kohäsives Ende enthält. Das Fragment wurde gentechnisch mit einer Translations-Terminationssequenz (TAA) und einem T5NT-Sequenzmotiv unmittelbar 5' der XbaI-Stelle verändert. Das 300 bp-XbaI/EcoRI-PCR-Fragment wurde gemeinsam mit einem 1,4 kb-SacI/EcoRI-Fragment, das aus pISSY-KPN stammt, in pBS-SK ligiert, das mit SacI/XbaI gespalten worden war, wobei pBSHIV2120A erzeugt wurde.
Das Plasmid pBSHIV2120B wurde mit HindIII und XbaI gespalten, um ein 1,8 kb-Fragment zu erzeugen, das die codierende HIV-2-gp120-Sequenz in unmittelbarer 3'-Nachbarschaft zu dem Vaccinia-Virus-H6-Promotor enthält. Dieses Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase in Anwesenheit von 2 mM dNTPs in glatte Enden überführt. Das Fragment mit glatten Enden wurde in pSD541VC ligiert, das mit SmaI gespalten worden war, wobei pATIHIV2120 erzeugt wurde. Dieses Plasmid wurde für in vitro-Rekombiantionsexperimente verwendet, wobei vP922 erhalten wurde.
Zur Expression des vollständigen HIV-2-env-Gens wurden, wie vorstehend beschrieben, Immunpräzipitationsexperimente mit vP922-infizierten Zellen durchgeführt. Aus scheininfizierten oder vP866-infizierten Vero-Zellen wurden keine HIV-spezifischen Arten präzipitiert. Aus Lysaten, die aus Zellen stammten, die mit vP922 infiziert worden waren, wurde jedoch eine Proteinart von 120 kDa präzipitiert.
Beispiel 5 - Expression von SIV-Genen in NYVAC Erzeugung der NYVAC/SIV-gp140-Rekombinante
Ein Plasmid pSS11E, das das SIV (_mac142) -env-Gen enthält, wurde von Dr. Genoveffa Franchini (NCI-NIH, Bethesda, MD) erhalten. Dieses Plasmid wurde mit HindIII und PstI gespalten, wobei ein 2,2 kb-Fragment freigesetzt wurde, das die Nucleotide 220 des SIV-env-Gens bis zu einer Region 160 bp stromabwärts des Translations-Terminations-Codons enthält. Es sollte angemerkt werden, dass eine Expressionskassette, die dieses Fragment enthält, in der Expression einer gp140-Proteinart anstelle einer gp160-Art resultiert. Diese Deletion von 40% der Transmembran-Region resultiert aus einer verfrühten Termination an Nucleotid 7.934 des Genoms (Franchini et al., 1987). Solche verfrühte Terminationen des env-Genprodukts sind nach Propagierung von SIV in Kultur berichtet worden (Kodama et al., 1989).
Der Aminosäure-codierende Bereich des Gens wurde mit PCR erhalten, wobei pSS11E als Matrize und die Oligonucleotide SIVENV1 (SEQ ID NR: 59) (5'-CGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGATGTCTTGGGAATC-3') und SIVENV2 (SEQ ID NR: 60) (5'-CAAGGCTTTATTGAGGTCTC-3') verwendet wurden. Das resultierende 250 bp-Fragment enthält die am weitesten 5'-gelegenen 230 bp des SIV-env-Gens in unmittelbarer Stromabwärtsnachbarschaft der am meisten 3'-gelegenen 20 bp des Vaccinia-Virus H6-Promotors (3'-Ende der NruI-Stelle). Durch Spaltung des Fragments mit HindIII, die 80 bp der SIV-env-Sequenzen entfernt, wurde ein 170 bp-Fragment erhalten.
Die Sequenzen, die den Rest des SIV-env-Gens enthielten, gefolgt von dem verfrühten Terminationssignal, wurden durch PCR aus pSS35E (erhalten von Dr. Genoveffa Franchini) erhalten. Dieses Plasmid enthält Sequenzen, die den C-terminalen Bereich des SIV-env-Gens in der LTR-Region stromabwärts des env-Gens enthalten. Die Oligonucleotide, die verwendet wurden, um das 360 bp-Fragment zu erhalten, waren SIVENV3 (SEQ ID NR: 61) (5'-CCTGGCCTTGGCAGATAG-3') und SIVENV4A (SEQ ID NR: 62) (5'-ATCATCGAATTCAAAAATATTACAAAGAGCGTG AGCTCAAGTCCTTGCCTAATCCTCC-3'). Dieses Fragment wurde mit PstI und EcoRI gespalten, wobei ein 260 bp-Fragment erzeugt wurde, das ein 5'-PstI-kohäsives Ende und ein 3'-EcoRI-kohäsives Ende besitzt.
Das 2,2 kb-HindIII/PstI-Fragment aus pSS11E, das 170 bp-NruI/HindIII-Fragment, das das 5'-Ende des Gens enthält, und das 260 bp-PstI/EcoRI-Fragment, das das 3'-Ende des Gens enthält, wurden mit einem 3,1 kb NruI/EcoRI-Fragment ligiert, das aus pRW838 stammt. pRW838 enthält den Vaccinia-Virus H6-Promotor, gekoppelt an das Tollwut-G-Gen, flankiert durch Kanarienvogel-Pockenvirus-Sequenzen, die die Inserierung von Genen in den C5-Locus ermöglichen. Spaltung mit NruI und EcoRI setzt das Tollwut-G-Gen frei und entfernt die am weitesten 3'-gelegenen 20 bp des H6-Promotors. Das resultierende C5-Inserierungs-Plasmid, das das SIV-env-Gen, gekoppelt an den Vaccinia-H6-Promotor, enthält, wurde als pC5SIVENV bezeichnet.
Das Plasmid pC5SIVENV wurde mit HindIII und EcoRI gespalten, wobei ein 2,2 kb-Fragment freigesetzt wurde, das die Sequenz von Nucleotid 150 des SIV-env-Gens bis zum Ende des gesamten Gens enthält. PCR wurde verwendet, um mit den Oligonucleotiden MPSYN286 (SEQ ID NR: 63) (5'-CCCCCCAAGCTTTTTTATTCTATACTT-3') und SIVENV2 (SEQ ID NR: 64) (5'-CAAGGCTTTATTGAGGTCTC-3') die Vaccinia-H6-Promotor/SIV-env-Verknüpfung aus pC5SIVENV zu erhalten. Das 320 bp-Fragment wurde mit HindIII gespalten, wobei ein 240 bp-Fragment erhalten wurde. Das 2,2 kb-HindIII/EcoRI- und das 240 bp-HindIII-Fragment wurden in pC3I co-ligiert, das mit HindIII und EcoRI gespalten worden war. Das resultierende Plasmid, das das HindIII-Fragment in der richtigen Orientierung relativ zu der SIV-env-codierenden Sequenz enthält, wurde als pC3SIVEM bezeichnet. Das Plasmid pC3I wurde wie folgt erhalten. Die Nucleotid-Sequenzanalyse eines genomischen 2,5 kb-BglII-Kanarienvogel-Pockenvirus-Fragments ergab den gesamten offenen C3-Leserahmen und die flankierenden 5'- und 3'-Regionen. Um ein Spender-Plasmid zur Inserierung fremder Gene in den C3-Locus mit der vollständigen Heraustrennung des offenen C3-Leserahmens zu konstruieren, wurden PCR-Primer verwendet, um die 5'- und 3'-Sequenzen relativ zu C3 zu amplifizieren. Die Primer für die 5'-Sequenzen waren RG277 (SEQ ID NR: 65) (5'-CAGTTGGTACCACTGGTATTTTATTTCAG-3') und RG278 (SEQ ID NR: 66) (5'-TATCTGAATTCCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCAAATGTGAGTTAATAT TAG-3').
Die Primer für die 3'-Sequenzen waren RG279 (SEQ ID NR: 67) (5'-TCGCTGAATTCGATATCAAGCTTATCGATTTTTATGACTAGTTA ATCAAATAAAAAGCATA CAAGC-3') und RG280 (SEQ ID NR: 68) (5'-TTRTCGAGCTCTGTAACATCAGTATCTAAC-3'). Die Primer waren so entworfen, dass sie eine multiple Clonierungsstelle beinhalten, die durch Vaccinia-Transkriptions- und Translations-Terminationssignale flankiert ist. Ebenfalls beinhaltet am 5'-Ende und 3'-Ende des linken Arms und des rechten Arms waren geeignete Restriktionsenzym-Schnittstellen (Asp718 und EcoRI für den linken Arm und EcoRI und SacI für den rechten Arm), die den beiden Armen ermöglichten, in den mit Asp718/SacI gespaltenen pBS-SK-Plasmidvektor zu ligieren. Das resultierende Plasmid wurde als pC3I bezeichnet.
Das Plasmid pC3SIVEM wurde durch Spaltung mit EcoRI linearisiert. Nachfolgende partielle Spaltung mit HindIII setzte ein 2,7 kb-HindIII/EcoRI-Fragment frei. Dieses Fragment wurde durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase in Anwesenheit von 2 mM dNTPs in glatte Enden überführt. Das Fragment wurde in pSD550VC ligiert, das mit SmaI gespalten worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pSIVEMVC bezeichnet. Dieses Plasmid wurde für in vitro Rekombinations-Experimente mit vP866 als Helfervirus verwendet, wobei vP873 erzeugt wurde. vP873 enthält das SIV-env-Gen im I4L-Locus.
Erzeugung einer NYVAC/gag/pol-und von gag-Rekombinante
Ein Plasmid, pSIVAGSS11G, das die SIV-cDNA-Sequenz enthält, die die gag- und pol-Gene umfasst, wurde von Dr. Genoveffa Franchini (NCI-NIH, Bethesda, MD) erhalten. Die gag- und pol-Gene dieses Plasmids wurden in unmittelbare Nachbarschaft 3' des Vaccinia-I3L-Promotors zwischen die flankierenden Vaccinia-tk-Arme platziert. Dies wurde durch Clonierung des 4.800 bp-CfoI/TagI-Fragments von pSIVGAGSSIIG, das das gag enthält, und die Oligonucleotide SIVL1 (SEQ ID NR: 69) (5'-TCGAGTGAGATAAAGTGAAAATATATATCATTATATTACAAGTACAATTATTT AGGTTTAATCATGGGCG-3') und SIVL2 (SEQ ID NR: 70) (5'-CCCATGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGTAATATAATGCTATATATTTTCACTTTATCT CAC-3'), entsprechend dem I3L-Promotor, in das 4.070 bp-XhoI/AccI-Fragment von pSD542, einem Derivat von pSD460, erreicht (1). Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wurde als pSIVG1 bezeichnet.
Um das pol-Gen zu entfernen, wurde ein 215 bp-PCR-Fragment aus pSIVGAGSSIIG erhalten, wobei die Oligonucleotide SIVPS (SEQ ID NR: 71) (5'-AATCAGAGAGCAGGCT-3') und SIVP6 (SEQ ID NR: 72) (5'-TTGGATCCCTATGCCACCTCTCT-3') verwendet wurden. Das durch PCR erhaltene Fragment wurde mit BamHI und StuI gespalten und mit dem partiellen 5.370 bp-BamHI/StuI-Fragment von SIVG1 ligiert. Das resultierte in der Erzeugung von pSIVG2. pSIVG2 wurde für in vitro-Rekombinations-Experimente mit vP873 als Helfervirus verwendet, wobei vP948 erhalten wurde.
Das Plasmid für die Inserierung von sowohl gag und pol in NYVAC-basierte Vektoren wurde auf die folgene Art und Weise gentechnisch erzeugt. pSIVG1, vorstehend beschrieben, enthält nicht relevante nichtcodierende 3'-Sequenzen, die durch Verwendung eines 1 kb-PCR-Fragments elinimiert wurden. Dieses Fragment wurde aus dem Plasmid pSIVGAGSSIIG mit den Oligonucleotiden SIVP5 und SIVP6 erzeugt. Dieses durch PCR erhaltene Fragment, das das 3'-Ende des pol-Gens enthält, wurde mit BamHI und HpaI gespalten. Das 1 kb-BamHI/HpaI-Fragment wurde in das partielle 7.400 bp-BamHI/HpaI-Fragment von pSIVG1 ligiert, wobei pSIVG4 erhalten wurde.
Sequenzanalyse von pSIVG4 ergab eine einzelne Basenpaar-Deletion innerhalb des pol-Gens. Um diesen Irrtum zu korrigieren, wurde das 2.300 bp-BglII/StuI-Fragment aus pSIVG1 in das partielle 6.100 bp-BglII/StuI-Fragment von pSIVG4 eingefügt, wobei pSIVG5 erhalten wurde. Das Plasmid pSIVG5 wurde für in vitro-Rekombinations-Experimente mit vP873 als Helfervirus verwendet, um vP943 zu erzeugen.
Erzeugung von NYVAC/SIV-p16- und -p28-Rekombinanten
Das pol-Gen und der Bereich des gag-Gens, der p28, p2, p8, p1 und p6 codiert, wurden aus pSIVG1 eliminiert. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide SIVL10 (SEQ ID NR: 73) (5'-AGACCAACAGCACCATCTAGCGGCAGAGGAGGAAATTACTAATTTTTATT CTAGAG-3') und SIVL11 (SEQ ID NR: 74) (5'-GATCCTCTAGAA TAAAAATTAGTAATTTCCTCCTCTGCCGCTAGATGGTGCTGTTGGT-3') in das 4.430 bp-AccI/BamHI-Fragment von pSIVG1 erreicht, wobei pSIVG3 erzeugt wurde. Dieses Plasmid enthält eine Expressionskassette für das SIV-p16-Genprodukt, das durch den Vaccinia-I3L-Promotor exprimiert wird.
Das Insekten-Pockenvirus regulierte 42 kDa-SIV p28-Gen (ausschließlich das 5'-Ende) wurde stromabwärts des I3L-regulierten p16-Gens eingefügt. Dies wurde durch Clonierung des 360 bp-BspMI/BamHI-Fragment von pSIVG1, enthaltend das 5'-Ende des p28-Gens, den Oligonucleotiden pSIVL14 (SEQ ID NR: 75) (5'-TAGACAAAATTGAAAATATATAATTACAAT ATAAAATGCCAGTACAACAAATAGGTGGTAACTATGTCCACCTGCCATT-3') und SIVL15 (SEQ ID NR: 76) (5'-GCTTAATGGCAGGTGGACATAGTTACCACCTATT TGTTGTACTGGCATTTTATATTGTAATTATATATTTTCAATTTTGT-3'), enthaltend den Insekten-Pockenvirus-42 kDa-Promotor, in das partielle 4.470 bp-XbaI/BamHI-Fragment von pSIVG3 erreicht. Das resultierende Plasmid wurde als pSIVG6 bezeichnet.
Der 3'-Bereich des p28-Gens wurde dann in pSIVG6 eingefügt. Ein 290 bp-PCR-Fragment, das das 3'-Ende des SIV-p28-Gens enthält, wurde aus pSIVG1 erhalten, wobei die Oligonucleotide SIVP12 (SEQ ID NR: 77) (5'-TGGATGTACAGACAAC-3') und SIVP13 (SEQ ID NR: 78) (5'-AAGGATCCGAATTCTTACAT TAATCTAGCCTTC-3') verwendet wurden. Dieses Fragment wurde mit BamHI gespalten und in das 4.830 bp-BamHI-Fragment von pSIVG6 ligiert. Das resultierende Plasmid pSIVG7 wurde für in vitro-Rekombinations-Experimente mit vP866 und vP873 als Helfervirus verwendet, wobei vP942 bzw. vP952 erzeugt wurden.
Expressionsanalysen
Das SIV-gp140-env-Genprodukt ist ein typisches Glycoprotein, das mit der Plasmamembran infizierter Zellen assoziiert ist. Es wird als ein Polyprotein von 140 kDa exprimiert, das proteolytisch zu einer extrazellulären Art von 112 kDa und einer Transmembran-Region von 28 kDa gespalten wird (Franchini et al., 1987). Immunfluoreszenz-Analyse, wobei Seren aus Rhesus-Makakken verwendet wurden, die seropositiv für SIV waren, gefolgt von Fluorescein-konjugiertem Kaninchen-anti-Affen IgG, zeigten die Expression des env-Genprodukts auf der Oberfläche von Vero-Zellen, die mit Rekombinanten infiziert worden waren. Oberflächen-Expression war nicht nachweisbar auf der Oberfläche von scheininfizierten Zellen oder Zellen, die mit dem parentalen NYVAC (vP866)-Virus infiziert worden waren. Darüber hinaus konnte nicht gezeigt werden, dass Zellen, die mit Rekombinanten infiziert worden waren, die ausschließlich gag-Gene enthielten, irgendeine SIV-Komponente auf der Oberfläche exprimieren. Zellen, die mit vP873, vP943, vP948 und vP952 infiziert worden waren, zeigten alle Obeflächenexpression, und alle enthielten signifikanterweise das SIV-env-Gen.
Die Authentizität der exprimierten SIV-Genprodukte (env und gag) in Vero-Zellen, die mit den NYVAC/HIV-Rekombinanten infiziert worden waren, wurde, wie vorstehend beschrieben, durch Immunpräzipitation analysiert, mit der Ausnahme, dass alle Proben 17 Stunden nach Infektion durch die Zugabe von 1 ml 3 × Puffer A geerntet wurden. Die Lysate aus den infizierten Zellen wurden mit vereinigten Seren aus SIV-seropositiven Rhesus-Makakken oder einem monoclonalen Antikörper spezifisch für das gag-p24-Genprodukt (beide erhalten von Dr. Genoveffa Frnachini, NCI-NIH, Bethesda, MD) analysiert.
Die Immunpräzipitation mit den SIV-seropositiven Makakken-Seren wurde auf die folgende Art und Weise durchgeführt. Die Makakken-Seren wurden 16 Stunden bei 4°C mit einer Protein A-Sepharose inkubiert. Nach Waschen mit Puffer A wurden die an Protein A-Sepharose gebundenen Seren zu Lysaten zugegeben, die mit normalen Affenseren und Protein A-Sepharose geklärt worden waren. Nachfolgend einer Übernacht-Inkubation bei 4°C wurden die Präzipitate 4 × mit Puffer A und 2 × mit LiCl₂/Harnstoff-Puffer gewaschen. Um die präzipitierten Proteine von dem Antikörper zu dissoziieren, wurden die Proben 5 Minuten in 80 μl 2 × Laemmli-Puffer gekocht. Die Proben wurden in einem 12,5% Gel fraktioniert, wobei das Dreyfuss-Gelsystem verwendet wurde (Dreyfuss et al., 1984). Das Gel wurde fixiert und für die Fluorographie mit 1 M Na-Salicylat behandelt. Alle Rekombinanten, die die SIV-Gene enthielten, exprimierten die entsprechenden Genprodukte. Die NYVAC-Rekombinanten vP873, vP943, vP948 und vP952, die das SIV-env-Gen enthielten, exprimierten alle das authentische gp140. Es ist jedoch schwierig, die Prozessierung des gp140-Proteins zu den 112 kDa- und 28 kDa-reifen Formen zu beurteilen. Keine Art mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 140 kDa wurde mit Makakken-anti-SIV-Seren aus scheininfizierten Vero-Zellen, vP866-infizierten Vero-Zellen und Vero-Zellen, die mit NYVAC/SIV-Rekombinanten infiziert worden waren, die das SIV-env-Gen nicht enthielten, präzipitiert. Die Expression der SIV-gag-codierten Genprodukte durch vP942, vP943, vP948 und vP952 wurde unter Verwendung der vereinigten Seren von Makakken, die mit SIV infiziert worden waren, und dem monoclonalen Antikörper, der für die p28-gag-Komponente spezifisch ist, gezeigt. Die Expression des gesamten p55-gag-Proteins ohne die pol-Region, die die Protease-Funktion enthält, durch NAVAC (vP948) in Vero-Zellen, ist offensichtlich. Diese Egebnisse zeigen, dass der Verlust der SIV-Protease-Expression die vollständige Proteolyse von p55 in dessen reife Form verhindert. Dies wird viel klarer gezeigt, wenn ein monoclonaler Antikörper verwendet wurde, der spezifisch für p28 ist, um gag-spezifische Produkte aus vP948-infizierten Vero-Zellen zu präzipitieren. Im Gegensatz zu diesem Ergebnis ermöglichte die Expression von SIV-gag mit dem pol-Gen (beinhaltet die Protease in vP943-infizierten Vero-Zellen) die proteolytische Spaltung des exprimierten p55-gag-Vorläufer-Polypeptids in seine reife Form.
Die Expression sowohl der p16- als auch p28-SIV-Genprodukte in vP942- und vP952-infizierten Vero-Zellen wurde gezeigt, indem die vereinigten Seren von Makakken verwendet wurden, die mit SIV infiziert worden waren. Die Verwendung des monoclonalen Antikörpers, der für p24 spezifisch ist, erkannte offensichtlich ausschließlich die p28-exprimierte Komponente.
Bestimmte Materialien und Verfahren, die sich auf die Beispiele 6 bis 8 beziehen.
Test für cytotoxische T-Lymphocyten und in vitro-Stimulation von Vorläufern cytotoxischer Gedächtnis-T- Lymphocyten. Sechs Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden intravenös mit 5 × 10⁷ pfu Vaccinia-Virus (NYVAC), rekombinantem Vaccinia-Virus, das HIV-1 (IIIB)-env (vP911) exprimiert, Kanarienvogel-Pockenvirus (ALVAC) oder mit rekombinantem Kanarienvogel-Pockenvirus, das HIV-1 (IIIB)-env (vCP112) exprimiert, inokuliert. Sieben Tage später wurden die Milzzellen auf primäre CTL-Aktivität gegen nicht modifizierte P815-Zellen oder P815-Zellen, die über Nacht mit einem Peptid inkubiert worden waren, das der hypervariablen V3-Schleifen-Region von HIV-1 (IIIB)-gp120 entspricht, getestet. 22 Tage nach der initialen Immunisierung wurden die Milzzellen der experimentellen Mäuse mit Pockenvirus-infizierten Stimulator- Milzzellen inkubiert und wie zuvor auf Gedächtnis-CTL-Aktivität gegen Peptid-gepulste Ziele getestet. Um sekundäre CTL-Aktivität zu bestimmen, erhielten die Mäuse 29 Tage nach der primären Immunisierung eine zweite Inokulierung von identischer Dosierung und identischem Gehalt wie die erste. Fünf Tage später wurden die Milzzellen auf cytolytische Aktivität gegen Peptid-gepulste Ziele getestet. Für die Cytotoxizitätstests wurden murine H-2^d-P815-Mastocytom-Zellen über Nacht in Medium (minimales essentielles Medium, das Earle-Salze enthielt und mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänzt war) mit oder ohne 20 μg/ml V3-Peptid (CNTRKRIRIQRGPGRAFVTGK, American Biotechnologies, Inc.) (SEQ ID NR: 79) inkubiert. Am folgenden Morgen wurden die P815-Zellen durch Zentrifugation gewaschen und 1 Stunde bei 37°C in 100 μCi Na₂ ⁵¹CrO₄ pro 2 × 10⁶ Zellen markiert. Die intakten Milzen wurden aseptisch aus den euthanasierten Mäusen entfernt, in eiskalter balancierter Hank-Salzlösung gebadet und unter Verwendung eines Stomacher-Mixers in Einzelzell-Suspensionen zerteilt. Die Milzzell-Suspensionen wurden mehrere Male durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit gewaschen und in Assay-Medium (RPMI 1640, enthaltend 10% fötales Kälberserum, 20 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) resuspendiert. Für Gedächtnis-CTL-Aktivität wurden die Milzzellen aus immunisierten Mäusen in Stimulationsmedium (minimales essentielles Medium mit Earle-Salzen, enthaltend 10% fötales Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 10^–4 M 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) resuspendiert und in vitro in aufrechten 25 cm²-Gewebekulturflaschen mit unbehandelten syngenen Stimulator-Milzzellen stimuliert, die mit einem Pockenvirus oder einer der Pockenvirus-Rekombinanten infiziert worden waren. Nach fünf Tagen bei 37°C wurden die Zellen gewaschen, gezählt und in Assay-Medium resuspendiert. ⁵¹Chrom-markierte Zielzellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen für einen 4-Stunden-⁵¹Cr-Freisetzungstest zu titrierten Effektor-Zellen zugegeben. Die Effektor zu Zielzell-Verhältnisse (E : T), die für die drei Tests gezeigt sind, waren 100 : 1 (primär), 20 : 1 (Gedächtnis) und 50 : 1 (sekundär). Die Cytotoxizität wurde, wie vorstehend beschrieben, als Prozentsatz berechnet, d. h. (experimentelle ⁵¹Cr-Freisetzung – spontane ⁵¹Cr-Freissetzung)/ (maximale ⁵¹Cr-Freisetzung – spontane ⁵¹Cr-Freisetzung) × 100. Die maximale Freisetzung wurde durch die Zugabe von 5% Natriumdodecylsulfat zu Zielzellen bestimmt, während die spontane Freisetzung durch Inkubation von Zielzellen in Abwesenheit von Effektor-Zellen bestimmt wurde. In keinem der dargestellten Experimente überschritt die spontane Freisetzung von ⁵¹Cr aus Zielzellen 20% der maximalen ⁵¹Cr-Freisetzung. Die Irrtumsbalken in 7 repräsentieren eine Standardabweichung von dem Durchschnitt. P<0,05, Student-t-Test im Vergleich mit entsprechenden Vaccinia- oder Kanarienvogel-Pockenvirusimmunisierten Mäusen.
Zelloberflächen-Phänotyp cytotoxischer Effektor- Zellen. Mäuse-Milzzellen wurden mit Vaccinia-Virus- oder Kanarienvogel-Pockenvirus-Vektoren (NYVAC, ALVAC) oder mit Vaccinia-Virus- oder Kanarienvogel-Pockenvirus-Rekombinanten, die HIV IIIB-env (vP911, vCP112) exprimieren, immunisiert. Eine zweite Inokulierung wurde 30 Tage nach der ersten verabreicht. vor der Zugabe von V3-Peptid-gepulsten Zielen wurden die Milzzellen mit monoclonalen Antikörpern oder Alloantiserum gegen murine T-Lymphocyten-Oberflächen-Antigene in einem 2-Schritt-Protokoll behandelt. Kurz, die Milzzellen wurden in einer Dichte von 10⁷ lebenden Zellen pro ml Cytotoxizitätsmedium (RPMI 1640, enthaltend 0,2% BSA und 5 mM HEPES) resuspendiert, welchem Alloanti-Thy 1.2 (Cedarlane), monoclonaler anti-CD4 (172.4, K. J. Weinhold, Duke University Medical Center) oder monoclonaler anit-Lyt 2.2 (Cedarlane) zugegeben wurden. Nach 30 Minuten bei 5°C wurden die Zellen gewaschen und im originalen Volumen des Cytotoxizitätsmediums resuspendiert, mit oder ohne Komplement (Kaninchen-Lo-Tox M, Cedarlane) in zwei gleiche Portionen aufgeteilt und 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann in Assay-Medium gewaschen und basierend auf den vorbehandelten Zelldichten vor der Zugabe zu einem 5-Stunden-⁵¹Cr-Freisetzungstest in Volumina von Assay-Medium resuspendiert, die ungefähre Effektor- zu Zielzell-Verhältnisse von 100 : 1 (primär), 10 : 1 (Gedächtnis) oder 80 : 1 (sekundär) ergaben. Die Irrtumsbalken in 10 repräsentieren eine Standardabweichung von den Durchschnittswerten.
Spezifität der CTL-Antigen-Rezeptor-Erkennung der V3-Schleifen-Region von HIV IIIB-gp120. Cytotoxische T-Lymphocyten und Gedächtnis-Vorläufer von cytotoxischen T-Lymphocyten wurden, wie vorstehend beschrieben, durch Inokulierung von Mäusen mit vCP112 erzeugt. Tests für cytotoxische T-Lymphocyten wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, mit Ausnahme, dass P815-Zielzellen über Nacht mit V3-Peptid aus HIV-1 IIIB (CNTRKRIRIQRGPGRAFVTGK) (SEQ ID NR: 79), MN (CNKRKRIHIGPGRAFYTTKN)(SEQ ID NR: 80) oder SF2 (CNTRKSIYIGPGRAFHTTGR) (SEQ ID NR: 81) gepulst worden waren. Effektor- zu Zielzell-Verhältnisse betrugen 100 : 1 (primär), 20 : 1 (Gedächtnis) und 50 : 1 (sekundär).
Antikörper-Antworten auf HIV-1 (IIIB)-gp120. Die Vertiefungen von ELISA-Platten (Immulon II) wurden über Nacht bei 4°C mit 0,5 μg partiell gereinigtem HIV-1 (IIIB)-gp120 (Dr. G. Franchini, NCI-NIH. Bethesda, MD) in Carbonatpuffer, pH 9,6 beschichtet. Die Platten wurden dann mit Phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung, enthaltend 0,05 Tween 20 (PBST), gewaschen. Die Platten wurden dann zwei Stunden bei 37°C mit PBST, enthaltend 1% Rinder-Serumalbumin (BSA), blockiert. Nach Waschen mit PBST wurden die Seren initial 1 : 20 mit PBST, enthaltend 0,1% BSA (Verdünnungspuffer), verdünnt. Die Seren wurden weiter seriell zweifach in den Vertiefungen der ELISA-Platte verdünnt. Die Platten wurden zwei Stunden bei 37°C inkubiert und mit PBST gewaschen. Mit Meerrettich-Peroxidase-konjugierte Kaninchenanti-Maus-Immun-globuline (DAKO) wurden 1 : 2.000 in Verdünnungspuffer verdünnt und in die Vertiefungen der ELISA-Platten gegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Nach Waschen mit PBST wurde OPD (o-Phenylendiamin-dihydrochlorid) in Substratpuffer zugegeben, und man ließ die Farbe wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur entwickeln. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2,5 M H₂SO₄ beendet. Die Absorption bei 490 nm wurde mit einem Bio-Tek EL-309-ELISA-Lesegerät bestimmt. Der Serum-Endpunkt wurde als der Umkehrwert der Verdünnung definiert, die einen Absorptionswert von 0,4 ergab.
Beispiel 6 Ein rekombinantes Kanarienvogel-Pockenvirus, das HIV-env exprimiert, löst HIV-spezifische cytotoxische T-Lymphocyten-Aktivität aus.
Sieben Tage nach der initialen Inokulierung mit der HIV-Kanarienvogel-Pockenvirus-Rekombinante (vCP112; in Beispiel 2 definiert) waren cytotoxische Antworten von Milzzellen gegen HIV-V3-Peptid-gepulste Zielzellen ungefähr äquivalent zu den cytotoxischen Antworten, die durch die gleiche Dosis, 5 × 10⁷ pfu, der NYVAC-Rekombinante vP911 (Beispiel 2), die das gleiche HIV-env-Gen exprimiert (7), ausgelöst wurden. Nachfolgend einer angemessenen in vitro-Stimulation oder einer zweiten Inokulierung stieg das Ausmaß an Cytotoxizität der Milzzellen von Mäusen an, die Kanarienvogel-Pockenvirus-Rekombinante erhielten, und waren vergleichbar mit Milzzellen aus Mäusen, denen in ähnlicher Weise die NYVAC-Rekombinante verabreicht wurde. Aus Milzzellen von Mäusen, die mit den nicht-rekombinanten NYVAC- oder ALVAC-Vektoren inokuliert wurden, wurden keine solchen cytotoxischen Antworten nachgewiesen, was das Erfordernis einer Immunisierung mit einer Pockenvirus-Rekombinante bestätigt, die das HIV-env-Gen exprimiert. Darüber hinaus wurde keine cytotoxische Reaktivität gegen nicht modifizierte P815-Zellen aus den Milzzellen von irgendeiner der Mäuse nachgewiesen, ungeachtet der Art und Weise der Inokulierung. Somit zeigten ausschließlich Mäuse, die mit rekombinantem NYVAC oder signifikanter mit rekombinantem ALVAC inokuliert wurden und die codierende env-Sequenz von HIV-1 exprimierten, V3-spezifische cytotoxische Antworten.
Beispiel 7 Charakterisierung von cytotoxischen Effektor-Zellen
Um die Identität der Milzzellen zu bestimmen, die mit der Lyse von HIV-1-V3-Peptid-gepulsten Zielzellen assoziiert sind, wurden Mäuse mit vCP112 immunisiert. Nach jeder Immunisierung oder in vitro-Stimulation wurde 21 Tage nach der ersten Inokulierung ein 2-Schritt-Verringerungs-Verfahren durchgeführt, und die Milzzellen wurden auf Cytotoxizität gegen V3-Peptid-gepulste P815-Zellen getestet. Mäuse, die mit dem Kanarienvogel-Pockenvirus-Vektor ALVAC inokuliert wurden, erzeugten keine Milzzellen, die in der Lage waren, Peptid-gepulste Ziele abzutöten. Nach einer einzelnen Immunisierung induzierte vCP112 Milzzellen, die in der Lage waren, V3-Peptid-gepulste Ziele abzutöten. Die lytischen Effektor-Zellen waren sensitiv für die Behandlung mit antimurinem Thy 1.2 oder Lyt 2.2 plus Komplement und waren resistent gegen anti-CD4. 10 zeigt die Sensitivität von cytotoxischen Effektor-Zellen aus Milzzellen von Mäusen, die mit vCP112 immunisiert worden waren, für Antikörper gegen cytotoxische T-Lymphocyten-Zell-Oberflächenantigene Thy 1.2 und Lyt 2.2. Weder Komplement noch irgendeiner/irgendeines der monoclonalen Antikörper oder Alloantiseren alleine bewirkte die cytolytische Wirkung dieser Zellen. Ähnliche Ergebnisse wurden fünf Tage nach einer zweiten Immunisierung erhalten, die am Tag 30 verabreicht wurde. 21 Tage nach einer einzelnen Inokulierung führt die in vitro-Stimulation mit vCP112-infizierten syngenen Milzzellen zu lytischen Effektor-Zellen, die nur teilweise gegen anti-Thy 1.2 sensitiv sind, obwohl sie vollständig sensitiv sind gegen anti-Lyt 2.2 und resistent sind gegen anti-CD4. Diese Thy 1.2-, CD4-, Lyt 2.2+-Effektor-Zellen werden nachfolgend einer in vitro-Stimulation mit vP911 von Milzzellen aus vCP112-inokulierten Mäusen nicht nachgewiesen. Nichtsdestoweniger ist es klar, dass HIV-V3-Schleifen-spezifische Cytotoxizität durch eine Population von T-Lymphocyten vermittelt wurde, die Thy 1.2 und Lyt 2.2, jedoch nicht CD4 exprimieren. Dieser Zelloberflächen-Phänotyp ist charakteristisch für klassische cytotoxische T-Lymphocyten.
Beispiel 8 Spezifität der CTL-Antigen-Rezeptor-Erkennung der V3-Schleifen-Region von HIV-gp120
Um die Spezifität von cytotoxischen Zellen zu testen, die durch die HIV-Kanarienvogel-Pockenvirus (ALVAC)-Rekombinante erzeugt wurden, wurde die Suszeptibilität von vCP112 für CTL-Aktivität zwischen P815-Zielzellen verglichen, die mit Peptiden gepulst worden waren, die der V3-Schleifenregion von gp120 von HIV-Isolaten IIIB, MN oder SFZ entspricht. HIV-spezifische primäre CTL-Aktivität war nur auf P815-Zielzellen beschränkt, die mit Peptid gepulst worden waren, das der V3-Schleife des HIV-Isolats IIIB entsprach, aber nicht auf Zielzellen, die mit Peptiden gepulst worden waren, die der V3-Schleifen-Region von gp120 der HIV-Isolate MN oder SF2 entsprachen, wie in 8 gezeigt, was die Spezifität des cytotoxischen T-Lymphocyten-Antigen-Rezeptors für die HIV IIIB-hypervariable V3-Schleife von gp120 zeigt, aber nicht für die V3-Schleife von HIV MN oder SF2. Ähnliche Ergebnisse wurden durch in vitro-stimulierte, HIV-spezifische Gedächtnis-CTL-Aktivität und sekundäre CTL-Aktivität erhalten, die durch Immunisierung mit der ALVAC-Rekombinanten vCP112 induziert wurde. Somit erkannten HIV-spezifische CTLs, die durch ein rekombinantes Kanarienvogel-Pockenvirus, das das env-Gen von HIV-Isolat IIIB exprimiert, ausschließlich Zielepitope, die von dem gleichen Antigen-Isolat abstammten. Diese Ergebnisse zeigen klar die ausgezeichnete Spezifität der Lymphocyten-Effektor-Zellen, die durch Immunisierung mit der HIV-Kanarienvogel-Pockenvirus-Rekombinante erzeugt worden waren, und verwerfen solche nicht-spezifischen Effektor-Mechanismen wie natürliche Killer (NK)-Zell-Aktivität.
Beispiel 9 Antikörper-Antworten von Mäusen, die mit NYVAC und ALVAC-basierten HIV-Rekombinanten inokuliert wurden
Um humorale Antworten auf HIV zu bewerten, wurden Mäuse am Tag 0 mit einer NYVAC-HIV-Rekombinante oder einer Kanarienvogel-Pockenvirus (ALVAC)-Rekombinante immunisiert, und sie erhielten eine zweite Immunisierung in Woche 4. Den Mäusen wurde in verschiedenen Intervallen bis 20 Wochen nach der initialen Immunisierung Blut entnommen. Vereinigte Seren von jeder Behandlungsgruppe wurden mit Hilfe von ELISA unter Verwendung von gereinigtem gp120 als Antigen auf Antikörper gegen HIV getestet; die Ergebnisse sind in 9 gezeigt, die die Antikörper-Antworten gegen HIV IIIB-gp120 von Mäusen bereitstellt, die mit Vektoren (NYVAC, ALVAC) oder mit der NYVAC-Rekombinante vP911 oder der ALVAC-Rekombinante (vCP112) immunisiert worden waren, die HIV-1-env exprimiert, wobei das invertierte Dreieck den Zeitpunkt der Verabreichung der zweiten Inokulierung anzeigt. Primäre Antikörper-Antworten waren im Allgemeinen schwach, aber nachweisbar. Nachfolgend der zweiten Immunisierung stiegen die Antikörper-Titer von Mäusen an, die mit sowohl vP911 als auch vCP112 immunisiert worden waren, und gipfelten in Woche 6 mit Titern von über 10.000. Diese Antikörper-Titer verblieben während der gesamten Dauer der Studie auf ungefähr dem gleichen Niveau. Somit war eine ALVAC-HIV-Rekombinante, vCP112, in der Lage, eine signigikante Antikörper-Antwort zu induzieren.
Die Inokulierung von Mäusen mit ALVAC, das das env-Gen von HIV-1 exprimiert, löst Milzzell-Reaktivität mit Eigenschaften von cytotoxischen T-Lymphocyten aus: das Erfordernis der Immunisierung, der Zelloberflächen-Phänotyp, das Gedächtnis und ausgewählte Epitopspezifität. Darüber hinaus werden Antikörper-Antworten gegen HIV-1-gp120 durch Inokulierung mit dieser ALVAC-Rekombinante induziert.
Beispiel 10 Herleitung von NYVAC- und ALVAC-basierten HIV-1-Rekombinanten und Expression von HIV-1 (MN)-env durch ALVAC und NYVAC
HIV-1 (MN)-env-Sequenzen wurden aus dem Plasmid pMN1.8-9 und dem Plasmid pMN1.8-10 erhalten, die ein 1.774 bp- bzw. ein 1.803 bp-Subfragment eines genomischen cDNA-Clons von HIV-1 (MN) enthielten. Diese Plasmide wurden durch das Labor von Dr. R. C. Gallo (NCI-NIH) bereitgestellt. Ein 1.026 bp-KpnI/EcoRI-Fragment wurde durch Amplifikation dieser Sequenzen aus pMN1.8-9 mit Hilfe von PCR erhalten, wobei die Oligonucleotide HIVMN6 (SEQ ID NR: 82) (5'-GGGTTATTAATGATCTGTAG-3') und HIV3B2 (SEQ ID NR: 39) verwendet wurden, gefolgt von der Spaltung mit KpnI/EcoRI. Dieses Fragment wurde in pBS-SK eingefügt, das mit KpnI und EcoRI gespalten worden war, wobei pBSMIDMN erhalten wurde.
Ein 1.028 bp-SalI/XbaI-Fragment wurde mit Hilfe von PCR aus pMN1.8-10 erhalten, wobei die Oligonucleotide HIVMN5 (SEQ ID NR: 83) (5'-ATCATCGAGCTCTGTTCCTTGGGTTCTTAG-3') und HIVMN3P (SEQ ID NR: 84) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTATAGCAAA GCCCTTTCCAAGCC-3') verwendet wurden, gefolgt vn Spaltung mit SacI und XbaI. Dieses Fragment wurde mit einem 404 bp-EcoRI/SacI-Fragment in pBS-SK co-ligiert, das mit EcoRI und XbaI gespalten worden war. Das 404 bp-Fragment wurde durch PCR mit pMN1.8-9 als Matrize und den Oligonucleotiden HIV3B1 (SEQ ID NR: 32) und HIVMN4 (SEQ ID NR: 85) (5'-ATCATCGAGCTCCTATCGCTGCTC-3') erhalten. Das resultierende Plasmid wurde als pBS3MN bezeichnet.
Das 1.026 bp-EcoRI/KpnI-Fragment aus pBSMIDMN wurde in das 4.315 bp große pBS3MN eingefügt, das mit EcoRI/KpnI gespalten worden war, wobei pBSMID3MN erzeugt wurde. Dieses Plasmid enthält das meiste des env-Gens, mit Ausnahme der am meisten 5'-gelegenen Region. Der Vaccinia-Virus H6-Promotor (Goebel et al., 1990a, b) und die am meisten 5'-gelegene Region des env-Gens wurden erhalten, indem ein 318 bp-KpnI-Fragment aus pBSH6HIV3B5P (definiert in Beispiel 2) isoliert wurde. Dieses Fragment wurde in KpnI/XbaI gespaltenes pBS-SK ligiert, gemeinsam mit dem 2.9 kb-KpnI/XbaI-Fragment aus pBSMID3MN. Das resultierende Plasmid wurde als pH6HMNE bezeichnet.
Das 2.7 kb-NruI/XbaI-Fragment aus pH6HMNE, das das gesamte HIV-1 (MN)-env-Gen in unmittelbarer 3'-Nachbarschaft zu den am meisten 3'-gelegenen 26 bp des H6-Promotors enthält, wurde in glatte Enden überführt und in NruI/SmaI-gespaltenes pSPHRH6 eingefügt. Das erzeugte das Plasmid pHAHIVMNE. Das Plasmid pSPHAH6 wurde wie folgt erhalten. Das Plasmid pMP2VCL (enthaltend eine Polylinker-Region innerhalb von Vaccinia-Sequenzen stromaufwärts des K1L-Wirtsbereich-Gens) wurde innerhalb des Polylinkers mit HindIII und XhoI anelierten und an die gepaarten Oligonucleotide SPHPRHA A bis D (SPHPRHA A (SEQ ID NR: 86) 5'-AGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGT-3' SPHPRHA B (SEQ ID NR: 87) (5'-TGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATC ATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAC-3') SPHPRHA C (SEQ ID NR: 88) ( 3'-TTATTAGTATTTAATAAAGTAATAGCGCTAT AGGCAATTCAAACATAGCATGAGCT-5') SPHPRHA D (SEQ ID NR: 89) (3'-AGAAATAAGATATGAATTTTTCACTTTTA TTTATGTTTCCAAGAACTCCCAACACAATTTAACTTTCGCTCT-5') ligiert, wobei pSP126 erzeugt wurde, das eine HindIII-Schnittstelle, den H6-Promotor -124 bis -1 (Perkus et al., 1989) und XhoI-, KpnI-, SmaI-, SacI- und EcoRI-Schnittstellen enthielt.
Das Plasmid pSD544 (enthaltend Vaccinia-Sequenzen, die die Position des HA-Gens umgeben, das durch eine Polylinker-Region und Translations-Terminations-Codons in sechs Leserahmen ersetzt wurde) wurde mit Xhol innerhalb des Polylinkers gespalten, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt und mit alkalischer Phosphatase behandelt. SP126 wurde mit HindIII gespalten, mit Klenow behandelt, und der H6-Promotor wurde durch Spaltung mit SmaI isoliert. Die Ligierung des H6-Promotor-Fragments mit pSD544 erzeugte pSPHAH6, das den H6-Promotor in der Polylinker-Region enthielt (in Richtung der HA-Transkription). Dieses Inserierungs-Plasmid erlaubt den Austausch des Vaccinia-HA-Gens (A56; Goebel et al., 1990a, b) mit fremdem genetischen Material.
Das C5L-Inserierungs-Plasmid wurde wie folgt erhalten. Unter Verwendung des Cosmid-Vektors pVK102 (Knauf and Nester, 1982) wurde eine genomische Bibliothek für vCP65 (ALVAC-basierte Tollwut G-Rekombinante mit Tollwutsequenz im C5-Locus) konstruiert. Diese Bibliothek wurde mit dem genomischen 0,9 kb-PvuII-Kanarienvogel-Pockenvirus-Fragment durchmustert, das innerhalb von pRW764.5 (C5-Locus) enthalten ist. Diese Kanarienvogel-Pockenvirus-DNA-Sequenzen enthalten den ursprünglichen Inserierungslocus. Ein Clon, der eine 29 kb-Inserierung enthält, wurde gezüchtet und als pHCOS1 bezeichnet. Aus diesem Cosmid, das C5-Sequenzen enthält, wurde ein 3,3 kb ClaI-Fragment subcloniert. Sequenzanalyse dieses ClaI-Fragments wurde verwendet-, um die Karte des C5-Locus von 1–1.372 zu erweitern.
Der C5-Inserierungs-Vektor, pC5L, wurde in zwei Schritten konstruiert. Der linke 1.535 bp-Arm wurde durch PCR-Amplifikation erzeugt, wobei die Oligonucleotide C5A (SEQ ID NR: 90) (5'-ATCATCGAATTCTGAATGTTAAATGTTATACTTTG-3') und C5B (SEQ ID NR: 91) (5'-GGGGGTACCTTTGAGAGTACCACTTCAG-3') verwendet wurden. Die Matrizen-DNA war genomische Kanarienvogel-Pockenvirus-DNA. Dieses Fragment wurde in EcoRI/SmaI-gespaltenes pUC8 cloniert. Die Sequenz wurde durch Standard-Sequenzierungsprotokolle überprüft. Der rechte 404 bp-Arm wurde durch PCR-Amplifikation erzeugt, wobei die Oligonucleotide C5C (SEQ ID NR: 92) (5'-ATCATCCTGCAGGTATTCTAAACTAGGAATAGATG-3') und CSDA (SEQ ID NR: 93) (5'-ATCATCCTGCAGGTATTCTAAACTAGGAATAGATG-3') verwendet wurden. Dieses Fragment wurde dann in den Vektor cloniert, der zuvor erzeugt worden war und der den linken Arm, gespalten mit SmaI/PstI, enthielt. Das gesamte Konstrukt wurde durch Standard-Sequenzanalysen überprüft und als pC5L bezeichnet. Dieses Inserierungs-Plasmid erlaubt das Einfügen fremder Gene in den C5-Locus.
Das 2,8 kb-XbaI/partielles KpnI-Fragment aus pH6HMNE wurde isoliert und in pC5L eingefügt, das mit XbaI und KpnI gespalten worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pC5HIVMNE bezeichnet.
Die Plasmide pHAHIVMNE und pC5HIVMNE wurden für in vitro-Rekombinations-Experimente mit NYVAC (vP866) bzw. ALVAC (CPpp) als Helfervirus verwendet. Diese wurden nach Standardverfahren durchgeführt (Piccini et al., 1987). Plaques, die von rekombinantem Virus stammen, wurden mit Hilfe von Plaque-Hybridisierung identifiziert, wobei eine radioaktiv markierte env-spezifische DNA-Sonde verwendet wurde (Piccini et al., 1987). Nach drei Runden Plaque-Aufreinigung wurden die rekombinanten Viren amplifiziert. Die NYVAC-basierte HIV-1 (MN)-env-Rekombinante wurde als vP1008 und die ALVAC-basierte Rekombinante als vCP125 bezeichnet. Die rekombinanten Viren vCP125 und vP1008 wurden mit Hilfe von Immunfluoreszenz und Immunpräzipitation auf Expression des HIV-1 (MN)-env-Gens analysiert, wobei die zuvor beschriebenen Verfahren verwendet wurden (Taylor et al., 1990). Die vereinigten menschlichen Seren von HIV-seropositiven Individuen (erhalten von Dr. K. Steimer, Chiron Corp., Emeryville, CA) wurden in diesen Tests verwendet. Die Ergebnisse der Immunfluoreszenz ergaben, dass Zellen, die entweder mit vCP125 oder vP1008 infiziert worden waren, das HIV-1 (MN)-Genprodukt auf ihrer Oberfläche exprimieren. Immunpräzipitation von Lysaten, die aus vP1008- und vCP125-infizierten Zellen hergestellt wurden, zeigten die Anwesenheit von drei hauptsächlichen HIV-1-spezifischen Proteinen mit offensichtlichen molekularen Massen von 160 kDa, 120 kDa bzw. 41 kDa. Diese stimmen mit der Expression des Vorläufer-Hüll-Glycoproteins (160 kDa) und den proteolytisch erhaltenen reifen Formen (120 kDa und 41 kDa) überein.
Beispiel 11 Expression des HIV-1 (MN)-gp120 durch NYVAC und ALAC
Ein 391 bp-EcoRI/XbaI-Fragment wurde aus pBS3MN amplifiziert, wobei die Oligonucleotide T7 (SEQ ID NR: 94) (5'-AATACGACTCACTATAG-3') und HIVMN120 (SEQ ID NR: 95) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTATCTTTTTTCTCTCTGCACCACTC-3') verwendet wurden, gefolgt von Spaltung mit EcoRI und XbaI. Dieses Fragment wurde an das 4,2 kb-EcoRI/XbaI-Fragment ligiert, das von pH6HMNE (definiert in Beispiel 10) abstammt. Das resultierende Plasmid enthält eine Pockenvirus-Expressionskassette für HIV-1 (MN)-gp120 in pBS-SK und wurde als pBSHIVMN120 bezeichnet.
Ein 1,7 kb-XbaI/partielles KpnI-Fragment wurde isoliert und in pC5L eingefügt, das mit KpnI/XbaI gespalten worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pC5HIVMN120 bezeichnet. Das Inserierungs-Plasmid zur Integration des HIV-1 (MN)-gp120-Gens in NYVAC wurde erhalten, indem zuerst das 1,6 kb NruI/SmaI-Fragment aus pBSHIVMN120 isoliert wurde. Dieses Fragment wurde in pSPHAH6 eingefügt, das mit NruI und SmaI gespalten worden war, um pHAHIVMN120 bereitzustellen.
Die Inserierungs-Plasmide pCSHIVMN120 und pHAHIVMN120 wurden in Rekombinations-Experimenten mit ALVAC (CPpp) und NYVAC (vP866) als Helfervirus verwendet. Diese Tests und die Plaque-Identifizierung und Aufreinigung wurden nach Standardverfahren durchgeführt (Piccini et al., 1987). Hybridisierungs-Analysen wurden mit einer radioaktiv markierten HIV-1 (MN)-gp120-spezifischen Sonde durchgeführt. Aufgereinigte Rekombinanten wurden amplifiziert. Die ALVAC-basierte HIV-1 (MN)-gp120-Rekombinante wurde als vCP124 bezeichnet und die NYVAC-basierte HIV-1 (MN)-gp120-Rekombinante als vP1004.
Zellen, die mit vCP124 und vP1004 infiziert worden waren, wurden mit Immunfluoreszenz und Immunpräzipitation auf Anwesenheit des rekombinanten, exprimierten HIV-1 (MN)-gp120 analysiert. Diese Tests wurden, wie zuvor beschrieben, durchgeführt (Taylor et al., 1990), wobei ein vereinigtes menschliches Serum aus HIV-seropositiven Individuen verwendet wurde (erhalten von K. Steimer, Chiron Corporation, Emeryville, CA). Die Ergebnisse aus diesen Studien zeigen klar, dass Zellen, die entweder mit vCP124 oder vP1004 infiziert worden waren, HIV-1 (MN)-gp120 enthielten, wohingegen gp120 in nicht infizierten Zellen und in Zellen, die mit den parentalen Viren, ALVAC und NYVAC, infiziert worden waren, nicht beobachtet wurde.
Beispiel 12 Expression einer nicht-spaltbaren Form vn HIV-1-gp160 durch ALVAC und NYVAC
Um eine nicht-spaltbare Form des HIV-1 (IIIB)-gp160 zu exprimieren, wurde bei Aminosäure 511 eine Arginin nach Threonin-Mutation gentechnisch erzeugt (Ratner et al., 1985), wie von Guo et al. (1990) gezeigt worden war. Diese Modifikationen wurden durchgeführt, um das Abwerfen von gp120 von der Oberfläche infizierter Zellen zu erniedrigen. Diese Manipulationen wurden wie folgt durchgeführt. Ein 376 bp-PstI/XbaI-Fragment wurde erhalten, indem zuerst die Sequenzen aus pBSHIV3BEII (beschrieben in Beispiel 2) amplifiziert wurden, wobei die Oligonucleotide HIV3B2A (SEQ ID NR: 96) (5'-GAAATAATAAAACAATAATC-3') und HIVECB (SEQ ID NR: 97) (5'-GCTCCTATTCCCACTGCAGTTTTTTCTCTCTGCAC-3') verwendet wurden, gefolgt von Spaltung mit PstI und XbaI. Dieses Fragment wurde mit einem 1.061 bp PstI/XbaI-Fragment und einem 4,5 kb EcoRI/XbaI-Fragment aus pBSHIV3BEII ligiert, wobei pBSHIV3BEEC erhalten wurde.
Die zentrale Region des Hantaan-Virus S-Segments wurde mit PCR erzeugt, wobei die Oligonucleotide T5HT3PPS (SEQ ID NR: 98) (5'-GTCCTGCAGGATGGAAAAGAATGCCCCAAGC-3') und HTS55PN (SEQ ID NR: 99) (5'-GGGGGAGGCAAACTACCAAGG-3') und der S^–-spezifische cDNA-Clon als Matrize verwendet wurden. Das 581 bp-Fragment enthält eine PstI-Schnittstelle an seinem 3'-Ende, und das 5'-Ende beinhaltet die NciI-Schnittstelle an Position 499 des S-Segments (Schmaljohn et al., 1986). Darüber hinaus eliminiert die Verwendung des Oligonucleotids T5HT3PPs (SEQ ID NR: 98) das T₅NT-Element an Position 1.029 bis 1.035, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern. Dieses Fragment wurde dann mit NciI und PstI gespalten. Das PCR-Fragment, das das 5'-Ende der codierenden Sequenz, fusioniert mit dem H6-Promotor enthält (vorstehend mit HindIII/NciI gespalten), wurde gemeinsam mit dem 581 bp-NciI/PstI-Fragment, das die zentrale Region des S- Segments enthält, in pBS-SK ligiert, das mit HindIII und PstI gespalten worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pBSHTSH65P bezeichnet.
Die am meisten 3'-gelegenen 438 bp des S-Segments wurden mit PCR erhalten, wobei die Oligonucleotide HTS3PXBA (SEQ ID NR: 100) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTAGA GTTTCAAAGGC-3') und T5HT5PSP (SEQ ID NR: 101) (5'-CGCCAGCATGCAGAAGCAGC-3') und der S-spezifische cDNA-Clon als Matrize verwendet wurden. Das 5'-Ende dieses Fragments enthält die PstI-Schnittstelle, lokalisiert an Position 1.039 der S-Segment-codierenden Sequenz (Schmaljohn et al., 1986), und das 3'-Ende enthält ein T₅NT-Sequenzmotiv und eine einzelne XbaI-Schnittstelle, unmittelbar vor der Inserierung in das PstI/XbaI-gespaltene pBS-SK, wobei pBSHTS3P erhalten wurde.
Um die gesamte S-Segment-Expressionskassette zu erzeugen, wurde ein 1.122 bp-PstI/partielles HindIII-Fragment aus pBSHTSH56P erhalten. Dieses Fragment wurde gemeinsam mit einem 290 bp-PstI/XbaI-Fragment aus pBSHTS3P in HindIII/XbaI-gespaltenes pBS-SK eingefügt. Das resultierende Plasmid wurde durch Linearisierung mit XbaI, gefolgt von einer partiellen HindIII-Spaltung, als pBSHVS bezeichnet.
Das 2,6 kb-NruI/XbaI-Fragment aus pBSHIV3BEEC, das die am meisten 3'-gelegenen 26 bp des H6-Promotors, gekoppelt an die gp160-Kassette enthält, wurde isoliert und in ein 3,0 kb-NruI/XbaI-Fragment von pBSHVS ligiert, wobei pBSHIV3BEECM erhalten wurde. Spaltung mit NruI und XbaI schneidet die am meisten 3'-gelegenen 26 bp des H6-Promotors und die Hantaan-Virus S-Sequenz heraus. Das 3,0 kb-NruI/XbaI-Fragment enthält die am meisten 5'-gelegenen 100 bp des H6-Promotors in einem pBS-SK-Plasmid.
Das 2,8 kb XbaI/partielles KpnI-Fragment aus pBSHIV3BEECM wurde mit XbaI/KpnI-gespaltenem pC5L ligiert, wobei pC5HIV3BEEC erhalten wurde. Ein 2,7 kb-NruI/XbaI- Fragment aus pBSHIVBEECM wurde mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase in glatte Enden überführt und in NruI/SmaI-gespaltenes pSPHAH6 eingefügt, um pHAHIV3BEEC zu erhalten.
Die Inserierungs-Plasmide pC5HIV3BEEC und pHAHIV3BEEC wurden für in vitro-Rekombinations-Experimente mit Hilfe von Standardverfahren (Piccini et al., 1987) verwendet, wobei ALVAC (CPpp) bzw. NYVAC (vP866) als Helfervirus verwendet wurden. Rekombinante Plaques wurden mit Hilfe von Standard-Plaque-Hybridisierungsanalyse identifiziert (Piccini et al., 1987), wobei eine radioaktiv markierte Sonde verwendet wurde, die für das HIV-1-env-Gen spezifisch ist. Nach drei Runden Aufreinigung wurden die rekombinanten Viren amplifiziert. Das rekombinante ALVAC-basierte HIV-1 (IIIB)-gp 160 (nicht spaltbar) wurde als vCPl26 bezeichnet und das NYVAC-basierte Äquivalent als vP1020.
Immunfluoreszenz- und Immunpräzipitations-Analysen wurden mit Hilfe vorstehend beschriebener Verfahren mit vP1020- und vCP126-infizierten Zellen durchgeführt, wobei vereinigtes menschliches Serum vn HIV-seropositiven Individuen verwendet wurde (erhalten von K. Steimer, Chiron Corp., Emeryville, CA). Immunfluoreszenz-Ergebnisse zeigten deutlich die Oberflächen-Expression des HIV-1 (IIIB)-gp160 (nichtspaltbare Form) auf der Oberfläche von Zellen, die entweder mit vCP126 oder vP1020 infiziert worden waren. Darüber hinaus zeigten Immunpräzipitations-Ergebnisse die Anwesenheit von einem HIV-1 (IIIB)-gp160 in diesen infizierten Zellen, das nicht proteolytisch in die reifen gp120- und gp41-Grundstrukturen gespalten wurde.
Eine nicht-spaltbare Form des HIV-1 (MN)-gp160 wurde ebenfalls verfolgt, und die rekombinanten Viren wurden wie folgt erhalten.
Ein PstI/XbaI-Fragment wurde durch PCR-Amplifikation aus pH6HMNE (beschrieben in Beispiel 10) erhalten, wobei die Oligonucleotide HIVMN3P (SEQ ID NR: 102) (5'-ATCATCTCTAGAATAAARATTATAGGAAAGCCCTTTCCAAGCC-3) und HIVECA (SEQ ID NR: 103) (5'-GTGCAGAGAAAAAACTGCAGTGGGAATAGGAGC-3') verwendet wurden, gefolgt von einer Spaltung mit PstI und XbaI. Dieses 1.061 bp-Fragment wurde mit dem 391 bp-EcoRI/PstI-Fragment aus pBSHIVMNT (beschrieben in Beispiel 13) und dem 4,2 kb EcoRI/XbaI-Fragment aus pH6HMNE (definiert in Beispiel 10) ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als pBSHIVMNEEC¹ bezeichnet. Die Sequenzanalyse der HIV-env-Inserierung ergab, dass ein einzelnes Nucleotid fehlte (zwischen den SacI und XbaI-Restriktionsschnittstellen). Um dies zu korrigieren wurden die nachfolgenden Manipulationen durchgeführt. Das 1.028 kb-SacI/XbaI-Fragment aus pH6HMNE wurde verwendet, um das entsprechende Fragment aus pBSHIVMNEEC zu substituieren, was in der Bildung von pBSHIVMNEEC resultierte.
Das 2,6 kb NruI/XbaI-Fragment aus pBSHIVMNEEC wurde isoliert, mit Klenow in glatte Enden überführt und in NruI/SmaI-gespaltenes pSPHAH6 (definiert in Beispiel 10) eingefügt. Das resultierende Plasmid wurde als pHAHIVMNEEC bezeichnet. Das 2,6 kb-NruI/XbaI-Fragment aus pBSHIVMNEEC wurde ebenfalls in NruI/XbaI-gespaltenes pVQH6C5LSP6 eingefügt (nachfolgend), um pC5HIVMNEEC zu erhalten.
Die Inserierungs-Plasmide, pHAHIVMNEEC und pC5HIVMNEEC, wurden in Standard-Rekombinations-Experimenten (Piccini et al., 1987) mit NYVRC (vP866) bzw. ALVAC (CPpp) als Helfervirus verwendet. Rekombinantes Virus wurde identifiziert und mit Hilfe von Standard-Plaque-Hybridisierung (Piccini et al., 1987) aufgereinigt, wobei eine radioaktiv markierte HIV-env-spezifische DNA-Sonde verwendet wurde. Gereinigtes rekombinantes Virus wurde dann amplifiziert. Die NYVAC- basierte Rekombinante, die nicht spaltbares HIV-1 (MN)-gp160 enthielt, wurde als vP1078 bezeichnet und das ALVAC-Äquivalent als vCP144.
Die Expressionsanalyse von vCP126 und vP1078 wurde, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression zu den HIV-1 (IIIB)-Gegenstücken, vP1020 und vCP126, qualitativ äquivalent war.
Beispiel 13 Expression einer nicht-spaltbaren, sekretierten Form von HIV-1-env durch ALVAC und NYVAC
ALVAC- und NYVAC-basierte rekombinante Viren wurden erzeugt, die ein HIV-1 (MN)-env exprimieren, das nicht proteolytisch gespalten wird und aufgrund der Eliminierung der Transmembran-Sequenz nahe des Carboxy-terminalen Endes des Genprodukts sekretiert wird. Ein 502 bp-PstI/XbaI-Fragment wurde erhalten, indem zunächst diese Sequenzen aus pH6HMNE (definiert in Beispiel 10) amplifiziert wurden, wobei die Oligonucleotide HIVECA (SEQ ID NR: 103) und HIVMNT1 (SEQ ID NR: 104) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTACAAACTTGCCCATTTATCCAATTCC-3') verwendet wurden, gefolgt von Spaltung mit PstI (5'-Ende) und XbaI (3'-Ende). Dieses Fragment entspricht den Nucleotiden 7.219 bis 7.808 (Ratner et al., 1985). Dieses Fragment dient als das 3'-Ende der env-Expressionskassette. Als solches, wird dem env-Genprodukt die Transmembran-Region fehlen, es wird durch ein Terminations-Codon terminiert, das von dem Oligonucleotid HIVMNT1 (SEQ ID NR: 104) bereitgestellt wird und es wird aufgrund eines Amino-Austausches an Position 511 (definiert in Beispiel 12), der durch die Verwendung des Oligonucleotids HIVECA (SEQ ID NR: 103) bereitgestellt wurde, nicht gespalten werden. Dieses 502 bp-Fragment wurde mit dem 391 bp-EcoRI/PstI-Fragment, das durch PCR aus pH6HMNE erhalten wurde, wobei die Oligonucleotide HIV3B1 (SEQ ID NR: 32) und HIVECB (SEQ ID NR: 97) verwendet wurden, und dem 4,2 kb- EcoRI/XbaI-Fragment aus pH6MNE, ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als pBSHIVMNT bezeichnet.
Das 2,2 kb-XbaI/partielles KpnI-Fragment aus pBSHIVMNT wurde isoliert und in pC5L eingefügt, das mit XbaI und KpnI gespalten worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pC5HIVMNT bezeichnet. Das NYVAC-Inserierungs-Plasmid wurde durch Isolierung des 2,1 kb-NruI/XbaI-Fragments aus pBSHIVMNT erhalten. Dieses Fragment wurde dann mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase in Anwesenheit von 2 mM dNTPs in glatte Enden überführt und in pSBHAH6 eingefügt, das mit NruI und SmaI gespalten worden war, wobei pHAHIVMNT erhalten wurde.
Die Inserierungs-Plasmide, pC5HIVMNT und pHAHIVMNT, wurden in Standard-Rekombinations-Experimenten (Piccini et al., 1987) mit ALVAC (CPpp) bzw. NYVAC (vP866) als Helfervirus verwendet. Rekombinantes Virus wurde durch Standard-Plaque-Hybridisierungstests (Piccini et al., 1987) identifiziert, wobei eine radioaktiv markierte HIV-env-spezifische Sonde verwendet wurde. Rekombinantes Virus wurde vor der Amplifikation drei Runden der Aufreinigung unterzogen. Das ALVAC-basierte HIV-1 (MN)-env (nicht spaltbar; sekretiert) wurde als vCP120 bezeichnet und das NYVAC-Äquivalent als vP994.
Immunpräzipitations-Analysen wurden für vCP120- und vP994-infizierte Zellen, wie zuvor beschrieben, durchgeführt (vorstehend), wobei vereinigte menschliche Seren aus HIV-seropositiven Individuen verwendet wurden. Sowohl vCP120 als auch vP994 exprimierten ein HIV-1 (MN)-env-spezifisches Genprodukt mit einem Molekulargewicht, das mit einem nicht spaltbaren, verkürzten Genprodukt übereinstimmte. Darüber hinaus bestätigte die Immunpräzipitation von zellfreiem Medium aus vCP120- und vP994-infizierten Zellkulturen die Sekretion dieses env-Genprodukts.
Ein ähnliches Konstrukt wurde für das HIV-1 (IIIB)-env-Gen gentechnisch erzeugt. Um das zu erreichen, wurden die folgenden Manipulationen durchgeführt. Ein 487 bp-PstI/XbaI-Fragment wurde erhalten, indem zunächst diese Sequenzen aus pBSH6HIV3B5P (definiert in Beispiel 2) amplifiziert wurden, wobei die Oligonucleotide HIVECA (SEQ ID NR: 103) und HIV3BT (SEQ ID NR: 105) (5'-ATCATCTCTAGAAT AAAAATTACAAACTTGCCCATTTATCTAATTCC-3') verwendet wurden, gefolgt von Spaltung mit PstI und XbaI. Ein 397 bp-EcoRI/PstI-Fragment wurde aus pBSHIV3BEEC isoliert, und ein 4,2 kb-EcoRI/XbaI-Fragment wurde aus pH6HIIIBEM isoliert. Diese drei Fragmente wurden zusammenligiert, um pBSHIV3BT1 zu erhalten. Das Plasmid, pH6HIIIBEM, wurde aus pBSHIV3BEII (definiert in Beispiel 2) durch Spaltung mit KpnI erhalten, um eine zweite Kopie des H6-Promotors, gekoppelt an den 5'-Bereich des HIV-1 (IIIB)-env-Gens, freizusetzen. Das 5,4 kb-KpnI-Fragment wurde dann erneut ligiert, um pBSHIV3BEII auszubilden.
Die 2,1 kb- und 2,9 kb-Fragmente, die durch Spaltung von pBSHIV3BEECM mit HindIII/XbaI erhalten wurden, wurden mit dem 105 bp-HindIII/XbaI-Fragment aus pBSHIV3BT1 ligiert, um pBSHIV3BT zu erhalten. Dieses Plasmid wurde mit NruI und XbaI gespalten, um ein 2,1 kb-Fragment auszuschneiden. Dieses Fragment wurde in glatte Enden überführt und in pSPHAH6 eingefügt, das mit NruI und SmaI gespalten worden war, um pHAHIV3BT zu erzeugen.
Das Plasmid pHAHIV3BT wurde mit NYVAC (vP866) als Helfervirus, wie vorstehend, in Rekombinations-Experimenten verwendet. Das rekombinante Virus wurde, wie vorstehend, identifiziert und aufgereinigt, und die resultierende Rekombinante wurde als vP1036 bezeichnet. Diese Rekombinante hatte alle Expressionsmerkmale, die für vCP120 und vP994 vorstehend beschrieben sind.
Beispiel 14 Expression von HIV-1 (MN)-gp120, das mit einer Transmembran-Sequenz verankert ist, durch NYVAC und ALVAC
Um die env-Region, die gp120 codiert, mit der Region, die die hydrophobe Transmembran-Sequenz codiert, zu fusionieren, wurden die folgenden Manipulationen duchgeführt. Ein 200 bp-Fragment, das der am meisten 3'-gelegenen Region der gp120-codierenden Sequenz entspricht, wurde durch PCR aus pH6HMNE (definiert in Beispiel 10) erhalten, wobei die Oligonucleotide HIV3B1 (SEQ ID NR: 32) und HIVMN18 (SEQ ID NR: 106) (5'-GCCTCCTACTATCATTATGAATAATCTTTTTCTCTCTG-3') verwendet wurden. Dieses Fragment wurde durch PCR an die anelierten Oligonucleotide HIVTMI (SEQ ID NR: 107) (5'-TTATTCATAATGATAGT AGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTCTCTGTAGTGAATAGAGTTAGGC AGGGATAA-3') und HIVTM2 (SEQ ID NR: 108) (5'-TTATCCCTGCCTAA CTCTATTCACTACAGAGAGTACAGCAAAAACTATTCTTAAACCTACCAAGCCTCCTACTATC ATTATGAATAA-3') fusioniert, wobei die Oligonucleotide HIV3B1 (SEQ ID NR: 32) und HIVTM3 (SEQ ID NR: 109) (5'-ATCATCTCTAGAATAAAAATTATCCCTGCCTAACTCTATTCAC-3') verwendet wurden. Die Oligonucleotide HIVTMI (SEQ ID NR: 107) und HIVTM2 (SEQ ID NR: 108) entsprechen den Nucleotiden 7.850 bis 7.934 (Ratner et al., 1985) und repräsentieren die Region, die die hydrophobe Anker-Sequenz des HIV-env-Gens codiert. Die Fusion mit HIVTM3 (SEQ ID NR: 109) erzeugt gentechnisch das 3'-Ende der sich ergebenden Kassette mit einem Terminationscodon und einer 3'-XbaI-Restriktionsschnittstelle. Das erhaltene Fragment wurde mit EcoRI/XbaI gespalten und mit pH6HMNE ligiert, das mit EcoRI und XbaI gespalten worden war, um pBHSIBMN120T zu erhalten.
Das 1,7 bp-NruI/XbaI-Fragment aus pBSHIVMN120T, das die am meisten 3'-gelegenen 26 bp des H6-Promotors und die vollständige HIV-1-Kassette enthält, wurde isoliert und in das 5,1 kb-NruI/XbaI-Fragment von pVQH6C5LSP6 eingefügt, wobei pCSHIVMN120T erhalten wurde. Das Plasmid pVQH6C5LSP6 wurde wie folgt erhalten.
pC5L (definiert in Beispiel 10) wurde innerhalb des Polylinkers mit Asp718 und NotI gespalten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit mit Kinase behandelten und anelierten Oligonucleotiden CP26 (SEQ ID NR: 110) (5'-GTACGTGACTAATTAGCTATAAAAAGGATCCGGTACCCTCGAGTCTAGAATCGATCCCGGGT TTTTATGACTAGTTAATCAC-3') und CP27 (SEQ ID NR: 111) (5'-GGCCGTGATTAACTAGTCATAAAAACCCGGGATCGATTCTAGACTCGAGGGTACCGGATCCT TTTTATAGCTAATTAGTCAC-3') (enthaltend eine unbrauchbar gemachte Asp718-Restriktions-schnittstelle, Translations-Stopp-Codons in 6 Leserahmen, das frühe Vaccinia-Transkriptions-Terminationssignal (Yuen and Moss, 1987), BamHI-, KpnI-, XhoI-XbaI-, ClaI- und SmaI-Restriktionsschnittstellen, das frühe Vaccinia-Transkriptions-Terminationssignal, Translations-Stopp-Codons in 6 Leserahmen und eine unbrauchbar gemachte NotI-Restriktionsschnittstelle) ligiert, wobei das Plasmid pC5LSP erzeugt wurde.
pC5LSP wurde mit BamHI gespalten und mit den anelierten Oligonucleotiden CP32 (SEQ ID NR: 112) (5'-GATCTTAATTAATTAGTCATCAGGCAGGGCGRGAACGAGACTATCTGCTCGTTAATTAATTA GGTCGACG-3') und CP33 (SEQ ID NR: 113) (5'-GATCCGTCGACCTAAT TAATTAACGAGCACATAGTCTCGTTCTCGCCCTGCCTGATGACTAATTAATTAA-3') ligiert, um pVQC5LSP6 zu erzeugen.
Das 1,7 kb-NruI/XbaI-Fragment aus pBSHIVMN120T wurde ebenfalls in glatte Enden überführt und in pSPHAH6 eingefügt, das mit NruI und SmaI gespalten worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pHAHIVMN120T bezeichnet.
Die Inserierungs-Plasmide, pC5HIVMN120T und pHAHIVMN120T wurden in Standard-Rekombinations-Experimenten (Piccini et al., 1987) mit ALVAC bzw. NYVAC als Helfervirus verwendet. Rekombinantes Virus wurde mit Hilfe von Standard-Plaque-Hybridisierung (Piccini et al., 1987) identifiziert und aufgereinigt, wobei eine radioaktiv markierte HIV-1-gp120-spezifische DNA-Sonde verwendet wurde. Die reinen Populationen wurden amplifiziert, und die ALVAC-basierte verankerte HIV-1 (MN)-gp120-Rekombinante wurde als vCP138 bezeichnet. Das NYVAC-basierte Äquivalent wurde als vP1035 bezeichnet.
Immunfluoreszenz- und Immunpräzipitations-Analysen wurden mit Hilfe von Standardverfahren (vorstehend) durchgeführt, um die Expression des verankerten HIV-1 (MN)-gp120 in vP138- und vP1035-infizierten Zellen zu überprüfen. Die Tests wurden durchgeführt, indem vereinigte menschliche Seren von HIV-seropositiven Individuen verwendet wurden (erhalten von Dr. K. Steimer, Chiron Corp., Emeryville, CA). Die Untersuchung von Oberflächen-Immunfluoreszenz zeigte, dass vCP138- und vP1035-infizierte Zellen HIV-1 (MN)-gp120 in der Plasmamembran enthielten. Signifikanterweise war die Oberflächenfärbung von vCP138- und vP1035-infizierten Zellen, verglichen mit Zellen, die mit rekombinanten Viren infiziert worden waren (d. h. vCP125, vCP124, vP1004 und vP1008), die gp160 oder ein nicht-verankertes gp120 exprimieren, verstärkt. Die Ergebnisse aus Immunpräzipitations-Analysen bestätigten die Expression von gp120 in vCP138- und vP1035-infizierten Zellen und dass das exprimierte Produkt von der erwarteten molekularen Masse war.
Beispiel 15 Erzeugung einer NYVAC/HIV-I-GAG (Protease^–)-Rekombinante
Das Plasmid pSD542 (ein NYVAC-TK-Locus-Spenderplasmid; siehe Beispiel 5) wurde aus dem Plasmid pSD460 erhalten (Tartaglia et al., 1992), indem Vektorplasmide pSD513, wie vorstehend in Beispiel 7 beschrieben, gebildet wurden. Die Polylinker-Region in pSD513 wurde durch Spaltung mit PstI/BamHI und Ligieren an die analierten synthetischen Oligonucleotide MPSYN288 (SEQ ID NR: 114) (5'-GGTCGACGGATCCT- 3') und MPSYN289 (SEQ ID NR: 115) (5'-GATCAGGATCCGTCGACCTGCA-3') modifiziert, wobei das Plasmid pSD542 resultierte.
Ein Plasmid, pHXB2D, das die menschliche Immunschwächevirus Typ I (HIV-1)-cDNA-Sequenz enthielt, wurde von Dr. R. C. Gallo (NCI-NIH) erhalten. Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen die flankierenden Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem das 1.625 bp BglII-Fragment von pHXB2D, das das 5'-Ende des gag-Gens enthält, in das 4.075 bp-BglII-Fragment von pSD542 cloniert wurde. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG2 genannt.
Das 3'-Ende des gag-Gens wurde dann stromabwärts vom Rest des gag-Gens cloniert. Dies wurde erreicht, indem ein 280 bp-ApaI-BamHI-PCR-Fragment, das das 3'-Ende des gag-Gens enthielt, in das 5.620 bp-ApaI-BamHI-Fragment von pHIVG2 cloniert wurde. Dieses PCR-Fragment wurde aus dem Plasmid pHXB20 mit den Oligonucleotiden HIVP5 (SEQ ID NR: 116) (5'-TGTGGCAAAGAAGGGC-3') und HIVP6 (SEQ ID NR: 117) (5'-TTGGATCCTTATTGTGACGAGGGGTC-3') erzeugt. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG3 genannt.
Der I3L-Promotor wurde dann stromaufwärts des gag-Gens cloniert. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIVL17 (SEQ ID NR: 118) (5'-GATCTTGAGATAAAGTGAAAATATATATCATTATATTACAAAGTACAATTATTTAGGTTTAA TCATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGAT-3') und HIV118 (SEQ ID NR: 119) (5'-CGATCTAATTCTCCCCCGCTTAATACTGACGCTCTCG CACCCATGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGTAATATAATGATATATATTTTCACTTTAT CTCAA-3'), die den Vaccinia-Virus I3L-Promotor und das 5'-Ende des gag-Gens codieren, in das partielle 5.540 bp-BglII-ClaI-Fragment von pHIVG3 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG4 genannt.
PHIVG4 wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP866 (NYVAC) als Helfervirus verwendet, wobei vP969 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Analysen wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob vP969 authentisches HIV-1-gag-Vorläuferprotein exprimiert.
Lysate aus den infizierten Zellen wurden auf Expression des HIV-1-gag-Vorläufers analysiert, wobei vereinigtes Serum von HIV-1-seropositiven Individuen verwendet wurde (erhalten von Chiron, Emeryville, CA). Die Seren wurden mit vP866-infizierten Vero-Zellen präadsorbiert. Die präadsorbierten Seren wurden in einer Übernacht-Inkubation bei 4°C an Protein A-Sepharose gebunden. Nach dieser Inkubationsperiode wurde das Material 4 × mit 1 × Puffer A gewaschen. Die mit normalen menschlichen Seren und Protein A-Sepharose vorgeklärtes Lysate wurden dann mit den HIV-1-seropositiven menschlichen Seren, die an Protein A-Sepharose gebunden waren, über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach der Übernacht-Inkubationsperiode wurden die Proben 4 × mit 1 × Puffer A und 2 × mit einem LiCl₂/Harnstoff-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden durch die Zugabe von 2 x Laemmli-Puffer (125 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol) und 5 Minuten Kochen von den Immunkomplexen dissoziiert. Die Proteine wurden in einem 10%-Dreyfuss-Gelsystem (Dreyfuss et al., 1984) fraktioniert, fixiert und für die Fluorographie mit 1 M Na-Salicylat behandelt. Die menschlichen Seren von HIV-1-seropositiven Individuen präzipitierten spezifisch das HIV-1-gag-Vorläufer-Protein aus vP969-infizierten Zellen, präzipitierten jedoch nicht HIV-1-spezifische Proteine aus scheininfizierten oder NYVAC-infizierten Zellen.
Beispiel 16 Erzeugung einer NYVAC/HIY-1-gag/pol-Rekombinante Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 1.625 bp BglII-Fragments von pHXB2D, enthaltend das 5'-Ende des gag-Gens, in das 4.075 bp-BglII-Fragment von pSD542 (definiert in Beispiel 15) erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG2 genannt.
Das 3'-Ende des gag-Gens wurde dann in pHIVG2 cloniert. Dies wurde durch Clonierung eines 280 bp ApaI-BamHI-PCR-Fragments, enthaltend das 3'-Ende des gag-Gens, in das 5.620 bp-ApaI-BamHI-Fragment von pHIVG2 erreicht. Dieses PCR-Fragment wurde mit den Oligonucleotiden HIVP5 (SEQ ID NR: 116) und HIVP6 (SEQ ID NR: 117) aus dem Plasmid pHXB2D erzeugt. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG3 genannt.
Der I3L-Promotor wurde dann stromaufwärts des gag-Gens cloniert. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIVL17 (SEQ ID NR: 118) und HIVL18 (SEQ ID NR: 119), codierend den Vaccinia-Virus I3L-Promotor und das 5'-Ende des gag-Gens, in das partielle 5.540 bp-BglII-ClaI-Fragment von pHIVG3 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG4 genannt.
Der Teil des gag-Gens, der p24, p2, p7 und p6 codiert, wurde dann eliminiert. Dies wurde durch Clonieren der Oligonucleotide HIVL19 (SEQ ID NR: 120) (5'-CTGACACAGGACACAGC AATCAGGTCAGCCAAAATTACTAATTTTTATCTCGAGGTCGACAGGACCCG-3') und HIVL20 (SEQ OD NR: 121) (5'-GATCCGGGTCCTGTCGACCTCGAGATAAAAATT AGTAATTTTGGCTGACCTGATTGCTGTGTCCTGTGTCAG-3') in das partielle 4.450 bp-PvuII-BamHI-Fragment von pHIVG4 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG5 genannt.
Der Rest des gag-Gens sowie das pol-Gen, wurden dann stromabwärts des p17-"Gens" cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.955 bp-ClaI-SalI-Fragments von pHXB2D, enthaltend das meiste des gag-Gens und das vollständige pol-Gen, in das 4.150 bp-ClaI-SalI-Fragment von pHIVG5 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG6 genannt.
Überflüssige nicht codierende 3'-Sequenz wurde dann eliminiert. Dies wurde durch Clonierung eines 360 bp-Af1II-BamHI-PCR-Fragments, enthaltend das 3'-Ende des pol-Gens, in das 8.030 bp-Af1II-BamHI-Fragment von pHIVG6 erreicht. Dieses PCR-Fragment wurde aus dem Plasmid pHXB2D mit den Oligonucleotiden HIVP7 (SEQ ID NR: 122) (5'-AAGAAAATTATAGGAC-3') und HIVP8 (SEQ ID NR: 123) (5'-TTGGATCCCTAATCCTCATCCTGT-3') erzeugt. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG7 genannt.
pHIVG7 wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP866 (NYVAC) als Helfervirus verwendet, wobei vP989 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP989-infizierten Zellen, zum Nachweis der Expression des HIV-1-gag-Vorläufer-Proteins, wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-1-spezifische Arten wurden aus scheininfizierten oder NYVAC-infizierten Vero-Zellen präzipitiert. Aus Lysaten von vP989-infizierten Zellen wurden jedoch Proteinarten, die dem gag-Vorläufer-Protein entsprechen, sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag-Spaltprodukte präzipitiert.
Beispiel 17 Erzeugung einer NYVAC/HIY-1-gag/pol- und env (gp120)-Rekombinante
Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVG7, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 16), hergestellt wurde.
PHIVG7 wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP921 als Helfervirus verwendet, wobei vP991 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP991-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression des HIV-gag-Vorläufer-Proteins wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten Vero-Zellen präzipitiert. Proteinarten, die den env- und gag-Vorläufer-Proteinen entsprechen, sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag-Spaltprodukte, wurden jedoch aus Lysaten von vP991-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 18 Erzeugung einer NYVAC/HIV-1-gag/pol- und env (gp160)-Rekombiaante
Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVG7, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 16), hergestellt wurde.
pHIVG7 wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP911 (vorstehend) als Helfervirus verwendet, wobei vP990 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP990-infizierten Zellen, zum Nachweis der Expression des HIV-1-gag-Vorläufer-Proteins, wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-1-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten Vero-Zellen präzipitiert. Proteinarten, die den env- und gag-Vorläufer-Proteinen entsprechen, sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag-Spaltprodukte, wurden jedoch aus Lysaten von vP990-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 19 Erzeugung einer NYVAC/HIV-1-p17-, p24-Rekombinante
Ein Plasmid, pHXB2D, das die HIV-1-cDNA-Sequenz enthält, wurde von Dr. R. C. Gallo (NCI-NIH) erhalten. Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial pHIVG5, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 16), hergestellt wurde.
Das 3'-Ende des p24-"Gens" wurde dann in pHIVG5 cloniert. Dies wurde durch Clonierung eins 660 bp-SalI-BamHI-PCR-Fragments, das das 3'-Ende des p24-"Gens" enthält, in das 4.450 bp-SalI-BamHI-Fragment von pHIVG5 erreicht. Dieses PCR-Fragment wurde aus dem Plasmid pHXB2D mit den Oligonucleotiden HIVP25 (SEQ ID NR: 124) (5'-AAAGTCGACCCATATCACCTAGAAC-3') und HIVP26 (SEQ ID NR. 125) (5'-TTTGGATCCTTACAAAACTCTTGCCTTAT-3') erzeugt. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG8 genannt.
Der 42 kd-Insekten-Pockenvirus-Promotor wurde dann stromaufwärts des p24-"Gens" cloniert. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIVL21 (SEQ ID NR: 126) (5'-TCGAGCAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAAATGCCTATAGTGCAGAACATCCAGGG GCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCA-3') und HIVL22 (SEQ ID NR: 127) (5'-TTTAAAGTTCTAGGTGATATGGCCTGATGTACCATTTGCC CCTGGATGTTCTGCACTATAGGCATTTTATATTGTAATTATATATTTTCAATTTTGC-3'), die den 42 kd-Insekten-Pockenvirus-Promotor und das 5'-Ende des p24-"Gens" codieren, in das 5.070 bp XhoI-NsiI-Fragment von pHIVG8 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG9 genannt.
pHIVG9 wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP866 (NYVAC) als Helfervirus verwendet, wobei vP970 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP970-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression des HIV-1-gag- Vorläufer-Proteins wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-1-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten oder NYVAC-infizierten Vero-Zellen präzipitiert. Eine Proteinart, die p24 entspricht, wurde jedoch aus Lysaten von vP970-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 20 Erzeugung einer NYVAC/HIV-1-p17-, p24- und env (gp120)-Rekombinante
Ein Plasmid, pHXB2D, das die HIV-1-cDNA-Sequenz enthält, wurde von Dr. R. C. Gallo (NCI-NIH) erhalten. Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVG9, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 19), hergestellt wurde.
pHIVG9 wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP921 als Helfervirus verwendet, wobei vP973 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP973-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression des HIV-1-gag-Vorläufer-Proteins wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-1-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten Vero-Zellen präzipitiert. Proteinarten, die env und p24 entsprechen, wurden jedoch aus Lysaten von vP973-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 21 Erzeugung einer NYVAC/HIV-1-p17, p24 und env (gp120)-Rekombinante
Ein Plasmid, pHXB2D, das die HIV-1-cDNA-Sequenz enthält, wurde von Dr. R. C. Gallo (NCI-NIH) erhalten. Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVG9, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 19), hergestellt wurde.
pHIVG9 wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP911 als Helfervirus verwendet, wobei vP971 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP971-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression des HIV-1-gag-Vorläufer-Proteins wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-1-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten Vero-Zellen präzipitiert. Proteinarten, die env und p24 entsprechen, wurden jedoch aus Lysaten von vP971-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 22 Erzeugung einer NYVAC/HIV-1- gag (Protease-) und env (verkürzt)-Rekombinante
Ein Plasmid, pHXB2D, das die HIV-1 cDNA-Sequenz enthält, wurde von Dr. R. C. Gallo (NCI-NIH) erhalten. Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVG9, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 19), hergestellt wurde.
Ein H6-reguliertes, verkürztes HIV-1-Hüllprotein-Gen wurde dann in pHIVG4 eingefügt. Dies wurde erreicht, indem das mit E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllte 1.600 bp-XhoI-NotI-Fragment von pHIVE10, das ein H6-reguliertes, verkürztes HIV-1-Hüllprotein-Gen enthält, in die aufgefüllte BamHI-Restriktionsschnittstelle von pHIVG4 cloniert wurde. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGEII genannt.
Das Plasmid pHIVE10 wurde durch Inserierung eines SacI/partiellen KpnI-Fragments aus pBSHIV3BCDT1 in die multiple Clonierungsregion von pIBI25 (IBI, New Haven, CT) erzeugt. Das Plasmid pBSHIV3BCDT1 enthält eine H6-regulierte Kassette, um eine stark verkürzte Form des HIV-1 (IIIB)-Hüllproteins (Aminosäure 1 bis 447; Ratner et al., 1985) zu exprimieren. Die Expression dieser Kassette wurde daraufhin getestet, ob die CD4-Bindung eliminiert ist, während die V3-Schleifen-Region und das T1-Epitop erhalten bleiben.
Um pBSHIV3BCDT1 zu konstruieren, wurden die folgenden Manipulationen durchgeführt. Ein durch PCR erhaltenes Fragment von 200 bp wurde aus pBSH6HIV3B5P (definiert in Beispiel 2) amplifiziert, wobei die Oligonucleotide HIV3B2A (SEQ ID NR: 96) und HIVCD4A (SEQ ID NR: 128) (5'-GCCTCCTACTATCATTATGAATAAACTGATGGGAGGGGCATAC-3') verwendet wurden. Dieses Fragment wurde durch PCR mit den anelierten Oligonucleotiden HIVTMI (SEQ ID NR: 107) und HIVTM2 (SEQ ID NR: 108) fusioniert, wobei die Oligonucleotide HIV3B2A (SEQ ID NR. 96) und HIVTM3 (SEQ ID NR: 109) verwendet wurden. Diese Manipulationen erzeugen das 3'-Ende der verkürzten env-Kassette, indem Sequenzen, die die HIV-1-env-Transmembran-Verankerung (Aminosäuren 691 bis 718; Ratner et al., 1985), ein Translations-Terminations-Codon (TAA) und eine 3'-XbaI-Restriktionsschnittstelle codieren, eingefügt werden. Dieses PCR-Fusionsprodukt wurde mit EcoRI und XbaI gespalten, wobei ein 243 bp-Fragment erhalten wurde. Das Fragment wurde mit dem 4.5 kb-EcoRI/XbaI-Fragment von pH6HIIIBE ligiert, wobei pBSHIV3BCDT1 erzeugt wurde.
PHIVGEII wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP866 (NYVAC) als Helfervirus verwendet, wobei vP979 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP979-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression des HIV-1-gag-Vorläufer-Proteins wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-1-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten oder NYVAC-infizierten Vero-Zellen präzipitiert. Proteinarten, die env- und den gag-Vorläufer-Proteinen entsprechen, wurden jedoch aus Lysaten vP979-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 23 Erzeugung einer NYVAC/HIV-1-gag/pol und env (verkürzt)-Rekombinante
Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVG7, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 16), hergestellt wurde.
Ein H6-reguliertes, verkürztes HIV-1-Hüllprotein-Gen wurde dann in pHIVG7 eingefügt. Dies wurde erreicht, indem das mit E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllte 1.600 bp-XhoI-NotI-Fragment von pHIVE10 (definiert in Beispiel 22), das ein H6-reguliertes, verkürztes HIV-1-Hüllprotein-Gen enthält, in die aufgefüllte BamHI-Restriktionsschnittstelle von pHIVG7 cloniert wurde. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGE12 genannt.
PHIVGE12 wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP866 (NYVAC) als Helfervirus verwendet, wobei vP978 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP978-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression des HIV-1-gag-Vorläufer-Proteins wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-1-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten oder NYVAC-infizierten Vero-Zellen präzipitiert. Proteinarten, die den env- und gag-Vorläufer-Proteinen entsprechen, sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag-Spaltprodukte wurden jedoch aus Lysaten von vP978-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 24 Erzeugung einer NYVAC/HIV-1-gag/pol und env (gp120)-Rekombinante
Die Sequenz, die das gag-Gen codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVG7, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 16), hergestellt wurde.
Die I3L-regulierte gag- und pol-Gene wurden dann in einen Kanarienvogel-Pockenvirus-Inserierungsvektor eingefügt. Dies wurde durch Clonierung des partiellen 4.360 bp-BglII-BamHI-Fragments von pHIVG7, das die I3L-regulierten gag- und pol-Gene enthält, in die BamHI-Restriktionsschnittstelle von pVQH6CP3L erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGEI4 genannt.
Das H6-regulierte HIV-1 (MN)-Hüllprotein (gp120)-Gen wurde dann in pHIVGEI4 eingefügt. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIVL29 (SEQ ID NR: 129) (5'-GGCCGCAAC-3') und HIVL30 (SEQ ID NR: 130) (5'-TCGAGTTGC-3') und des 1.600 bp-NruI-NotI-Fragments von pBSHIVMN120, das das H6-regulierte gp120-Gen enthält, in das 11.500 bp-NruI-XhoI-Fragment von pHIVGEI4 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGE15 genannt.
Das H6-regulierte Hüllprotein (gp120)-Gen und die I3L-regulierten gag- und pol-Gene wurden dann in einen Vaccinia-Virus-Inserierungsvektor eingefügt. Dies wurde durch Clonierung des 6.400 bp-NotI-BamHI-Fragments von pHIVGE15, das das H6-regulierte gp 120-Gen und die I3L-regulierten gag- und pol-Gene enthält, in das 4.000 bp-NotI-BglII-Fragment von pST542VcVQ erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGE16 genannt.
pHIVGE16 wurde in in vitro Rekombinations-Experimenten mit vP866 (NYVAC) als Helfervirus verwendet, wobei vP988 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP988-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression HIV-1-gag-Vorläufer-Proteins wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-1-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten oder NYVAC-infizierten Vero-Zellen präzipitiert. Proteinarten, die den env- und gag-Vorläufer-Proteinen entsprechen, sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag-Spaltprodukte wurden jedoch aus Lysaten von vP988-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 25 Erzeugung einer NYVAC/HIV-1-gag/pol-und env (gp160)-Rekombinanten
Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVGE16, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 24), hergestellt wurde.
Das gp120-Gen wurde dann durch das gp160-Gen ersetzt. Dies wurde durch Clonierung des 2.600 bp-NruI-NotI-Fragments von pH6HMNE, das das gesamte HIV-1 (MN)-Hüllprotein (gp160)-Gen enthält, in das partielle 8.000 bp-NruI-NotI-Fragment von pHIVGE16 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGE19 genannt.
pHIVGE19 wurde in in vitro Rekombinations-Experimenten mit vP866 (NYVAC) als Helfervirus verwendet, wobei vP1009 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP1009-infizierten Zellen zum Nachweis der Epression des HIV-1-gag-Vorläufer-Proteins wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-1-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten oder NYVAC-infizierten Vero-Zellen präzipitiert. Proteinarten, die den env- und gag-Vorläufer-Proteinen entsprechen, sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag-Spaltprodukte wurden jedoch aus Lysaten von vP1009-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 26 Erzeugung einer ALVAC/HIV-1-gag/pol und env (gp120)-Rekombinante
Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVGE15, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 24), hergestellt wurde.
pHIVGE15 wurde in Rekombinations-Experimenten mit ALVAC (CPpp) als Helfervirus verwendet, wobei vCP117 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Analysen wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, jedoch mit einzelligen CEF-Zellschichten, um zu bestimmen, ob vCP117 authentische HIV-1-gag- und env-Gen-Produkte exprimiert.
Lysate der infizierten Zellen wurden auf HIV-gag- und env-Genexpression analysiert, wobei Serum von HIV-1-seropositiven Individuen (erhalten vom New York State Department of Health) verwendet wurde. Die Seren wurden mit ALVAC-infizierten CEF-Zellen präadsorbiert. Die präadsorbierten Seren wurden in einer Übernacht-Inkubation bei 4° C an Protein A-Sepharose gebunden. Nach dieser Inkubationsperiode wurde das Material 4 × mit 1 × Puffer A gewaschen. Die Lysate, die mit normalen menschlichen Seren und Protein A-Sepharose vorgeklärt worden waren, wurden dann über Nacht bei 4°C mit den HIV-1-seropositiven menschlichen Seren inkubiert, die an Protein A-Sepharose gebunden waren. Nach der Übernacht-Inkubationsperiode wurden die Poben 4 × mit 1 × Puffer A und 2 × mit einem LiCl₂/Harnstoff-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden durch Zugabe von 2 x Laemmli-Puffer (125 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol) und 5 Minuten Kochen von den Immunkomplexen dissoziiert. Die Proteine wurden in einem 10% Dreyfuss-Gelsystem (Dreyfuss et al., 1984) fraktioniert, fixiert und für die Fluorogaphie mit 1 M Na-Salicylat behandelt.
Menschliche Seren von HIV-1-seropositiven Individuen präzipitierten spezifisch die HIV-1-gag- und -env-Proteine aus vCP117-infizierten Zellen, präzipitierten jedoch nicht HIV-1-spezifische Proteine aus scheininfizierten oder ALVAC-infizierten Zellen.
Beispiel 27 Erzeugung einer ALVAC/HIV-1-gag/pol- und env (gp160)-Rekombinante
Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVGE15, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 24), hergestellt wurde.
Das gp120-Gen wurde dann durch das gp160-Gen ersetzt. Dies wurde durch Clonierung des 2.600 bp-NruI-NotI-Fragments von pH6HMNE, das das gesamte HIV-1 (MN)-Hüllprotein (gp160)-Gen enthält, in das 9.800 bp-NruI-NotI-Fragment von pHIVGE15 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGE18 genannt.
Der flankierende Kanarienvogel-Pockenvirus-Arm, der im vorherigen Schritt deletiert worden war, wurde dann in pHIVGE18 cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 1.500 bp-Notl-Fragments von pHIVGE15, das den flankierenden C3-Arm enthält, in das 12.400 bp-NotI-Fragment von pHIVGE18 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGE20 genannt.
pHIVGE20 wurde in Rekombinations-Experimenten mit ALVAC (CPpp) als Helfervirus verwendet, wobei vCP130 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Analysen wurden, wie vorstehend beschrieben, mit einzelligen CEF-Zellschichten durchgeführt, um zu bestimmen, ob vCP130 authentische HIV-1-gag- und -env-Gen-Produkte exprimiert.
Lysate von den infizierten Zellen wurden auf HIV-1-gag- und env-Genexpression getestet, wobei vereinigte Seren von HIV-1-seropositiven Individuen (erhalten von Chiron, Emeryville, CA) verwendet wurden. Die Seren wurden mit ALVAC-infizierten CEF-Zellen präadsorbiert. Die präadsorbierten Seren wurden in einer Übernacht-Inkubation bei 4°C an Protein A-Sepharose gebunden. Nach dieser Inkubationsperiode wurde das Material 4 × mit 1 × Puffer A gewaschen. Die Lysate, die mit normalen menschlichen Seren und Protein A-Sepharose vorgeklärt worden waren, wurden dann über Nacht bei 4°C mit den HIV-1-seropositiven menschlichen Seren inkubiert, die an Protein A-Sepharose gebunden waren. Nach der Übernacht-Inkubationsperiode wurden die Proben 4 × mit 1 × Puffer A und 2 × mit einem LiCl₂/Harnstoff-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden durch die Zugabe von 2 × Laemmli-Puffer (125 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol) und 5 Minuten Kochen von den Immunkomplexen dissoziiert. Die Proteine wurden in einem Dreyfuss-Gelsystem (Dreyfuss et al., 1984) fraktioniert, fixiert und für die Fluorographie mit 1 M Na-Salicylat behandelt. Menschliche Seren aus HIV-1-seropositiven Individuen präzipitierten spezifisch die HIV-1-gag- und -env-Proteine aus vCP130-infizierten Zellen, präzipitierten jedoch nicht HIV-1-spezifische Proteine aus scheininfizierten oder ALVAC-infizierten Zellen.
Beispiel 28 Erzeugung einer ALVAC/HIV-1-gag/pol-Rekombinante
Ein Plasmid, pHXP2D, das die HIV-1-cDNA-Sequenz enthält, wurde von Dr. R. C. Gallo (NCI-NIH) erhalten. Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVG7, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 16), hergestellt wurde.
Die gag- und pol-Gene wurden dann zwischen flankierende Kanarienvogel-Pockenvirus-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.400 bp-SmaI-NotI-Fragments von pHIVG7, das die I3L-regulierte gag- und pol-Gene enthält, und der Oligonucleotide HIV2L6 (SEQ ID NR: 131) (5'-GGCCAAAC-3') und HIV2L7 (SEQ ID NR: 132) (5'-TCGAGTTT-3') in die SmaI-XhoI-Restriktionsschnittstelle von pSPCP3L erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG24 genannt.
pHIVG24 wurde in Rekombinations-Experimenten mit ALVAC (CPpp) als Helfervirus verwendet, wobei vCP152 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vCP152-infizierten Zellen wurden zum Nachweis der Expression der HIV-1- env- und gag-Proteine, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-1-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten oder ALVAC-infizierten Zellen präzipitiert. Proteinarten, die dem gag-Vorläufer-Protein entsprechen, sowie verschiedene Zwischenprodukten und reife gag-Spaltprodukte wurden jedoch aus Lysaten von vCP152-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 29 Erzeugung einer ALVAC/HIV-1-gag/pol und env (verkürzt)-Rekombinante
Ein Plasmid, pHXB2D, das die HIV-1-cDNA-Sequenz enthält, wurde von Dr. R. C. Gallo (NCI-NIH) erhalten. Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVG24, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 28), hergestellt wurde.
pHIVG24 wurde in Rekombinations-Experimenten mit vCP120 als Helfervirus verwendet, wobei vCP155 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vCP155-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression der HIV-1- env- und gag-Proteine wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-1-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten Zellen präzipitiert. Proteinarten, die den env- und gag-Vorläufer-Proteinen entsprechen, sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag-Spaltprodukte wurden jedoch aus Lysaten von vCP155-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 30 Erzeugung einer ALVAC/HIV-1-gag/pol und env (gp120 mit Transmembranverankerung)-Rekombinante
Ein Plasmid, pHXB2D, das die HIV-1-cDNA-Sequenz enthält, wurde von Dr. R. C. Gallo (NCI-NIH) erhalten. Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIVG24, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 28), hergestellt wurde.
pHIVG24 wurde in Rekombinations-Experimenten mit vCP138 als Helfervirus verwendet, wobei vCP156 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vCP156-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression der HIV-1- env- und gag-Proteine (einzellige CEF-Zellschicht) wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV-1-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten Zellen präzipitiert. Proteinarten, die den env- und gag-Vorläufer-Proteinen entsprechen, sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife Spaltprodukte wurden jedoch aus Lysaten von vCP156-infizierten Zellen präzipitiert.
Es wurde gezeigt, dass die Expression von HIV-1-gag-spezifischen Gen-Produkten durch Vaccinia-Virus, entweder alleine oder in Kombination mit env, zur Produktion von nichtinfektiösen Virus-ähnlichen Partikeln führt (Haffar et al., 1990; Hu et al., 1990). Vor diesem Hintergrund wurde untersucht, ob Zellen, die mit ALVAC-basierten Rekombinanten infiziert worden waren, die HIV-1-gag-pol- und -env-Gene exprimieren, ebenfalls solche Partikel produzieren. Darüber hinaus könnten dann HIV-1-Virus-ähnliche Partikel ohne irgendwelche Pockenvirus-Virion-Kontaminanten aufgereinigt werden, wenn diese ALVAC-basierten Rekombinanten verwendet werden, um Zellen, die nicht von Vögeln stammen, zu infizieren (d. h. Vero, MRC-5, etc.).
Um die Partikel-Bildung unter Verwendung von Vero-Zellen zu untersuchen, die mit vCP156 infiziert worden waren, wurde das nachfolgende Experiment durchgeführt. Vero-Zellen wurden mit einer m. o. i. von ungefähr 5 pfu pro Zelle infiziert. Nach einer Infektionsperiode von 24 Stunden wurde der Überstand abgeerntet und durch 10 min. Zentrifugation bei 2.000 UpM geklärt. Der Überstand wurde dann durch Filter zentrifugiert, die eine molekulare Ausschlussgröße von 30.000 kDa besitzen (Centricell 60, Polysciences, Inc., Warrington, PA). Somit würden alle kleineren Moleküle diese Filter passieren. Das Material, das von den Filtern zurückgehalten wurde, wurde dann in einer Standard-Western Blot-Analyse (Maniatis et al., 1990) analysiert, wobei vereinigts menschliches Serum von HIV-seropositiven Individuen (erhalten von Dr. J. Conroy, New York State Department of Health) verwendet wurde. Die Ergebnisse der Western Blot-Analyse zeigten die Anwesenheit des hauptsächlichen Kernproteins p24 und des verankerten HIV-1 (MN)-gp120 in dem Material, das durch die Filter zurückgehalten wurde. Mit dem vorstehend erwähnten Größenausschluss hätte das p24 den Filter passiert, wenn es nicht in einer höheren strukturellen Konfiguration vorgelegen hätte (d. h. Virus-ähnliche Partikel). Deshalb zeigen diese Ergebnisse deutlich, dass HIV-1-Virus-ähnliche Partikel, die die gp120-Hüllkomponente enthalten, in vCP156-infizierten Zellen produziert werden.
Beispiel 31 Expression der T1-, T2- und TH4.1-Epitope des HIV-1-env-Gens in ALVAC und NYVAC
Rekombinante Pockenviren vP1062 und vCPl46 wurden erzeugt, um die T1-, T2-, und TH4.1-Epitope von HIV-1-env (Hosmalin et al., 1991) als einzelne Peptide zu exprimieren.
Konstruktion des Plasmids p731T1. Das Plasmid pMPI3H enthält das frühe/intermediäre Vaccinia-I3L-Promotor-Element (Schmitt and Stunnenberg, 1988; Vos and Stunnenberg, 1988) in einem pUC8-Hintergrund. Das Promotor-Element wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) synthetisiert, wobei pMPVC1, ein Subclon von Vaccinia-HindIII I, als Matrize und die synthetischen Oligonucleotide MPSYN283 (SEQ ID NR: 133) (5'-CCCCCCAAGCTTACATCATGCAGTGGTTAAAC-3') und MPSYN287 (SEQ ID NR: 134) (5'-GATTAAACCTAAATAATTGT-3') als Primer verwendet wurden. Die DNA aus dieser Reaktion wurde mit HindIII und RsaI gespalten, und ein 0,1 kb-Fragment, das das Promotor-Element enthielt, wurde gereinigt. Eine Linker-Region wurde durch AnelierungPaarung komplementärer synthetischer Oligonucleotide MPSYN398 (SEQ ID NR: 135) (5'-ACAATTATTTAGGTTAACTGCA-3') und MPSYN399 (SEQ ID NR: 136) (5'-GTTAACCTAAATAATTGT-3') zusammengesetzt. Das durch PCR erhaltene Promotor-Element und die Polylinker-Region wurden mit dem Vektor-Plasmid pUC8 ligiert, das mit HindIII und PstI gespalten worden war. Das resultierende Plasmid, pMP3H, enthält die I3L-Promotor-Region von den Positionen –100 bis –6 relativ zu dem Initiations-Codon, gefolgt von einer Polylinker-Region, die HpaI-, PstI-, SalI-, BamHI-, SmaI- und EcoRI-Restriktionsschnittstellen enthält. Die Spaltung mit HpaI produziert DNA mit glatten Enden, die an Position –6 im Promotor linearisiert ist.
Eine Kassette, die das T1-Peptid, reguliert durch den Vaccinia-I3L-Promotor, enthält, wurde durch Ligieren der komplementären Oligonucleotide T1C (SEQ ID NR: 137) (5'- TAATCATGAAACAAATTATTAATATGTGGCAAGAAGAGGAAAAGCTRTGTACGCTTGACTAG TTAATCACTCGAG-3') und T1N (SEQ ID NR: 138) (5'-GATCCTCGAGTGATTAACTAGTCAAGCGTACATAGCTTTTCCTACTTCTTGCCACATATTAA TAATTTGTTTCATGATTA-3') mit dem Plasmid pMPI3H, das mit HpaI und BamHI gespalten worden war, erzeugt. Diese Ligierung stellt die letzten fünf Basenpaare des Promotors wieder her, stellt die vollständige codierende Sequenz des T1-Peptids bereit und erzeugt eine XhoI-Restriktionsschnittstelle zwischen dem Stopp-Codon und der BamHI-Restriktionsschnittstelle. Das ist das Plasmid p731T1. Die Sequenz des Fragments wurde durch Nucleotid-Sequenzanalyse überprüft.
Konstruktion des Plasmids pH6T2. Eine Kassette, die das T2-Peptid, reguliert durch den Vaccinia-H6-Promotor, enthält, wurde in zwei Schritten erzeugt: der H6-Promotor wurde über die EcoRV-Restriktionsschnittstelle aus einem Plasmid erhalten, das den synthetischen H6-Promotor (Perkus et al., 1989) enthält, wobei PCR und die Primer H6PCR1 (SEQ ID NR: 157) und H6PCR2 (SEQ ID NR: 205) (5'-TTAACGGATATCGCGATAATG-3') verwendet wurden, wobei eine 5'-HindIII-Restriktionsschnittstelle erzeugt wurde. Dieses 122 bp-Fragment, das durch PCR erhalten wurde, wurde mit HindIII und EcoRV gespalten, gefolgt von der Ligierung in gleichermassen gespaltenes pBS-SK+ (Stratagene, La Jolla, CA), wobei das Plasmid pBSH6 erzeugt wurde. Die komplementären Oligonucleotide T2C (SEQ ID NR: 139) (5'-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCACGAAGATATTATTTCTTTGTGGGATCAATCTTTAAA ATGACTAGTTAATCAG-3') und T2N (SEQ ID NR: 140) (5'-GATCCTGATTAACTAGTCATTTTAAAGATTGATCCCACARAGAAATAATATCTTCGTGCATT ACGATACAAACTTAACGGAT-3'), die das 3'-Ende des H6-Promotors von der EcoRV-Restriktionsschnittstelle aus vervollständigen, die das T2-Peptid codieren und eine BamHI-Restriktionsschnittstelle am 3'-Ende des Gens erzeugen, wurden aneliert, dann mit pBSH6 ligiert, das mit EcoRV und BamHI gespalten worden war. Dieses Plasmid wurde nach der Überprüfung des Fragments durch Nucleotid-Sequenzanalyse als pH6T2 bezeichnet.
Konstruktion des Plasmid pVQ42KTH4.1. Eine Kassette, die das TH4.1-Peptid, reguliert durch den 42 K-AmEPV-Promotor enthält, wurde durch aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen erzeugt: der 107 bp-42 K-Promotor, mit 5'-PstI und SmaI-Restriktionsschnittstellen, wurde durch PCR aus dem Plasmid p42KRABI erhalten, ein Plasmid, das das Gen für das Tollwut-Glycoprotein unter der Kontrolle des 42 K-Promotors enthält, wobei die Primer 42KVQ1 (SEQ ID NR: 141) (5'-AATTAATTAGCTGCAGCCCCGGGTCAAAAAAATATAAATG-3') und 42KVQ2 (SEQ ID NR: 142) (5'-CCTTGTACTACTTCAATTACTCTATCCATTTTATATTGTAATTATA TATTTTC-3') verwendet wurden. Die Sequenz der 107 bp-Promotor-Region dieses durch PCR-erhaltenen Fragments ist (SEQ ID NR: 143) 5'-TCAAAAAAATATAAATGATTCACCATCTGATAATTTATTGGGAAGA ATATGATAATATTTTGGGATTTCAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAA-3'. Das 159 bp-Fragment, das durch PCR erhalten wurde, wurde durch eine zweite PCR mit den codierenden Sequenzen von TH4.1 fusioniert, wobei dieses Fragment und synthetische Oligonucleotide, TH41C (SEQ ID NR: 144) (5'-ATGGATAGAGTAATTGAAGTAGTACAAGGAGCTTATAGAGCTATTAGATGACTAGTTAATCA CTCGAGGATCC-3') und TH41N (SEQ ID NR: 145) (5'-GGATCCTCGAGTGATTAACTAGTCATCTAATAGCTCTATAAGCTCCTTGTACTACTTCAATT ACTCTATCCAT-3'), die das TH4.1-Peptid codieren, als Matrize und die Primer 42 KTH41 (SEQ ID NR: 146) (5'-ATCATCGGATCCTCGAGTGATTAAACTAGTCATCTAATAGCTC-3') und 42KVQ1 (SEQ ID NR: 141) verwendet wurden. Dieses 210 bp-Fragment, das durch PCR erhalten wurde, wurde in 5'-Richtung erweitert, indem eine BamHI-Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende eingefügt wurde, wobei das Fragment und die synthetischen Oligonucleotide VQC (SEQ ID NR: 147) (5'-TTAATCAGGATCCTTAATTAA TTAGTTATTAGACAAGGTGAAAACGAAACTATTTGTAGCTTAATTRATTAGCTGCAGCCCGG G-3') und VQN (SEQ ID NR: 148) (5'-CCCGGGCTGCAGCTAATTAATTAAGC TACAAATAGTTTCGTTTTCACCTTGTCTAATAACTAATTAATTAAGGATCCTGATTAA-3') als Matrize für eine dritte PCR verwendet wurden, wobei die Primer 42KTH41 (SEQ ID NR: 146) und BAMVQ (SEQ ID NR: 149) (5'-TTAATCAGGATCCTTAATTAATTAGTTRTTAGAC-3') verwendet wurden. Nach der Nucleotid-Sequenzanalyse ergab sich ein Fehler in der Sequenz von Oligonucleotid 42KTH41 (SEQ ID NR: 146), derart, dass eine zusätzliche Base (ein A) nach Position 24 eingefügt worden war, wie durch die Unterstreichung in der vorstehenden Sequenz für 42KTH41 angezeigt. Diese wurde mit einer abschließenden PCR korrigiert, bei der das 272 bp-Fragment, das aus der dritten PCR erhalten wurde, als Matrize mit den Primern BAMVQ (SEQ ID NR: 149) und 42KTH41A (SEQ ID NR: 150) (5'-ATCATCGGATCCTCGAGTGATTAACTAGTCATCTAATAGCTC-3'), eingesetzt wurde. Nach der abschließenden PCR sollte die Kassette in 5'-Richtung zu 42K-TH4.1 BamHI-, PstI- und SmaI-Restriktionsschnittstellen zusammen mit XhoI und BamHI 3'-Restriktionsschnittstellen enthalten. Dieses 271 bp-Fragment, das durch PCR erhalten wurde, wurde mit BamHI gespalten und in die BamHI-Restriktionsschnittstelle von pBS-SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) cloniert, wobei das Plasmid pVQ42KTH4.1 erzeugt wurde. Nucleotid-Sequenzanalyse dieses Plasmids versicherte, dass die Sequenz des Promotors und der codierenden Region korrekt war. Es wurde jedoch eine 3 bp-Deletion offenbart, die in dem Verlust der 3'-BamHI-Restriktionsschnittstelle resultiert.
Konstruktion des Plasmids pT1T2TH4.1. Diese drei Kassetten wurden in einem enzelnen Plasmid pT1T2TH4.1 so kombiniert, dass I3L-T1 auf die folgende Art und Weise in entgegengesetzter Orientierung zu den beiden anderen Genen vorliegt: ein 170 bp-HindIII/XhoI-Fragment wurde aus p731T1 isoliert und in das gleichermassen gespaltene pH6T2 ligiert, wobei pT1T2 erzeugt wurde. Ein 290 bp-BamHI/SacI-Fragment aus pVQ42KTH4.1 wurde in das gleichermassen gespaltene pT1T2 ligiert, wobei pT1T2TH4.1 erzeugt wurde. Die Sequenz der Inserierung wurde durch Nucleotid-Sequenzanalyse überprüft.
pC5LSP (definiert in Beispiel 14) wurde mit EcoRI gespalten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit dem selbst-anelierten Oligonucleotid CP29 (SEQ ID NR: 151) (5'-AATTGCGGCCGC-3') ligiert, das mit NotI gespalten und in linearer Form gereinigt worden war, gefolgt von einer Ligierung mit sich selbst. Dieses Verfahren fügte eine NotI-Restriktionsschnittstelle in pC5LSP ein, wobei pNC5LSP5 erzeugt wurde.
Das Plasmid pSD550 wurde aus pSD548 wie folgt erhalten. Das Plasmid pSD548 (Tartaglia et al., 1992) ist ein Vaccinia-Vektorplasmid, in dem der I4L-ORF (Goebel et al., 1990a, b) durch eine Clonierungs-Region ersetzt wurde, die aus BglII und Smal-Restriktionsschnittstellen besteht. Um die Multi-Clonierungs-Region zu erweitern, wurde pSD548 mit BglII und SmaI gespalten und mit den analierten komplementären synthetischen Oligonucleotiden 539A (SEQ ID NR: 152) (5'-AGAAAAATCAGTTAGCTARGATCTCCCGGGCTCGAGGGTACCGGATCCTGATTAGTTAATTT TTGT-3') und 539B (SEQ ID NR: 153) (5'-GATCACAAAAATTAACTAATCAG GATCCGGTACCCTCGAGCCCGGGAGATCTTAGCTAACTGATTTTTCT-3') ligiert. In dem resultierenden Plasmid pSD550 enthält die Multi-Clonierungs-Region BglII-, SmaI-, XhoI-, KpnI- und BamHI-Restriktionsschnittstellen.
Das 602 bp-XhoI-Fragment aus pT1T2TH4.1, das die Gene für die Epitope, getrieben durch ihre jeweiligen Promotoren, enthält, wurde in die Spender-Plasmide pNC5LSP5 und pSD550 in deren XhoI-Restriktionsschnittstellen cloniert. Nucleotid-Sequenzanalyse wurde verwendet, um die Sequenz und die Orientierung der Inserierung zu überprüfen. Die resultierenden Plasmide pC5T1T2TH4.1 und pI4T1T2TH4.1 wurden in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC und NYVAC verwendet, um die rekombinanten Viren vCP146 bzw. vP1062 zu erzeugen. Durch Hybridisierung einer spezifischen DNA-Sonde auf virale Plaques wurde gezeigt, dass diese rekombinanten Viren die gewünschten Gene enthalten.
Beispiel 32 Expression von zwei Fusionspeptiden, die die T1-, T2- und TH4.1-Epitope von HIV-1-env mit und ohne eine Transmembran-Verankerungsdomäne aus HIV-1-env enthalten
Rekombinante Pockenviren vP1060, vP1061, vCP154 und vCP148 wurden erzeugt, um ein Fusionspeptid zu exprimieren, das aus den Signalsequenzen von HIV-1-env besteht, die durch spaltbare Linker-Regionen an Sequenzen gekoppelt sind, die den T1-, T2- und TH4.1-Epitopen von HIV-1-env entsprechen. vP1060 und vCP154 unterscheiden sich von vP1061 und vCP148 derart, dass die ersten beiden rekombinanten Viren das Fusionspeptid gemeinsam mit Sequenzen exprimieren, die der Transmembran-Region von HIV-1-env entsprechen.
Beide Fusionspeptide enthalten den 51 Aminosäuren-N-terminalen Bereich von HIV-1 (IIIB)-env, die Reste 1 bis 50 (plus initiierendes Met), basierend auf Ratner et al., (1985). Die Aminosäuresequenz dieser Signalregion (SEQ ID NR: 154) ist MKEQKTVAMRVKEKYQHLWRWGWRWGTMLLGMLMICSATEKL WVTVYYGVP. Diese wird gefolgt durch die T1-, T2- und TH4.1-Epitope (Hosmalin et al., 1991), durch eine spaltbare Linker-Region von bis zu 5 Aminosäuren Länge getrennt von dem Signal, von einander und von der Verankerungs-Sequenz, sofern diese vorliegt. Die Aminosäuresequenz dieser Region des Peptids (SEQ ID NR: 155) ist [Signal]-PFR-KQIINMWQEVGKAMYA-PPFRK-HEDIISLWDQSLK-PPFRK-DRVIEWQGRAIR-[PPFRK-Verankerung]. Die Verankerungs-Domäne ist eine 28 Aminosäuren-Transmembran-Region von HIV-1 (IIIB)-env, Reste 691 bis 718. Die Aminosäuresequenz dieser Region (SEQ ID NR: 156) ist LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSVVNRVRQG-[Stop].
Für beide Versionen des Fusionspeptids wurden der H6-Promotor und die HIV-1-env-Signalsequenzen durch PCR aus dem Plasmid pBSH6HIV3B5P (definiert in Beispiel 2) erhalten, wobei die Primer H6PCR1 (SEQ ID NR: 157) (5'-ACTACTAAGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG-3') und PCRSIGT1 (SEQ ID NR: 158) (5'-CATATTAATTTGTTTTCTAAAAGGAGGTACCCCATAATAGACTGTG-3') verwendet wurden. Dieses 341 bp-Fragment, das durch PCR erhalten wurde, besteht aus einer 5'-HindIII-Restriktionsschnittstelle, gefolgt von dem H6-Promotor und codierenden Sequenzen für das Signal, dem Linker und den ersten 6 Aminosäuren des T1-Peptids.
Der Rest der codierenden Region für das Konstrukt ohne die Transmembran-Region wurde durch PCR-Amplifikation der Oligonucleotide T2T4A (SEQ ID NR: 159) (5'-GCTCCTCCTTTTAGAAAACACGAAGATATTATTTCTTTGTGGGATCAATCTTTAAAACCTCC TTTTAGAAAAGATAGAGTAATTGAAGTAGTAC-3') und T2T4B (SEQ ID NR: 160) (5'-GTACTACTTCAATTACTCTATCTTTTCTAAAAGGAGGTTTTAAAGATTGATCC CACRAAGAAATAATATCTTCGTGTTTTCTAAAAGGAGGAGC-3') erzeugt, wobei die Primer PCRTIT2 (SEQ ID NR: 161) (5'-AAACAAATTATTAATATGTGG CAAGAAGTAGGAAAAGCTATGTACGCTCCTCCTTTTAGAAAACACGAAG-3') und PCRT4END (SEQ ID NR: 162) (5'-ACTACTTCTAGATTATCTAATAGCTCTATA AGCTCCTTGTACTACTTCAATTACTC-3') verwendet wurden. Dieses 177 bp-Fragment, das durch PCR erhalten wurde, codiert das T1-Peptid, eine Linker-Region, das T2-Peptid, eine andere Linker-Region und das TH4.1-Peptid, gefolgt von einer 3'-XbaI-Restriktionsschnittstelle. Dieses Fragment wurde mit dem 314 bp-PCR-Fragment, das durch PCR erhalten wurde und die Promotor- und Signalsequenzen enthält, durch PCR mit den Primern H6PCR1 (SEQ ID NR: 157) und PCRC4END (SEQ ID NR: 162) fusioniert. Nachfolgend der Spaltung dieses 473 bp PCR-Fragments mit HindIII und XbaI wurde aus einem Agarosegel ein Fragment von 455 bp isoliert, mit einem in ähnlicher Weise gespaltenem pBS-SK ligiert und die Sequenz der Inserierung durch Nucleotid-Sequenzanalyse verifiziert. Das resultierende Plasmid wurde als pBST1T2TH4.1 bezeichnet.
Der Rest der codierenden Region der Version mit der Transmembran-Verankerung wurde durch PCR-Amplifikation der Oligonucleotide T2T4A (SEQ ID NR: 159) und T2T4B (SEQ ID NR: 160) erzeugt, wobei die Primer PCRTIT2 (SEQ ID NR: 161) und PCRT4TM (SEQ ID NR: 163) (5'-TACTATCATTATGAATAATTTTCTAAAAGG AGGTCTAATAGCTCTATAAGCTCCTTGTACTACTTCAATTACTC-3') verwendet wurden, wobei das 3'-Ende verändert wurde, um die Transmembran-Region einzupassen. Dieses 195 bp-Fragment, das durch PCR erhalten wurde, wurde durch PCR mit Oligonucleotiden, die die Verankerung umfassen, HIVTMI (SEQ ID NR: 107) und HIVTM2 (SEQ ID NR: 108), fusioniert, wobei die Primer PCRTIT2 (SEQ ID NR: 161) und PCRT4END (SEQ ID NR: 162) verwendet wurden. Dieses 276 bp-Fragment, das durch PCR erhalten wurde, wurde mit dem durch PCR erhaltenen 314 bp-Fragment, das den Promotor und Signalsequenzen enthält, durch PCR mit den Primern H6PCR1 (SEQ ID NR: 157) und PCRT4END (SEQ ID NR: 162) fusioniert. Nach der Spaltung dieses durch PCR-erhaltenen 572 bp-Fragments mit HindIII und XbaI wurde aus einem Agarosegel ein Fragment von 554 bp isoliert, in das gleichermassen gespaltene pBS ligiert und die Sequenz der Inserierung durch Nucleotid-Sequenzanalyse überprüft. Das resultierende Plasmid wurde als pBST1T2TH4.1A bezeichnet.
pC5LSP (definiert in Beispiel 14) wurde mit BamHI gespalten und an die gepaarten Oligonucleotide CP32 (SEQ ID NR: 112) und CP33 (SEQ ID NR: 113) ligiert, wobei pVQC5LSP6 erzeugt wurde. pVQC5LSP6 wurde mit EcoRI gespalten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit dem selbstanelierten Oligonucleotid CP29 (SEQ ID NR: 151) ligiert, das mit NotI gespalten und in linearer Form gereinigt worden war, gefolgt von der Ligierung mit sich selbst. Dieses Verfahren fügte eine NotI-Restriktionsschnittstelle in pVQC5LSP6 ein, wobei pNVQC5LSP7 erzeugt wurde.
Beide Kassetten wurden einzeln zwischen die XhoI- und XbaI-Restriktionsschnittstellen des Inserierungs-Plasmids pNVQC5LSP7 eingefügt. Diese Plasmide, pC5ST1T1TH4.1 und pC5ST1T2TH4.1A, wurden verwendet, um die Kanarienvogel-Pockenvirus-Rekombinanten vCP148 bzw. vCP154 zu erzeugen. BamHI-SmaI-Fragmente wurden aus pC5ST1T1TH4.1 und pC5ST1T2TH4.1A ausgeschnitten und mit dem gleichermassen gespaltenen pSD550 (definiert in Beispiel 31) ligiert, wobei die Plasmide pI4ST1T2TH4.1 bzw. pI4ST1T1TH4.1A erzeugt wurden. Diese Plasmide wurden in Rekombinations-Experimenten mit NYVAC als Helfervirus verwendet, wobei die Rekombinanten vP1061 bzw. vP1060 resultierten. Durch Hybridisierung einer spezifischen DNA-Sonde auf virale Plaques wurde gezeigt, dass diese rekombinanten Viren die gewünschten Gene enthalten.
Beispiel 33 Expression des HIV-1-nef-Gens in ALVAC, TROVAC und NYVAC
Rekombinante Pockenviren vP1084, vFP174 und vCP168, die HIV-1-nef (MN) exprimieren, wurden wie folgt erzeugt:
Der I3L-Promotor wurde durch PCR aus dem Plasmid pMPI3H erhalten, wobei die Primer I3PCR1 (SEQ ID NR: 164) (5'-ATCATCGGATCCAAGCTTACATCATGCAGTGG-3') und PI3NEF2 (SEQ ID NR: 165) (5'-CGTTTTGACCATTTGCCACCCATGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTG-3') verwendet wurden. Die codierende Region von nef wurde durch PCR-Amplifikation von pMN1.8-10 (ein Clon von dem Teil des MN-Genoms zwischen den SstI-Restriktionsschnittstellen an Position 7.792 und 9.595) erzeugt, wobei die Primer PI3NEF1 (SEQ ID NR: 166) (5'-AGTACAATTATTTAGGTTTAATCATGGGTGGCAAATGGTCAAAACG-3') und PNEFBAM (SEQ ID NR: 167) (5'-ATCATCGGATCCTAACACTTCTCTCTCCGG-3') verwendet wurden. Die Fusion der codierenden Region mit dem Promotor wurde durch Amplifikation der vorausgehenden PCR-Produkte erreicht, wobei die Primer I3PCR1 (SEQ ID NR: 164) und PNEFBAM (SEQ ID NR: 167) verwendet wurden. Nach der Spaltung dieses Produkts mit BamHI wurde ein Fragment von 0,7 kb aus einem Agarosegel isoliert und mit dem gleichermassen gespaltenen pBS-SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) ligiert, wobei das Plasmid pI3NEF erzeugt wurde. Es war an dieser Stelle, dass zum ersten Mal Sequenz-Abweichungen beobachtet wurden. Es wurde bestimmt, dass die Sequenz der Kassette sich aufgrund von Abweichungen in dem Plasmid pMN1.8-10 (bereitgestellt von Dr. R. C. Gallo, NCI-NIH) von der publizierten Sequenz (Gurgo et al., 1988, GenBank-Zugangs-Nummer M17449), unterscheidet. Diese Unterschiede sind nachfolgend in Bezug auf die publizierte Sequenz zusammengefasst.
Die beiden stillen Mutationen in der Kassette (an den Positionen 8.834 und 9.127) waren offensichtlich Fehler bei der PCR. Da es keine Auswirkung auf das codierte Protein gibt, wurde diesen erlaubt, zu verbleiben. Die Leserahmen-Verschiebung an 9.309 resultiert in einem verlängerten offenen Leserahmen, der mehr anderen HIV-1-Isolaten ähnelt. In Übereinstimmung mit der publizierten Größe von nef aus dem MN-Isolat erforderte diese Kassette eine vierte PCR, um das verkürzte 3'-Ende der codierenden Region zu erzeugen.
Das Entfernen der zusätzlichen Base an Position 9.930 wurde durch PCR-Amplifikation der Inserierung in pI3NEF mit den Primern I3PCR1 (SEQ ID NR: 164) und PNEFFIXI (SEQ ID NR: 168) (5'-ATCATCGGATCCTAACACTTCTCTCTCCGGGTCATCCATCCATGCTGGC TCATAG-3') erreicht. Nach der Spaltung dieses durch PCR erhaltenen 678 bp-Fragments mit BamHI, wurde aus einem Agarosegel ein Fragment von 660 bp isoliert und mit dem gleichermassen gespaltenen pBS ligiert, wobei das Plasmid pBSI3NEF erzeugt wurde. Die Inserierung wurde durch Nucleotid-Sequenzanalyse überprüft.
Das 660 bp-BamHI-Fragment aus pBSI3NEF, das das nef-Gen enthält, wurde in die BamHI-Restriktionsschnittstelle des Inserierungs-Plasmids pNVQC5LSP7 (definiert in Beispiel 32) eingefügt. Das resultierende Plasmid, pC5I3NEF, wurde für eine Rekombination in den C5-Locus von ALVAC verwendet, wobei die Rekombinante vCP168 erzeugt wurde. Das gleiche 660 bp-BamHI-Fragment wurde auch in die BamHI-Restriktionsschnittstelle des Inserierungs-Plasmids pSD550 (definiert in Beispiel 31) eingefügt, wobei das Plasmid pI4I3NEF erzeugt wurde. Eine Rekombination dieses Plasmids mit NYVAC erzeugte die Rekombinante vP1084.
Ein Inserierungs-Plasmid für den F16-Locus von TROVAC wurde auf die folgende Art und Weise erhalten. Ein 7,3 kb NaeI/NdeI-Fragment wurde aus einem Plasmid isoliert, das das 10,5 kb-HindIII-Fragment des Hühner-Pockenvirus enthielt, das von Tartaglia et al. (1990) beschrieben wurde, und in das gleichermassen gespaltene pUC9 ligiert, wobei das Plasmid pRW866 erzeugt wurde.
pUC9 wurde mit PvuII gespalten und ein EcoRI-Linker wurde zwischen die PvuII-Restriktionsschnittstellen ligiert, wobei das Plasmid pRW715 erzeugt wurde. Eine Clonierungsstelle, die durch Hühner-Pockenvirus-Sequenzen flankiert ist, wurde durch PCR-Amplifikation eines Teils des 10,5 kb-Fragments mit den Primern RW264 (SEQ ID NR: 169) (5'-AATTAACCCGGGATCCAAGCTTCTAGCTAGCTAATTTTTATAGCGGCCGCTATAATCGTTAA CTTATTAG-3') und RW267 (SEQ ID NR: 170) (5'-GCTAGAA ATCTCTTAGTTTTTATAGTTG-3') erzeugt. Eine benachbarte Region wurde ebenfalls durch PCR amplifiziert, wobei die Primer RW266 (SEQ ID NR: 171) (5'-GTTACATATGTACAGAATCTGATCATAG-3') und RW265 (SEQ ID NR: 172) (5'-CTAGCTAGRAGCTTGGATCCCGGGTTAATT AATTAATAAAAAGCGGCCGCGTTAAAGTAGAAAAATG-3') verwendet wurden. Diese durch PCR erhaltenen Fragmente wurden durch eine dritte PCR fusioniert, wobei die Primer RW266 (SEQ ID NR: 171) und RW267 (SEQ ID NR: 170) verwendet wurden. Das resultierende Fragment, das durch PCR erhalten wurde, bestand aus Hühner-Pockenvirus-Sequenzen, die durch eine 5'-EcoRI-Restriktionsschnittstelle und eine 3'-NdeI-Restriktionsschnittstelle flankiert sind. Zentral in dem Fragment befindet sich eine Polyclonierungs-Region, die SmaI-, BamHI- und HindIII-Restriktionsschnittstellen enthält, die von NotI-Restriktionsschnittstellen und Translations-Stopp-Codons in 6 Leserahmen flankiert ist. Ein frühes Transkriptions-Terminations-Signal (Yuen and Moss, 1987) befindet sich benachbart zu der 3'-NotI-Restriktionsschnittstelle. Dieses durch PCR erhaltene Fragment, gespalten mit EcoRI und NdeI, wurde in das gleichermaßen gespaltene pRW715 ligiert, wobei das Plasmid pRW864 erzeugt wurde. Ein 11 K-reguliertes lac Z-Gen wurde durch partielle BamHI-, vollständige PstI-Spaltung aus pAM1 ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde mit Klenow-Polymerase in glatte Enden überführt und in SmaI-gespaltenes pRW864 ligiert, wobei pRW867A erzeugt wurde. Das NotI-Fragment aus pRW867A wurde mit Klenow-Polymerase in Anwesenheit von dNTPs in glatte Enden überführt, derart dass die NotI-Restriktionsschnittstellen nach einer Ligierung in eine FspI-Restriktionsschnittstelle wieder hergestellt wurden, und in pRW866 ligiert, das mit FspI partiell gespalten worden war, sodass die Inserierung an Position 1.955 entsprechender Stelle durchgeführt wurde, wie von Tartaglia et al. (1990) beschrieben. Das resultierende Plasmid, pRW868, wurde dann mit NotI gespalten, um die lac Z-Kassette zu entfernen, und in den 66 bp-Polylinker von pRW864 ligiert, der durch NotI-Spaltung ausgeschnitten worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pRW673 bezeichnet. Ein 81 bp-SmaI-Fragment wurde aus pVQ42KTH4.1 (definiert in Beispiel 31) erhalten und in SmaI-gespaltenes pRW873 eingefügt, wobei das Plasmid pVQ873 erzeugt wurde.
Die nef-Kassette wurde als ein 684 bp-HindIII-Fragment zur Inserierung in pVQ873 aus pBSI3NEF ausgeschnitten, gefolgt von einer Rekombination in den F16-Locus von TROVAC, wobei vFP174 erzeugt wurde.
Beispiel 34 Expression von HIV-2-Genen in NYVAC
Erzeugung einer NYVAC/HIV2-gag/pol-Rekombinante. Ein Plasmid, pISSYEGP, das die menschlichen Immunschwächevirus Typ 2 (HIV2)-gag- und -pol-Gene enthält, wurde von Dr. G. Franchini (NCI-NIH) erhalten. Die gag- und pol-Gene aus diesem Plasmid wurden stromabwärts des I3L-Promotors und zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.400 bp-BstUI-BglII-Fragments von pISSYEGP, das die HIV2- gag- und pol-Gene enthält, und die Oligonucleotide SIVL1 (SEQ ID NR: 69) und HIV2L1 (SEQ ID NR: 173) (5'-CGCCCATGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGTAATATAATGATATATATTT TCACTTTATCTCAC-3'), die den I3L-Promotor enthalten, in das 4.070 bp-XhoI-BglII-Fragment von pSD542 (definiert in Beispiel 15) erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV21 genannt.
Nicht-relevante, nicht-codierende 3'-Sequenz wurde dann eliminiert. Dies wurde durch Clonierung eines 280 bp BclI-SmaI-PCR-Fragments, das das 3'-Ende des pol-Gens enthält, in das 8.100 bp-BclI-SmaI-Fragments von pHIV21 erreicht. Dieses PCR-Fragment wurde aus dem Plasmid pISSYEGP mit den Oligonucleotiden HIV2P2 (SEQ ID NR: 174) (5'- ATGGCAGTTCATTGCAT-3') und HIV2P3 (SEQ ID NR: 175) (5'-TTCCCGGGAGATCTCTATGCCATTTCTCCAT-3') erzeugt. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV22 genannt.
pHIV22 wurde in Rekombinations-Experimenten mit NYVAC (vP866) als Helfervirus verwendet, wobei vP1045 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Analysen wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob vP1045 authentische HIV2-gag-Genprodukte exprimiert.
Lysate von den infizierten Zellen wurden auf HIV2-gag-Expression analysiert, wobei vereinigtes Serum von HIV2-seropositiven Individuen (erhalten von Dr. G. Franchini (NCI-NIH)) verwendet wurde. Die Seren wurden mit vP866-infizierten Vero-Zellen präadsorbiert. Die präadsorbierten Seren wurden in einer Übernacht-Inkubation bei 4°C an Protein A-Sepharose gebunden. Nach dieser Inkubationsperiode wurde das Material 4 × mit 1 × Puffer A gewaschen. Lysate, die mit normalen menschlichen Seren und Protein A-Sepharose vorgeklärt worden waren, wurden dann über Nacht bei 4°C mit den HIV2-seropositiven menschlichen Seren inkubiert, die an Protein A-Sepharose gebunden waren. Nach der Übernacht-Inkubationsperiode wurden die Proben 4 × mit 1 × Puffer A und 2 × mit einem LiCl₂/Harnstoff-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden durch die Zugabe von 2 x Laemmli-Puffer (125 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol) und 5 Minuten Kochen von den Immunkomplexen dissoziiert. Die Proteine wurden in einem 10%-Dreyfuss-Gelsystem (Dreyfuss et al., 1984) fraktioniert, fixiert und für die Fluorographie mit 1 M Na-Salicylat behandelt.
Menschliche Seren von HIV2-seropositiven Individuen präzipitierten spezifisch das HIV2-gag-Vorläufer-Protein sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag- Protein-Spaltprodukte aus vP1045-infizierten Zellen, präzipitierten aber keine HIV2-spezifischen Proteine aus scheininfizierten oder NYVAC-infizierten Zellen.
Beispiel 35 Erzeugung einer NYVAC/HIV2-gag/pol und env (gp160)-Rekombinanten
Ein Plasmid, pISSYEGP, das die HIV2- gag- und pol-Gene enthält, wurde von Dr. G. Franchini (NCI-NIH) erhalten. Die gag- und pol-Gene aus diesem Plasmid wurden stromabwärts des I3L-Promotors und zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIV22, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 34), hergestellt wurde.
pHIV22 wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP920 als Helfervirus verwendet, wobei vP1047 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP1047-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression der HIV2-gag-Proteine wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV2-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten Zellen präzipitiert. Proteinarten, die den HIV2-env- und -gag-Vorläufer-Proteinen entsprechen, sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag-Spaltprodukte wurden jedoch aus Lysaten von vP1047-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 36 Erzeugung einer NYVAC/HIV2-gag/pol und env (gp120)-Rekombinante
Ein Plasmid, pISSYEGP, das die HIV2-gag- und -pol-Gene enthält, wurde von Dr. G. Franchini (NCI-NIH) erhalten. Die gag- und pol-Gene von diesem Plasmid wurden stromabwärts des I3L-Promotors und zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pHIV22, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 34), hergestellt wurde.
pHIV22 wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP922 als Helfervirus verwendet, wobei vP1044 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP1044-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression der HIV2-gag-Proteine wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine HIV2-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten Zellen präzipitiert. Proteinarten, die den HIV2-env- und gag-Vorläufer-Proteinen entsprechen, sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag-Spaltprodukte wurden jedoch aus Lysaten von vP1044-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 37 Expression von HIV2-Genen in ALVAC
Erzeugung einer ALVAC/HIV2-gag/pol- und -env (gp160)-Rekombinante. Das Plasmid pBSH6HIV2ENV (definiert in Beispiel 4) enthält das H6-regulierte HIV2-env (gp160)-Gen. Das H6-regulierte env-Gen aus diesem Plasmid wurde zwischen flankierende Kanarienvogel-Pockenvirus-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 2.700 bp-XhoI-SacII-Fragments von pBSH6HIV2ENV, das das H6-regulierte env-Gen enthält, und der Oligonucleotide HIV2L4 (SEQ ID NR: 176) (5'-GGTTG-3') und HIV2L5( SEQ ID NR: 177) (5'-AATTCAACCGC-3') in die XhoI-EcoRI-Restriktionsschnittstelle von pC6L (definiert in Beispiel 50) erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV23 genannt.
Die HIV2-gag- und -pol-Gene wurden dann in pHIV23 cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.450 bp-XmaI-NotI-Fragments von pHIV22, das die I3L-regulierten HIV2-gag- und -pol-Gene enthält, und der Oligonucleotide HIV2L6 (SEQ ID NR: 131) und HIV2L7 (SEQ ID NR: 132) in das 7.000 bp-XmaI-XhoI-Fragment von pHIV23 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV25 genannt.
pHIV25 wurde in Rekombinations-Experimenten mit ALVAC (CPpp) als Helfervirus verwendet, wobei vCP153 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Analysen wurden durchgeführt, wie vorstehend beschrieben, aber mit einschichtigen CEF-Zellschichten, um zu bestimmen, ob vCP153 authentische HIV2-gag- und -env-Genprodukte exprimiert.
Lysate von den infizierten Zellen wurden auf HIV2-gag- und -env-Genexpression analysiert, wobei vereinigtes Serum von HIV2-seropositiven Individuen (erhalten von Dr. G. Franchini (NCI-NIH)) verwendet wurde. Die Seren wurden mit ALVAC-infizierten CEF-Zellen präadsorbiert. Die präadsorbierten Seren wurden in einer Übernacht-Inkubation bei 4° C an Protein A-Sepharose gebunden. Nach dieser Inkubationsperiode wurde das Material 4 × mit 1 × Puffer A gewaschen. Die mit normalen menschlichen Seren und Protein A-Sepharose vorgeklärten Lysate wurden dann über Nacht bei 4°C mit den HIV2-seropositiven menschlichen Seren inkubiert, die an Protein A-Sepharose gebunden waren. Nach der Übernacht-Inkubationsperiode wurden die Proben 4 × mit 1 × Puffer A und 2 × mit einem LiCl₂/Harnstoff-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden durch die Zugabe von 2 × Laemmli-Puffer (125 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol) und 5 Minuten Kochen von den Immunkomplexen dissoziiert. Die Proteine wurden in einem 10%-Dreyfuss-Gelsystem (Dreyfuss et al., 1984) fraktioniert, fixiert und für die Fluorographie mit 1 M Na-Salicylat behandelt.
Menschliche Seren von HIV2-seropositiven Individuen präzipitierten spezifisch die HIV2-env- und -gag-Vorläufer-Proteine sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag-Spaltprodukte aus vCP153-infizierten Zellen, präzipitierten aber keine HIV2-spezifischen Proteine aus scheininfizierten oder ALVAC-infizierten Zellen.
Beispiel 38 Expression von SIV-Genen in NYVAC Erzeugung einer NYVAC/SIV-env (gp120-gp28) und gag (Protease^–)-Rekombinante
Immunpräzipitations-Analysen wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob vP948 (definiert in Beispiel 5) authentische SIV-env- und gag-Vorläufer-Proteine exprimiert. Lysate aus den infizierten Zellen wurden auf SIV-env- und -gag-Vorläufer-Expression analysiert, wobei Serum aus SIV-seropositiven Makakken (erhalten von Dr. G. Franchini (NCI-NIH)) verwendet wurde. Die Seren wurden mit NYVAC (vP866)-infizierten Vero-Zellen präadsorbiert. Die präadsorbierten Seren wurden in einer Übernacht-Inkubation bei 4° C an Protein A-Sepharose gebunden. Nach dieser Inkubationsperiode wurde das Material 4 × mit 1 × Puffer A gewaschen. Die mit normalen Makakken-Seren und Protein A-Sepharose vorgeklärten Lysate wurden dann über Nacht bei 4°C mit den SIV-seropositiven Makakken-Seren inkubiert, die an Protein A-Sepharose gebunden waren. Nach der Übernacht-Inkubationsperiode wurden die Proben 4 × mit 1 × Puffer A und 2 × mit einem LiCl₂/Harnstoff-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden durch die Zugabe von 2 × Laemmli-Puffer (125 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol) und 5 Minuten Kochen von den Immunkomplexen dissoziiert. Die Proteine wurden in einem 10%-Dreyfuss-Gelsystem (Dreyfuss et al., 1984) fraktioniert, fixiert und für die Fluorographie mit 1 M Na-Salicylat behandelt.
Makakken-Seren von SIV-seropositiven Individuen präzipitierten spezifisch das SIV-gag-Vorläufer-Protein und das Hüll-Glycoprotein aus vP948-infizierten Zellen, präzipitierten aber nicht SIV-spezifische Proteine aus scheininfizierten Zellen.
Beipiel 39 Erzeugung einer NYVAC/SIV-gag/pol-Rekombinante
Ein Plasmid, pSIVGAGSSIIG, enthaltend SIV_MAC142-cDNA-Sequenz, wurde von Dr. G. Franchini (NCI-NIH) erhalten. Die gag- und pol-Gene aus diesem Plasmid wurden stromabwärts des I3L-Promotors und zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem das Plasmid pSIVG5, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 5), hergestellt wurde.
pSIVG5 wurde in Rekombinations-Experimenten mit NYVAC (vP866) als Helfervirus verwendet, wobei vP1042 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP1042-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression der SIV-env- und -gag-Vorläufer-Proteine wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine SIV-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten oder NYVAC-infizierten Vero-Zellen präzipitiert. Proteinarten, die dem gag-Vorläufer-Protein entsprachen sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag-Spaltprodukte wurden jedoch aus Lysaten von vP1042-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 40 Erzeugung einer NYVAC/SIV-gag/pol und env (gp120-gp41)-Rekombinante
pSIVG5 (Beispiel 5) wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP1050 als Helfervirus verwendet, wobei vP1071 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP1071-infizierten Zellen zeigten die Expression von SIV-Genen.
Beispiel 41 Erzeugung einer NYVAC/SIV-gag/pol und env (gp120-gp28)-Rekombinante
pSIVG5 (Beispiel 5) wurde in Rekombinations-Experimenten mit vP874 als Helfervirus verwendet, wobei vP943 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP943-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression der SIV-env- und gag-Vorläufer-Proteine wurden, wie vorstehend beschieben, durchgeführt. Keine SIV-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten Vero-Zellen präzipitiert. Proteinarten, die den env- und gag-Vorläufer-Proteinen entsprechen, sowie verschiedene Zwischenprodukte und reife gag-Spaltprodukte, wurden jedoch aus Lysaten vP943-infizierter Zellen präzipitiert.
Beispiel 42 Erzeugung einer NYVAC/SIV-p16, p28-Rekombinante
Immunpräzipitations-Experimente mit vP942 (Beispiel 5)-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression der SIV-env- und -gag-Vorläufer-Proteine wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine SIV-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten Vero-Zellen präzipitiert. Proteinarten, die p16 und p28 entsprechen, wurden jedoch aus Lysaten von vP942-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 43 Erzeugung einer NYVAC/SIV-p16, p28 und env (gp120-gp28)-Rekombinante
Immunpräzipitations-Experimente mit vP952 (Beispiel 5)-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression der SIV-env- und -gag-Vorläufer-Proteine wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine SIV-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten Vero-Zellen präzipitiert. Proteinarten, die env, p16 und p28 entsprechen, wurden jedoch aus Lysaten von vP952-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 44 Erzeugung einer NYVAC/SIV-env (gp120-gp41)-Rekombinante
Das Plasmid pSIVEMVC enthält das H6-regulierte SIV_MAC142-Hüllprotein-Gen (in vitro selektierte verkürzte Version). Die Region des Hüllprotein-Gens, die das unreife Terminations-Codon enthält, wurde in pBSK+ cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 1.120 bp-ClaI-BamHI-Fragments von pSIVEMVC in die ClaI-BamHI-Restriktionsschnittstelle von pBSK+ erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIV10 genannt.
Das stromaufwärts liegende Terminations-Codon, TAG, wurde dann gegen das ursprüngliche CAG-Codon ausgetauscht. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide SIVL20 (SEQ ID NR: 178) (5'-CTAGCTAAGTTAAGGCAGGGGTATAGGCCAGTG TTCTCTTCCCCACCCTCTTATTTCCAGCAGACTCATACCCAACAG-3') und SIVL21 (SEQ ID NR: 179) (5'-GTCCTGTTGGGTATGAGTCTGCTGGAAATAAGAGGGTGGG GAAGAGAACACTGGCCTATACCCCTGCCTTAACTTAG-3') in das 4.000 bp-NheI-PpuMI-Fragment von pSIV10 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIV11 genannt.
Die Region, die das modifizierte Codon enthält, wurde dann in pSIVEMVC zurück cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 380 bp-BglII-NheI-Fragments von pSIV11, das das modifizierte Codon enthält, in das 5.600 bp-partielle BglII-NheI-Fragment von pSIVEMVC erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIV12 genannt.
pSIV12 wurde in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit NYVAC (vP866) als Helfervirus verwendet, wobei vP1050 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vP1050-infizierten Zellen zum Nachweis der Expression der SIV-env- und -gag-Vorläufer-Proteine wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Keine SIV-spezifischen Arten wurden aus scheininfizierten oder NYVAC-infizierten Vero-Zellen präzipitiert. Eine Proteinart, die env entspricht, wurde jedoch aus Lysaten von vP1505-infizierten Zellen präzipitiert.
Beispiel 45 Expression von SIV-Genen in ALVAC
Erzeugung einer ALVAC/SIV-gag/pol-Rekombinante. Ein Plasmid, pSIVGAGSSIIG, das die SIV_MAC142-cDNA-Sequenz enthält, wurde von Dr. G. Franchini (NCI-NIH) erhalten. Die gag- und pol-Gene aus diesem Plasmid wurden stromabwärts des I3L-Promotors und zwischen flankierende Vaccinia-Virus-Arme cloniert. Dies wurde erreicht, indem initial das Plasmid pSIVG5, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 5), hergestellt wurde.
Die gag/pol-Gene wurden dann zwischen flankierende Kanarienvogel-Pockenvirus-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.500 bp-SmaI-NotI-Fragments von pSIVG5, das die I3L-regulierten gag/pol-Gene enthält, in die SmaI-NotI-Restriktionsschnittstelle von pC5L (definiert in Beispiel 10) erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIVGC13 genannt.
pSIVGC13 wurde in Rekombinations-Experimenten mit ALVAC (CPpp) als Helfervirus verwendet, wobei vCP172 erhalten wurde.
Immunpräzipitations-Experimente mit vCP172-infizierten Zellen zeigten die Expression von SIV-Genen.
Beispiel 46 Expression von SIV-Genen in ALVAC
Erzeugung einer ALVAC/SIV-env (gp120-gp41) und gag/pol-Rekombinante. Ein Plasmid, pSIVGAGSSIIG, enthaltend Affen-Immunschwächevirus (SIV_MAC142)-cDNA-Sequenz, wurde von Genoveffa Franchini (NCI-NIH) erhalten. Die gag/pol-Gene aus diesem Plasmid wurden stromabwärts des I3L-Promotors und zwischen flankierende Vaccinia-Virus-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.800 bp-CfoI-TagI-Fragments von pSIVGAGSSIIG, das die gag/pol-Gene enthält, und der Oligonucleotide SIVL1 (SEQ ID NR: 69) und SIVL2 (SEQ ID NR: 70), die den Vaccinia-Virus-I3L-Promotor codieren, in das 4.070 bp-XhoI-AccI-Fragment von pSD542VCVQ erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIVG1 genannt.
Nicht relevante nicht-codierende 3'-Sequenz wurde dann eliminiert. Dies wurde durch Clonierung eines 1.000 bp-BamHI-HpaI-PCR-Fragments, das das 3'-Ende des pol-Gens enthält, in das partielle 7.400 bp-BamHI-HpaI-Fragment von pSIVG1 erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde aus dem Plasmid pSIVGAGSSIIG mit den Oligonucleotiden SIVP5 (SEQ ID NR: 71) und SIVP6 (SEQ ID NR: 72) erzeugt). Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIVG4 genannt.
Sequenzanalyse ergab, dass pSIVG4 eine einzelne Basenpaar-Deletion innerhalb des pol-Gens enthält. Um diesen Fehler zu korrigieren, wurde das 2.320 bp-BglII-StuI-Fragment von pSIVG1 in das partielle 6.100 bp-BglII-StuI-Fragment von pSIVG4 cloniert. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIVG5 genannt.
Die gag/pol-Gene wurden dann zwischen flankierende Kanarienvogel-Pockenvirus-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.500 bp-SmaI-NotI-Fragments von pSIVG5, das die I3L-regulierten gag/pol-Gene enthält, in die SmaI-NotI-Restriktionsschnittstelle von pC5L erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIVGC13 genannt.
Das SIV-env-Gen wurde dann in pSIVGC13 cloniert. Dies wurde durch Clonierung des mit E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllten partiellen 2.750 bp-BglII-XhoI-Fragment von pSIV12, das das H6-regulierte SIV-env-Gen enthält, in die SmaI-Restriktionsschnittstelle von pSIVGC13 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIVGCI4 genannt.
pSIVGCI4 wird in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC als Helfervirus verwendet.
Erzeugung einer ALVAC/SIV-env (gp120-gp41)-Rekombinante. Ein Plasmid, pSIVEMVC, enthält das H6-regulierte Affen-Immunschwächevirus-Hüllprotein-Gen (in vitro selektierte verkürzte Version). Die Region des Hüllprotein-Gens, die das unreife Terminations-Codon enthält, wurde in pBSK+ cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 1.120 bp-ClaI-BamHI-Fragments von pSIVEMVC in die ClaI-BamHI-Restriktionsschnittstelle von pBSK+ erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIV10 genannt.
Das stromaufwärts liegende Terminations-Codon, TAG, wurde dann durch das ursprüngliche CAG-Codon ausgetauscht. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide SIVL20 (SEQ ID NR: 178) und SIVL21 (SEQ ID NR: 179) in das 4.000 bp-NheI-PpuMI-Fragment von pSIV10 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIV11 genannt.
Die Region, die das modifizierte Codon enthält, wurde dann in pSIVEMV zurück cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 380 bp-BglII-NheI-Fragments von pSIV11 in das 5.600 bp-partielle BglII-NheI-Fragment von pSIVEMVC erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIV12 genannt.
Das env-Gen wurde dann zwischen flankierende Kanarienvogel-Pockenvirus-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 2.700 bp-NruI-Asp718-Fragments von pSIV12, das das H6-regulierte env-Gen enthält, in das 7.400 bp-NruI-Asp718-Fragment von pNVQH6C5SLP18 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pSIVGCI5 genannt.
pSIVGCI5 wird in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC als Helfervirus verwendet.
Beispiel 47 Erzeugung von HIV1-Genen in ALVAC
Erzeugung einer ALVAC/HIV1-gag (+pro) (IIIB)- und gp120 (+ Transmembran) (MN)-Rekombinante. Ein Plasmid, pHXB2D, das die menschliche Immunschwächevirus Typ 1 (HIV1)-cDNA-Sequenz (IIIB) enthält, wurde von Dr. R. C. Gallo (NCI-NIH) erhalten. Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 1.625 bp-BglII-Fragments von pHXB2D, das das 5'-Ende des gag-Gens enthält, in das 4.075 bp-BglII-Fragment von pSD542VCVQ erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG2 genannt.
Das 3'-Ende des gag-Gens wurde dann in pHIVG2 cloniert. Dies wurde durch Clonierung eines 280 bp-ApaI-BamHI-PCR-Fragments, das das 3'-Ende des gag-Gens enthält, in das 5.620 bp-ApaI-BamHI-Fragment von pHIVG2 erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde aus dem Plasmid pHXB2D mit den Oligonucleotiden HIVP5 (SEQ ID NR: 116) und HIVP6 (SEQ ID NR: 117) erzeugt). Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG3 genannt.
Der I3L-Promotor wurde dann stromabwärts des gag-Gens cloniert. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIVL17 (SEQ ID NR: 118) und HIVL18 (SEQ ID NR: 119), die den Vaccinia-Virus-I3L-Promotor und das 5'-Ende des gag-Gens codieren, in das partielle 5.540 bp-BglII-ClaI-Fragment von pHIVG3 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG4 genannt.
Der Teil des gag-Gens, der p24, p2, p7 und p6 codiert, wurde dann eliminiert. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIVL19 (SEQ ID NR: 120) und HIVL20 (SEQ ID NR: 121) in das partielle 4.450 bp-PvuII-BamHI-Fragment von pHIVG4 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG5 genannt.
Der Rest des gag-Gens, sowie das pol-Gen, wurden dann stromabwärts des p17-"Gens" cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.955 bp-ClaI-SalI-Fragments von pHXB2D, das das meiste des gag-Gens und das gesamte pol-Gen enthält, in das 4.150 bp-ClaI-SalI-Fragment von pHIVG5 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG6 genannt.
Nicht-relevante nicht codierende 3'-Sequenz wurde dann eliminiert. Dies wurde durch Clonierung eines 360 bp-Af1II-BamHI-PCR-Fragments, das das 3'-Ende des pol-Gens enthält, in das 8.030 bp-Af1II-BamHI-Fragment von pHIVG6 erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde aus dem Plasmid pHXB2D mit den Oligonucleotiden HIVP7 (SEQ ID NR: 122) und HIVP8 (SEQ ID NR: 123) erzeugt). Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG7 genannt.
Die I3L-regulierten gag- und pol-Gene wurden dann in einen Kanarienvogel-Pockenvirus-Inserierungs-Vektor eingefügt. Dies wurde durch Clonierung des partiellen 4.360 bp-BglII-BamHI-Fragments von pHIVG7, das die I3L-regulierten gag- und pol-Gene enthält, in die BamHI-Restriktionsschnittstelle von pVQH6CP3L erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGE14 genannt.
Das H6-regulierte HIV1-gp120 (+ Transmembran)-Gen wurde dann in pHIVGE14 cloniert. Dies wurde erreicht, indem das 1.700 bp NruI-SmaI-Fragment von pC5HIVMN120T, das das gp120 (+ Transmembran)-Gen enthält, in das 11.400 bp Nrul-SmaI-Fragment von pHIVGE14 cloniert wurde. Das resultierende Plasmid wird pHIVGE14T genannt.
Das meiste des pol-Gens wurde dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung eines 540 bp-ApaI-BamHI-PCR-Fragments, das das 3'-Ende des HIV1-Protease-"Gens" enthält, in das 10.000 bp-ApaI-BamHI-Fragment von pHIVGE14T erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde aus dem Plasmid pHIVG7 mit den Oligonucleotiden HIVP5 (SEQ ID NR: 116) und HIVP37 (SEQ ID NR: 180; 5'-AAAGGATCCCCCGGGTTAAAAATTTAAAGTGCAACC-3') erzeugt). Diese Manipulation entfernt das meiste des pol-Gens, lässt aber das Protease-"Gen" intakt. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV32 genannt.
pHIV32 wird in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC als Helfervirus verwendet.
Beispiel 48 Erzeugung von HIV1-Genen in NYVAC
Erzeugung einer NYVAC/HIV1-gag (+pro) und gp120 (+ Transmembran)-Rekombinante. Ein Plasmid, pHXB2D, das menschliches Immunschwächevirus Typ 1 (HIV1)-cDNA-Sequenz (IIIB) enthält, wurde von Dr. R. C. Gallo (NCI-NIH) erhalten. Die Sequenz, die das 5'-Ende des gag-Gens codiert, wurde zwischen flankierende Vaccinia-Virus-tk-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 1.625 bp-BglII-Fragments von pHXB2D, das das 5'-Ende des gag-Gens enthält, in das 4.075 bp-BglII-Fragment von pSD542VCVQ erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG2 genannt.
Das 3'-Ende des gag-Gens wurde dann in pHIVG2 cloniert. Dies wurde durch Clonierung eines 280 bp-ApaI-BamHI-PCR-Fragments, das das 3'-Ende des gag-Gens enthält, in das 5.620 bp-ApaI-BamHI-Fragment von pHIVG2 erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde aus dem Plasmid pHXB2D mit den Oligonucleotiden HIVP5 (SEQ ID NR: 116) und HIVP6 (SEQ ID NR: 117) erreicht). Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG3 genannt.
Der I3L-Promotor wurde dann stromaufwärts des gag-Gens cloniert. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIVL17 (SEQ ID NR: 118) und HIVL18 (SEQ ID NR: 119), die den Vaccinia-Virus-I3L-Promotor und das 5'-Ende des gag-Gens codieren, in das partielle 5.540 bp-BglII-ClaI-Fragment von pHIVG3 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG4 genannt.
Der Teil des gag-Gens, der p24, p2, p7 und p6 codiert, wurde dann eliminiert. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIVL19 (SEQ ID NR: 120) und HIVL20 (SEQ ID NR: 121) in das partielle 4.450 bp-PvuII-BamHI-Fragment von pHIVG4 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG5 genannt.
Der Rest des gag-Gens sowie das pol-Gen wurden dann stromabwärts des p17-"Gens" cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.955 bp-ClaI-SalI-Fragments von pHXB2D, das das meiste des gag-Gens und das gesamte pol-Gen enthält, in das 4.150 bp-ClaI-SalI-Fragment von pHIVG5 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG6 genannt.
Nicht relevante nicht 3'-codierende Sequenz wurde dann eliminiert. Dies wurde durch Clonierung eines 360 bp AflII-BamHI-PCR-Fragments, das das 3'-Ende des pol-Gens enthält, in das 8.030 bp-AflII-BamHI-Fragment von pHIVG6 erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde aus dem Plasmid pHXB2D mit den Oligonucleotiden HIVP7 (SEQ ID NR: 122) und HIVP8 (SEQ ID NR: 123) erzeugt). Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVG7 genannt.
Die I3L-regulierten gag- und pol-Gene wurden dann in einen Kanarienvogel-Pockenvirus-Inserierungs-Vektor eingefügt. Dies wurde durch Clonierung des partiellen 4.360 bp-BglII-BamHI-Fragments von pHIVG7, das die I3L-regulierten gag- und pol-Gene enthält, in die BamHI-Restriktionsschnittstelle von pVQH6CP3L erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGE14 genannt.
Das H6-regulierte HIV1-Hüllprotein-"gp120"-Gen (MN) wurde dann in pHIVGE14 eingefügt. Dies wurde durch Clonierung des 1.600 bp-NruI-NotI-Fragments von pBSHIVMN120, das das H6-regulierte Hüll-"gp120"-Gen enthält, und der Oligonucleotide HIVL29 (SEQ ID NR: 129) und HIVL30 (SEQ IDNR: 130) in das 11.500 bp-NruI-XhoI-Fragment von pHIVGE14 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGE15 genannt.
Das H6-regulierte HIV1-Hüllprotein-"gp120"-Gen (MN) und die I3L-regulierten gag- und pol-Gene (IIIB) wurden dann in einen Vaccinia-Virus-Inserierungs-Vektor eingefügt. Dies wurde durch Clonierung des 6.400 bp-NotI-BamHI-Fragments von pHIVGE15, das das H6-regulierte HIV1-Hüllprotein-"gp120"-Gen (MN) und die I3L-regulierten gag- und pol-Gene (IIIB) enthält, in das 4.000 bp-NotI-BglII-Fragment von pSD542 (definiert in Beispiel 15) erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGE16 genannt.
Das "gp120"-Gen wurde dann durch das "gp160"-Gen ersetzt. Dies wurde durch Clonierung des 2.600 bp-NruI-NotI-Fragments von pH6HMNE (definiert in Beispiel 10), das das gesamte HIV1-Hüllprotein-Gen (MN) enthält, in das partielle 8.000 bp-NruI-NotI-Fragment von pHIVGE16 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIVGE19 genannt.
Der Teil des env-Gens, der gp41 codiert, wurde dann durch die env-Transmembran-Region ersetzt. Dies wurde durch Clonierung des 1.700 bp-NruI-NotI-Fragments von pBSHIVMN120T, das das H6-regulierte gp 120 (+ Transmembran)-Gen enthält, in das partielle 8.500 bp-NruI-NotI-Fragment von pHIVGE19 erreicht. Das resultierende Plasmid wird pHIVGE19T genannt.
Das meiste des pol-Gens wurde dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung eines 540 bp-ApaI-SmaI-PCR-Fragments, das das 3'-Ende des HIV1-Protease-"Gens" enthält, in das 7.000 bp-ApaI-SmaI-Fragment von pHIVGE19T erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde aus dem Plasmid pHIVG7 mit den Oligonucleotiden HIVP5 (SEQ ID NR: 116) und HIVP37 (SEQ ID NR: 180) erzeugt). Diese Manipulation entfernt das meiste des pol-Gens, lässt aber das Protease-"Gen" intakt. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV33 genannt.
pHIV33 wird in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit NYVAC als Helfervirus verwendet.
Beispiel 49 Erzeugung von HIV2-Genen in ALVAC
Erzeugung einer ALVAC/HIV2-gag/pol-Rekombinante. Ein Plasmid, pBSH6HIV2ENV (definiert in Beispiel 4), enthält das H6-regulierte menschliches Immunschwächevirus Typ 2 (HIV2)-env-Gen. Das H6-regulierte env-Gen aus diesem Plasmid wurde zwischen flankierende Kanarienvogel-Pockenvirus-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 2.700 bp-XhoI-SacII-Fragments von pBSH6HIV2ENV und der Oligonucleotide HIV2L4 (SEQ ID NR: 176) und HIV2L5 (SEQ ID NR: 177) in die XhoI-EcoRI-Restriktionsschnittstelle von pC6L (definiert in Beispiel 50) erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV23 genannt.
Die HIV2-gag- und -pol-Gene wurden dann in pHIV23 cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.450 bp-XmaI-Not'I-Fragments von pHIV22, das die I3L-regulierten HIV2-gag- und pol-Gene enthält, und der Oligonucleotide HIV2L6 (SEQ ID NR: 131) und HIV2L7 (SEQ ID NR: 132) in das 7.000 bp-XmaI-Xhol-Fragment von pHIV23 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV25 genannt.
Das env-Gen wurde dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIV2L8 (SEQ ID NR: 181; 5'-CGATRAACCGC-3') und HIV2L9 (SEQ ID NR: 182; 5'-GGTTTAT-3') in das partielle 8.800 bp-ClaI-SstII-Fragment von pHIV25 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV27 genannt.
pHIV27 wurde in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC als Helfervirus verwendet, wobei vCP190 erhalten wurde.
Erzeugung einer ALVAC/HIV2-env (gp160)-Rekombinante. Ein Plasmid, pBSH6HIV2ENV (definiert in Beispiel 4), enthält das H6-regulierte menschliche Immunschwächevirus Typ 2 (HIV2)-env-Gen. Das H6-regulierte env-Gen aus diesem Plasmid wurde zwischen flankierende Kanarienvogel-Pockenvirus- Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 2.700 bp-XhoI-SacII-Fragments von pBSH6HIV2ENV und der Oligonucleotide HIV2L4 (SEQ ID NR: 176) und HIV2L5 (SEQ ID NR: 177) in die Xhol-EcoRI-Restriktionsschnittstelle von pC6L (definiert in Beispiel 50) erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV23 genannt.
Die HIV2-gag- und -pol-Gene wurden dann in pHIV23 cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.450 bp-XmaI-NotI-Fragments von pHIV22, das die I3L-regulierten HIV2-gag- und -pol-Gene enthält, und der Oligonucleotide HIV2L6 (SEQ ID NR: 131) und HIV2L7 (SEQ ID NR: 132), in das 7.000 bp-XmaI-XhoI-Fragment von pHIV23 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV25 genannt.
Die gag- und pol-Gene wurden dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIV2L10 (SEQ ID NR: 183; 5'-GGGAAAG-3') und HIV2L11 (SEQ ID NR: 184; 5'-GATCCTTTCCC-3'), in das partielle 7.000 bp-BamHI-SmaI-Fragment von pHIV25 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV28 genannt.
pHIV28 wurde in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC als Helfervirus verwendet, wobei vCP188 erhalten wurde.
Erzeugung einer ALVAC/HIV2-gp120-Rekombinante. Ein Plasmid, pBSH6HIV2ENV, enthält das H6-regulierte menschliche Immunschwächevirus Typ 2 (HIV2)-env-Gen. Das H6-regulierte env-Gen aus diesem Plasmid wurde zwischen flankierende Kanarienvogel-Pockenvirus-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 2.700 bp-XhoI-SacII-Fragments von pBSH6HIV2ENV (definiert in Beispiel 4) und der Oligonucleotide HIV2L4 (SEQ ID NR: 176) und HIV2L5 (SEQ ID NR: 177) in die XhoI-EcoRI-Restriktionsschnittstelle von pC6L erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV23 genannt.
Die HIV2-gag- und -pol-Gene wurden dann in pHIV23 cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.450 bp-XmaI-NotI-Fragments von pHIV22, das die I3L-regulierten HIV2-gag- und pol-Gene enthält, und der Oligonucleotide HIV2L6 (SEQ ID NR: 131) und HIV2L7 (SEQ ID NR: 132) in das 7.000 bp-XmaI-XhoI-Fragment von pHIV23 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV25 genannt.
Die gag- und pol-Gene wurden dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIV2L10 (SEQ ID NR: 183) und HIV2L11 (SEQ ID NR: 184) in das partielle 7.000 bp-BamHI-SmaI-Fragment von pHIV25 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV28 genannt.
Der Teil des env-Gens, der gp41 codiert, wurde dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung des 360 bp-PstI-XbaI-Fragments von pBSHIV2120B, das das 3'-Ende des gp120-Gens enthält, und der Oligonucleotide HIV2L12 (SEQ ID NR: 185; 5'-CTAGAAAACCGC-3') und HIV2L13 (SEQ ID NR: 186; 5'-GGTTTT-3') in das 5.600 bp-PstI-SstII-Fragment von pHIV28 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV29 genannt.
pHIV29 wird in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC als Helfervirus verwendet.
Erzeugung einer ALVAC/HIV2-gag/pol und gp120-Rekombinante. Ein Plasmid, pBSH6HIV2ENV (definiert in Beispiel 4) enthält das H6-regulierte menschliche Immunschwächevirus Typ 2 (HIV2)-env-Gen. Das H6-regulierte env-Gen aus diesem Plasmid wurde zwischen flankierende Kanarienvogel-Pockenvirus-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 2.700 bp-XhoI-SacII-Fragments von pBSH6HIV2ENV und der Oligonucleotide HIV2L4 (SEQ ID NR: 176) und HIV2L5 (SEQ ID NR: 177) in die XhoI-EcoRI-Restriktionsschnittstelle von pC6L (definiert in Beispiel 50) erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV23 genannt.
Die HIV2- gag- und -pol-Gene wurden dann in pHIV23 cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.450 bp-XmaI-NotI-Fragments von pHIV22, das die I3L-regulierten HIV2-gag- und -pol-Gene enthält, und der Oligonucleotide HIV2L6 (SEQ ID NR: 131) und HIV2L7 (SEQ ID NR: 132) in das 7.000 bp-XmaI-XhoI-Fragment von pHIV23 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV25 genannt.
Die gag- und pol-Gene wurden dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIV2L10 (SEQ ID NR: 183) und HIV2L11 (SEQ ID NR: 184) in das partielle 7.000 bp-BamHI-SmaI-Fragment von pHIV25 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV28 genannt.
Der Teil des env-Gens, der gp41 codiert, wurde dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung des 360 bp-PstI-XbaI-Fragments von pBSHIV2120B, das das 3'-Ende des gp120-Gens enthält, und der Oligonucleotide HIV2L12 (SEQ ID NR: 185) und HIV2L13 (SEQ ID NR: 186) in das 5.600 bp-PstI-SstII-Fragment von pHIV28 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV29 genannt.
Das gp120-Gen wurde dann in pHIV25 cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 1.550 bp-NruI-SacII-Fragments von pHIV29, das das H6-regulierte gp120-Gen enthält, in das 9.000 bp-NruI-SacII-Fragment von pHIV25 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV30 genannt.
pHIV30 wird in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC als Helfervirus verwendet.
Erzeugung einer ALVAC/HIV2-gp120 (+ Transmembran)-Rekombinante. Ein Plasmid, pBSH6HIV2ENV (definiert in Beispiel 4), enthält das H6-regulierte menschliche Immunschwächevirus Tpy 2 (HIV2)-env-Gen. Das H6-regulierte env-Gen aus diesem Plasmid wurde zwischen flankierende Kanarienvogel-Pockenvirus-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 2.700 bp-XhoI-SacII-Fragments von pBSH6HIV2ENV und der Oligonucleotide HIV2L4 (SEQ ID NR: 176) und HIV2L5 (SEQ ID NR: 177) in die XhoI-EcoRI-Restriktionsschnittstelle von pC6L (definiert in Beispiel 50) erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV23 genannt.
Die HIV2- gag- und pol-Gene wurden dann in pHIV23 cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.450 bp-XmaI-NotI-Fragment von pHIV22, das die I3L-regulierten HIV2-gag- und pol-Gene enthält, und der Oligonucleotide HIV2L6 (SEQ ID NR: 131) und HIV2L7 (SEQ ID NR: 132) in das 7.000 bp-XmaI-XhoI-Fragment von pHIV23 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV25 genannt.
Die gag- und pol-Gene wurden dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIV2L10 (SEQ ID NR: 183) und HIV2L11 (SEQ ID NR: 184) in das partielle 7.000 bp-BamHI-SmaI-Fragment von pHIV25 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV28 genannt.
Der Teil des env-Gens, der gp41 codiert, wurde dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung des 360 bp-PstI-XbaI-Fragments von pBSHIV2120B, das das 3'-Ende des gp120-Gens enthält, und der Oligonucleotide HIV2L12 (SEQ ID NR: 185) und HIV2L13 (SEQ ID NR: 186) in das 5.600 bp-PstI-SstII-Fragment von pHIV28 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV29 genannt.
Die HIV1-env-Transmembran-Region wurde dann an das Ende des gp120-Gens cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 500 bp-EcoRI-Fragments von pHIV31, das das 3'-Ende des gp120-Gens und die env-Transmembran-Region enthält, in das 5.600 bp-EcoRI-Fragment von pHIV29 erreicht. (pHIV31 wurde durch Clonierung eines 500 bp-PstI-XbaI-PCR-Fragments, das das 3'-Ende des gp120-Gens und die env-Transmembran-Region enthält, in die PstI-XbaI-Restriktionsschnittstelle von pIBI25 erreicht. Dieses PCR-Fragment wurde aus dem PCR-Fragment PCRTMI und den Oligonucleotiden HIVTMI (SEQ ID NR: 107) und HIVTM2 (SEQ ID NR: 108) mit den Oligonucleotiden HIV2P14 (SEQ ID NR: 187; 5'-CAGAAGTAGCATATATGT-3') und HIVTM3 (SEQ ID NR: 109) erzeugt. PCRTMI wurde aus dem Plasmid pHIV28 mit den Oligonucleotiden HIV2P14 (SEQ ID NR: 187) und HIV2P15 (SEQ IDNR: 188; 5'-GCCTCCTACTATCATTATGAATAATCTCTTATGTCTCCCTGGAGC-3') erzeugt). Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV34 genannt.
pHIV34 wird in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC als Helfervirus verwendet.
Erzeugung einer ALVAC/HIV2-gag/pol- und gp120 (+ Transmembran)-Rekombinante. Ein Plasmid, pBSH6HIV2ENV (definiert in Beispiel 4), enthält das H6-regulierte menschliches Immunschwächevirus Typ 2 (HIV2)-env-Gen. Das H6-getriebene env-Gen aus diesem Plasmid wurde zwischen flankierende Kanarienvogel-Pockenvirus-Arme cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 2.700 bp-XhoI-SacII-Fragments von pBSH6HIV2ENV und der Oligonucleotide HIV2L4 (SEQ ID NR: 176) und HIV2L5 (SEQ ID NR: 177) in die XhoI-EcoRI-Restriktionsschnittstelle von pC6L (definiert in Beispiel 50) erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV23 genannt.
Die HIV2- gag- und pol-Gene wurden dann in pHIV23 cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 4.450 bp-XmaI-NotI-Fragments von pHIV22, das die I3L-regulierten HIV2-gag- und pol-Gene enthält, und der Oligonucleotide HIV2L6 (SEQ ID NR: 131) und HIV2L7 (SEQ ID NR: 132) in das 7.000 bp-XmaI-Xhol-Fragment von pHIV23 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV25 genannt.
Die gag- und pol-Gene wurden dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide HIV2L10 (SEQ ID NR: 183) und HIV2L11 (SEQ ID NR: 184) in das partielle 7.000 bp- BamHI-SmaI-Fragment von pHIV25 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV28 genannt.
Der Teil des env-Gens, der gp41 codiert, wurde dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung des 360 bp-PstI-Xbal-Fragments von pBSHIV2120B (definiert in Beispiel 4), das das 3'-Ende des gp120-Gens enthält, und der Oligonucleotide HIV2L12 (SEQ ID NR: 185) und HIV2L13 (SEQ ID NR: 186) in das 5.600 bp-PstI-SstII-Fragment von pHIV28 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV29 genannt.
Die HIV1-env-Transmembran-Region wurde dann an das Ende des gp120-Gens cloniert. Dies wurde durch Clonierung des 500 bp-EcoRI-Fragments von pHIV31, das das 3'-Ende des gp120-Gens und die env-Transmembran-Region enthält, in das 5.600 bp-EcoRI-Fragment von pHIV29 erreicht. PHIV31 wurde durch Clonierung eines 500 bp-PstI-XbaI-PCR-Fragments, das das 3'-Ende des gp120-Gens und die env-Transmembran-Region enthält, in die PstI-XbaI-Restriktionsschnittstelle von pIBI25 (IBI, New Haven, CT) erhalten. Dieses PCR-Fragment wurde aus dem PCR-Fragment PCRTMI und den Oligonucleotiden HIVTMI (SEQ ID NR: 107) und HIVTM2 (SEQ ID NR: 108) mit den Oligonucleotiden HIV2P14 (SEQ ID NR: 187) und HIVTM3 (SEQ ID NR: 109) erzeugt. PCRTMI wurde aus dem Plasmid pHIV28 mit den Oligonucleotiden HIV2P14 (SEQ ID NR: 187) und HIV2P15 (SEQ ID NR: 188) erzeugt. Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV34 genannt.
Das gp120 (+ Transmembran)-Gen wurde dann in ein Plasmid cloniert, das die HIV2-gag/pol-Gene enthält. Dies wurde durch Clonierung des 2.700 bp-ClaI-Fragments von pHIV34, das das H6-regulierte gp120 (+ Transmembran)-Gen enthält, in das 6.800 bp-ClaI-Fragment von pHIV30 erreicht. (pHIV30 wurde durch Clonierung des 1.550 bp-NruI-SacII-Fragments von pHIV29, das das H6-regulierte gp120-Gen enthält, in das 9.000 bp-NruI- SacII-Fragment von pHIV25, erhalten). Das Plasmid, das durch diese Manipulation erzeugt wurde, wird pHIV35 genannt.
pHIV35 wird in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC als Helfervirus verwendet.
Beispiel 50 Expression von zwei Fusionspeptiden, die das p24-Epitop von HIV-1-gag fusioniert mit den T1- und V3-Schleifen-Epitopen von HIV-1-env mit und ohne die Signaldomäne von HIV-1-env enthalten
Durch eine Reihe von Polymerase-Kettenreaktionen wurden zwei Expressions-Kassetten erzeugt, die nachfolgend beschrieben sind. Diese Kassetten unterscheiden sich darin, dass eine Version die Signalsequenzen von HIV-1-env fusioniert mit den Epitopen exprimiert, wohingegen die andere dies nicht tut.
Der Version des Fusionspeptids mit dem Signal geht der 51 Aminosäuren-N-terminale Bereich von HIV-1 (IIIB)-env, Reste 1 bis 50 (+ initiierendes Met), basierend auf Ratner et al. (1985), gefolgt von einer spaltbaren Linker-Region, voraus. Die Aminosäuresequenz dieser Region ist (SEQ ID NR: 189) MKEQKTVAMRVKEKYQHLWRWGWRWGTMLLGMLMICSATEKLWVTVYYGVP-PFRK.
Beide Versionen des Fusionspeptids enthalten eine Aminosäuresequenz, die auf den definierten T-Zell-Epitopen von p24, der V3-Schleife (MN) und T1 von HIV-1 (MN)-env basiert. Das Peptid ist so entworfen, dass die Epitope voneinander und dem Signal, wo vorhanden, durch die Sequenz (SEQ ID NR: 189) PPFRK, getrennt sind. Die Sequenz dieser Region des Peptids ist (SEQ ID NR: 190) [Signal-PFRK]-GPKEPFRDYVDRFYK-PPFRKVQINCTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIRQAH CNISRAK-PPFRKQIINMWQEVEKAMYA. In der Version, der die Signalsequenz fehlt, ist die Region, die durch [Signal-PFRK] angezeigt ist, ausschließlich durch ein initiierendes Methionin ersetzt.
Für die Kassette mit dem Signal wurden der H6-Promotor und das Signal durch PCR aus dem Plasmid pBST1T2TH4.1 (vorstehend beschrieben) erhalten, wobei die Primer K6PCR1 (SEQ ID NR: 157; 5'-ACTACTAAGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG-3') und SIGPCR24 (SEQ ID NR: 191; 5'-AGGTCCCTTCCTGAA TGGAGGTACCCCATAATAGACTG-3') verwendet wurden. Das p24-Epitop wurde durch PCR-Amplifikation dieses 307 bp PCR-Fragments und der Oligonucleotide P24A (SEQ ID NR: 192; 5'-CCATTCAGGAAGGGACCTAAAGAACCTTTTAGAGATTATGTAGATAGATTTTAT AAACCACCTTTTAGAAAA-3') und P24B (SEQ ID NR: 193; 5'-TTTTCTAAAAGGTGGTTTATAAAATCTATCTACATAATCTCTAAAAGGTTCTTTAGGTCCCT TCCTGAATGG-3') mit der Signalsequenz fusioniert, wobei die Primer H6PCR1 und P24PCR (SEQ ID NR: 194; 5'-GTACAATTAATTTGTACTTTTCTAAAAGGTGGTTTATAAAATC-3') verwendet wurden. Dieses 377 bp-PCR-Fragment besteht aus dem H6-Promotor, gekoppelt mit den codierenden Sequenzen für das Signal, dem p24-Epitop und den ersten 6 Aminosäuren der V3-Schleife.
Für die Kassette ohne das Signal wurde der H6-Promotor durch PCR aus dem Plasmid PH6T2 (vorstehend beschrieben) erhalten, wobei die Primer H6PCR1 (SEQ ID NR: 157) und H6P24 (SEQ ID NR: 195; 5'-GGTGGTTTATAAAATCTATCTACAT AATCTCTAAAAGGTTCTTTAGGTCCCATTACGATACAAACTTAACGG-3') verwendet wurden. Das p24-Epitop wurde mit dem Promotor durch PCR-Amplifikation dieses 187 bp PCR-Fragments und der Oligonucleotide P24A (SEQ ID NR: 192) und P24B (SEQ ID NR: 193) fusioniert, wobei die Primer H6PCR1 (SEQ ID NR: 157) und P24PCR (SEQ ID NR: 194) verwendet wurden. Dieses 214 bp-PCR-Fragment besteht aus dem H6-Promotor, gekoppelt an die codierenden Sequenzen des p24-Epitops und der ersten 6 Aminosäuren der V3-Schleife.
Die codierenden Sequenzen für die V3-Schleifen-Region wurden durch PCR-Amplifikation des SmaI-Fragments aus dem Plasmid pHIVGE16EV (vorstehend beschrieben) erhalten, wobei die Primer V3PCR1 (SEQ ID NR: 196; 5'-AAACCACC TTTTAGAAAAGTACAAATTAATTGTAC-3') und V3PCR2 (SEQ ID NR: 197; 5'-CTGCTTACGGAACGGTGGTTTTGCTCTACTAATGTTACAATG-3') verwendet wurden. Das T1-Epitop wurde mit der codierenden Region für die V3-Schleife durch PCR-Amplifikation dieses 171 bp-PCR-Fragments und der Oligonucleotide MNT1A (SEQ ID NR: 198; 5'-CCACCGTTCCGTAAGCAGATAATAAACATGTGGCAAGAAGTAGAAAAAGCTATGTATGCTTA A-3') und MNT1B (SEQ ID NR: 199; 5'-TTAAGCATACATA GCTTTTTCTACTTCTTGCCACATGTTTATTATCTGCTTACGGAACGGTGG-3') als Matrize verknüpft, wobei die Primer V3PCR1 (SEQ ID NR: 196) und TIMNPCR (SEQ ID NR: 200; 5'-TCATCAAAGCTTCTCGAGAAAAATTA AGCATACATAGCTTTTTC-3') verwendet wurden. Dieses 239 bp-PCR-Fragment besteht aus dem letzten Codon des p24-Epitops, der V3-Schleife und dem T1-Epitop, gefolgt in 3'-Richtung von einem frühen Transkriptions-Terminations-Signal (TTTTTNT) und XhoI- und HindIII-Restriktionsschnittstellen.
Für die Kassette mit dem Signal wurden der Promotor, das Signal und p24-Epitop-codierende Sequenzen mit der codierenden Region für das V3-Schleife/T1-Epitop durch PCR-Amplifikation der 377 bp- und 239 bp-PCR-Fragmente verknüpft, wobei die Primer H6PCR1 (SEQ ID NR: 157) und TIMNPCR (SEQ ID NR: 200) verwendet wurden. Nach der Spaltung dieses 581 bp PCR-Fragments mit HindIII wurde ein Fragment von 563 bp aus einem Agarosegel isoliert, in ein gleichermassen gespaltenes pBS (Stratagene, La Jolla, CA) ligiert, wobei das Plasmid pMNT1P24 erzeugt wurde. Die Inserierung wurde durch Nucleotid-Sequenzanalyse überprüft.
Für die Kassette ohne das Signal wurden der Promotor und p24-codierende Sequenzen mit der codierenden Region des V3-Schleife/T1-Epitops durch PCR-Amplifikation der 171 bp- und 239 bp-PCR-Fragmente verknüpft, wobei die Primer H6PCR1 (SEQ ID NR: 157) und TIMNPCR (SEQ ID NR: 200) verwendet wurden. Nach der Spaltung dieses 418 bp-PCR-Fragments mit HindIII, wurde ein Fragment von 400 bp aus einem Agarosegel isoliert, mit einem gleichermassen gespaltenen pBS (Stratagene, La Jolla, CA) ligiert, wobei das Plasmid pMN24EV3T1NSA erzeugt wurde. Die Inserierung wurde durch Nucleotid-Sequenzanalyse überprüft.
Ein C6-Inserierungs-Vektor, der 370 bp stromaufwärts von C6, einen Polylinker, enthaltend SmaI-, PstI-, XhoI- und EcoRI-Restriktionsschnittstellen, und 1.156 bp Stromabwärts-Sequenz enthält, wurde auf die folgende Art und Weise erhalten. Die 0,4 kb-Stromaufwärts-Sequenz wurde durch PCR-Amplifikation eines Cosmid-Clous erzeugt, der aus gereinigter genomischer Kanarienvogel-Pockenvirus-DNA erhalten wurde, wobei die Oligonucleotide C6A1SG (SEQ ID NR: 201; 5'-ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT-3') und C6B1SG (SEQ ID NR: 202; 5'-GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGGCA TTTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA-3') verwendet wurden. Der 1.2 kb-Stromabwärts-Arm wurde durch PCR-Amplifikation der gleichen Matrize erzeugt, wobei die Oligonucleotide C6ClSG (SEQ ID NR: 203; 5'-CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTA TATATAATTGAAAAAGTAA-3') und C6D1SG (SEQ ID NR: 204; 5'-GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG-3') verwendet wurden. Diese Fragmente wurden durch eine dritte PCR fusioniert, die Gel-gereinigte 0,4 und 1,2 kb-Fragmente als Matrize für die Primer C6A1SG (SEQ ID NR: 201) und C6D1SG (SEQ ID NR: 204) verwendete. Das resultierende 1,6 kb-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert, mit SacI und KpnI gespalten und in das gleichermassen gespaltene pBS (Stratagene, La Jolla, CA) ligiert, wobei das C6-Inserierungs-Plasmid pC6L erzeugt wurde.
Beide Expressions-Kassetten wurden durch PstI/XhoI-Spaltung aus pMNT1P24 und pMN24EV3T1NSA ausgeschnitten, aus Agarose-Gelen isoliert und getrennt in das gleichermassen gespaltene pC6L ligiert, wobei die Plasmide pC6P24FS bzw. pC6P24FNS für die Rekombination in den C6-Locus von ALVAC erzeugt wurden. Die resultierenden Rekombinanten werden als vCP189 bzw. vCP195 bezeichnet.
BamHI/XhoI-Fragmente aus pMNT1P24 und pMN24EV3T1NSA wurden in gleichermassen gespaltenes pSD550VC (definiert in Beispiel 33) ligiert, wobei pI4P24FS und pI4P24FNS für die Rekombination in den I4-Locus von NYVAC erzeugt wurden, wobei vP1117 bzw. vP1110 erzeugt wurde.
Expression von Tetanus-Toxin-Fragment C in Pockenviren, die HIV-1-Proteine exprimieren. Es wurde vorgeschlagen, dass die Einfügung verschiedener Th-Epitope aus homologen (Good et al., 1987) und heterologen Proteinen (Francis et al., 1987) dazu in der Lage sein kann, T-Zell-Hilfe für spezifische B-Zell-Antworten gegen synthetische Peptid-Impfstoffe zu rekrutieren. In einer Bemühung, verstärkte Immunantworten gegen HIV-1-Antigen auszulösen, sind verschiedene T-Zell-Epitope, die von HIV-1 abstammen, in rekombinante Pockenviren eingefügt worden. Um diese Strategie weiter zu verfolgen, wird Tetanus-Toxin-Fragment C, das andere bekannte menschliche T-Helfer-Zell-Epitope enthält (Ho et al., 1990), in einer ALVAC-Rekombinante mit HIV-1-Antigenen coexprimiert. Die Anwesenheit dieser Epitope aus Tetanus-Toxin kann die Immunantwort gegen HIV-1 verstärken, indem sie unspezifische T-Zell-Hilfe bereitstellt.
PstI/SmaI-gespaltenes pC6P24FS (vorstehend beschrieben) wurde modifiziert, indem das PstI/SmaI-Fragment aus dem Plasmid pVQ42KTH4.1 (vorstehend beschrieben) ligiert wurde, wobei pC6P24FSVQ erzeugt wurde. Dieses Plasmid wurde innerhalb des H6-Promotors mit NruI und am 3'-Ende mit XhoI gespalten und mit einem 1,4 kb-Fragment ligiert, das aus gleichermassen gespaltenem pH6 TETC (vorstehend beschrieben) isoliert worden war. Das resultierende Plasmid, pC6VQTETC, wurde durch Restriktionsspaltung und Nucleotid-Sequenzanalyse der Regionen, die die Clonierungsstellen umgeben, überprüft. Nach der Überprüfung wurde pC6VQTETC in Rekombinations-Experimenten mit vCP112, vCP125 und vCP156 verwendet.
Beispiel 51 Studien von mononucleären Zellen auf peripherem Blut mit NAVAC/HIV-1- und ALVAC/HIV-1-Rekombinanten
Während umfangreiche Fragen hinsichtlich der Immunogenität von NYVAC/HIV-1- und ALVAC/HIV-1-Konstrukten im Menschen am besten im Zusammenhang mit klinischen Studien angesprochen werden, wurde bereits eine Reihe von relevanten Einblicken durch in vitro-Tests betreffend zelluläre Antworten gewonnen. Eine zentrale Frage im Hinblick auf die Verwendung dieser Impfstoff-Konstrukte im Menschen betrifft deren Fähigkeit, Einfluss auf zelluläre anti-HIV-1-Reaktivitäten zu nehmen, insbesondere cytotoxische T-Lymphocyten (CTL)-Antworten. Ob als eine Komponente einer vorbeugenden oder einer therapeutischen Impfstoff-Strategie, es gibt zahlreiche Beispiele, die eine vorteilhafte Rolle für CTL in einer Vielzahl viraler Infektionen im Menschen vorschlagen (McMicheal et al., 1983; Moss et al., 1978; Borysiewicz et al., 1988). Obwohl der genaue Beitrag von anti-HIV-I-CTL zur Verhinderung oder Kontrolle viraler Infektionen noch zu klären verbleibt, schlagen Studien von Letvin und Mitarbeitern, die das SIV/Makakken-Tiermodell verwenden, vor, daß anti-SIV-1-CTL, insbesondere gag-spezifische CTL, einen ausschlaggebenden Faktor zur Kontrolle des Fortschreitens der Erkrankung repräsentieren können (Letvin and King, 1990). Dies in Verbindung mit den Beobachtungen zahlreicher Forscher, dass anti-HIV-1-CTL-Aktivitäten direkt in mononucleären Zellen aus frischem periphärem Blut (PBMC) in einem relativ hohen Anteil asymptomatischer Patienten gemessen werden kann (in einer Übersicht zusammengefasst in Walker and Plata, 1990; Autran et al., 1991), unterstützt die Behauptung, dass das Auslösen von anti-HIV-I-CTL-Reaktivitäten als ein hauptsächliches Ziel von sowohl präventiven als auch therapeutischen Impfstoffen beinhaltet sein sollte.
Um die Fähigkeit von NYVAC/HIV-1- und ALVAC/HIV-1-Konstrukten, auf relevante CTL-Reaktivitäten Einfluss zu nehmen, zu testen, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, die eine große Anzahl von HIV-1-infizierten Patienten umfassten, bei denen direkt anti-HIV-1-gp160-CTL-Reaktivitäten nicht nachweisbar waren. Aus diesen Patienten wurden PBMCs erhalten, und ein Teil der PBMC wurde entweder mit dem vollständigen Replikations-kompetenten Vaccinia/gp160-Konstrukt vPE16 (Walker et al., 1987) oder dem Replikationsabgeschwächten NYVAC/gp160- oder den ALVAC/gp160-Konstrukten infiziert. Die akut-infizierten PBMC wurden gewaschen und in einem 10-Tage dauernden in vitro-Stimulationsprotokoll als Stimulatoren für die verbleibenden PBMC verwendet. Die Kontrollen beinhalteten sowohl nicht-stimulierte als auch Kontroll-Vektor (d. h. parentales Pockenvirus minus HIV-1-Gen)-stimulierte Kulturen. Nach der 10-Tage-Inkubation in Abwesenheit von exogenem IL-2 wurden die Zellen gewaschen und auf CTL-Aktivitäten gegen autologe B-Lymphozyten-Zelllinien (BLCL) untersucht, die entweder mit einem Kontroll-Vaccinia-Virus, vSC8, oder dem Vaccinia/gp160-vPE16-Konstrukt infiziert worden waren. Zusätzlich wurde parallel eine phänotypische Verminderung von CD8+-Zellen durchgeführt, wobei magnetische Mikrosphären-Sortierung verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser Studien, die in 11 gezeigt sind, ergaben, dass Kulturen, die mit irgendeinem der HIV-1-gp160-Kontrukte stimuliert worden waren, einen hohen Spiegel an anti-gp160-cytolytischer Aktivität aufwiesen, die nach dem Entfernen von CD8+-Zellen vollständig beseitigt wurde, was konsistent ist mit dem Auftreten von CTL-Aktivitäten, wohingegen nicht-stimulierte oder mit Kontroll-Vektor stimulierte Kulturen keine nachweisbare CTL-Aktivität gegen HIV-1-gp160-gerichtete BLCL zeigten. Die vielleicht am meisten signifikante Beobachtung, die durch diese Studien erhalten wurde, war das übereinstimmende Ergebnis, dass die Stärke der CTL-Antwort in den NYVAC/gp160- und ALVAC/gp160-stimulierten Kulturen größer war, als in denjenigen, die mit den vollständig replikationskompetenten, vPE16-infizierten PBMC stimuliert worden waren. Es ist nicht bekannt, ob diese offensichtliche Verstärkung der CTL-Stimulation durch NYVRC/gp160 und ALVAC/gp160 aufgrund von Unterschieden in der Expression durch die Rekombinanten im Vergleich zu vPE16 oder aufgrund der Abschwächungs-Eigenschaften der NYVAC- und ALVAC-Vektoren auftrat.
Umfangreiche durchflusszytometrische Analysen der verschiedenen stimulierten Kulturen wurden ebenfalls durchgeführt, um den Effektor-Zell-Phänotyp, der induziert wurde, genauer zu identifizieren. Im Vergleich mit entweder nicht-stimulierten oder Kontroll-Vektor-stimulierten Kulturen resultierte die Erzeugung von anti-gp160-cytolytischen Reaktivitäten in einer Abnahme an CD3⁺/CD4⁺-Subpopulationen und einem kompensatorischen Anstieg der CD3⁺/CD8⁺-Zellen. Signifikante Anstiege an CD3⁺/CD25⁺-, CD3⁺/HLA-DR⁺-, CD8⁺/S6F1⁺-, CD8⁺/CD38⁺- und CD3⁺/CD69⁺-Zellen wurden ebenfalls festgestellt. Wenn die cytolytischen Aktivitäten jeder Kultur gegen Anstiege einzelner Zell-Suppopulationen aufgetragen wurden, wurde eine lineare Beziehung zwischen zellulärer anti-gp160-Reaktivität und Anstiegen in der CD8⁺/S6F1⁺-Population gefunden. Dieser zelluläre Phänotyp definiert im Allgemeinen CTL (Morinoto et al., 1987).
Diese frühen vorklinischen Studien mit Zellen aus HIV-1-infizierten Patienten veranschaulichen deutlich die Fähigkeit von NYVAC- und ALVAC/HIV-1-Vektoren, aus Vorläufer- Populationen, die innerhalb des PBMC-Pools von Patienten enthalten sind, potente CTL-Aktivitäten hervorzurufen. Darüber hinaus dienen diese Studien als starkes Beispiel für die potentielle klinische Verwendbarkeit dieser Vektoren im Zusammenhang mit einer therapeutischen Impfstoff-Strategie. Diese könnte die Form einer einfachen Immunisierung mit diesen Vektoren annehmen oder könnte eine ex vivo-Komponente beinhalten, entweder ein zielgerichtetes Angehen von Zellen und erneute Infusion oder ex vivo-CTL-Erzeugung, gefolgt von einem adoptiven (angenommenen) Transfer in großem Maßstab. In jedem Fall machen die kombinierte Sicherheit der nicht replizierenden Vektoren und ihre innewohnende starke zelluläre Immunogenität diese zu idealen Kandidaten für eine Immunbasierte Therapie im Menschen.
Damit wurden die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in Einzelheiten beschrieben, was so zu verstehen ist, dass die Erfindung, die durch die anhängigen Ansprüche definiert ist, durch die besonderen Einzelheiten, die in der vorstehenden Beschreibung ausgeführt sind, nicht eingeschränkt wird, da viele offensichtlichen Variationen davon möglich sind, ohne dass man sich von dem Geist oder dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung entfernt.
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Claims

Modifiziertes, rekombinantes Pockenvirus, wobei das modifizierte, rekombinante Pockenvirus nicht-essentielle Pockenvirus-codierte genetische Funktionen aufweist, die inaktiviert sind, so dass das Pockenvirus eine attenuierte Virulenz besitzt, wobei das modifizierte, rekombinante Pockenvirus ein exogenes DNA-Segment von einem Immunschwächevirus in einer nicht-essentiellen Region des rekombinanten Pockenvirus-Genoms umfasst, wobei das modifizierte, rekombinante Pockenvirus ausgewählt ist aus: i) rekombinantem Vaccinia-Virus, wobei die Regionen J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L-K1L und 14L daraus entfernt wurden; ii) rekombinantem Vaccina-Virus, wobei die offenen Leseraster für das Thymidin-Kinase-Gen, die haemorrhagische Region, die A-Typ-Einschlusskörper-Region, das Haemagglutinin-Gen, die Wirtsspektrum-Gen-Region und die große Untereinheit der Ribonucleotid-Reduktase daraus entfernt wurden; iii) NYVAC; iv) ALVAC; v) TROVAC oder einem Vogelpockenvirus, erhalten von einem Wildtyp-Hühnerpocken-Isolat, das attenuiert wurde durch ungefähr 50 serielle Passagen in bebrüteten Hühnereiern, gefolgt von 25 Passagen auf Hühnerembryo-Fibroblasten, wobei das Virus weiterhin vier aufeinander folgenden Plaque-Aufreinigungen unterworfen und ein Plaque-Klon davon in Hühnerembryo-Fibroblasten weiter amplifiziert wird; vi) TROVAC; vii) einem Vogelpockenvirus, erhalten aus einem Wildtyp-Hühnerpocken-Isolat, das attenuiert wurde durch ungefähr 50 serielle Passagen in bebrüteten Hühnereiern, gefolgt von 25 Passagen auf Hühnerembryo-Fibroblasten, wobei das Virus weiterhin vier aufeinander folgenden Plaque-Aufreinigungen unterworfen und ein Plaque-Klon davon in Hühnerembryo-Fibroblasten amplifiziert wird.
Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, wobei das exogene DNA-Segment weiterhin ein menschliches T-Helfer-Lymphocyten-Epitop codiert, das vom Tetanus-Toxin-Fragment C abgeleitet ist, und wobei das rekombinante Pockenvirus ALVAC ist.
Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, wobei das exogene DNA-Segment ein Immunschwächevirus-Genprodukt codiert, wobei das Genprodukt ausgewählt ist aus: der V3-Schleife; Epitop 88; gp160; gp120; Gag; Pol; Nef; Env; p16; p28; gp140; der V3-Schleife, fusioniert an das Epitop 88; Gag und Pol; Gag, Pol und gp120; Gag, Pol und gp160; Gag, Pol und verkürztes Env; nicht-gespaltenes gp160; gp120, verankert mit einer Transmembransequenz; Gag, Pol und gp120, verankert mit einer Transmembransequenz; der Signaldomäne von Env und p24, fusioniert an die T1- und V3-Schleife von Env; p24, fusioniert an die T1- und V3-Schleife von Env; V3-Schleife, fusioniert an Epitop 88; T1-, T2- und TH4.1-Epitope; Env-Signaldomäne, T1-, T2- und TH4.1-Epitope; und Gag, Pol-Protease und gp120, verankert mit einer Transmembransequenz.
Pockenvirus nach Anspruch 1 oder 2, wobei die genetischen Funktionen durch Entfernen eines offenen Leserasters, das einen Virulenzfaktor codiert, inaktiviert sind.
Pockenvirus nach Anspruch 1 oder 2, wobei die genetischen Funktionen durch insertionale Inaktivierung eines offenen Leserasters, das einen Virulenzfaktor codiert, inaktiviert sind.
Pockenvirus nach Anspruch 4, wobei das offene Leseraster ausgewählt ist aus J2R, B13 + B14R, A26L, A56R, C7L-K1L, 14L und Kombinationen davon.
Pockenvirus nach Anspruch 5, wobei das offene Leseraster ausgewählt ist aus J2R, B13 + B14R, A26L, A56R, C7L-K1L, 14L und Kombinationen davon.
Pockenvirus nach Anspruch 4, wobei die nicht-essentielle Region des rekombinanten Virusgenoms, worin die DNA des Immunschwächevirus gelegen ist, ausgewählt ist aus J2R, B13 + B14R, A26L, A56R, C7L-K1L, 14L und Kombinationen davon.
Pockenvirus nach Anspruch 5, wobei die nicht-essentielle Region des rekombinanten Pockenvirus-Genoms, worin die DNA des Immunschwächevirus gelegen ist, ausgewählt ist aus J2R, B13 + B14R, A26L, A56R, C7-K1L, 14L und Kombinationen davon.
Rekombinantes Vaccinia-Virus nach Anspruch 3, wobei das Immunschwächevirus menschliches Immunschwächevirus ist.
Rekombinantes Vaccinia-Virus nach Anspruch 3, wobei das Immunschwächevirus Affen-Immunschwächevirus ist.
Rekombinantes Kanarienvogel-Pockenvirus nach Anspruch 3, wobei das Immunschwächevirus menschliches Immunschwächevirus ist.
Rekombinantes Hühnerpockenvirus nach Anspruch 3, wobei das Immunschwächevirus menschliches Immunschwächevirus ist.
Impfstoff zur Induzierung einer Immunantwort in einem Wirtstier, das mit diesem Impfstoff inokuliert wurde, wobei der Impfstoff einen Träger und ein rekombinantes Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 13 umfasst.
Virus nach Anspruch 10, das vP988 ist, wobei vP988 NYVAC mit einem HIV-env-(gp120)-DNA-Segment, einem HIV-gag-DNA-Segment und einem HIV-pol-DNA-Segment umfasst, eingefügt in die J2R-Region.
Virus nach Anspruch 10, das vP990 ist, wobei vP990 NYVAC mit einem HIV-env-(gp160)-DNA-Segment, eingefügt in die 14L-Region, sowie ein HIV-gag-DNA-Segment und ein HIV-pol-DNA-Segment umfasst, eingefügt in die J2R-Region.
Virus nach Anspruch 10, das vP991 ist, wobei vP991 NYVAC mit einem HIV-env-(gp120)-DNA-Segment, das in die A26L-Region eingefügt ist, sowie ein HIV-gag-DNA-Segment und ein HIV-pol-DNA-Segment umfasst, eingefügt in die J2R-Region.
Virus nach Anspruch 10, das vP1009 ist, wobei vP1009 NYVAC mit einem HIV-env-(gp160)-DNA-Segment, einem HIV-gag-DNA-Segment und einem HIV-pol-DNA-Segment umfasst, eingefügt in die J2R-Region.
Virus nach Anspruch 12, das vCP117 ist, wobei vCP117 ALVAC mit einem HIV-env-(gp120)-DNA-Segment, einem HIV-gag-DNA-Segment und einem HIV-pol-DNA-Segment umfasst, eingefügt in die J2R-Region.
Virus nach Anspruch 12, das vCP120 ist, wobei vCP120 ALVAC mit einem verkürzten, nicht gespaltenen, sekretierten HIV-env-(gp160)-DNA-Segment umfasst, eingefügt in einen C 5-Locus.
Virus nach Anspruch 12, das vCP125 ist, wobei vCP125 ALVAC mit einem HIV-env-(gp160)-DNA-Segment umfasst, eingefügt in einen C 5-Locus.
Virus nach Anspruch 12, das vCP130 ist, wobei vCP130 ALVAC mit einem HIV-env-(gp160)-DNA-Segment, einem HIV-gag-DNA-Segment und einem HIV-pol-DNA-Segment umfasst, eingefügt in die J2R-Region.
Virus nach Anspruch 12, das vCP138 ist, wobei vCP138 ALVAC mit einem transmembranen HIV-env-(gp120)-DNA-Segment umfasst, eingefügt in einen C 5-Locus.
Virus nach Anspruch 12, das vCP155 ist, wobei vCP155 ALVAC mit einem verkürzten, nicht gespaltenen, sekretierten HIV-env-(gp160)-DNA-Segment umfasst, eingefügt in einen C 5-Lokus, sowie einem HIV-gag-DNA-Segment und einem HIV-pol-DNA-Segment, eingefügt in die J2R-Region.
Virus nach Anspruch 12, das vCP156 ist, wobei vCP156 ALVAC mit einem Transmembran-HIV-env-(gp120)-DNA-Segment umfasst, eingefügt in einen C 5-Locus, sowie einem HIV-gag-DNA-Segment und einem HIV-pol-DNA-Segment, eingefügt in die J2R-Region.
Virus nach einem der Ansprüche 15 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die HIV-DNA von den Isolaten MN oder IIIB stammt.
Impfstoff zur Induzierung einer Immunantwort in einem Wirtstier, das mit diesem Impfstoff inokuliert wurde, wobei der Impfstoff einen Träger und ein rekombinantes Virus nach einem der Ansprüche 15 bis 26 umfasst.
Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs nach Anspruch 27, umfassend das Kombinieren des rekombinanten Virus nach einem der Ansprüche 15 bis 26 mit einem Träger.