DE10249594A1

DE10249594A1 - Immunisierung gegen Bestandteile des Humanen Immunschwächevirus (HIV)

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Publication number: DE10249594A1
Application number: DE10249594A
Authority: DE
Original assignee: Jassoy Christian Dr
Current assignee: Jassoy Christian Dr
Priority date: 2002-10-24
Filing date: 2002-10-24
Publication date: 2004-05-13
Also published as: WO2004037846A1; AU2003276159A1

Abstract

Bekannte Verfahren zur Immunisierung gegen das Humane Immunschwächevirus (HIV) verwenden Totimpfstoff, Protein-, Peptid- und Lipopeptidvakzine, DNA-Plasmide, rekombinante Virus- und Bakterienvektoren oder Kombinationen einzelner Substanzen. Das neue Immunisierungsverfahren basiert stattdessen auf der Verabreichung von vermehrungsunfähigen lentiviralen Vektoren, die als Transgen ein oder mehrere HIV-Gene sowie die Glykoproteine eines Immunschwächevirus enthalten. DOLLAR A Vermehrungsunfähige lentivirale Vektoren werden in Zellkultur hergestellt, wobei die Vektoren alle erforderlichen genetischen Informationen und Bestandteile zur Infektion einer Zelle über den CD4-Rezeptor sowie ein Transgen besitzt, das die genetische Information für ein oder mehrere HIV-Gene trägt. Zur Immunisierung werden die Vektoren entweder direkt verabreicht oder die genetische Information zur Erzeugung eines Vektors wird in ein Poxvirusgenom verpackt und das rekombinante Poxvirus verabreicht, wobei die Infektion durch das rekombinante Poxvirus zur Produktion von lentiviralen Vektorpartikeln führt. DOLLAR A Das Verfahren eignet sich zur Erzeugung einer humoralen und zellulären Immunantwort gegen Proteine des Humanen Immunschwächevirus (HIV).

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Erzeugung einer Immunantwort gegen Bestandteile des Humanen Immunschwächevirus (HIV) durch lentivirale, vermehrungsunfähige Vektoren, die als Transgen ein oder mehrere HIV-Gene enthalten, sowie ein besonders geeignetes Verfahren für die Applikation der Vektorkonstrukte.

Technologischer Hintergrund der Erfindung

Das Humane Immunschwächevirus (HIV) ist ein Virus aus der Familie der Retroviren, Subfamilie Lentiviren. Die Infektion mit HIV führt nach mehreren Jahren klinischer Latenz zur Entwicklung des Erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) und Tod durch opportunistische Infektionen, Tumoren, Enzephalopathie oder Schwindsucht („wasting disease") (Fauci und Lane (1998), "Human immunodeficiency virus (HIV) disease: AIDS and related disorders" in: Harrison's Principles of Internal Medicine, 14. Aufl., S. 1791-1855). Es hat sich gezeigt, dass Aufklärung mit dem Ziel das Risiko der sexuellen Übertragung zu reduzieren, die Zahl der HIV-Übertragungen verringern kann (Joint United Nations Programme on HIV/AIDS (2001), "AIDS epidemic update" UNAIDS, Genf). Auch in den entwickelten Ländern kann durch diese Maßnahmen Neuinfektionen nicht vollständig verhindert werden. Um die Infektionskette wirksam zu durchbrechen wird deshalb große Hoffnung in die Entwicklung eines HIV-Impfstoffs gesetzt.

Es ist bekannt, dass die Immunisierung eines Menschen oder eines Tieres diese gegenüber einer Infektion mit dem gleichen oder einem ähnlichen, verwandten Erreger schützt. Das heißt, dass die auf die Impfung folgende Infektion entweder nicht zur Symptomatik der Erkrankung führt oder dass die Erkrankung wesentlich milder verläuft. Es ist auch bekannt, dass eine Immunantwort gegen einen viralen Infektionserreger durch verschiedene Verfahren erzeugt werden kann. Dazu gehören Lebend-, Tot- Protein-, Peptidimpfstoffe, Virusähnliche Partikel, DNA-Vakzine, virale und bakterielle Vektorimpfstoffe und Kombinationen dieser Verfahren (Keusch und Bart (1998), „Immunization principles and vaccine use" in: Harrison's Principles of Internal Medicine, 14. Aufl., S. 758 ff., MacGraw-Hill-Verlag, New York, NY, U. S. A.). Diese Verfahren und davon abgeleitete Modifikationen sind auch für die HIV-Infektion in Erprobung (International AIDS Vaccine Initiative Database of Preventive AIDS Vaccines in Human Trials (URL: http://www.iavi.org/trialsdb/searchresults.asp?list=vaccine&vt=.&fs=.). Lebendvirusimpfstoffe sind abgeschwächte (attenuierte) Viren oder verwandte, apathogene Erreger, die im Geimpften eine Immunantwort induzieren, die auch gegen das pathogene Virus wirksam ist. Entscheidender Vorteil von Lebendimpfstoffen ist, dass sie sich im Geimpften vermehren und dadurch die Antigenmenge, mit der der Geimpfte in Kontakt kommt, erhöhen. Lebendimpfstoffe erreichen die Zielzellen im Organismus die am relevantesten für die Erzeugung einer Immunantwort sind. Dadurch werden üblicherweise mehrere Arme der Immunantwort wie Antikörper und zytotoxische T-Lymphozyten (CTL), lokaler und systemischer Immunschutz gleichzeitig induziert. Lebendimpfstoffe müssen meist nur einmal appliziert werden um eine langanhaltende Immunität zu erzeugen (Keusch und Bart (1998), „Immunization principles and vaccine use" in: Harrison's Principles of Internal Medicine, 14. Aufl., S. 758 ff., MacGraw-Hill-Verlag). Gentechnologisch modifizierte Lebendviren, die eine Immunantwort gegen die durch Immunschwächeviren hervorgerufene Krankheit bewirken, sind aus dem Tiermodell bekannt (Daniel et al. (1992), "Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene" Science 258: 1938–1941). Impfstoffe gegen HIV auf der Basis von replikationsfähigen, abgeschwächten HI-Viren gelten als zu riskant für die Anwendung beim Menschen, da sie, wie durch Tierversuche festgestellt wurde, im Organismus persistieren, sich vermehren und unter bestimmten Bedingungen selbst die tödliche Immunschwächekrankheit AIDS hervorrufen können (Baba et al. (1999), Live attenuated, multiply deleted simian immunodeficiency virus causes AIDS in infant and adult macaques" Nat. Med. 5(2):194-203).

Totimpfstoffe sind chemisch inaktivierte Viren. Bekannt ist die Impfung bereits infizierter Personen mit inaktivierten HI-Viren zur Verstärkung der HIV-spezifischen Immunantwort (Kahn et al. (2000), "Evaluation of HIV-1 immunogen, an immunologic modifier, administered to patients infected with HIV having 300 to 549 × 10(6)/L CD4 cell counts: A randomized controlled trial" Jama 284(17):2193-202). Das Verfahren zur Herstellung der HIV-Totimpfstoffe führt allerdings dazu, dass der äußere Teil der Hüllglykoproteine (gp120) verloren geht. Deswegen können solchermaßen hergestellte Impfkonstrukte keine neutralisierenden Antikörper, die eine wesentliche Komponente der antiviralen Immunantwort darstellen, induzieren.

Protein-Vakzine sind synthetisch hergestellte Kopien einzelner viraler Proteine oder aufgereinigte Virusbestandteile. Sie induzieren in erster Linie eine Antikörperantwort. Experimentelle und Klinische Studien zeigen, dass HIV-Glykoproteine in der Lage sind, neutralisierende Antikörper, das sind Antikörper, die eine Virusinfektion blockiern können, zu induzieren (Belshe et al. (1993), "Safety and immunogenicity of a fully glycosylated recombinant gp 160 human immunodeficiency virus type 1 vaccine in subjects at low risk of infection" J Infect Dis 168(6):1387-95; Gorse et al. (1999), "HIV-1MN recombinant glycoprotein 160 vaccine-induced cellular and humoral immunity boosted by HIV-1MN recombinant glycoprotein 120 vaccine" AIDS Res Hum Retroviruses 15(2):115-32; McElrath et al. (2000), "A phase II study of two HIV type 1 envelope vaccines, comparing their immunogenicity in populations at risk for acquiring HIV type 1 infection" AIDS Res Hum Retroviruses 16(9):907-19). Neben Glykoproteinen von HIV-Laborstämmen werden zur Immunisierung Proteine, deren Aminosäuresequenz denen von Wildtyp-Viren entsprechen, verwendet (Mascola et al. (1996), "Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1" J Infect Dis 173(2):340-8). Außerdem sind auch Impfungen mit anderen HIV-Proteinen bekannt (Le Buanec et al. (1998), "A prophylactic and therapeutic AIDS vaccine containing as a component the innocuous Tat toxoid" Biomed Pharmacother 52(10):431-5).

Peptid-Impfstoffe enthalten einzelne Peptide oder Ketten mehrerer Sequenzen von 10–25 Aminosäuren Länge, die Proteinabschnitte repräsentieren, die besonders häufig oder effizient durch das Immunsystem erkannt werden (immunogene Epitope). Um sie dem Immunsystem in optimaler Weise zu präsentieren, werden die Peptide chemisch an weitere Molekülen, z. B. in Form von Lipopeptiden, gekoppelt oder unter Zusatz geeigneter Adjuvanzien appliziert (Gorse et al. (1996), "A dose-ranging study of a prototype synthetic HIV-1MN V3 branched peptide vaccine" J Infect Dis 173(2):330-9.; Kelleher et al. (1997), "Safety and immunogenicity of UBI HIV-1MN octameric V3 peptide vaccine administered by subcutaneous injection" AIDS Res Hum Retroviruses 13(1):29-32.; Pialoux et al. (2001), "Lipopeptides induce cell-mediated anti-HIV immune responses in seronegative volunteers" Aids 15(10):1239-49.).

Pseudovirionen (Virus-like particles, VLP) sind in ihrer äußeren Struktur dem Virus ähnliche Partikel. Sie werden gentechnisch hergestellt, indem virale Strukturgene, insbesondere die HIV-gag-Gene, in Zellen zur Expression gebracht werden. Zusätzlich zu den Gag-Proteinen können Pseudovirionen auch weitere HIV-Proteine enthalten, insbesondere Pol- und Env-Proteine (Paliard et al. (2000), "Priming of strong, broad, and long-lived HIV type 1 p55gag-specific CD8+ cytotoxic T cells after administration of a virus-like particle vaccine in rhesus macaques" AIDS Res Hum Retroviruses 16(3):273-82.; Montefiori et al. (2001), "Induction of neutralizing antibodies and gag-specific cellular immune responses to an R5 primary isolate of human immunodeficiency virus type 1 in rhesus macaques" J Virol 75(13):5879-90.; Buonaguro et al. (2002), "Induction of neutralizing antibodies and cytotoxic T lymphocytes in Balb/c mice immunized with virus-like particles presenting a gp120 molecule from a HIV-1 isolate of clade A" Antiviral Res 54(3):189-201.; Dale et al. (2002), "Chimeric Human Papilloma Virus-Simian/Human Immunodeficiency Virus Virus-like-Particle Vaccines: Immunogenicity and Protective Efficacy in Macaques" Virology 301(1):176.). Pseudovirionen enthalten kein Genom und sind nicht infektiös (Griffiths et al. (1993), "Hybrid human immunodeficiency virus Gag particles as an antigen carrier system: induction of cytotoxic T-cell and humoral responses by a Gag: V3 fusion" J Virol 67(6):3191-8.; Martin et al. (1993), "Immunization of human HIV-seronegative volunteers with recombinant p17/p24:Ty virus-like particles elicits HIV-1 p24-specific cellular and humoral immune responses" Aids 7(10):1315-23.; Kelleher et al. (1998), "Safety and immunogenicity of a candidate therapeutic vaccine, p24 virus-like particle, combined with zidovudine, in asymptomatic ubjects" Aids 12(2):175-82.).

Induktion einer HIV-spezifischen Immunantwort durch Applikation von DNA (DNA-Vakzine). Das Prinzip der Immunisierung mit DNA-Plasmiden beruht auf der Beobachtung, dass die Applikation von DNA eine Immunantwort gegen ein auf dem Plasmid kodiertes Protein induzieren kann Wolff et al. (1990), "Direct gene transfer into mouse muscle in vivo" Science 247(4949 Pt 1):1465-8). In bestimmten Tiermodellen können DNA-Impfstoffe eine protektive Immunantwort hervorrufen (Ulmer et al. (1993), "Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein" Science 259(5102):1745-9). Verschiedene Verfahren zur DNA-immunisierungen gegen das HI-Virus oder das mit ihm verwandte Affenimmunschwächevirus (SIV) sind bekannt (Akahata et al. (2000), "DNA vaccination of macaques by a full genome HIV-1 plasmid which produces noninfectious virus particles" Virology 275(1):116-24; Weber et al. (2001), "Phase I clinical trial with HIV-1 gp160 plasmid vaccine in HIV-1- infected asymptomatic subjects" Eur J Clin Microbiol Infect Dis 20(11):800-3; Graham (2002), "Clinical trials of hiv vaccines*" Annu Rev Med 53:207-21). Unter anderem werden neben Plasmiden mit natürlicher HIV- oder SIV-Sequenz Plasmide mit modifizierter, synonymer Virus-Gensequenz (Deml et al. (2001), "Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein" J Virol 75(22):10991-1001; Shiver et al. (2002), "Replication-incompetent adenoviral vaccine vector elicits effective anti-immunodeficiency-virus immunity" Nature 415(6869):331-5) verwendet. Zusätzlich sind Verfahren bekannt, bei denen die DNA zusammen mit immunogenen Hilfsstoffen wie CpGs (Deml et al. (2001), "Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein" J Virol 75(22):10991-1001) oder Zytokinen (Barouch et al. (2000), "Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokine-augmented DNA vaccination" Science 290(5491):486-92) appliziert werden. In einer weiteren Variante der DNA-Immunisierung wird zur Immunstimulation zusätzlich zur HIV-DNA gleichzeitig die DNA des Glykoprotein-Gens des Vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) appliziert (Marsac et al. (2002), "Enhanced presentation of major histocompatibility complex class I- restricted human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag-specific epitopes after DNA immunization with vectors coding for vesicular stomatitis virus glycoprotein-pseudotyped HIV-1 Gag particles" J Virol 76(15):7544-53).

Präsentation von HIV-Antigenen durch Trägerviren (Virale Vektoren). Es ist bekannt, dass zur Immunisierung Virusproteine über virale Vektoren in einen Organismus eingebracht werden können. Virale Vektoren sind Derivate von apathogenen Viren, die gentechnisch so verändert werden, dass sie Gene fremder Organismen tragen können. Im Falle einer Immunisierung gegen HIV ist es Aufgabe der Trägerviren, HIV-Gene in den Organismus einzubringen. Diese Gene werden in virusinfizierten Zellen abgelesen (transkribiert) und daraus HIV-Proteine hergestellt, die dem Immunsystem anschließend präsentiert werden. Virale Vektoren können vemehrungsfähig oder vermehrungsunfähig sein. Nach Infektion durch vermehrungsunfähige Vektoren werden keine vollständigen Viruspartikel sondern nur einzelne Gene des Virusvektors einschließlich der eingeschleusten Fremdgene aktiviert und exprimiert. Für HIV-Impfstudien wurden unter anderem verschiedene Vakzinia-Virus- und Vogel-Pockenvirus-Konstrukte, die eines oder mehrere HIV-Gene beinhalten, hergestellt, sowie rekombinante Viren auf Basis von Adenovirus, Rhabdoviren, Herpes-simplex-Virus, Poliovirus, Adenoassoziiertes Virus und Alphaviren, wie Semliki-Forest-, Sindbis- und Venezuelanisches Pferdeenzephalitis-Virus, konstruiert (Robinson (2002), "New hope for an AIDS vaccine" Nat Rev Immunol 2(4):239-50). Vakzinia- und Kanarienpockenviruskonstrukte, die HIV-Gene tragen, sowie Impfverfahren auf Basis eines Adenovirus Typ 5 werden zur Zeit am Menschen getestet (Zagury et al. (1988), "A group specific anamnestic immune reaction against HIV-1 induced by a candidate vaccine against AIDS" Nature 332(6166):728-31; Graham et al. (1993), "Augmentation of human immunodeficiency virus type 1 neutralizing antibody by priming with gp 160 recombinant vaccinia and boosting with rgp160 in vaccinia-naive adults" J Infect Dis 167(3):533-7; Belshe et al. (1998), "Induction of immune responses to HIV-1 by canarypox virus (ALVAC) HIV-1 and gp120 SF-2 recombinant vaccines in uninfected volunteers" Aids 12(18):2407-15; Clements-Mann et al. (1998), "Immune responses to human immunodeficiency virus (HIV) type 1 induced by canarypox expressing HIV-1MN gp120, HIV-1SF2 recombinant gp120, or both vaccines in seronegative adults" J Infect Dis 177(5):1230-46; Hanke und McMichael (2000), "Design and construction of an experimental HIV-1 vaccine for a year 2000 clinical trial in Kenya" Nat Med 6(9):951-5; Johnston und Flores (2001), "Progress in HIV vaccine development" Curr Opin Pharmacol 1(5):504-10.). Die Expression des HIV-Gens gag zusammen mit pol und env durch Pockenviruskonstrukte führt zur Bildung von Pseudovirionen (Karacostas et al. (1989), "Human immunodeficiency virus-like particles produced by a vaccinia virus expression vector" Proc Natl Acad Sci U S A 86(22):8964-7; Haffar et al. (1990), "Human immunodeficiency virus-like, nonreplicating, gag-env particles assemble in a recombinant vaccinia virus expression system" J Virol 64(6):2653-9).

Präsentation von HIV-Antigenen durch Trägerbakterien (Bakterielle Vektoren). Bekannt ist, attenuierte oder apathogene Bakterien, zum Beispiel Salmonella typhi (Impfstamm CVD 908) und Streptococcus gordonii, die molekulargenetisch so modifiziert wurden, dass sie HIV-Gene tragen, zur Immunisierung über die Schleimhäute zu verabreichen (Di Fabio et al. (1998), "Vaginal immunization of Cynomolgus monkeys with Streptococcus gordonii expressing HIV-1 and HPV 16 antigens" Vaccine 16(5):485-92; Johnston et al. (2001), "Progress in HIV vaccine development" Curr Opin Pharmacol 1(5):504-10).

Es ist bekannt, aus Retroviren, einschließlich Vertretern der retroviralen Subfamilie der Lentiviren, durch gentechnische Manipulationen Konstrukte herzustellen, die infektiös sind jedoch unfähig zur Vermehrung (Curran et al. (2000), "Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors" Mol Ther 1(1):31-8; Negre et al. (2000), "Characterization of novel safe lentiviral vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) that efficiently transduce mature human dendritic cells" Gene Ther 7(19):1613-23; Ailles und Naldini (2002), "HIV-1-derived lentiviral vectors" Curr Top Microbiol Immunol 261:31-52). Solche Konstrukte entsprechen in ihrer Größe und Form ihren Ursprungsviren und werden vermehrungsunfähige (replikationsinkompetente) retrovirale Vektoren genannt. Lentivirale Vektoren sind gentechnisch von Lentiviren abgeleitete Konstrukte, die unter anderem aus dem Humanen Immunschwächevirus (HIV) sowie dem Affenimmunschwächevirus (SIV) entwickelt wurden. Die Vektoren tragen meist einen Teil, nie jedoch das vollständige Genom des Ausgangsvirus (Kim et al. (1998), "Minimal requirement for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1" J Virol 72(1):811-6). Es ist bekannt, retrovirale Vektoren einschließlich Vektoren hergeleitet von HIV und SIV solchermaßen genetisch zu gestalten, dass sie ein Fremdgen enthalten, welches in infizierten Zellen zur Expression kommt. Das Fremdgen (Transgen) stammt in der Regel von einem anderen Organismus oder Virus und steht unter der regulatorischen Kontrolle eines eigenen Promotors. Die Infektion (Transduktion) von Zellen durch einen lentiviralen Vektor führt zur Expression des Transgens in der infizierten (transduzierten) Zelle. (Curran et al. (2000), "Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors" Mol Ther 1(1):31-8; Negre et al. (2000), "Characterization of novel safe lentiviral vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) that effciently transduce mature human dendritic cells" Gene Ther 7(19):1613-23; Ailles et al. (2002), "HIV-1-derived lentiviral vectors" Curr Top Microbiol Immunol 261:31-52).

Replikationsinkompetente retrovirale Vektoren zeichnen sich dadurch aus, dass die Vektoren zwar in der Lage sind, Zielzellen einmalig zu infizieren und ein Transgen zu exprimieren, dass die virale Replikation jedoch unterdrückt ist. Hierzu können beispielsweise Gene von Strukturproteinen (zum Beispiel das env-Gen) deletiert und in separaten Expressionsplasmiden oder Verpackungszellinien in trans zur Verfügung gestellt werden. Außerdem können regulatorische Gene (bei HIV beispielsweise das tat-Gen) entfernt oder unterdrückt werden. Ebenso können alternativ oder ergänzend Gene für kritische Virulenzfaktoren (bei HIV beispielsweise das vif-Gen) entfernt oder unterdrückt werden. Schließlich können auch regulatorische Sequenzen im Bereich des Long Terminal Repeat entfernt werden, die dazu führen, dass ein sogenannter „selbst-inaktivierender" lentiviraler Vektor gebildet wird (Kim et al. (1998), "Minimal requirement for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1" J Virol 72(1):811-6). Durch solche gentechnischen Manipulationen veränderte Virusvektoren sind in ihrer Replikationsfähigkeit und der Fähigkeit zur homologen Rekombination eingeschränkt and gelten als apathogen hinsichtlich der urspünglichen Pathogenität der Ausgangsviren (Ailles et al. (2002), "HIV-1-derived lentiviral vectors" Curr Top Microbiol Immunol 261:31-52).

Es sind mehrere Verfahren bekannt, wie retrovirale Vektoren in vitro hergestellt werden. Es ist möglich, Zielzellen, sogenannte Vektorproduktionszellen, mit zwei oder mehr Plasmiden gleichzeitig transient zu transfizieren und anschließend die Vektoren dem Zellkulturüberstand zu entnehmen. Es ist auch möglich, Vektorproduktionszelllinien herzustellen, die konstitutiv oder nach Induktion einzelne oder alle Bestandteile für die Vektorproduktion generieren (Zufferey (2002), "Production of lentiviral vectors" Curr Top Microbiol Immunol 261:107-21).

Es ist schließlich auch bekannt, das Genom replikationsinkompetenter retroviraler Vektoren in anderen Viren zu verpacken. So wurden Teile replikationsinkompetenter retroviraler Vektoren in rekombinante Semliki-Forest-Viren (Wahlfors et al. (1997), "Semliki Forest virus-mediated production of retroviral vector RNA in retroviral packaging cells" Hum Gene Ther 8(17):2031-41; Li und Garoff (1998), "Packaging of intron-containing genes into retrovirus vectors by alphavirus vectors" Proc Natl Acad Sci U S A 95(7):3650-4), Herpesviren (Savard et al. (1997), "Defective herpes simplex virus type 1 vectors harboring gag, pol, and env genes can be used to rescue defective retrovirus vectors" J Virol 71(5):4111-7), Adenovirale Vektoren (Feng et al. (1997), "Stable in vivo gene transduction via a novel adenoviral/retroviral chimeric vector" Nat Biotechnol 15(9):866-70) und Viren aus der Familie der Pockenviren (Holzer et al. (1999), "Poxviral/retroviral chimeric vectors allow cytoplasmic production of transducing defective retroviral particles" Virology 253(1):107-14; Konetschny et al. (2002), "Retroviral vectors produced in the cytoplasmic vaccinia virus system transduce intron-containing genes" J Virol 76(3):1236-43) (US Patent 6,352,856) verpackt.

Lentivirale Vektoren auf der Basis von Immunschwächeviren wurden bisher für die virologische Grundlagenforschung sowie für die In vitro- und In-vivo-Anwendung in der experimentellen Gentherapie hergestellt. Die experimentelle Gentherapie zielt in erster Linie auf den Ersatz defekter Gene im menschlichen Organismus sowie der Tumortherapie (Amado und Chen (1999), "Lentiviral vectors-the promise of gene therapy within reach?" Science 285(5428):674-6; Holzer et al. (1999), "Poxviral/retroviral chimeric vectors allow cytoplasmic production of transducing defective retroviral particles" Virology 253(1):107-14; Klimatcheva et al. (1999), "Lentiviral vectors and gene therapy" Front Biosci 4:D481-96; Deglon et al. (2000), "Self-inactivating lentiviral vectors with enhanced transgene expression as potential gene transfer system in Parkinson's disease" Hum Gene Ther 11(1):179-90; Deglon und Aebischer (2002), "Lentiviruses as vectors for CNS diseases" Curr Top Microbiol Immunol 261:191-209; Galimi und Verma (2002), "Opporfunities for the use of lentiviral vectors in human gene therapy" Curr Top Microbiol Immunol 261:245-54; Konetschny et al. (2002), "Retroviral vectors produced in the cytoplasmic vaccinia virus system transduce intron-containing genes" J Virol 76(3):1236-43; Maurice et al. (2002), "Efficient gene transfer into human primary blood lymphocytes by surface- engineered lentiviral vectors that display a T cell-activating polypeptide" Blood 99(7):2342-50; Nguyen et al. (2002), "Highly efficient lentiviral vector-mediated transduction of nondividing, fully reimplantable primary hepafocytes" Mol Ther 6(2):199-209) (US Patente 6,013,516; 6,352,856; 6,451,595). Darüber hinaus wird auch erprobt, die HIV-Infektion mit lentiviralen Vektoren zu behandeln. Ziel dieser Entwicklungen ist es, durch Gentherapie die Zielzellen für die HIV-Infektion, die Lymphozten, widerstandsfähig gegen eine HIV-Infektion zu machen (Klimatcheva et al. (2001), "Defective lentiviral vectors are efficiently trafficked by HIV-1 and inhibit its replication" Mol Ther 3(6):928-39; Amado et al. (2002), "Lentiviral vectors for gene therapy of HIV-induced disease" Curr Top Microbiol Immunol 261:229-43).

Neben Anwendungen in virologischer Grundlagenforschung und experimenteller Gentherapie sind Verfahren bekannt, bei denen HIV-Vektoren für die Sensitivitäts- und Resistenztestung von HIV gegen antivirale Substanzen eingesetzt werden (Jármy et al. (2001), "Phenotypic analysis of the sensitivity of HIV to revese transcriptase, protease and integrase inhibitors using a selfinactivating virus vector system" J. Med. Virol. 64(3):223-231) (U. S: Patente 6,103,462; 6,242,187).

In Hinsicht auf eine Immunreaktion gegenüber retroviralen Vektoren ist bekannt, dass ähnlich wie bei der Verwendung von Vektoren auf der Basis anderer, nicht-retroviraler Viren die Immunantwort, die nach der Applikation eines retroviralen Vektorkonstrukts erzeugt wird, gegen die Vektorstrukturproteine selbst gerichtet sein kann. Dieser Effekt wird in Hinsicht auf die Verwendung von retroviralen Vektoren für die Gentherapie als unerwünscht und hinderlich angesehen (McCormack et al. (1997), "Anti-vector immunoglobulin induced by retroviral vectors" Hum Gene Ther 8(10):1263-73).

Unter Pseudotypisierung versteht man die Bildung von viralen Vektoren, welche die Hüllglykoproteine einer anderen Virusgattung tragen. Lentivirale Vektoren können mit Glykoproteinen verschiedener Viren kombiniert werden. Es ist bekannt, dass Dendritische Zellen, durch replikationsinkompetente HIV-Vektoren, die mit dem Glykoprotein des Vesikulären Stomatitisvirus (VSV-G) pseudotypisiert wurden, in vitro infiziert werden. Werden Dendritische Zellen infiziert, können sie eine virusspezifische T-Lymphozyten-Immunreaktion gegen HIV-Strukturen in Zellkultur erzeugen (Granelli-Piperno et al. (2000), "Dendritic cells, infected with vesicular stomatitis virus-pseudotyped HIV-1, present viral antigens to CD4+ and CD8+ T cells from HIV-1- infected individuals" J Immunol 165(11):6620-6; Gruber et al. (2000), "Dendritic cells transduced by multiply deleted HIV-1 vectors exhibit normal phenotypes and functions and elicit an HIV-specific cytotoxic T-lymphocyte response in vitro" Blood 96(4):1327-33).

Es ist bekannt, retrovirale Vektoren auf der Basis von Murinen Leukämieviren, die als Transgen ein oder mehrere HIV-Gene enthalten, als Immunstimulans zur therapeutischen Immunisierung bei HIV-Infizierten anzuwenden. Die Immunstimulation wird dabei entweder durch direkte Verabreichung der Vektoren in den Organismus erzielt oder durch Injektion von autologen Zellen, die zuvor in vitro mit retroviralen Vektoren, die HIV-Gene tragen, transduziert wurden (Warner et al. (1991), "Induction of HIV-specific CTL and antibody responses in mice using retroviral vectortransduced cells" AIDS Res Hum Retroviruses 7(8):645-55; Irwin et al. (1994), "Direct injection of a recombinant retroviral vector induces human immunodeficiency virus-specific immune responses in mice and nonhuman primates" J Virol 68(8):5036-44; Ziegner et al. (1995), "Cytotoxic T-lymphocyte induction in asymptomatic HIV-1-infected patients immunized with Retrovector-transduced autologous fibroblasts expressing HIV-1IIIB Env/Rev proteins" Aids 9(1):43-50; Warner et al. (1998), "Human immunodeficiency virus immunotherapy using a retroviral vector" Curr Top Microbiol Immunol 226:145-60) (U. S. Patent 5,716,826).

Die bekannten Verfahren zur Immunisierung gegen Proteine des HI-Virus und die bisher dazu verwendeten Reagenzien haben unter anderem die folgenden Nachteile: Lebendimpfstoffe auf der Basis von Immunschwächeviren sind zwar die potentesten unter den bekannten Immunogenen, doch tragen sie ein hohes Pathogenitätsrisiko und sind deshalb als Impfstoffe gegen HIV nicht geeignet.

Protein- und Peptidimpfstoffe sowie Pseudovirionen enthalten nur Teile des Virus. Eine Immunantwort gegen HIV sollte jedoch möglichst breit angelegt sein und gegen möglichst viele Virusstrukturkomponenten gerichtet sein.

Da DNA-Impfstoffe keine Proteinstrukturen präsentieren, können durch solche Immunogene keine Antikörper gegen Konformationsepitope, die durch die Tertiär- und Quartärstruktur von Proteinen entstehen, induziert werden. Insbesondere erzeugen sie keine neutralisierenden Antikörper gegen HIV. Gleichermaßen können durch bekannte Peptidimpfstoffe keine Antikörper gegen Epitope gebildet werden, die erst durch die Konformation der natürlichen Proteine entstehen.

Da Impfstoffe wie Totimpfstoffe, Protein- und Peptidimpfstoffe, Pseudovirionen und DNA sich im Körper des Geimpften nicht vermehren, entspricht die eingesetzte Antigenmenge der maximalen Antigenmenge, der das Immunsystem eines Organismus ausgesetzt ist. Nicht replizierende Impfstoffe sind deswegen zwar prinzipiell sicher, aber weit weniger immunogen als Impfstoffe, die sich im Geimpften zunächst noch vermehren. Dies bedeutet, dass zur Erzeugung einer kräftigen und lang anhaltenden Immunantwort eine mehrmalige Applikation des Impfstoffs erforderlich ist. Je geringer die Anzahl der Impfungen, um so leichter lässt sich ein umfassender Immunschutz in einer Bevölkerung erzielen. Impfschemata, bei denen mehrmals immunisiert werden muss, sind wesentlich schwieriger in der Praxis umzusetzen. Dies trifft insbesondere auf solche Länder zu, in denen das Gesundheitssystem nur unzureichend entwickelt ist. Außerdem bedeuten Mehrfachimpfungen nicht nur aufwendigere Logistik und Kosten in der Anwendung sondern grundsätzlich höhere Produktionskosten.

Nachteile von Totimpfstoffen und Impfstoffen bestehend aus einzelnen Viruskomponenten sowie DNA-Immunogenen ist, dass sie meist keine lokale Immunantwort auf Schleimhäuten induzieren, weil effiziente Transportsysteme, die sie zu den lokalen antigenprozessierenden Zellen transportieren, fehlen (Keusch und Bart (1998), „Immunization principles and vaccine use" in: Harrison's Principles of Internal Medicine, 14. Aufl., S. 758 ff., MacGraw-Hill-Verlag). Deshalb müssen bei der Anwendung solcher Impfstoffe zusätzliche immunstimulatorische Maßnahmen ergriffen werden, um auch eine Immunreaktion auf Schleimhäuten zu erzielen, falls diese, wie bei der HIV-Infektion, erwünscht ist.

Ein Nachteil der Immunisierung mit Viralen Vektoren ist, dass sie nur einmal appliziert werden können, da bereits nach der erstmaligen Anwendung der Vektoren das Immunsystem massiv auf das Trägervirus reagiert und diese Immunreaktion bei einer Applikation die Immunantwort gegen die transportierten HIV-Proteine überlagert.

Nachteil von Impfstoffen auf Basis von Bakteriellen Vektoren ist, dass sie lokal verabreicht nur eine Schleimhautimmunität, nicht jedoch eine systemische Immunantwort hervorrufen. Hinsichtlich der Erzeugung einer Immunantwort durch „Targeting" von Dendritischen Zellen ist zu prüfen, ob eine Anwendung von VSV-G-pseudotypisierten Vektoren in vivo möglich ist, denn VSV-G-pseudotypisierte lentivirale Vektoren werden durch humanes Serum inaktiviert (DePolo et al. (2000), "VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum" Mol Ther 2(3):218-22). Außerdem haben die Dendritischen Zellen ihre herausgehobene Rolle in der HIV-Pathogenese dann, dass sie einen besonderen Rezeptor (DC-SIGN) für das HIV-Glykoprotein gp120 besitzen, der es ermöglicht HI-Viren zu den lymphatischen Organen zu transportieren. Lentivirale Vektoren ohne HIV-Glykoprotein oder ein äquivalentes Molekül aus verwandten Immunschwächeviren erfahren nicht den natürlichen Ausbreitungsweg im Organismus. Dies ist ein Nachteil in Hinsicht auf die Erzeugung einer Immunantwort über einen Weg, der der natürlichen Infektion ähnelt.

In Bezug auf die direkte Immunisierung eines Organismus ist die Verwendung von retroviralen Vektoren auf Basis von Oncoretroviren wie den Murinen Leukämieviren nachteilig, da dadurch eine Immunantwort gegen Antigene der Oncoretroviren erzeugt wird und eine mehrmalige Applikation der Vektoren deshalb nicht sinnvoll ist. Auch werden von solchen Vektoren die natürlichen Zielzellen einer HIV-Infektion nicht erreicht.

Der Erfindung liegt daher das Problem zugrunde, eine Immunantwort gegen das Humane Immunschwächevirus (HIV) zu erzeugen, wobei das Immunogen strukturell von HIV abgeleitet und infektiös aber nicht vermehrungsfähig, zur Expression eines oder mehrerer HIV-Proteine geeignet und zur Erzeugung einer gegen Virusbestandteile gerichteten Immunantwort in vivo tauglich sein soll. Der Erfindung liegt weiterhin das technische Problem zugrunde, einen lentiviralen Vektor, der als Transgen ein oder mehrere HIV-Gene enthält, und zur Erzeugung einer Immunantwort gegen Bestandteile des Humanen Immunschewächevirus (HIV) geeignet ist, zur Verfügung zu stellen. Schließlich liegt der Erfindung das Problem zugrunde, ein Trägersystem auf Basis rekombinanter Poxviren zur Verfügung zu stellen, mit dem der lentivirale Vektor besonders effizient appliziert werden kann.

Grundzüge der Erfindung

Die Grundkonzeption der Erfindung besteht in der Verwendung von replikationsinkompetenten lentiviralen Vektoren zur Immunisierung, das heißt zur Erzeugung einer Immunantwort, gegen Bestandteile des HIV. Bei den replikationsinkompetenten lentiviralen Vektoren handelt es sich um infektiöse Partikel, die alle für die Infektion einer Zelle notwendigen Virusbestandteile enthalten. Die genetische Information der Vektoren stammt aus einem Lentivirus, bevorzugt aus HIV-1, HIV-2 oder SIV. Das Genom der replikationsinkompetenten viralen Vektoren ist jedoch unvollständig. Daher können erfindungsgemäße replikationsinkompetente lentivirale Vektoren Zielzellen zwar infizieren, im Gegensatz zu den ursprünglichen Viren bilden sich in infizierten Zellen jedoch nicht erneut infektiöse Viruspartikel. Die Vektoren enthalten ein Transgen unter der transkriptionellen Kontrolle eines eukaryoten Promotors. Das Transgen eines Vektors für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist ein Gen oder eine Kombination von Proteingenen aus der Gruppe bestehend aus den HIV-Genen „gag, pol, env, nef, vif, vpr, vpu, vpx, tat, rev". Die Vektoren enthalten in ihrer Hülle Glykoproteine aus HIV-1, HIV-2 oder SIV.

Zur Immunisierung werden Vektoren in definierter Konzentration und Menge ohne oder unter Zusatz eines Adjuvans einmal oder mehrmals verabreicht. In einer Modifikation wird die Immunisierung mit den Vektoren kombiniert mit Immunisierungen durch andere Verfahren, insbesondere mit rekombinanten Vektoren auf der Basis von Adeno- oder Pockenviren oder mit DNA-Plasmiden, Proteinen, Peptiden, Lipopeptiden oder bakteriellen Vektoren enthaltend Gene des HI-Virus.

In einer besonderen Ausführung der Erfindung wird das Genom der erfindungsgemäßen lentiviralen Vektoren in Viren aus der Familie der Poxviren verpackt. Dazu werden das Transgen und die cis-aktiven Elemente sowie die zur Transkomplementierung erforderlichen genetischen Strukturen in das Genoms eines Poxvirus integriert. Cls-aktive Elemente sind solche Genstrukturen des Retrovirus, die für die Transkription, Verpackung und Integration eines retroviralen Genoms essentiell sind. In trans werden diejenigen Elemente zur Verfügung gestellt, die zur Produktion eines reifen Vektorpartikels notwendig sind, insbesondere weitere reglulatorische Proteine sowie die Strukturproteine gag, pol und env. Damit die lentiviralen Vektorgene sowie das Transgen mit seinen cis-aktiven Elementen transkribiert werden, werden spezielle Promotoren zur Transkription der Vektorgene im Zytoplasma eingeführt. Das Transgen selbst steht unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryoten Promotors, der im Zellkern aktiv ist.

Zur Immunisierung werden die rekombinanten Poxviruskonstrukte enthaltend die lentiviralen Vektoren verabreicht, indem eine bestimmte Menge intracutan, subcutan, transcutan, intramuskulär, intaperitoneal, intravenös oder auf Schleimhäute verabreicht wird. Die Verabreichung kann einmalig oder mehrfach, alleine oder in Kombination mit anderen HIV-Impfstoffen, als einzelner Wirkstoff oder zusammen mit immunstimulatorischen Substanzen erfolgen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

1. Herstellung von lentiviralen Vektoren zur Immunisierung

Lentivirale Vektoren für ein erfindungsgemäßes Vefahren werden in Zellkultur durch Transfektion von Zellen durch geeignete Plasmide hergestellt. Vektoren bilden sich dabei in den transfizierten Zellen und werden aus dem Zellkulturüberstand gewonnen.

Ein für ein erfindungsgemäßes Verfahren geeignetes Vektorplasmid enthält außer den für die Replikation und Genexpression in Bakterien notwendigen Genen und Antibiotika-Resistenzgenen eine Kassette, die die cis-aktiven Bereiche des lentiviralen Genoms und ein Transgen enthält. Zu den cis-aktiven Regionen zählen insbesondere, aber nicht ausschließlich, Teile der Long-Terminal-Repeat (LTR)-Regionen, die Primerbindungsstelle und das Verpackungssignal. Das Transgen steht unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryoten, nukleär aktiven Promotors. Die Genkassette steht unter der Kontrolle eines eigenen Promotors, wie beispielhaft dem CMV-Promotor. Innerhalb der Genkassette liegen optional weitere Gene des Lentivirus. So ist es in einer besonderen Ausführungsform vorteilhaft, dass sich gag, pol und rev sowie das rev- responsive Element (RRE) zusammen mit der Kassette auf dem Plasmid befindet. In keinem Fall jedoch enthält das Plasmid das vollständige Genom eine Lentivirus. Auf einem zweiten und gegebenenfalls einem dritten oder auf weiteren Plasmiden befinden sich die lentiviralen Gene, die als trans-aktive Gene für die Produktion eines Virusvektors notwendig sind. Dazu gehören die Gene env, gag, pol, rev sowie optional die Gene vif, vpr, vpu, nef, tat. In diesen Verpackungsplasmiden stehen die HIV-Gene unter der transkriptionellen Kontrolle eines eukaryoten Promotors. Die Verpackungssequenz Psi sowie alle weiteren cis-aktiven Regionen befinden sich immer auf dem Plasmid mit dem Transgen.

In einer besonderen Ausführungsform werden für die Herstellung des Vektorplasmids ausgehend von einem proviralen HIV-Konstrukt mehrere für die HIV-Replikation notwendige Genabschnitte deletiert, insbesondere das Glykoprotein-Gen und ein Abschnitt im 3'U3-Bereich, der die virale TATA-Box enthält. In dieses Konstukt wird die genetische Information für ein Transgen unter Kontrolle eines heterologen, eukaryoten Promotors integriert. In diesem Plasmid werden zusätzlich zu env-Gen und 3'U3 weitere Gene deletiert, unter anderem die Gene vif, vpu, vpr, tat und nef. Außerdem wird der HIV-Promotor durch den CMV-Promotor ersetzt. Dadurch enthält das Plasmid zusätzlich zur Transgenkassette die HIV-Gene gag, pol und rev sowie das RRE.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform werden anstelle der HIV-1 gag-, pol-, env- und rev-Gene die entsprechenden Gensequenzen von HIV-2 oder SIV verwendet. In einer weiteren Ausführungsform werden anstelle eines oder mehrerer natürlicher Gene aus der Gruppe „gag, pol, env, rev" synonyme, Kodon-optimerte Gensequenzen verwendet, das sind Gene, die andere, synonyme Kodons für die Kodierung der gleichen Peptidsequenz besitzen. Es ist auch möglich, modifizierte gag-pol-Gene, deren Kernretentionssignale entfernt wurden, zu verwenden um den Export der gag-pol mRNAs aus dem Zellkern zu gewährleisten.

Die genetische Information des Glykoprotein-Gens wird durch Restriktionsverdau oder ähnliche Verfahren aus einem Virus-Laborstamm gewonnen und in ein Expressionsplasmid inseriert. Ebenso ist es möglich, nach Reverser Transkription der Virus-RNA durch Amplifikation der viralen Nukleinsäure, insbesondere durch Polymerase-Kettenreaktion, das Glykoprotein-Gen aus einem Laborstamm oder aus Probandenmaterial zu gewinnen und in ein Expressionsplasmid zu inserieren. Es ist gleichermaßen möglich, das env-Gen synthetisch herzustellen.

Das Transgen für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist ein HIV-Genbereich oder eine Kombination mehrerer Genabschnitte aus der Gruppe „gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, nef". Die genetischen Strukturen, insbesondere die Glykoproteingene, entstammen aus Viren der Gruppe „HIV-1, HIV-2, SIV" oder sind diesen analog. Optional enthält das Transgens synthetisch modifizierte Genomsequenzen. So ist es vorteilhaft, synonyme Gensequenzen zu verwenden. Die synonyme Sequenz hat den Vorteil, dass die Expression des Gens dadurch verbessert wird und die Gefahr einer homologen Rekombination und die Bildung pathogener Viren verringert wird.

Das Transgen enthält Sequenzen aus HIV-1, HIV-2 oder SIV. Optional besitzt es jedoch zusätzlich weitere Gene, deren Expressionsprodukte zur verstärkten Immunisierung beitragen, wie z. B. Zytokine, Chemokine, Antikörper, Hormone, Tetanus-, Diphtherie oder ein anderes Toxoid. Dabei stehen diese Gene unter der transkriptionellen Kontrolle eines eigenen Promotors oder sind mit dem HIV-Transgen über eine Interne Ribosomen-Eintrittsstelle verknüpft.

Die Plasmide werden in Bakterien, vorzugsweise in E. coli, vermehrt und anschließend aufgereinigt. Mit den Plasmiden werden durch dem Fachmann bekannte Standardverfahren eukaryote Zellen, vorzugsweise Zellen ohne HIV-Rezeptoren, wie die humane embryonale Nierenfibroblasten-Zelllinie HEK 293T, transfiziert. Die Transfektion der Plasmide in HEK 293T-Zellen führt dort zur Bildung von Vektorpartikeln, deren Genom die Regionen enthält, die auf dem Plasmid, das die cis-aktiven Regionen und das Transgen enthält, kodiert sind. Nach einigen Tagen, vorzugsweise nach 48–72 Stunden, werden die Vektoren aus dem Zellkulturmedium gewonnen, optional außerdem noch konzentriert durch Zentrifugation oder Filtrierung und die Konzentration infektiöser Vektoren bestimmt. Die Vektoren können eingefroren gelagert werden. Die Vektorpartikel gleichen in Form und Struktur natürlichen, infektiösen Lentiviren. Werden mit den lentiviralen Vektoren eukaryote Zellen infiziert, wird das Transgen exprimiert. Die Einführung der Fremd-Nukleinsäure in die Zellen wird als Transduktion bezeichnet. Eine Bildung von infektiösen Partikeln findet nicht statt.

Ein lentiviraler Vektor für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist beispielsweise dadurch erhältlich, daß a) in ein Ausgangskonstrukt, insbesondere ein Plasmid oder Cosmid, ein virales Genom inseriert wird, b) in dem Zielvirusgenom enthaltenden Konstrukt aus Stufe a) zumindest env und eine für die Genexpression des Virus notwendige Sequenz, insbesondere im 3'U3-Bereich modifiziert oder daraus deletiert werden, c) in das Produkt aus Stufe b) die genetische Information zur Expression der Markersubstanz inseriert wird, d) das Vektorkonstrukt aus Stufe c) zusammen mit einem Vektorkonstrukt enthaltend die genetische Information für ein HIV- oder SIV-env-Gen in ein Vektorproduktionssystem eingebracht und darin exprimiert wird, e) optional ein in Stufe b) deletiertes Protein in trans über ein Konstrukt, insbesondere ein Plasmid, oder eine Verpackungszelllinie in Stufe d) eingeführt wird und f) der in Stufe d) bzw. e) erzeugte virale Vektor nach seiner Produktion mittels des Vektorproduktionssystems, ggf. nach Zell-Kultivierung, isoliert wird.

Das Vektorproduktionssystem kann eine Verpackungszelllinie sein. Eine Verpackungszelllinie produziert bereits konstitutiv eines oder mehrere für die Bildung der Viruspartikel notwendigen Virusbestandteile, insbesondere das env-Gen. Die Isolierung kann darin bestehen, Zellkulturüberstand abzunehmen. Erfindungsgemäße lentivirale Vektoren können auch dadurch erzeugt werden, dass die Gene des Vektors stabil in eine Zelllinie integriert werden. Dazu werden durch dem Fachmann bekannte Verfahren eukaryote Zellen mit Plasmiden „stabil" transfiziert, Vektor-exprimierende Zellen identifiziert, und selektiert. Lentivirale Vektoren werden dabei aus dem Zellkulturüberstand der Produktionszelllinie isoliert.

2. Herstellung von rekombinanten Poxviren enthaltend das Genom zur Bildung lentiviraler Vektoren zur Immunisierung

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die genetischen Strukturen, die für die Bildung von erfindungsgemäßen infektiösen, replikationsinkompetenten lentiviralen Vektoren notwendig sind, in das Genom eines Virus aus der Familie der Poxviren integriert. Dazu werden cis-aktive Regionen zusammen mit dem Transgen und die anderen für die Vektorbildung notwendigen Genstrukturen an einer, zwei oder mehreren Genorten des Poxvirus eingefügt. Cis-aktive Bereiche zusammen mit dem Transgen sowie alle anderen Gene stehen unter transkriptioneller Kontrolle zytoplasmatisch aktiver Promotoren. Vorteilhaft sind dazu Poxviruspromotoren, insbesondere Frühe Promotoren wie der p7,5-Promotor. Zur Expression in Poxviren werden in den zu integrierenden lentiviralen Vektor-Genen alle kryptischen Transkriptions-Stopp-Sequenzen entfernt. Bei Verwendung Früher Poxvirus-Promotoren werden Abschnitte mit der Nukleotidsequenz TTTTTNT eliminiert. Unterhalb der zu transkribierenden Gensequenzen werden Stopp-Signale eingeführt. Bei Verwendung Früher Poxvirus-Promotoren wird die Sequenz TTTTTNT hinter die zu transkribierende Sequenz eingeführt. Es ist für ein erfindungsgemäßes Verfahren auch möglich, andere Poxviruspromotoren einschießlich Später oder Früh/Später Promotoren zu verwenden. Falls das verwendete Poxvirus ein Vakziniavirus ist, ist es vorteilhaft die Gene der lentiviralen Vektoren in den Bereich der Notl-Schnittstelle des Vakziniavirusgenoms sowie in das Thymidinkinase-Gen zu integrieren. Rekombinierte Poxviren werden durch dem Fachmann bekannte Verfahren selektiert, in eukaryoten Zellen angezüchtet und optional durch Zentrifugation konzentriert.

In einer besonderen Ausführungsform werden mehrere Expressionskassetten für einzelne HIV-Proteine gleichzeitig in das Poxvirusgenom eingefügt, wobei die Gensequenzen der zugrundeliegenden Lentiviren unterschiedlichen HIV-Stämmen oder unterschiedlichen Viren aus der Gruppe „HIV-1, HIV-2, SIV" entsprechen und entweder mit natürlichen Genen übereinstimmen oder modifizierte, optional synthetische, synonyme Nukleotidsequenzen besitzen.

Bevorzugt werden aus der Familie der Poxviren die Orthopoxviren, insbesondere das Vakziniavirus sowie Poxviren, die in ihrer Vermehrung im menschlichen Organismus eingeschränkt sind, wie das Modifizierte Vakziniavirus vom Typ Ankara (MVA) und Avipoxviren.

3. Immunisierung

Zur Immunisierung werden erfindungsgemäße infektiöse, replikationsinkompetente lentivirale Vektoren in definierter Konzentration und Menge ohne oder zusammen mit Adjuvans auf die Schleimhaut, intracutan, subcutan, transdermal, intranasal, intramusculär, intraperitoneal, intravenös oder auf anderem Weg einmal oder mehr als einmal appliziert. In einer besonderen Ausführungsform wird die Immunisierung mit den lentiviralen Vektoren kombiniert mit Immunisierungen durch ein anderes Verfahren, insbesondere zusammen mit rekombinanten Vektoren auf der Basis von Adeno- oder Pockenviren oder mit geeigneten DNA-Plasmiden, Protein-, Peptid-, Lipopeptid-Vakzinen oder bakteriellen Vektoren enthaltend Gene des HI-Virus. Als Adjuvans sind alle Substanzen geeignet, die zur Immunstimulation und -modulation beitragen ohne selbst ein HIV-Antigen darzustellen. Insbesondere, aber nicht ausschließlich, können dies Freund'sches Adjuvans, CpG-ODN, Derivate von Saponin und anderen Detergenzien, Zytokine, Chemokine, Toxoide wie Tetanus-, Diphtherie und Choleratoxin, Antikörper und Hormone sein. Die rekombinanten Poxviruskonstrukte enthaltend die lentiviralen Vektoren werden verabreicht, indem eine bestimmte Konzentration und Menge ohne oder zusammen mit Adjuvans auf die Schleimhaut, intracutan, subcutan, transdermal, intranasal, intramusculär, intraperitoneal, intravenös oder auf anderem Weg appliziert wird. Die Verabreichung kann einmalig oder mehrfach, alleine oder in Kombination mit anderen HIV-Impfstoffen, als einzelner Wirkstoff oder zusammen mit immunstimulatorischen Substanzen erfolgen.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von nicht beschränkenden Ausführungsbeispielen und Figuren näher erläutert.
Beispiel 1: Immunisierung mit einem HIV-1-Vektor enthaltend humanisiertes, synonymes gag/p39 (syngag)
Beispiel 2: Immunisierung mit einem HIV-1-Vektor enthaltend humanisiertes, synonymes gag/p39 (syngag) in Kombination mit einem DNA-Plasmid
Beispiel 3: Konstruktion eines Vektors, der das Glykoprotein von HIV-1 enthält.
Beispiel 4: Konstruktion eines rekombinanten Vakzinia-Virus zur Expression des Vektors pGJ2-syngag
Es zeigen
1: Plasmid pGJ2syngag zur Herstellung eines Vektors für ein erfindungsgemäßes Verfahren
2: Plasmid pSFsyngag als HIV-gag-Expressionsplasmid zur Impfung in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Vektorkonstrukt
3: Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Antwort in Balb/c-Mäusen nach Impfung mit einer Kombinationsimpfung aus DNA-Vakzine pSFsyngag und lentiviralem Vektor pGJ2syngag enthaltend das Syngag-Protein.
4: HIV-Gag/p55-spezifische humorale Immunantwort in Balb/c-Mäusen nach Impfung mit einer Kombinationsimpfung aus DNA-Vakzine pSFsyngag und lentiviralem Vektor pGJ2syngag enthaltend das Syngag-Protein.
5: Plasmid pEnv(Lig) zur Herstellung eines Vektors für ein erfindungsgemäßes Verfahren enthaltend die Glykoproteine von HIV-1.
6: Konstruktion eines rekombinanten Vakzinia-Virus (Stamm Copenhagen) enthaltend die Gensequenzen eines lentiviralen, replikationsinkompetenten Vektors auf Basis von pGJ2syngag und der HIV-1-Glykoproteine.
Beispiel 1: Immunisierung mit einem HIV-1-Vektor enthaltend humanisiertes, synonymes gag/p39 (syngag)

A) Aus dem Plasmid pczHSRV2 (Moebes et al., J. Virol. 1997; 71:7305-7311) wurde das Foamyvirus-Genom und der 3'-Teil des CMV-Promotors durch Restriktionsverdau mit Pmel und Ndel entfernt. Das HIV-1-Plasmid pHXB2D (Gen-Bank Nr. K03455 M38432) wurde mit BssHII und AfIII sowie mit AfIIII und Xbal verdaut. Der 3'-Teil des CMV-Promotors und der 5'-Teil der R-Region aus dem HIV-LTR wurden mit Hilfe der rekombinanten PCR rekonstruiert. Die BssHII/AfIIII und AfIIII/Xbal-Fragmente aus pHXB2D, das rekonstruierte CMV-Promotor/HIV-R-Konstrukt, verdaut mit BssHII und Ndel, und das Ndel/Pmel-Fragment des Plasmids pczHSRV2 wurden miteinander ligiert. Durch rekombinante PCR wurden die zellulären Restsequenzen aus pHXB2D entfernt. Durch Verdau mit Pvull und EcoRV wurde eine Deletion in der 3'-U-Region vorgenommen, wodurch die TATA-Box entfernt wurde. Durch Verdau mit Bpu 1102I und Asp7I8 wurde das nef-Gen teilweise entfernt. Dadurch wurde das Konstrukt pGJ2 erhalten. Anschließend wurde das syngag-Gen zusammen mit dem Spleen Focus-Forming Virus (SFFV)-Promotor in den Bereich der Esp3I-Schnittstelle in pGJ2 hineinligiert. Syngag ist ein synthetisch hergestelltes Gen, dessen Gensequenz für die HIV-Gag-Proteine p17 und p24 kodiert. Die Nukleotidsequenz von syngag ist:

Dadurch wurde das Plasmid pGJ2syngag erhalten, wozu auf 1 hingewiesen wird.

A) pczVSV-G wurde hergestellt gemäß der Literaturstelle (Pietschmann et al (2000), „Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export" J. Virol.73:2613-2621).
B) Die Plasmide pGJ2syngag und pczVSV-G wurden durch die CaCl₂-Methode (Soneoka et al. Nucl. Acids Research 1995. Vol. 23. No.4. 628–633) in 293T-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden für 8 h bei 37°C inkubiert, das Medium gewechselt und für weitere 16 h inkubiert. Anschließend wurde mit Natrium-Butyrat die Transkription der Vektor-DNA induziert, nach 8h das Natrium-Butyrat-haltige Medium entfernt und die Zellen für weitere 16 h in frischem Medium inkubiert. Dazu wurde zu diesem Zeitpunkt Medium verwendet, das frei von fötalem Rinderserum (FCS) ist. Dabei entstehen replikationsinkompetente Virus-Vektoren, die aus dem Zellkulturüberstand isoliert und durch Ultrazentrifugation (45 000 g, 150 min., 4° C) konzentriert wurden.
C) Die Expression des Transgens wurde getestet indem zu HEK 293-Zellen Zellkulturüberstand enthaltend die replikationsinkompetenten Virusvektoren gegeben und die Zellen für 48 – 72 Stunden bei 37°C inkubiert wurden. Anschließend wurden die Zellen lysiert und das Lysat durch Western-Blot-Test analysiert. Dabei wurde ein HIV-Gaglp24-spezifischer monoklonaler Antikörper zum Protein-Nachweis eingesetzt. Die Untersuchung zeigt die Expression eines Gag-Proteins in transduzierten Zellen mit einem Molekulargewicht von etwa 39 kD.
A) Die Vektoren wurden direkt vor der Applikation mit 10 μg immunstimulatorischen CpG-Oligodinukleotiden (CpG-ODN) (Nukleinsäuresequenz 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT-3') gemischt. Für die Austestung der Immunogenität wurde Mäusen (Mus musculus) des Inzuchtstamms Balb/c 5 × 10⁶ infektiöse Einheiten der Vektoren enthaltend die CpG-ODN intraperitoneal injiziert. Die Immunisierung wurde nach 2 Wochen wiederholt. Weitere 12 Tage später wurden die Mäuse getötet, Blut entnommen und die humorale Immunantwort gegen Vektorbestandteile untersucht. Es wurden fünf Tiere immunisiert.
A) Die Gag-spezifische Antikörperantwort wurde durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt. Dabei wurde eine Mikrotiterplatte mit in E. coli hergestelltem HIV-1 Gag/p55-Protein (2,5 μg/ml) beschichtet. Anschließend wurde Serum aus immunisierten Mäusen gewonnen und in einer Verdünnungsreihe auf die Platte pipettiert. Daraufhin wurde ein Detektionsantiserum (Kaninchen-anti-Maus-IgG), das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, zugegeben sowie anschließend Substrat. Die Extinktion bei 450 nm wurde photometrisch bestimmt und der Titer an Gag/p55-spezifischen Antikörpern wurde ermittelt als das Reziprok der Serumverdünnung, deren Extinktion größer war als die Extinktion von Kontrollserum nicht immunisierter Tiere. Diese Untersuchung zeigt die Induktion einer Gag-spezifischen Antikörperantwort im Blut von Mäusen, die mit dem Vektor pGJ2-syngag geimpft wurden, wozu auf Tabelle 1 hingewiesen wird. Tabelle 1: Titer anti-Gag/p55-spezifischer Antikörper in Mäusen nach zweimaliger Impfung mit pGJ2syngag
F) Die Konzentration an neutralisierenden Antikörpern wurde durch den Neutralisationstest bestimmt. Dabei wurde Serum in Form einer Verdünnungsreihe zu 100 TCID₅₀ von mit VSV-G pseudotypisierten pGJ2-GFP-Vektoren, das sind pGJ2syngag-ähnliche Vektoren, die als Transgen anstelle von syngag das Grün-fluoreszierende Protein GFP tragen, gegeben und mikroskopisch untersucht, bis zu welcher Serumverdünnung die Markergenexpression unterdrückt werden kann. Der Neutralisationstiter entspricht dem Reziprokwert der höchsten Verdünnung, bei der noch eine vollständige Hemmung der GFP-Expression beobachtet wurde. Diese Untersuchung zeigt die Induktion einer Vektor-neutralisierenden Antikörperantwort im Blut von Mäusen, die mit dem Vektor pGJ2syngag geimpft wurden, wozu auf Tabelle 2 hingewiesen wird. Tabelle 2: Titer neutralisierender, anti-VSV-G-Glykoprotein-spezifischer Antikörper in Mäusen nach zweimaliger Impfung mit pGJ2syngag

Beispiel 2: Immunisierung mit einem HIV-1-Vektor enthaltend humanisiertes, synonymes gag/p39 (syngag) in Kombination mit einem DNA-Plasmid

A) Aus dem Plasmid pczHSRV2 (Moebes of al., J. Virol. 1997; 71:7305-7311) wurde das Foamyvirus-Genom und der 3'-Teil des CMV-Promotors durch Restriktionsverdau mit Pmel und Ndel entfernt. Das HIV-1-Plasmid pHXB2D (Gen-Bank Nr. K03455 M38432) wurde mit BssHII und AfIII sowie mit AfIIII und Xbal verdaut. Der 3'-Teil des CMV-Promotors und der 5'-Teil der R-Region aus dem HIV-LTR wurden mit Hilfe der rekombinanten PCR rekonstruiert. Die BssHII/AfIIII und AfIIII/XbaI-Fragmente aus pHXB2D, das rekonstruierte CMV-Promotor/HIV-R-Konstrukt, verdaut mit BssHII und Ndel, und das Ndel/Pmel-Fragment des Plasmids pczHSRV2 wurden miteinander ligiert. Durch rekombinante PCR wurden die zellulären Restsequenzen aus pHXB2D entfernt. Durch Verdau mit Pvull und EcoRV wurde eine Deletion in der 3'-U-Region vorgenommen, wodurch die TATA-Box entfernt wurde. Durch Verdau mit Bpu 1102I und Asp7I8 wurde das nef-Gen teilweise entfernt. Dieses Konstrukt ist pGJ2. Anschließend wurde das syngag-Gen zusammen mit dem Spleen Focus-Forming Virus (SFFV)-Promotor in den Bereich der Esp3I-Schnittstelle in pGJ2 hineinligiert. Dadurch wurde das Plasmid pGJ2syngag erhalten, wozu auf 1 hingewiesen wird.
B) pczVSV-G wurde hergestellt gemäß der Literaturstelle (Pietschmann et al (2000), „Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export" J. Virol.73: 2693-2621).
C) Die beiden rekombinanten Plasmid-DNAs wurden durch die CaCl₂-Methode (Soneoka et al. Nucl. Acids Research 1995. Vol. 23. No. 4. 628-633 in 2931-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden für 8 h bei 37°C inkubiert, das Medium gewechselt und für weitere 16 h inkubiert. Anschließend wurde mit Natrium-Butyrat die Transkription der Vektor-DNA induziert, nach 8h das Natrium-Butyrat-haltige Medium entfernt und die Zellen für weitere 16 h in frischem Medium inkubiert. Dazu wurde Medium verwendet, das frei von fötalem Rinderserum ist. Dabei entstehen replikationsinkompetente Virus-Vektoren, die aus dem Zellkulturüberstand gewonnen und durch Ultrazentrifugation (45 000 g, 150 min., 4° C) konzentriert wurden.
D) Ein syngag-enthaltendes Expressionsplasmid wurde hergestellt, indem das syngag-Gen zusammen mit dem Promotor des Spleen Focus-Forming Virus in den Vektor pcDNA3.1zeo (Invitrogen) kloniert wurde. Dadurch wurde das Plasmid pSFsyngag erhalten, wozu auf 2 hingewiesen wird.
E) 100 μg pSFsyngag Plasmid-DNA wurden mit 10 μg CpG-ODN gemischt und zur Austestung der Immunogenität Mäusen (Mus musculus) des Inzuchtstamms Balb/c je 50 μg DNA/5 μg CpG-ODN in die Mm. quadriceps beider Hinterbeine injiziert. Drei Wochen später wurden aus pGJ2syngag und pczVSV-G hergestellte Vektoren mit 10 μg immunstimulatorischen CpG-Oligodinukleotiden (CpG-ODN) (Nukleinsäuresequenz 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT-3') gemischt. 5 × 10⁶ infektiöse Einheiten der Vektoren enthaltend die CpG-ODN wurden intraperitoneal injiziert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse getötet, die Milz und Blut entnommen und die zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Antwort sowie die humorale Immunantwort gegen das HIV-Gag-Protein gemessen. Als Kontrollen wurden Balb/c-Mäuse zweimal mit Plasmid-DNA immunisiert. Es wurden je fünf Tiere immunisiert.
A) Die HIV-Gag-spezifische CTL-Antwort wurde wie folgt analysiert: Die entnommene Milz wurde zerkleinert, die Erythrozyten in Ammoniumchlorid-haltiger hypotoner Lösung lysiert und die mononukleären Zellen isoliert. Die CTL-Reaktion wurde durch den ELISpot-Test untersucht. Dafür wurden die mononukleären Zellen in eine mit einer Membran versehene Mikrotiterplatte, die mit Antikörpern gegen Maus-Interferon-γ (IFN-γ) beschichtet war, ausgesät. Zusätzlich wurde als Antigen ein Peptid aus dem Bereich des HIV-Gag/p24-Proteins mit der Aminosäuresequenz „AMQMLKETI" in einer Konzentration von 10 μg/ml zugegeben. Die Zellen wurden mit dem Antigen für 40 h bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abgewaschen und die IFN-γ-Produktion mit einem immunologischen Detektionssystem nachgewiesen. In diesem Detektionssystem wurde ein mit Streptavidin konjugierter Anti-IFN-γ-Antikörper als Nachweisantikörper zugegeben. Durch Zugabe von an Biotin gekoppelter Alkalischer Peroxidase und Substrat läuft eine Farbreaktion dort ab, wo durch antigenspezifische Lymphozyten IFN-γ produziert und an die Membran der Mikrotiterplatte gebunden wurde. Die in diesem Test sichtbar werdenden Spots entsprechen durch das Gag-Peptid AMQMLKETI aktivierten zytotoxischen T-Lymphozyten. Die Spots wurden mithilfe eines Sektionsmikroskops ausgezählt und die Anzahl der Spots bezogen auf 10⁶ mononukleäre Milzzellen ermittelt, wozu auf 3 hingewiesen wird.
A) Die Gag-spezifische Antikörperantwort wurde durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt. Dabei wurde eine Mikrotiterplatte mit in E. coli hergestelltem HIV-1 Gag/p55-Protein (2,5 μg/ml) beschichtet. Anschließend wurde Serum aus immunisierten Mäusen gewonnen und in einer Verdünnungsreihe auf die Platte pipettiert. Daraufhin wurde ein Detektionsantiserum (Kaninchen gegen Maus-IgG), das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, zugegeben sowie anschließend Substrat. Die Extinktion bei 450 nm wurde photometrisch bestimmt und der Titer an Gag/p55-spezifischen Antikörpern wurde ermittelt als das Reziprok der Serumverdünnung, deren Extinktion größer war als die Extinktion von Kontrollserum nicht immunisierter Tiere. Diese Untersuchung zeigt die Induktion einer Gag-spezifischen Antikörperantwort im Blut von Mäusen, die mit pSFsyngag und dem Vektor pGJ2-syngag geimpft wurden, wozu auf 4 hingewiesen wird.

Beispiel 3: Konstruktion eines Vektors, der das Glykoprotein von HIV-1 enthält.

A) Aus dem Plasmid pczHSRV2 (Moebes et al., J. Virol. 1997; 71:7305-7311) wurde das Foamyvirus-Genom und der 3'-Teil des CMV-Promotors durch Restriktionsverdau mit Pmel und Ndel entfernt. Das HIV-1-Plasmid pHXB2D (Gen-Bank Nr. K03455 M38432) wurde mit BssHII und AfIII sowie mit AfIIII und Xbal verdaut. Der 3'-Teil des CMV-Promotors und der 5'-Teil der R-Region aus dem HIV-LTR wurden mit Hilfe der rekombinanten PCR rekonstruiert. Die BssHII/AfIIII und AfIIII/Xbal-Fragmente aus pHXB2D, das rekonstruierte CMV-Promotor/HIV-R-Konstrukt, verdaut mit BssHII und Ndel, und das Ndel/Pmel-Fragment des Plasmids pczHSRV2 wurden miteinander ligiert. Durch rekombinante PCR wurden die zellulären Restsequenzen aus pHXB2D entfernt. Durch Verdau mit Pvull und EcoRV wurde eine Deletion in der 3'-U-Region vorgenommen, wodurch die TATA-Box entfernt wurde. Durch Verdau mit Bpu 1102I und Asp7I8 wurde das nef-Gen teilweise entfernt. Dieses Konstrukt ist pGJ2. Anschließend wurde das syngag-Gen zusammen mit dem Spleen Focus-Forming Virus (SFFV)-Promotor in den Bereich der Esp3I-Schnittstelle in pGJ2 hineinligiert. Dadurch wurde das Plasmid pGJ2syngag erhalten, wozu auf 1 hingewiesen wird.
B) Das Plasmid pHXB2 wurde mit den Restriktionsenzymen Sall und Xhol geschnitten. Dabei entsteht ein 3,1 kb großes Fragment, welches unter anderem das gesamte Leseraster des env-Gens enthält. Dieses Fragment wurde über eine Xhol-Schnittstelle in den pC-DNA(–) Vektor (Invitrogen) kloniert. Dieses Plasmid wurde mit Bpil und Xhol geschnitten und das so erhaltene Bpil/Xhol-Fragment enthält das komplette Leseraster des env-Gens. Die 5'-Überhänge der Schnittstellen wurden durch die Behandlung mit der Klenow-Polymerase aufgefüllt. Das eukaryotische Expressionsplasmid pCl (Promega), welches ein Intron und einen CMV-Promotor enthält, wurde mit Smal geschnitten und das Bpil/Xhol Fragment hinein kloniert. Dadurch wurde das Plasmid pEnv(Lig), bei dem das HIV-1-env-Gen unter Kontrolle des CMV-Promotors steht, erhalten, wozu auf die 5 hingewiesen wird.
C) Die beiden rekombinanten Plasmid-DNAs werden durch die CaCl₂ Methode (Soneoka et al. Nucl. Acids Research 1995. Vol. 23. No.4. 628-633) in 293T-Zellen transfiziert. Die Zellen werden für 8 h bei 37°C inkubiert, das Medium gewechselt und für weitere 16 h inkubiert. Anschließend wird mit Natrium-Butyrat die Transkription der Vektor-DNA induziert, nach 8h das Natrium-Butyrat-haltige Medium entfernt und die Zellen für weitere 16 h in frischem Medium inkubiert. Dabei entstehen replikationsinkompetente Virus-Vektoren, die aus dem Zellkulturüberstand isoliert werden.

Beispiel 4: Konstruktion eines rekombinanten Vakzinia-Virus zur Expression des Vektors pGJ2syngag
Durch PCR wird das 5'-Ende der Expressionskassette von pGJ2syngag unterhalb des CMV-Promotors amplifiziert, wobei gleichzeitig am 5' Ende der Immediate Early-Promotor p7.5 aus Vakziniavirus sowie Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Eagl und Xhol angefügt werden. Durch PCR wird auch das 3'-Ende der Expressionskassette von pGJ2syngag amplifiziert, wobei gleichzeitig das Vakziniavirus-Immediate Early Gen Stop-Signal TTTTTGT hinter der 3'R-Region eingefügt wird. Die Fragmente werden zusammen mit dem mittleren Teil der Expressionskassette aus pGJ2syngag in das Plasmid pBK-CMV ligiert. Anschließend wird das modifizierte pGJ2syngag-Vektorgenom durch das Restriktionsenzym Eagl herausgeschnitten und in die Notl-Schnittstelle eines Vakziniavirus (Stamm Copenhagen) hineinkloniert. 143B Tk-Zellen werden mit der ligierten Vakziniavirus-DNA transfiziert und nach Inkubation für 24–72 h rekombinante Vakziniaviren aus dem Zelllysat gewonnen. Vakziniaviren werden kloniert und rekombinante Vakzinaviren, die pGJ2-syngag-Vektorkomponenten exprimieren, selektiert. Eine Expressionskassette enthaltend das HIV-1-env-Gen, aus dem die Transskriptionsstopps entfernt wurden, unter transkriptioneller Kontrolle des Immediate Early-Promotor p7.5 aus Vakziniavirus wird durch homologe Rekombination in den Thymidinkinasegen (tk)-Locus des Vakziniavirus enthaltend pGJ2syngag hineinkloniert, wozu auf 6 hingewiesen wird
Ein erfindungsgemäßer lentiviraler Vektor für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist abgeleitet vom Genom eines einzigen HIV-1-Stamms. Es wird dem einschlägig erfahrenen Durchschnittsfachmann jedoch offensichtlich, dass Sequenzen aus mehreren unterschiedlichen HIV-1-Sequenzen als Ausgangsbasis für die Konstruktion von erfindungsgemäßen lentiviralen Vektoren und Verfahren verwendet werden können. Es ist bekannt, chimäre Lentiviren enthaltend Elemente aus HIV und SIV herzustellen. Es ist deshalb offensichtlich, dass anstelle oder zusätzlich zu Sequenzen aus HIV-1 auch Sequenzen aus HIV-2 oder dem Affenimmunschwächevirus SIV im Vektor enthalten sein können, solange dadurch ein funktionsfähiger lentiviraler Vektor gebildet wird. Dabei können die Virussequenzen sowohl von Laborstämmen als auch von Virus-Primärisolaten stammen. Es ist dabei möglich Gene, die für HIV-Proteine kodieren, zu modifizieren, zu kürzen oder durch synthetische, synonyme Gensequenzen zu ersetzen.
Vorteilhaft ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und dazu geeigneten Vakzinierungskonstrukten die Verwendung von HIV-1-Glykoprotein-Genen. Es ist jedoch auch möglich, zusätzlich oder anstelle der HIV-1-Gene die Glykoprotein-Gene der mit HIV-1 verwandten Viren HIV-2 und SIV zu verwenden.
Um den Vektor biologisch sicher zu machen ist es nützlich, bestimmte regulatorische Genabschnitte zu entfernen. Insbesondere ist es vorteilhaft, durch Entfernung einer Region im 3'U3 des 3'-LTR-Bereichs einen „selbst-inaktivierenden" Vektor herzustellen. Außerdem kann durch Ersatz natürlicher Gensequenzen durch synonyme Kodon-veränderte Gene das Risiko einer homologen Rekombination reduziert werden.
Es wird auch offensichtlich werden, dass in lentiviralen Vektoren für erfindungsgemäße Verfahren und den davon abgeleiteten rekombinanten Poxviren mehrere HIV-Gene als Transgen enthalten sein können. Neben der Integration eine Genomabschnitts aus dem Bereich des gag-Gens ist es möglich weitere oder andere HIV-Genomabschnitte aus der Gruppe „gag, pol, env, rev, tat, vif, vpr, vpu, nef als Transgen in den gegebenenfalls in Poxviren verpackten lentiviralen Vektor zu inkorporieren. Neben der Verwendung von HIV-Gensequenzen als Transgen, die natürlichen HIV-Sequenzen entsprechen, ist es vorteilhaft, synthetische Gensequenzen mit veränderten Kodonsequenzen, die für die gleichen Proteine kodieren, einzusetzen.
Innerhalb des Genoms des lentiviralen Vektors können zusätzlich zum Transgen Gene zur Expression immunregulatorischer Proteine wie Zytokine, Chemokine, Antikörper, Hormone, Tetanus-, Diphtherie-, Cholera- oder ein anderes Toxoid integriert sein.
Es ist möglich, die erfindungsgemäßen Vektoren einmal zu verabreichen. Vorteilhaft ist jedoch die mehrmalige Applikation, da dadurch eine Verstärkung der Immunantwort, insbesondere gegen die Glykoproteine, erzielt werden kann. Es ist möglich, die Vektoren in Kombination mit anderen HIV-Impfstoffen zu verabreichen. Es ist auch möglich unterschiedliche erfindungsgemäße Vektoren, die genetisch von verschiedenen Immunschwächeviren abgeleitet wurden, zu kombinieren und entweder gemeinsam oder nacheinander zu verabreichen. Es ist auch möglich, Vektoren bei der Anwendung mit anderen bekannten und neu zu entwickelnden Adjuvanzien zu kombinieren.
Besonders zweckmäßig zur Vermehrung und Verabreichung des erfindungsgemäßen lentiviralen Vektors ist die Verpackung seines Genoms in Viren aus der Familie der Poxviren. Darunter sind besonders Vakziniavirus aus der Subfamilie der Orthopoxviren sowie Avipoxviren einschließlich Geflügelpocken- und Kanarienpockenviren und andere Poxviren, deren Replikationsfähigkeit im menschlichen Organismus eingeschränkt ist, wie der Vakziniavirus-Stamm Modifiziertes Vakzinia-Virus Typ Ankara, MVA. In Poxviruskonstrukten können die Gene, die für die Herstellung von lentiviralen Vektoren in der Zelle notwendig sind an ein, zwei oder mehr unterschiedlichen Orten integriert sein. Es ist vorteilhaft, cis-aktive Sequenzen zusammen mit dem Transgen von den Genen, die zur Komplementation in trans notwendig sind, zu trennen. Dabei können gleichzeitig auch mehrere genetisch unterschiedliche, jedoch analoge lentivirale Gene an einem oder mehreren Orten des Poxvirusgenoms integriert werden, so dass die in Poxvirus-infizierten Zellen entstehenden Vektorpartikel Proteinkomponenten von verschiedenen Lentiviren der Gruppe „HIV-1, HIV-2, SIV" enthalten. Insbesondere ist es vorteilhaft, zur Herstellung erfindungsgemäßer rekombinanter Poxviren mehrere HIV-Glykoproteingene in das Poxvirus zu integrieren. Zwei oder mehr Glykoproteingene können dabei entweder an einem einzigen Genlocus, insbesondere im Bereich des tk-Gens, oder an zwei oder mehr unterschiedlichen Genloci integriert werden. Dadurch werden in infizierten Zellen rekombinante lentivirale Vektoren gebildet, die die Glykoproteine von unterschiedlichen HIV-Stämmen tragen. Es ist gleichermaßen möglich zwei oder mehr Kassetten für andere HIV-Struktur- und Regulatorgene sowie zwei oder mehr Kassetten enthaltend die cis-aktiven Elemente und unterschiedliche Transgene in das Poxvirusgenom zu integrieren. Es wird dem Durchschnittsfachmann offensichtlich, dass eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten der Anzahl und Anordnung von Komponenten zur Produktion von lentiviralen Vektoren enthaltend HIV-Transgene und Glykoproteingene aus Immunschwächviren erzeugt werden können. Das Einfügen von zusätzlichen genetisch andersartigen HIV-Genen hat den Vorteil, dass dem Immunsystem gleichzeitig Proteine von mehreren unterschiedlichen HI-Virusstämmen präsentiert werden und eine breite, kreuzreaktive Immunantwort erzielt werden kann. Es ist offensichtlich, dass dabei auch gleichzeitig Genkomponenten von HIV-2 und SIV mit-integriert werden können. Es ist auch möglich, dass Gene für immunregulatorische Proteine wie Zytokine, Chemokine, Antikörper, Hormone, Tetanus-, Diphtherie-, Cholera- oder ein anderes Toxoid in das Poxvirusgenom außerhalb oder innerhalb der Expressionskassetten für die Gene der lentiviralen Vektoren eingeführt werden, um damit bei der Vakzinierung eine Immunmodulation zu erzielen. Erfindungsgemäße Poxviruskonstrukte können einmalig aber auch mehrfach hintereinander verabreicht werden, wobei es bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zunächst unerheblich ist, ob die Verabreichung im Abstand von Tagen oder Wochen oder erst von mehreren Jahren erfolgt. Es können auch mehrere Poxviruskonstrukte, die jeweils die Genome von lentiviralen Vektoren auf Basis von genetisch unterschiedlichen HIV-Stämmen besitzen, gleichzeitig oder in Folge verabreicht werden. Außerdem können rekombinante Poxviruskonstrukte in bestimmter zeitlicher Reihenfolge oder Lokalisation zusammen mit anderen Vakzinen gegen HIV auf der Basis von Substanzen aus der Gruppe „Protein-, Peptid-, Lipopeptid-, DNA-Vakzine, Pseudovirion, bakterieller und viraler Vektor" oder anderen, bisher noch unbekannten Imfpfstoff verabreicht werden. Poxviruskonstrukte können auch mit immunregulatorischen Substanzen in bestimmter zeitlicher Reihenfolge oder Lokalisation zusammen verabreicht werden. Es ist auch möglich zwei oder mehrere Poxviruskonstrukte, die jeweils zumindest teilweise unterschiedliche lentivirale Genomsequenzen enthalten, gemeinsam oder nacheinander zu applizieren um eine breite immunisierende Wirkung gegenüber einer Vielzahl von antigenen HIV-Varianten zu induzieren.
Die in Poxviren verpackten lentiviralen Vektoren enthaltend HIV-Transgene können für das erfindungsgemäße Verfahren der Erzeugung einer Immunantwort über verschiedene Wege appliziert werden. So ist es möglich, die Poxviruskonstrukte intracutan, subcutan, transdermal, intramuskulär, intravenös, intraperitoneal oder auf Schleimhäute der Atemwege, der Verdauungsorgane einschließlich dem Darm oder der Geschlechtsorgane zu verabreichen.
Vorteile der Erfindung
Retrovirale Vektoren gelten als nur schwach immunogen (McConnack et al. (1997), "Anti-vector immunoglobulin induced by retroviral vectors" Hum Gene Ther 8(10):1263-73). Es ist deshalb überraschend, dass im Mausmodell durch replikationsinkompetente lentivirale Vektoren enthaltend Syngag eine beachtliche humorale und zelluläre Immunantwort gegen das HIV-Gag-Protein, deren Ausmaß der anderer Immunisierungsverfahren entspricht oder sie sogar übertrifft sowie gleichzeitig eine neutralisierende Antikörperantwort gegen das Glykoprotein erzielt werden kann.
Darüber hinaus zeigt die Erfindung einen Weg auf, mit dem gleichzeitig mehrere elementare Schwierigkeiten bei der Erzeugung einer HIV-spezifischen Immunantwort gelöst werden. Dazu zählen die Möglichkeit einer Vakzinierung durch einen Impfstoff, der wie ein Lebendimpfstoff die Zellen, die natürliche Zielzellen der HIV-Infektion sind, infiziert, gleichzeitig jedoch eine hohe biologische Sicherheit besitzt. Die natürliche Expression der HIV-Glykoproteine an der Virusoberfläche ermöglicht die Induktion einer neutralisierenden Antikörperantwort, gleichzeitig werden durch die Expression und intrazelluläre Prozessierung von Virusproteinen in infizierten Zellen zytotoxische T-Lymphoyzten, denen eine entscheidende Bedeutung bei der HIV-Abwehr beigemessen wird, aktiviert. Die Integration des Transgens ermöglicht eine Weitergabe des Transgens bei der Zellteilung und damit eine Vermehrung des Antigens in vivo. Durch die Wahl geeigneter Promotoren ist kann die Expression von HIV-Protein aus transduzierten Zellen längere Zeit anhalten oder nach einer Latenzzeit zu einem erneuten Antigenkontakt „von innen" führen. Dadurch ist eine länger anhaltende HIV-spezifische Immunaktivierung im einmal immunisierten Organismus möglich.
Mit der Erfindung werden folgende weitere Vorteile gegenüber der Immunisierung mit anderen Verfahren erhalten. Durch die Immunisierung mit Vektoren werden Partikel verabreicht, die in ihrer Größe und Form sowie der Proteinzusammensetzung und Glykoproteinexpression dem pathogenen Ausgangsvirus ähneln, wobei die natürliche Infektion in optimaler Weise nachgeahmt wird. Ein Vorteil von lentiviralen Vektoren, die die Glykoproteine von HIV oder SIV tragen ist, dass Dendritische Zellen diese Vektoren zu den Organen des Immunsystems transportieren können. Bei der natürlichen Infektion ist die Bindung von HIV über sein Glykoprotein gp120 an Dendritische Zellen und der Transport durch diese Zellen zu den lymphatischen Organen, wo das Virus auf die eigentlichen Zielzellen, die Makrophagen und die CD4+ T-Lymphozyten, trifft und diese infiziert, ein wichtiges pathogenetisches Element der HIV-Infektion. Dieser pathogenetische Prozess kann durch erfindungsgemäße Vektoren nachvollzogen werden.
Die Infektion über das CD4-Molekül ermöglicht auch die Infektion von solchen Zellen, die weil sie viele Jahre leben als Reservoir einer HIV-Infektion betrachtet werden (Finzi et al. (1997), "Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy" Science 278(5341):129300). Dadurch kann möglicherweise eine langanhaltende Immunaktivierung erzielt werden.
Anders als bei der Immunisierung mit Totimpfstoff enthalten die Vektor-Partikel für ein erfindungsgemäßes Verfahren HIV- oder SIV-Glykoproteine in ihrer natürlichen Konfiguration. Dies begünstigt die Bildung neutralisierender Antikörper.
Ein besonderer Vorteil durch die Verwendung von erfindungsgemäßen lentiviralen Vektoren gegenüber Vektoren auf Basis von Oncoretroviren ist, dass damit eine Immunantwort gegen Nicht-Immunschwächeviren, die eine Auffrischimpfung blockieren würde, nicht erzeugt wird. Im Gegensatz zu anderen viralen Vektoren einschließlich oncoretroviraler Vektoren, die HIV-Gene enthalten, ist eine mehrfache Verabreichung der erfindungsgemäßen lentiviralen Vektoren sinnvoll, denn sie verstärkt die Immunantwort gegen die Virus-Glykoproteine.
Bei dem Verfahren zur Immunisierung unter Verwendung von rekombinanten Poxviren enthaltend Gene lentiviraler Vektoren kommt es zu einer Reihe weiterer wesentlicher Vorteile: Poxviruskonstrukte sind physikalisch-chemisch wesentlich stabiler als die Immunschwächeviren und lentivirale Vektoren. Sie lassen sich deshalb zu höheren Titern konzentrieren und widerstehen Einfrier- und Auftauvorgänge wesentlich besser. Sie sind deshalb weniger empfindlich gegenüber Unterbrechungen der Kühlkette, einem kritischen Punkt bei der Anwendung von Impfstoffen, insbesondere in heißen und ärmeren Ländern.
Die Verabreichung von rekombinanten Poxviren führt im Körper zunächst zu einer umfangreichen Vermehrung der Poxviruskonstrukte über mehrere Tage. Da das lentivirale Genom stabil in den Pockenviren verpackt ist, kommt es gleichzeitig zu einer massiven Produktion von Vektorpartikeln, die ihrerseits CD4+ Zellen infizieren und transduzieren, wobei das Transgen exprimiert wird. Dadurch wird durch die Verabreichung rekombinanten Poxviruskonstrukte eine drastische Steigerung der Vektorzahl und eine Potenzierung der Antigenmenge in vivo erzielt. Bei diesem Verfahren wird mit nur einer einzigen Immunisierung dem Immunsystem auf dreierlei Weise HIV-Antigen dargeboten: 1. Zunächst präsentieren die rekombinanten Poxviren lentivirale Glykoproteine, so dass die Poxviruspartikel selbst bereits eine neutralisierende Antikörperantwort hervorrufen. 2. Es werden in infizierten Zellen HIV-Vektorpartikel produziert, zur erweiterten Aktivierung einer Immunantwort gegen Vektor-Strukturbestandteile. 3. In infizierten Zellen wird das Transgen exprimiert, prozessiert und ermöglicht so insbesondere die Aktivierung zytotoxischer T-Lymphozyten.
Es ist weiterhin besonders vorteilhaft, dass durch und in rekombinanten Poxviren Antigene von mehreren genetisch unterschiedlichen HIV-Stämmen gleichzeitig verabreicht werden können. Dadurch ist das Verfahren geeignet, mit einem einzigen Impfstoff und einer einzigen Verabreichungsdosis eine kräftige, breit angelegte, kreureaktive Immunantwort zu erzeugen. Es ist damit besonders geeignet, die Anzahl der notwendigen Immunisierungen und die benötigte Impfstoffmenge zu reduzieren.
Nukleotidsequenzen

1. Syngag:
2. CpG-Oligodinucleotid TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT

Claims

Ein Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort gegen Proteine des Humanen Immunschwächevirus (HIV), dadurch gekennzeichnet, dass ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor appliziert wird, der ein oder mehrere HIV-Gene als Transgen enthält, wobei optional das Transgen Komponenten von zwei oder mehr unterschiedlichen HIV-Stämmen enthält.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der lentivirale, replikationsinkompetente Virusvektor Glykoproteine eines Lentivirus aus der Gruppe „HIV-1, HIV-2, SIV" enthält.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch, gekennzeichnet, dass der lentivirale, replikationsinkompetente Virusvektor weitere Gene zur Expression von immunregulatorischen Substanzen enthält.
Ein Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort gegen Proteine des Humanen Immunschwächevirus (HIV), dadurch gekennzeichnet, dass ein Poxvirus enthaltend die Genombestandteile eines replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektors, der ein oder mehrere HIV-Gene als Transgen enthält, verabreicht wird, wobei optional das Transgen Komponenten von zwei oder mehr unterschiedlichen HIV-Stämmen enthält.
Ein Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Poxvirusgenom zusätzlich zu allen für die Erzeugung eines lentiviralen Vektors notwendigen Genen eine oder mehrere weitere Kopien von Genen aus der Gruppe „gag, pol, env, tat, rev, vif, vpu, vpr, nef" aus genetisch unterschiedlichen Virusstämmen der Gruppe „HIV-1, HIV-2, SIV" unter transkriptioneller Kontrolle eines im Zytoplasma aktiven Promotors enthält.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Orthopoxvirus enthaltend Genombestandteile replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren appliziert wird.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Vakziniavirus enthaltend Genombestandteile replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren appliziert wird.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein in humanen Zellen replikationsinkompetentes Poxvirus enthaltend Genombestandteile replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren appliziert wird.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Avipoxvirus enthaltend Genombestandteile replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren appliziert wird.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 4–9, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Gensequenzen für immunregulatorische Proteine im lentiviralen Vektor enthalten sind.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 4–10, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Gensequenzen für immunregulatorische Proteine im Poxvirus-Vektor enthalten sind.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 4–11, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zum rekombinanten Poxvirusvektor immunregulatorische Substanzen appliziert werden.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 4–12, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Poxvirusvektor einem Individuum nur einmal verabreicht wird.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 4–12, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Poxvirusvektor einem Individuum mehrmals verabreicht wird.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 13–14, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Poxvektor in Zusammenhang hinsichtlich zeitlicher Reihenfolge oder Lokalisation mit der Applikation eines weiteren Immunogens aus der Gruppe „Protein-, Peptid-, Lipopetid-, DNA-Plasmid-Impfstoff, Viraler und Bakterieller rekombinanter Vektor-Impfstoff, Pseudovirion" oder einem anderen zukünftig noch zu entwickelnden Impfstoffprinzip kombiniert verabreicht wird.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 13–15 dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehr verschiedene rekombinante Poxviren, die Vektoren enthalten, welche auf genetischer Basis von unterschiedlichen HIV-Stämmen hergestellt wurden, verabreicht werden.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor für ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor von einem Virus der Gruppe „HIV-1, HIV-2, SIV" abgeleitet ist.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass er ein oder mehrere HIV-Gene als Transgen enthält, wobei optional das Transgen Komponenten von zwei oder mehr unterschiedlichen HIV-Stämmen enthält.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass er Glykoproteine eines Lentivirus aus der Gruppe „HIV-1, HIV-2, SIV" enthält.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 17–19, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Immunantwort gegen HIV-Strukturbestandteile hervorruft.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach Anspruch 17–20, dadurch gekennzeichnet, dass das Transgen eine kodonoptimierte Nukleinsäuresequenz besitzt.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 17–21, dadurch gekennzeichnet, dass der lentivirale Vektor ein selbst-inaktivierender Vektor ist.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 17–22, dadurch gekennzeichnet, dass das Transgen unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryoten nukleär aktiven Promotors steht.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Transgen unter transkriptioneller Kontrolle des SFFV-Promotors steht.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 17–24, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor weitere Gene zur Immunstimulation einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zytokine, Hormone, Antikörper, Bakterientoxin unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryoten Promotors enthält.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 1–25, dadurch gekennzeichnet, dass die Genom-Bestandteile des Vektors in einem Poxvirus verpackt sind.
Ein Poxvirus nach einem der Ansprüche 1–25, dadurch gekennzeichnet, dass Genombestandteile von zwei oder mehr replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektoren enthalten sind, wobei die Genomteile der lentiviralen Vektoren von zwei oder mehr unterschiedlichen HIV-Stämmen abgeleitet ist.
Ein Poxvirus nach einem der Ansprüche 1–25, dadurch gekennzeichnet, dass im Poxvirusgenom Genombestandteile von einem replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektor und zusätzlich Gene von einem, zwei oder mehr unterschiedlichen HIV-Stämmen enthalten sind.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 26–28, dadurch gekennzeichnet, dass Bestandteile des Vektors in einem Orthopoxvirus verpackt sind.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 26–28, dadurch gekennzeichnet, dass Bestandteile des Vektors in einem Vakziniavirus verpackt sind.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 26–28, dadurch gekennzeichnet, dass Bestandteile des Vektors in einem in humanen Zellen replikationsinkompetenten Poxvirus verpackt sind.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 26–28, dadurch gekennzeichnet, dass Bestandteile des Vektors in einem Avipoxvirus verpackt sind.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 26–32, dadurch gekennzeichnet, dass cis-aktive Regionen zusammen mit dem Transgen sowie die trans-aktiven Strukturgene am gleichen Ort des Poxvirusgenoms integriert sind.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 26–32, dadurch gekennzeichnet, dass cis-aktive Regionen zusammen mit dem Transgen und die trans-aktiven Strukturgene an getrennten Orten des Poxvirusgenoms integriert sind.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 26–32, dadurch gekennzeichnet, dass Bestandteile mehrerer Vektorgenome auf Basis unterschiedlicher HIV-Stämme gleichzeitig im Poxvirusgenom verpackt sind.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 26 – 32, dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehr Glykoproteingene von genetisch verschiedenen HIV-Stämmen gleichzeitig im Poxvirusgenom verpackt sind.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 26–36, dadurch gekennzeichnet, dass er intracutan, subcutan, intramuskulär, transdermal, intravenös, intraperitoneal, oder auf Schleimhäute appliziert wird.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass er nur einmal appliziert wird.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass er mehr als einmal appliziert wird.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 38–39, dadurch gekennzeichnet, dass er in Zusammenhang hinsichtlich zeitlicher Reihenfolge oder Lokalisation mit der Applikation eines weiteren Immunogens aus der Gruppe „Protein-, Peptid-, Lipopetid-, DNA-Plasmid-Impfstoff, Viraler und Bakterieller rekombinanter Vektor-Impfstoff, Pseudovirion" oder einem anderen zukünftig noch zu entwickelnden Impfstoffprinzip kombiniert verabreicht wird.
Ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor nach einem der Ansprüche 38–40, dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehr verschiedene rekombinante Poxviren, die Vektoren enthalten, welche zumindest teilweise auf genetischer Basis von unterschiedlichen HIV-Stämmen hergestellt wurden, verabreicht werden.