WO2004037846A1 - Immunisierung gegen bestandteile des humanen immunschwächevirus (hiv) - Google Patents

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Definitions

  • HIV human immunodeficiency virus
  • the invention relates to the generation of an immune response to components of the human immunodeficiency virus (HIV) by lentivira- le, replication-incompetent vectors that contain a transgene, one or several re HIV genes, as well as a particularly suitable method for the application of the vector constructs'.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • the human immunodeficiency virus is a virus from the family of retroviruses, subfamily lentiviruses. After several years of clinical latency, infection with HIV leads to the development of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and death from opportunistic infections, tumors, encephalopathy or wasting disease (Fauci and Lane (1998), "Human immunodeficiency” virus (HIV) disease: AIDS and related disorders "in: Harrison's Principles of Infernal Medicine, 14th ed., pp. 1791-1855).
  • immunization of a human or animal protects them against infection with the same or a similar, related pathogen. This means that the infection following vaccination either does not lead to symptoms of the disease or that the disease is much milder. It is also known that an immune response against a viral infectious agent can be generated by various methods. These include live, dead protein, peptide vaccines, virus-like particles, DNA vaccines, viral and bacterial vector vaccines and combinations of these methods (Keusch and Bart (1998), "Immunization principles and vaccine use” in: Harrison's Principles of Infernal Medicine, 14th ed., P.
  • Live virus vaccines are weakened (attenuated) viruses or related, apathogenic pathogens that induce an immune response in the vaccinated that is also effective against the pathogenic virus.
  • the decisive advantage of live vaccines is that they multiply in the vaccinated and thereby increase the amount of antigen with which the vaccinated comes into contact.
  • Live vaccines reach the target cells in the organism that are most relevant for generating an immune response. This typically induces multiple arms of the immune response, such as antibodies and cytotoxic T lymphocytes (CTL), local and systemic immune protection at the same time.
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • Live vaccines usually only have to be applied once to produce long-lasting immunity (Keusch and Bart (1998), “Immunization principles and vaccine use” in: Harrison's Principles of Infernal Medicine, 14th ed., P. 758 ff., MacGraw- Hill-Verlag) Genetically modified live viruses that cause an immune response against the disease caused by immunodeficiency viruses are known from the animal model (Daniel et al. (1992), "Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene” Science 258: 1938-1941).
  • HIV vaccines based on replicable, weakened HI viruses are considered too risky for use in humans because, as has been found in animal experiments, they persist in the organism, multiply and, under certain conditions, can themselves cause the fatal immune deficiency disease AIDS ( Baba et al. (1999), "Live attenuated, multiply deleted simian immunodeficiency virus causes AIDS in infant and adult macaques" Nat. Med. 5 (2): 194-203).
  • Vaccines are chemically inactivated viruses. It is known to vaccinate already infected people with inactivated HI viruses to strengthen the HIV-specific immune response (Kahn et al. (2000), "Evaluation of HIV-1 immunogen, an immunologic modifier, administered to patients infected with HIV having 300 to 549 x 10 (6) / L CD4 cell counts: A randomized controlled trial "Jama 284 (17): 2193-202).
  • the process for producing the HIV dead vaccines leads to the fact that the outer part of the envelope glycoproteins (gp120) is lost. Therefore, vaccine constructs produced in this way cannot induce neutralizing antibodies, which are an essential component of the antiviral immune response.
  • Protein vaccines are synthetically produced copies of individual viral proteins or purified virus components. They primarily induce an antibody response. Experimental and clinical studies show that HIV glycoproteins are able to induce neutralizing antibodies, ie antibodies that can block a viral infection (Belshe et al. (1993), "Safety and immunogenicity of a fully glycosylated recombinant gp160 human im- munodeficiency virus type 1 vaccine in subjects at low risk of infection "J Infect Dis 168 (6): 1387-95; Gorse et al.
  • proteins whose amino acid sequence corresponds to that of wild-type viruses are used for the immunization (Mascola et al.
  • Peptide vaccines contain individual peptides or chains of several sequences of 10-25 amino acids in length, which represent protein segments that are recognized particularly frequently or efficiently by the immune system (immunogenic epitopes).
  • the peptides are chemically attached to other molecules, e.g. B. in the form of lipopeptides, coupled or applied with the addition of suitable adjuvants (Gorse et al. (1996), "A dose-ranging study of a prototype synthetic HIV-1 MN V3 branched peptide vaccine" J Infect Dis 173 (2): 330-9 .; Kelleher et al.
  • VLP Virus-like particles
  • pseudovirions are particles similar to the virus in their outer structure. They are genetically engineered by expressing viral structural genes, especially the HIV gag genes, in cells.
  • pseudovirions can also contain other HIV proteins, in particular Pol and Env proteins (Paliard et al. (2000), "Priming of strong, broad, and long-lived HIV type 1 p55gag-specific CD8 + cytotoxic T cells after administration of a virus-like particle vaccine in rhesus macaques "AIDS Res Hum Retroviruses 16 (3): 273-82 .; Montefiori et al.
  • DNA vaccine Induction of an HIV-specific immune response by application of DNA (DNA vaccine).
  • DNA vaccine The principle of immunization with DNA plasmids is based on the observation that the application of DNA can induce an immune response against a protein encoded on the plasmid (Wolff et al. (1990), "Direct gene transfer into mouse muscle in vivo” Science 247 (4949 Pt 1): 1465-8).
  • DNA vaccines can produce a protective immune response (Ulmer et al. (1993), "Heterologous protection a gainst influenza by injection of DNA encoding a viral protein” Science 259 (5102): 1745-9).
  • plasmids with a modified, synonymous virus gene sequence (Demi et al. (2001), "Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human.”
  • immunodeficiency virus type 1 Gag protein "J Virol 75 (22): 10991-1001; Shiver et al. (2002)”
  • Replication-incompetent adenoviral vaccine vector elicits effective anti-immunodeficiency-virus immunity "Nature 415 (6869): 331-5) used.
  • methods are known for which the DNA together with immunogenic adjuvants such as CpGs (Demi et al.
  • HIV-1 major histocompatibility complex class I - restricted human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag-specific epitopes after DNA immunization with vectors coding for vesicular stomatitis virus glycoprotein-pseudotyped HIV-1 Gag particles
  • viral vectors Presentation of HIV antigens by carrier viruses (viral vectors). It is known that viral proteins can be introduced into an organism via viral vectors for immunization. Viral vectors are derivatives of non-pathogenic viruses that are genetically modified so that they can carry genes from foreign organisms. In the case of an immunization against HIV, it is the task of the carrier virus to introduce HIV genes into the organism. These genes are read (transcribed) in virus-infected cells and used to produce HIV proteins, which are then presented to the immune system. Viral vectors can be reproductive or unable to reproduce. After infection by vectors that are unable to reproduce, only complete genes of the virus vector, including the introduced foreign genes, are activated and expressed, rather than complete virus particles.
  • vaccinia virus and avian pox virus constructs which contain one or more HIV genes, as well as recombinant viruses based on adenovirus, rhabdoviruses, herpes simplex virus, poliovirus, adenoassociated virus and Alphaviruses such as Semliki Forest, Sindbis and Venezuelan equine encephalitis virus are constructed (Robinson (2002), "New hope for an AIDS vaccine” Nat Rev Immunol 2 (4): 239-50).
  • Vaccine and canarypox virus constructs that carry HIV genes and vaccination methods based on a type 5 adenovirus are currently being tested in humans (Zagury et al.
  • HIV antigens by carrier bacteria (bacterial vectors). It is known to use attenuated or non-pathogenic bacteria, for example Salmonella typhi (vaccine strain CVD 908) and Streptococcus gordonii, which have been genetically modified so that they carry HIV genes, for immunization via the mucous membranes (Di Fabio et al. ( 1998), "Vaginal immunization of Cynomolgus monkeys with Streptococcus gordonii expressing HIV-1 and HPV 16 antigens" Vaccine 16 (5): 485-92; Johnston et al. (2001), “Progress in HIV vaccine development” Curr Opin Pharmacol 1 (5): 504-10).
  • Salmonella typhi vaccine strain CVD 908
  • Streptococcus gordonii which have been genetically modified so that they carry HIV genes, for immunization via the mucous membranes
  • Lentiviral vectors are genetically derived constructs derived from the human immunodeficiency virus (HIV) and the monkey immunodeficiency virus (SIV) were developed.
  • the vectors usually carry part, but never the complete genome of the parent virus (Kim et al. (1998), "Minimal requirement for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1" J Virol 72 (1): 811-6).
  • the foreign gene usually comes from another organism or virus and is under the regulatory control of its own promoter. Infection (transduction) of cells by a lentiviral vector leads to expression of the transgene in the infected (transduced) cell.
  • Infection (transduction) of cells by a lentiviral vector leads to expression of the transgene in the infected (transduced) cell.
  • Replication-incompetent retroviral vectors are characterized in that the vectors are able to infect target cells once and to express a transgene, but that viral replication is suppressed.
  • genes from structural proteins for example the env gene
  • regulatory genes such as the tat gene in HIV
  • genes for critical virulence factors in HIV, for example, the vif gene
  • lentiviral vectors modified by such genetic engineering manipulations are limited in their replication ability and the ability for homologous recombination and are considered apathogenic with regard to the original pathogenicity of the original viruses (Ailles et al. (2002), "HIV-1-derived lentiviral vectors” Curr Top Microbiol Immunol 261: 31-52).
  • retroviral vectors are made in vitro. It is possible to transiently transfect target cells, so-called vector production cells, with two or more plasmids at the same time and then to remove the vectors from the cell culture supernatant. It is also possible to produce vector production cell lines which, constitutively or after induction, generate individual or all components for vector production (Zufferey (2002), “Production of lentiviral vectors” Curr Top Microbiol Immunol 261: 107-21).
  • Lentiviral vectors based on immunodeficiency viruses have hitherto been produced for basic virological research and for in vitro and in vivo use in experimental gene therapy.
  • Experimental gene therapy primarily aims at the replacement of defective genes in the human organism and tumor therapy (Amado and Chen (1999), "Lentiviral vectors-the promise of gene therapy within reach?" Science 285 (5428): 674-6; Holzer et al. (1999), "Poxviral / retroviral chimeric vectors allow cyto-plasmic production of transducing defective retroviral particles" Virology 253 (1): 107-14; Klimatcheva et al.
  • HIV vectors are used for the sensitivity and resistance testing of HIV against antiviral substances (Järmy et al. (2001), "Phenotypic analysis of the sensitivity of HIV to revese transcriptase, protease and integrase inhibitors using a self-inactivating virus vector system "J. Med. Virol. 64 (3): 223-231) (U.S. Patents 6,103,462; 6,242,187).
  • retroviral vectors With regard to an immune response to retroviral vectors, it is known that, similar to the use of vectors based on other, non-retroviral viruses, the immune response generated after the application of a retroviral vector construct can be directed against the vector structural proteins themselves. This effect is considered undesirable and obstructive with regard to the use of retroviral vectors for gene therapy (McCormack et al. (1997), “Anti-vector immunoglobulin induced by retroviral vectors" Hum Gene Ther 8 (10): 1263-73) ,
  • Pseudotyping means the formation of viral vectors which carry the envelope glycoproteins of another virus type. Lentiviral vectors can be combined with glycoproteins from various viruses. Dendritic cells are known to be infected in vitro by replication-incompetent HIV vectors pseudotyped with the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G). If dendritic cells are infected, they can generate a virus-specific T-lymphocyte immune reaction against HIV structures in cell culture (Granelli-Pipemo et al.
  • retroviral vectors based on murine leukemia viruses which contain one or more HIV genes as a transgene, as an immunostimulant for therapeutic immunization in HIV-infected persons.
  • Immune stimulation is achieved either by direct administration of the vectors into the organism or by injection of autologous cells which have previously been transduced in vitro with retroviral vectors which carry HIV genes (Warner et al. (1991), "Induction of HIV -specific CTL and antibody responses in mice using retroviral vector-transduced cells "AIDS Res Hum Ret- roviruses 7 (8): 645-55; Irwin et al.
  • Live vaccines based on immunodeficiency viruses are the most potent of the known immunogens, but they carry a high risk of pathogenicity and are therefore vaccines not suitable for HIV.
  • Protein and peptide vaccines as well as pseudovirions contain only parts of the virus. However, an immune response against HIV should be as broad as possible and should be directed against as many virus structure components as possible.
  • DNA vaccines do not present any protein structures, such immunogens cannot induce antibodies against conformation epitopes that arise from the tertiary and quaternary structure of proteins. In particular, they do not generate neutralizing antibodies to HIV.
  • known peptide vaccines cannot produce antibodies against epitopes that only arise from the conformation of natural proteins. Since vaccines such as dead vaccines, protein and peptide vaccines, pseudovirions and DNA do not multiply in the body of the vaccinated, the amount of antigen used corresponds to the maximum amount of antigen to which the immune system of an organism is exposed. Therefore, non-replicating vaccines are safe in principle, but far less immunogenic than vaccines that initially multiply in the vaccinated.
  • Vaccines based on bacterial vectors have the disadvantage that they are administered locally only to cause mucosal immunity, but not to cause a systemic immune response.
  • VSV-G pseudotyped vectors With regard to the generation of an immune response by "targeting" dendritic cells, it must be checked whether it is possible to use VSV-G pseudotyped vectors in vivo, because VSV-G pseudotyped lentiviral vectors are inactivated by human serum (DePolo et al. ( 2000), "VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human sem-" Mol Ther 2 (3): 218-22).
  • the dendritic cells have their prominent role in the HIV pathogenesis in that they have a special receptor (DC-SIGN) for the HIV glycoprotein gp120, which enables HIV viruses to be transported to the lymphatic organs.
  • DC-SIGN special receptor for the HIV glycoprotein gp120
  • Lentiviral vectors without HIV glycoprotein or an equivalent molecule from related immunodeficiency viruses do not experience the natural pathway in the Organism: This is a disadvantage in terms of generating an immune response via a route similar to the natural infection.
  • retroviral vectors based on oncoretroviruses such as the murine leukemia virus is disadvantageous since it generates an immune response against antigens of the oncoretroviruses and one repeated application of the vectors is therefore not useful.
  • Such vectors also fail to reach the natural target cells of HIV infection.
  • the invention is therefore based on the problem of generating an immune response against the human immunodeficiency virus (HIV), the immunogen being structurally derived from HIV and infectious but not capable of reproduction, suitable for the expression of one or more HIV proteins and for generating an immune response directed against virus components should be suitable in vivo.
  • the invention is further based on the technical problem of providing a lentiviral vector which contains one or more HIV genes as a transgene and is suitable for generating an immune response against components of the human immunodeficiency virus (HIV).
  • the invention is based on the problem of providing a carrier system based on recombinant poxviruses with which the lentiviral vector can be applied particularly efficiently.
  • the basic concept of the invention is the use of replication-incompetent lentiviral vectors for immunization, that is to say for the generation of an immune response, against components of HIV.
  • the replication-incompetent lentiviral vectors are infectious particles that contain all the virus components necessary for the infection of a cell.
  • the genetic information of the vectors comes from a lentivirus, preferably from HIV-1, HIV-2 or SIV.
  • the genome of the replication-incompetent viral vectors is incomplete. Therefore, replication-incompetent lentiviral vectors according to the invention can infect target cells, in contrast to the original viruses However, infectious virus particles do not reappear in infected cells.
  • the vectors contain a transgene under the transcriptional control of a eukaryotic promoter.
  • the transgene of a vector for a method according to the invention is a gene or a combination of protein genes from the group consisting of the HIV genes “gag, pol, env, nef, vif, vpr, vpu, vpx, tat, rev”
  • Vectors contain glycoproteins from HIV-1, HIV-2 or SIV in their envelope.
  • vectors are administered once or several times in a defined concentration and amount without or with the addition of an adjuvant.
  • the immunization with the vectors is combined with immunizations by other methods, in particular with recombinant vectors based on adenovirus or pox viruses or with DNA plasmids, proteins, peptides, lipopeptides or bacterial vectors containing genes of the HI virus ,
  • the genome of the lentiviral vectors according to the invention is packaged in viruses from the poxvirus family.
  • the transgene and the cis-active elements as well as the genetic structures required for transcomplementation are integrated into the genome of a pox virus.
  • Cis-active elements are those gene structures of the retrovirus which are essential for the transcription, packaging and integration of a retroviral genome. In trans those elements are made available which are necessary for the production of a mature vector particle, in particular further regulatory proteins as well as the structural proteins gag, pol and env.
  • special promoters for the transcription of the Vector genes introduced in the cytoplasm In order for the lentiviral vector genes and the transgene with its cis-active elements to be transcribed, special promoters for the transcription of the Vector genes introduced in the cytoplasm.
  • the transgene itself is under the transcriptional control of a eukaryotic promoter that is active in the cell nucleus.
  • the recombinant poxvirus constructs containing the lentiviral vectors are administered by administering a certain amount intracutaneously, subcutaneously, transcutaneously, intramuscularly, intaperitoneally, intravenously or on mucous membranes.
  • the administration can take place once or several times, alone or in combination with other HIV vaccines, as a single active ingredient or together with immunostimulatory substances.
  • Lentiviral vectors for a method according to the invention are produced in cell culture by transfection of cells by means of suitable plasmids. Vectors are formed in the transfected cells and are obtained from the cell culture supernatant.
  • a vector plasmid suitable for a method according to the invention contains, in addition to the genes and antibiotic resistance genes necessary for replication and gene expression in bacteria, a cassette which contains the cis-active regions of the lentiviral genome and a transgene.
  • the cis-active regions include, in particular, but not exclusively, parts of the long terminal repeat (LTR) regions, the primer binding site and the packaging signal.
  • the transgene is under the transcriptional control of a eukaryotic, nuclear active promoter.
  • the gene cassette is under the control of its own promoter, such as the CMV promoter. Additional genes are optionally located within the gene cassette of the lentivirus.
  • gag, pol and rev and the rev-responsive element are located on the plasmid together with the cassette.
  • the plasmid contain the entire genome of a lentivirus.
  • the lentiviral genes which are necessary as trans-active genes for the production of a virus vector, are located on a second and possibly a third or on further plasmids. These include the genes env, gag, pol, rev and optionally the genes vif, vpr, vpu, nef, tat.
  • the HIV genes are under the transcriptional control of a eukaryotic promoter.
  • the packaging sequence Psi and all other cis-active regions are always on the plasmid with the transgene.
  • the vector plasmid for the preparation of the vector plasmid, starting from a proviral HIV construct, several gene segments necessary for HIV replication are deleted, in particular the glycoprotein gene and a segment in the 3'U3 region which contains the viral TATA box.
  • the genetic information for a transgene under the control of a heterologous, eukaryotic promoter is integrated into this construct.
  • further genes are deleted in this plasmid, including the genes vif, vpu, vpr, tat and nef.
  • the HIV promoter is replaced by the CMV promoter.
  • the plasmid contains the HIV genes gag, pol and rev as well as the RRE in addition to the transgene cassette.
  • the corresponding gene sequences of HIV-2 or SIV are used instead of the HIV-1 gag, pol, env and rev genes.
  • synonymous, codon-optimized gene sequences are used, that is genes which have other, synonymous codons for coding the same peptide sequence.
  • the genetic information of the glycoprotein gene is obtained from a virus laboratory strain by restriction digestion or similar methods and inserted into an expression plasmid. It is also possible, after reverse transcription of the virus RNA, to amplify the viral nucleic acid, in particular by means of the polymerase chain reaction, to obtain the glycoprotein gene from a laboratory strain or from test material and to insert it into an expression plasmid. It is equally possible to produce the env gene synthetically.
  • the transgene for a method according to the invention is an HIV gene region or a combination of several gene segments from the group "gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, nef".
  • the genetic structures, in particular the glycoprotein genes originate from viruses the group "HIV-1, HIV-2, SIV" or are analogous to these.
  • the transgene optionally contains synthetically modified genome sequences. So it is advantageous to use synonymous gene sequences.
  • the synonymous sequence has the advantage that it improves the expression of the gene and reduces the risk of homologous recombination and the formation of pathogenic viruses.
  • the transgene contains sequences from HIV-1, HIV-2 or SIV.
  • genes whose expression products contribute to increased immunization such as. B. cytokines, chemokines, antibodies, hormones, tetanus, diphtheria or another toxoid. These genes are under the transcriptional control of their own promoter or are linked to the HIV transgene via an internal ribosome entry point.
  • the plasmids are propagated in bacteria, preferably in E. coli, and then purified.
  • the plasmids are used to transfect eukaryotic cells, preferably cells without HIV receptors, such as the human embryonic kidney fibroblast cell line HEK 293T, using standard methods known to those skilled in the art.
  • the transfection of the plasmids in HEK 293T cells there leads to the formation of vector particles whose genome contains the regions which are encoded on the plasmid which contains the cis-active regions and the transgene.
  • the vectors are obtained from the cell culture medium, optionally additionally determined by centrifugation or filtration and the concentration of infectious vectors.
  • the vectors can be stored frozen.
  • the shape and structure of the vector particles resemble natural, infectious lentiviruses. If eukaryotic cells are infected with the lentiviral vectors, the transgene is expressed. The introduction of the foreign nucleic acid into the cells is called transduction. Infectious particles are not formed.
  • a lentiviral vector for a method according to the invention can be obtained, for example, by a) inserting a viral genome into an initial construct, in particular a plasmid or cosmid is, b) in the construct from stage a) containing target virus genome at least env and a sequence necessary for the gene expression of the virus, in particular in the 3'U3 range, modified or deleted therefrom, c) the product from stage b) the genetic information - tion for expression of the marker substance is inserted, d) the vector construct from step c) together with a vector construct containing the genetic information for an HIV or SIV env gene is introduced into a vector production system and expressed therein, e) optionally an in stage b) deleted protein is introduced into trans via a construct, in particular a plasmid, or a packaging cell line in stage d) and f) the viral vector generated in stage d) or e) after its production by means of the vector production system, if necessary after Zeil cultivation, is isolated.
  • the vector production system can be a packaging cell line.
  • a packaging cell line already constitutively produces one or more virus components necessary for the formation of the virus particles, in particular the env gene. Isolation can consist of removing cell culture supernatant.
  • Lentiviral vectors according to the invention can also be generated in that the genes of the vector are stably integrated into a cell line. For this purpose, eukaryotic cells are transfected with plasmids “stably” by methods known to the person skilled in the art, vector-expressing cells are identified and selected. Lentiviral vectors are isolated from the cell culture supernatant of the production cell line.
  • the invention particularly relates to the production of recombinant poxviruses containing the genome for the formation of lentiviral vectors for immunization.
  • the genetically table structures which are necessary for the formation of infectious, replication-incompetent lentiviral vectors according to the invention, integrated into the genome of a virus from the family of poxviruses.
  • cis-active regions are inserted together with the transgene and the other gene structures necessary for vector formation at one, two or more gene locations of the pox virus.
  • Cis-active areas together with the transgene and all other genes are under the transcriptional control of cytoplasmic active promoters.
  • Pox virus promoters are advantageous for this, in particular early promoters such as the p7.5 promoter.
  • early promoters such as the p7.5 promoter.
  • all cryptic transcription stop sequences are removed in the lentiviral vector genes to be integrated.
  • sections with the nucleotide sequence TTTTTNT are eliminated. Stop signals are introduced below the gene sequences to be transcribed.
  • the sequence TTTTTNT is inserted behind the sequence to be transcribed. It is also possible for a method according to the invention to use other poxvirus promoters including later or early / later promoters.
  • poxvirus used is a vaccinia virus
  • Recombined poxviruses are selected by methods known to those skilled in the art, grown in eukaryotic cells and optionally concentrated by centrifugation.
  • a plurality of expression cassettes for individual HIV proteins are simultaneously inserted into the poxvirus gene nom inserted, where the gene sequences of the underlying lentiviruses correspond to different HIV strains or different viruses from the group “HIV-1, HIV-2, SIV” and either match natural genes or have modified, optionally synthetic, synonymous nucleotide sequences.
  • orthopoxviruses in particular the vaccinia virus, and poxviruses which are restricted in their replication in the human organism, such as the modified Ankara (MVA) vaccinia virus and avipoxviruses.
  • VAA modified Ankara
  • infectious, replication-incompetent lentiviral vectors are applied in a defined concentration and amount without or together with adjuvant to the mucous membrane, intracutaneously, subcutaneously, transdermally, intranasally, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously or in another way once or more than once.
  • the immunization with the lentiviral vectors is combined with immunizations by another method, in particular together with recombinant vectors based on adenovirus or poxviruses or with suitable DNA plasmids, protein, peptide, lipopeptide vaccines or bacterial Vectors containing genes of the HI virus.
  • All substances that contribute to immune stimulation and modulation without being an HIV antigen are suitable as adjuvants.
  • these can be Freund's adjuvant, CpG-ODN, derivatives of saponin and other detergents, cytokines, chemokines, toxoids such as tetanus, diphtheria and cholera toxin, antibodies and hormones.
  • the recombinant poxvirus constructs containing the lentiviral vectors are administered by applying a certain concentration and amount without or together with adjuvant to the mucous membrane, intracutaneously, subcutaneously, transdermally, intranasally, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously or in another way.
  • the administration can take place once or several times, alone or in combination with other HIV vaccines, as a single active substance or together with immunostimulatory substances.
  • a lentiviral vector according to the invention for a method according to the invention is derived from the genome of a single HIV-1 strain. Sequences from several different HIV-1 sequences can be used as a starting basis for the construction of lentiviral vectors and methods according to the invention. Chimeric lentiviruses containing elements from HIV and SIV can be produced. In particular, it is provided that, instead of or in addition to sequences from HIV-1, sequences from HIV-2 or the monkey immunodeficiency virus SIV are also contained in the vector, preferably if a functional lentiviral vector is thereby formed.
  • the virus sequences can originate from laboratory strains as well as from virus primary isolates. It is possible to modify, shorten, or replace genes that code for HIV proteins or to replace them with synthetic, synonymous gene sequences.
  • HIV-1 glycoprotein genes are advantageous in the method according to the invention and suitable vaccination constructs.
  • glycoprotein genes of the HIV-1-related viruses HIV-2 and SIV in addition to or instead of the HIV-1 genes.
  • To make the vector biologically safe it is useful to remove certain regulatory gene segments.
  • the risk of homologous recombination can be reduced by replacing natural gene sequences with synonymous codon-modified genes ,
  • lentiviral vectors for the method according to the invention and the recombinant poxviruses derived therefrom contain several HIV genes as transgenes.
  • further or different HIV genome sections from the group “gag, pol, env, rev, tat, vif, vpr, vpu, nef” are preferably packaged as transgenes in the poxviruses, if appropriate.
  • synthetic gene sequences with modified codon sequences which code for the same proteins.
  • immunoregulatory proteins such as cytokines, chemokines, antibodies, hormones, tetanus, diphtheria, cholera or another toxoid in addition to the transgene within the genome of the lentiviral vector.
  • the vectors according to the invention are to be administered once. However, repeated application is advantageous, since it enables an increase in the immune response, in particular against the glycoproteins, to be achieved. It is also planned to administer the vectors in combination with other HIV vaccines. chen. It is also envisaged to combine different vectors according to the invention, which have been genetically derived from different immunodeficiency viruses, and to administer them either together or in succession. It is also contemplated to combine vectors in use with other known and newly developed adjuvants.
  • viruses from the poxvirus family are particularly useful for multiplying and administering the lentiviral vector according to the invention.
  • viruses from the poxvirus family include, in particular, vaccinia viruses from the subfamily of orthopox viruses and avipox viruses, including fowlpox and canarypox viruses and other poxviruses whose replication ability in the human organism is restricted, such as the vaccinia virus strain Modified vaccine virus type Ankara, MVA.
  • MVA Modified vaccine virus type Ankara
  • lentiviral genes are integrated at one or more locations in the poxvirus genome, so that the vector particles formed in poxvirus-infected cells produce protein components from various lentiviruses from the group “HIV-1, HIV- 2, SIV ".
  • Two or More glycoprotein genes can either be integrated at a single gene locus, in particular in the area of the tk gene, or at two or more different gene loci. This creates recombinant lentiviral vectors in infected cells that carry the glycoproteins of different strains of HIV.
  • cassettes for other HIV structural and regulatory genes and two or more cassettes containing the cis-active elements and different transgenes into the pox virus genome. It is preferred according to the invention that a large number of possible combinations of the number and arrangement of components for the production of lentiviral vectors containing HIV transgenes and glycoprotein genes are generated from immunodeficiency viruses.
  • the insertion of additional genetically different HIV genes has the advantage that proteins from several different HIV virus strains are presented to the immune system at the same time and a broad, cross-reactive immune response can be achieved. It is particularly preferred that gene components of HIV-2 and SIV are also integrated at the same time.
  • genes for immunoregulatory proteins such as cytokines, chemokines, antibodies, hormones, tetanus, diphtheria, cholera or other toxoid may be introduced into the poxvirus genome outside or within the expression cassettes for the genes of the lentiviral vectors to thereby introduce vaccination to achieve immunomodulation.
  • Pox virus constructs are preferably administered once, but also several times in succession, with a preferred method It is initially irrelevant whether the administration takes place at intervals of days or weeks or only after several years. It is also envisaged to administer several pox virus constructs, each of which has the genomes of lentiviral vectors based on genetically different HIV strains, at the same time or in succession. It is also preferred to use recombinant poxvirus constructs in a specific chronological order or location together with other vaccines against HIV based on substances from the group “protein, peptide, lipopeptide, DNA vaccine, pseudovirion, bacterial and viral vector” or others, Pox virus constructs are preferably also administered together with immunoregulatory substances in a specific chronological order or location. It is also preferred to administer two or more pox virus constructs, each containing at least partially different lentiviral genome sequences, together or in succession, to induce a broad immunizing effect against a variety of antigenic HIV variants.
  • the lentiviral vectors containing HIV transgenes packed in poxviruses are preferably applied for a method of generating an immune response in various ways. It is thus possible to administer the pox virus constructs intracutaneously, subcutaneously, transdermally, intramuscularly, intravenously, intraperitoneally or on the mucous membranes of the respiratory tract, the digestive organs including the intestine or the genital organs.
  • Retroviral vectors are considered to be only weakly immunogenic (McCormack et al. (1997), "Anti-vector immunoglobulin induced by retroviral vectors" Hum Gene Ther 8 (10): 1263-73). It is therefore surprising seeing that in the mouse model by replication-incompetent lentiviral vectors containing Syngag a remarkable humoral and cellular immune response against the HIV-Gag protein, the extent of which corresponds to or exceeds that of other immunization methods and at the same time a neutralizing antibody response against the glycoprotein can be achieved.
  • the invention shows a way in which several elementary difficulties in generating an HIV-specific immune response can be solved simultaneously. These include the possibility of vaccination through a vaccine that, like a live vaccine, infects the cells that are natural target cells of HIV infection, but at the same time has high biological safety.
  • the natural expression of the HIV glycoproteins on the virus surface enables the induction of a neutralizing antibody response.
  • the expression and intracellular processing of virus proteins in infected cells result in cytotoxic T lymphocytes, which are of crucial importance in the defense against HIV , activated.
  • the integration of the transgene enables the transgene to be passed on during cell division and thus an increase in the antigen in vivo.
  • Suitable promoters means that the expression of HIV protein from transduced cells can persist for a longer period of time or can lead to renewed contact with the antigen "from the inside" after a latency period. This enables a longer-lasting HIV-specific immune activation in the once immunized organism.
  • Infection via the CD4 molecule also enables infection of those cells which, because they live for many years, are considered to be a reservoir of HIV infection (Finzi et al. (1997), "Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy "Science 278 (5341): 1295-300). This may result in long-lasting immune activation.
  • the vector particles for a method according to the invention contain HIV or SIV glycoproteins in their natural configuration. This favors the formation of neutralizing antibodies.
  • a particular advantage of using lentiviral vectors according to the invention compared to vectors based on oncoretroviruses is that an immune response against non-immunodeficiency viruses that would block a booster vaccination is thereby is not generated.
  • multiple administration of the lentiviral vectors according to the invention makes sense, since it increases the immune response against the virus glycoproteins.
  • poxvirus constructs are physically and chemically much more stable than the immunodeficiency viruses and lentiviral vectors. They can therefore be concentrated to higher titers and withstand freezing and thawing processes much better. They are therefore less sensitive to interruptions in the cold chain, a critical point when using vaccines, especially in hot and poorer countries.
  • the administration of recombinant poxviruses initially leads to an extensive multiplication of the poxvirus constructs in the body over several days. Since the lentiviral genome is stably packaged in the smallpox virus, there is at the same time a massive production of vector particles, which in turn infect and transduce CD4 + cells, the transgene being expressed. As a result, the administration of recombinant poxvirus constructs drastically increases the vector number and potentiates the amount of antigen in vivo. With this method, the immune system is presented with HIV antigen in three ways with just one immunization: 1. First, the recombinant poxviruses present lentiviral glycoproteins, so that the poxvirus particles themselves already produce a neutralizing antibody response. 2. It HIV vector particles are produced in infected cells for the extended activation of an immune response against vector structural components. 3. The transgene is expressed and processed in infected cells, thus enabling in particular the activation of cytotoxic T lymphocytes.
  • the method is suitable for generating a powerful, broad-based, cancer-reactive immune response with a single vaccine and a single administration dose. It is therefore particularly suitable to reduce the number of immunizations required and the amount of vaccine required.
  • a method for generating an immune response against proteins of the human immunodeficiency virus is preferred, characterized in that a lentiviral, replication-incompetent virus vector is applied which contains one or more HIV genes as transgenes, the transgene optionally having components of two or contains more different strains of HIV.
  • the virus vector preferably contains glycoproteins of a lentivirus from the group “HIV-1, HIV-2, SIV”.
  • the virus vector preferably contains further genes for the expression of immunoregulatory substances.
  • a pox virus containing the genome components of a replication-incompetent lentiviral virus vector which contains one or more HIV genes as a transgene is preferably administered, the transgene optionally containing components from two or more different HIV strains.
  • the pox virus genome preferably contains additional borrowed one or more additional copies of genes from the group "gag, pol, env, tat, rev, vif, vpu, vpr, nef" from genetically different virus strains of the group "HIV-1" for all genes necessary for the generation of a lentiviral vector "HIV-2, SIV" contains under transcriptional control of a promoter active in the cytoplasm.
  • An orthopox virus particularly preferably a vaccinia virus, containing genome components of replication-incompetent lentiviral virus vectors is preferably applied.
  • a poxvirus containing replication-incompetent in human cells and containing genome components of replication-incompetent lentiviral virus vectors is more preferably applied.
  • An avipox virus containing genome components of replication-incompetent lentiviral virus vectors is more preferably applied.
  • gene sequences for immunoregulatory proteins are preferably contained in the lentiviral vector.
  • gene sequences for immunoregulatory proteins are also preferably contained in the Poxvirus vector.
  • immunoregulatory substances are preferably applied.
  • the recombinant pox virus vector is preferably administered to an individual several times.
  • the recombinant Pox vector is preferred in connection with the chronological order or location with the application of a further immunogen from the group "protein, peptide, lipopeptide, DNA plasmid vaccine, viral and bacterial recombinant vector vaccine, pseudovirion" or another vaccine principle to be developed in the future. It is further preferred to administer two or more different recombinant poxviruses which contain vectors which have been produced on a genetic basis from different HIV strains.
  • a lentiviral, replication-incompetent virus vector is also preferred, which is characterized in that the vector is derived from a virus from the group "HIV-1, HIV-2, SIV". It preferably contains one or more HIV genes as transgenes, wherein the transgene optionally contains components from two or more different HIV strains. It particularly preferably contains glycoproteins from a lentivirus from the group “HIV-1, HIV-2, SIV”.
  • the lentiviral, replication-incompetent virus vector preferably elicits an immune response against HIV structural components.
  • the lentiviral, replication-incompetent virus vector is preferably characterized in that the transgene has a codon-optimized nucleic acid sequence.
  • the lentiviral, replication-incompetent virus vector is preferably characterized in that it is a self-inactivating vector. It is also preferably characterized in that it contains further genes for immunostimulation, including, but not limited to, cytokines, hormones, antibodies, bacterial toxin under the transcriptional control of a eukaryotic promoter.
  • the lentiviral, replication-incompetent virus vector is preferably characterized in that the genome components of the vector are packaged in a pox virus.
  • a pox virus is also preferred, in which genome components of two or more replication-incompetent lentiviral virus vectors are contained, the genome components of the lentiviral vectors being derived from two or more different HIV strains. Genome components of a replication-incompetent lentiviral are preferred in the poxvirus genome Virus vector and additionally genes from one, two or more different HIV strains.
  • Components of the vector are preferably packaged in an orthopox virus, in particular in a vaccinia virus.
  • Components of the vector are preferably packaged in a pox virus which is replication-incompetent in human cells.
  • Components of the vector are preferably packaged in an avipox virus.
  • Cis-active regions are preferably integrated together with the transgene and the trans-active structural genes at the same location of the poxvirus genome.
  • Cis-active regions are also preferably integrated together with the transgene and the trans-active structural genes at separate locations of the pox virus genome.
  • Components of several vector genomes based on different HIV strains are preferably packaged simultaneously in the poxvirus genome.
  • Two or more glycoprotein genes from genetically different strains of HIV are preferably packaged simultaneously in the poxvirus genome.
  • the virus vector is preferably applied intracutaneously, subcutaneously, intramuscularly, transdermally, intravenously, intraperitoneally, or on mucous membranes.
  • the virus vector is preferably applied only once.
  • the virus vector is also preferably applied more than once.
  • the virus vector is preferred with the application of a further immunogen from the group "protein, peptide, lipopeptide, DNA plasmid vaccine, viral and bacterial recombinant vector vaccine, pseudovirion" or another in the future
  • the vaccine principle still to be developed is administered in combination, preferably two or more different recombinant poxviruses which contain vectors which have been produced at least in part on the genetic basis of different HIV strains.
  • the present invention relates to a replication-incompetent lentiviral virus vector which is suitable for generating an immune response against proteins of the human immunodeficiency virus (HIV).
  • the replication-incompetent lentiviral virus vector is derived from at least one strain, that is to say “strain”, from the group of viruses consisting of HIV-1, HIV-2 and SIV.
  • the replication-incompetent lentiviral virus vector contains in the genome, in particular as at least one transgene , a first lentivirus gene of a gene group which is derived from a first strain, ie "strain", the group of viruses consisting of HIV-1, HIV-2 and SIV, and a second or further lentivirus gene, in particular of the same gene group, which from a second or further strain, that is to say “strain”, the group of viruses consisting of HIV-1, HIV-2 and SIV, which is genetically different from the first strain, that is to say is in particular a different strain
  • the lentivirus gene in particular the at least one transgene, codes for a glycoprotein.
  • the lentivirus gene, in particular the at least one transgene is a gene from the group of genes consisting of gag, pol and nef.
  • the lentiviral vector is a self-inactivating vector.
  • the transgene is under the transcriptional control of a eukaryotic nuclear active promoter.
  • the promoter is the SFFV promoter.
  • the genome in particular the transgene, contains at least one further gene for the expression of at least one immunoregulatory substance.
  • the at least one further gene encodes a cytokine, hormone, antibody or bacterial toxin under the transcriptional control of a eukaryotic nuclear active promoter.
  • Another object of the present invention is a virus vector, in particular derived from a lentivirus strain from the group of viruses consisting of HIV-1, HIV-2 and SIV, which in the genome has at least one copy of a codon-optimized nucleic acid sequence, in particular shown in SEQ ID NO. 1, namely the syngag sequence.
  • Another object of the present invention is a recombinant pox virus vector which is particularly suitable for generating an immune response against proteins of the human immunodeficiency virus (HIV), preferably for immunization and / or immunotherapy.
  • the recombinant poxvirus vector according to the invention is derived from a poxvirus.
  • the recombinant poxvirus vector according to the invention contains in the genome (a) first genome components of a lentiviral virus vector for the expression of lentiviral virus vectors, comprising (i) at least one first lentiviral expression cassette, (ii) at least one first env gene and (iii) at least one first gag gene, in particular in connection with a pol gene, preferably gag and pol genes, the first genome components each being derived from a first strain of the group of the viruses HIV-1, HIV-2 or SIV , and; (b) at least one further genome component, in particular genetically different from the first genome components, which is derived from a second strain of the group of the viruses HIV-1, HIV-2 or SIV and at least the first Genome components (i) to (iii) corresponds to or is contained therein, with the proviso that the second or further strain of the group of viruses HIV-1, HIV-2 or SIV from the first strain of the group of viruses HIV-1, HIV- 2 or SIV is genetically different.
  • the at least one further genome component is selected from the group consisting of (a) a second or further lentiviral expression cassette which is derived from the second strain of the viruses HIV-1, HIV-2 or SIV, (b) a transgene with a first lentivirus gene of a gene group derived from the first strain and a second or further genetically different lentivirus gene of the same gene group, thus preferably a corresponding gene encoding a glycoprotein, gag gene, pol gene or nef gene, which is derived from the second strain is derived, (c) a second or further env gene from the second strain, (d) a second or further gag gene from the second strain, in particular in connection with the first pol gene or a further pol gene from the second tribe.
  • a second or further lentiviral expression cassette which is derived from the second strain of the viruses HIV-1, HIV-2 or SIV
  • the transgene is located as the at least one further genome component in the first lentiviral expression cassette. In a further preferred embodiment The transgene is localized as the at least one further genome component in the second or further lentiviral expression cassette.
  • the pox virus vector thus contains genome components from at least one lentiviral virus vector which allow the expression of infectious particles such as lentiviral virus vectors, at least one genome component, in particular a gene, preferably a gag and env gene, or a gene encoding one or more glycoproteins, at least is contained twice, the first copy of the gene being derived from a first strain of the group of viruses HIV-1, HIV-2 or SIV and the second and / or further copy of a second or further strain of the group of viruses HIV-1 , HIV-2 or SIV is derived, the second or further strain being genetically different from the first strain.
  • infectious particles such as lentiviral virus vectors
  • at least one genome component in particular a gene, preferably a gag and env gene, or a gene encoding one or more glycoproteins
  • gag-pol genes from genetically different HIV strains are simultaneously packaged in the poxvirus genome.
  • A lentiviral expression cassette
  • This cassette is under the control of at least one cytoplasmic active promoter, for example a poxvirus pro- motors, especially an early pox virus promoter; and (B) genes for the structural proteins gag and env and at least one pol gene which encodes the enzymes necessary for replication, these genes preferably being under the control of cytoplasmic active promoters.
  • These genes are preferably in the form of gag-pol gene cassettes and env gene cassettes, in particular the gag-pol gene cassette and the env gene cassette each have their own cytoplasmic active promoter.
  • Gag-pol can be provided with a common promoter or separately as gag and pol genes with their own promoters.
  • the gag-pol reading frame, together with the lentiviral expression cassette (A), is particularly preferably between the 5'-LTR and 3'-LTR and preferably uses the same promoter (FIG. 6). However, it can also be integrated into the pox virus genome at another point (FIG. 7). Furthermore, the env gene, together with its cytoplasmic active promoter, lies outside the lentiviral expression cassette (A).
  • the packaged at least one lentiviral expression cassette (A) contains, preferably as at least one transgene, one or more lentiviral genes, in particular HIV genes. A transgene is particularly preferably part of at least one gag gene in which the codon use has preferably also been changed.
  • a transgene is derived from a gag-pol gene, a gag-pol-nef gene, an env gene and / or another combination of lentiviral genes, in particular HIV genes, against which an immune response is preferred should be generated.
  • all gene cassettes are built into the genome of the pox virus vector several times.
  • two or more lentiviral expression cassettes, two or more env genes, and / or two or more gag-pol- Gene cassettes installed.
  • the two or more transgenes, the two or more gag-pol genes and the two or more env genes each originating from different virus strains are infected in the Pox virus Cells formed a variety of different lentiviral, infectious reproductive vectors.
  • several gene cassettes for the env gene which is also particularly variable in nature, are installed.
  • the “swarm” of similar vectors thus provided according to the invention particularly advantageously contains very much more immunogenic epitopes than a vector formed from a single virus strain and thereby generates a broader immune response.
  • the pox virus vector contains genome components of at least two genetically different lentiviral virus vectors, each derived from a different genetically different virus strain of HIV-1, HIV-2 or SIV.
  • the first and / or second or further lentiviral expression cassette contains the gag and pol genes as a gag-pol reading frame.
  • the first env gene in particular together with a cytoplasmically active promoter, is present outside the first and / or second or further lentiviral expression cassette.
  • the genome components of the lentiviral virus vector contained in the genome of the pox virus vector are under the transcriptional control of a promoter active in the cytoplasm.
  • At least one cis-active region of a lentiviral virus vector together with at least one transgene of the lentiviral virus vector and at least one trans-active gag and / and or env gene integrated at separate locations in the genome of the pox virus.
  • the pox virus from which the pox virus vector is derived is selected from the group of pox viruses consisting of orthopox viruses, in particular vaccinia viruses, and avipox viruses.
  • the genome of the poxvirus vector contains at least one gene coding for an immunoregulatory protein.
  • the immunoregulatory gene is preferably present as a transgene and / or separately in the pox virus genome. As a transgene, it is preferably integrated either within a single lentiviral expression cassette together with the transgene which codes for one or more lentiviral genes, in particular HIV genes, the immunoregulatory gene having its own nuclear active promoter, or it is in the form of Transgene in a separate lentiviral expression cassette if at least one further lentiviral expression cassette containing one or more HIV genes are integrated in the poxvirus genome. If the immunoregulatory gene is not integrated as a transgene but is integrated separately in the poxvirus genome, it preferably receives its own cytoplasmic active promoter.
  • the pox virus vector it is characterized in that the genome component from the lentiviral virus vector contains at least one gene encoding at least one immunoregulatory protein.
  • Another object of the present invention is the use of the replication-incompetent lentiviral virus vector for immunotherapy and / or for immunization against the human immunodeficiency virus (HIV) and for the production of a drug kit for immunotherapy and / or for immunization against the human immunodeficiency virus (HIV).
  • HIV human immunodeficiency virus
  • immunotherapy is understood to be a therapeutic method in which a disease state is treated by an immunological method.
  • immunization is understood to mean a prophylactic and / or therapeutic method, in particular vaccination, in which an immune response is caused in the animal or human organism, in particular the body (in vivo), but also in tissue and cell cultures (in vitro) , so that later contact with the pathogen does not lead to illness.
  • the constructs provided according to the invention are preferably suitable for both.
  • Another object of the present invention is also the use of a pox virus vector containing at least in the genome At least two genetically different lentivirus genes, each from a different strain of HIV-1, HIV-2 or SIV, for immunotherapy and / or for immunization against the human immunodeficiency virus (HIV) as well as for the production of a drug kit for immunotherapy and / or for immunization against the human immunodeficiency virus (HIV).
  • a pox virus vector containing at least in the genome At least two genetically different lentivirus genes, each from a different strain of HIV-1, HIV-2 or SIV, for immunotherapy and / or for immunization against the human immunodeficiency virus (HIV) as well as for the production of a drug kit for immunotherapy and / or for immunization against the human immunodeficiency virus (HIV).
  • Another object of the present invention is also the use of a pox virus vector containing genetic structures in the genome for the formation of infectious replication-incompetent lentiviral virus vectors which in at least one transgene have at least one lentivirus gene from strains selected from the group of viruses consisting of HIV-1, HIV-2 or SIV, for immunotherapy and / or for immunization against the human immunodeficiency virus (HIV) as well as for the manufacture of a drug kit for immunotherapy and / or for immunization against the human immunodeficiency virus (HIV).
  • Another object of the present invention is the use of a pox virus vector for immunotherapy and / or for immunization against the human immunodeficiency virus (HIV) and for the production of a pharmaceutical kit for immunotherapy and / or for immunization against the human immunodeficiency virus (HIV).
  • a pox virus vector for immunotherapy and / or for immunization against the human immunodeficiency virus (HIV) and for the production of a pharmaceutical kit for immunotherapy and / or for immunization against the human immunodeficiency virus (HIV).
  • Another object of the present invention is also a kit for immunotherapy and / or for immunization containing at least one replication-incompetent lentiviral virus vector.
  • kits for immunotherapy and / or for immunization containing at least tens a pox virus vector.
  • the kit additionally contains immunoregulatory substances.
  • the kit contains at least one further immunogen selected from the group consisting of protein, peptide, lipopeptide, DNA plasmid vaccines, vaccines of viral and bacterial recombinant vectors and pseudovirions.
  • Another object of the present invention is also a method for inducing an immune response against proteins of the human immunodeficiency virus (HIV) in the animal or human organism, which comprises the steps of providing the replication-incompetent lentiviral virus vector (step a), the application, ie administration , in particular vaccinating, the replication-incompetent lentiviral virus vector in the animal or human organism, in particular the body (in vivo), but also in tissues and cell cultures (in vitro) (step b), and the induction, i.e. generation, of an immune response, in particular Immunization, against proteins of HIV in animal or human organism (step c) contains, in particular consists of.
  • step a the steps of providing the replication-incompetent lentiviral virus vector
  • step b the application, ie administration , in particular vaccinating, the replication-incompetent lentiviral virus vector in the animal or human organism, in particular the body (in vivo), but also in tissues and cell cultures (in vitr
  • Another object of the present invention is also a method for inducing an immune response against proteins of the human immunodeficiency virus (HIV) in the animal or human organism, which comprises the steps of providing the recombinant poxvirus vector (step a), the application, i.e. administration, in particular vaccination , the pox virus vector in the animal or human organism, in particular the body (in vivo), but also in tissue and cell cultures (in vitro) (step b) and the induction of an immune response, in particular immunization, against proteins of HIV in the animal or human organism (step c) contains, in particular consists of.
  • step a the application, i.e. administration, in particular vaccination , the pox virus vector in the animal or human organism, in particular the body (in vivo), but also in tissue and cell cultures (in vitro)
  • step c contains, in particular consists of.
  • the virus vector is applied once in the animal or human organism (step b). In a further preferred variant, the virus vector is repeatedly applied to the animal or human organism (step b), that is to say administered, in particular vaccinated.
  • At least one immunoregulatory substance is additionally administered, ie administered, in particular vaccinated, in step b).
  • At least one further immunogen is selected in step b) together with the virus vector at the same location, in particular at the same application location, in particular simultaneously or at a later time, and / or simultaneously and preferably at another application location the group consisting of protein vaccines, peptide vaccines, lidopeptide vaccines, DNA plasmid vaccines, vaccines, viral recombinant vector vaccines, bacterial recombinant vector vaccines and pseudovirions, applied, that is administered, in particular vaccinated.
  • the application in step b) is carried out on the mucosa, intracutaneously, subcutaneously, transdermally, intranasally, intramuscularly, intraperitoneally and / or intravenously, without or together with adjuvant.
  • at least two genetically different recombinant poxviruses according to one of claims 9 to 17 are provided in step a), the different poxviruses each containing genome components of at least two different lentiviral virus vectors, each derived from a different lentivirus strain from the group consisting of HIV-1, HIV-2 and SIV, and in step b) the at least two genetically different poxviruses applied.
  • the present invention also relates to the methods for producing the virus vectors, in particular the replication-incompetent lentiviral virus vector and the recombinant poxvirus vector.
  • the present invention also relates to antibodies, monoclonal and polyconal, directed against the replication-incompetent lentiviral virus vector and / or the recombinant poxvirus vector, in particular specifically binding to epitopes of the proteins or structures of the vectors and / or of the vectors and / or with them infected host cells formed proteins or structures.
  • Figure 1 Plasmid pGJ2syngag for the preparation of a vector for a method according to the invention
  • Figure 2 plasmid pSFsyngag as HIV gag expression plasmid for vaccination in combination with a vector construct according to the invention
  • FIG. 3 Cytotoxic T lymphocyte (CTL) response in Balb / c mice after vaccination with a combination vaccination
  • DNA vaccine pSFsyngag and lentiviral vector pGJ2syngag containing the Syngag protein were used to prepare a vaccine pSFsyngag and lentiviral vector pGJ2syngag containing the Syngag protein.
  • FIG. 4 HIV-Gag / p55-specific humoral immune response in Balb / c mice after vaccination with a combination vaccination from DNA vaccine pSFsyngag and lentiviral vector pGJ2syngag containing the Syngag protein.
  • Figure 5 Plasmid pEnv (Lig) for the production of a vector for a method according to the invention containing the glycoproteins of HIV-1.
  • Figure 6 Construction of a recombinant vaccine virus (Copenhagen strain) containing the gene sequences of a lentiviral, replication-incompetent vector based on pGJ2syngag and the HIV-1 glycoproteins.
  • FIG. 7 Construction of a recombinant vaccinia virus containing the cis-active elements and the transgene of a lentiviral vector based on pVeksyngag as well as the HIV genes gag-pol and env under transcriptional control of vaccinia virus promoters inserted into different gene locations of the vaccine -Virusgenoms.
  • the sequence listing contains:
  • SEQ ID NO. 1 The nucleotide sequence of "syngag", a synthetically produced gene whose gene sequence codes for the HIV gag proteins p17 and p24;
  • SEQ ID NO. 2 The nucleotide sequence of the immunostimulatory CpG oligodinucleotide (CpG-ODN).
  • Example 1 Immunization with an HIV-1 Vector Containing Humanized, Synonymous gag / p39 (syngag)
  • the foamy virus genome and the 3 'part of the CMV promoter were removed from the plasmid pczHSRV2 (Moebes et al., J. Virol. 1997; 71: 7305-7311) by restriction digestion with Pmel and Ndel.
  • the HIV-1 plasmid pHXB2D (gene bank no. K03455 M38432) was digested with BssHIl and Aflll as well as with Afllll and Xbal.
  • the 3 'part of the CMV promoter and the 5' part of the R region from the HIV LTR were reconstructed using the recombinant PCR.
  • the BssHII / Afllll and Afllll / Xbal fragments from pHXB2D, the reconstructed CMV promoter / HIV-R construct digested with BssHIl and Ndel, and the Ndel / Pmel fragment of the plasmid pczHSRV2 were ligated together.
  • the cellular residual sequences were removed from pHXB2D by recombinant PCR. Digestion with Pvull and EcoRV resulted in a deletion in the 3'-U region, which removed the TATA box.
  • the nef gene was partially removed by digestion with Bpu 11021 and Asp7l8. Thereby the construct pGJ2 was obtained.
  • syngag was then ligated together with the Spleen Focus-Forming Virus (SFFV) promoter into the region of the Esp3l interface in pGJ2.
  • SFFV Spleen Focus-Forming Virus
  • syngag shown in SEQ ID No. 1, is a synthetically produced gene whose gene sequence codes for the HIV gag proteins p17 and p24.
  • the plasmid pGJ2syngag was thus obtained, for which reference is made to FIG. 1.
  • pczVSV-G was prepared according to the literature reference (Pietschmann et al (2000), "Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export” J. Virol.73: 2613-2621).
  • the expression of the transgene was tested by adding cell culture supernatant containing the replication-incompetent virus vectors to HEK 293 cells and incubating the cells at 37 ° C. for 48-72 hours. The cells were then lysed and the lysate was analyzed by Western blot test. An HIV-Gag / p24-specific monoclonal antibody was used for protein detection. The investigation shows the expression of a Gag protein in transduced cells with a molecular weight of approximately 39 kD.
  • mice (Mus musculus) of the inbred strain Balb / c 5 x 106 infectious units of the vectors containing the CpG ODN (SEQ ID NO. 2) were injected intraperitoneally. The immunization was repeated after 2 weeks. A further 12 days later, the mice were sacrificed, blood was drawn and the humoral immune response against vector components was examined. Five animals were immunized.
  • a detection antiserum goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase was then added, followed by substrate. The absorbance at 450 nm was determined photometrically and the titer of Gag / p55-specific antibodies was determined as the reciprocal of the serum dilution, the absorbance of which was greater than the
  • the concentration of neutralizing antibodies was determined by the neutralization test. Serum was given in the form of a series of dilutions to 100 TCID50 of pGJ2-GFP vectors pseudotyped with VSV-G, that is to say pGJ2syngag-like vectors which carry the green-fluorescent protein GFP instead of syngag and were examined microscopically, up to which serum dilution the marker gene expression can be suppressed.
  • the neutralization titer corresponds to the reciprocal of the highest dilution at which complete inhibition of GFP expression was still observed. This study shows the induction of a vector neutralizing antibody response in the blood of mice vaccinated with the vector pGJ2syngag, for which reference is made to Table 2.
  • Table 2 Titer neutralizing, anti-VSV-G-glycoprotein-specific antibody in mice after two vaccinations with pGJ2syngag
  • Example 2 Immunization with an H1V-1 vector containing humanized, synonymous gag / p39 (syngag) in combination with a DNA plasmid
  • the HIV-1 plasmid pHXB2D (gene bank no. K03455 M38432) was digested with BssHIl and Aflll as well as with Afllll and Xbal.
  • the 3 'part of the CMV promoter and the 5' part of the R region from the HIV LTR were reconstructed using the recombinant PCR.
  • the BssHII / Afllll and Afllll / Xbal fragments from pHXB2D, the reconstructed CMV promoter / HIV-R construct digested with BssHIl and Ndel, and the Ndel / Pmel fragment of the plasmid pczHSRV2 were ligated together.
  • the cellular residual sequences were removed from pHXB2D by recombinant PCR. Digestion with Pvull and EcoRV resulted in a deletion in the 3'-U region, which removed the TATA box.
  • the nef gene was partially removed by digestion with Bpu 11021 and Asp7l8. This construct is pGJ2.
  • the syngag gene was then ligated together with the Spleen Focus-Forming Virus (SFFV) promoter into the region of the Esp3l interface in pGJ2.
  • SFFV Spleen Focus-Forming Virus
  • pczVSV-G was prepared according to the literature reference (Pietschmann et al (2000), "Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export” J. Virol.73: 2613-2621).
  • the two recombinant plasmid DNAs were obtained by the CaCl2 method (Soneoka et al. Nucl. Acids Research 1995. Vol. 23. No.4. 628-633) transfected in 293T cells.
  • the cells were incubated at 37 ° C for 8 h, the medium was changed and incubated for a further 16 h.
  • the transcription of the vector DNA was induced with sodium butyrate, the medium containing sodium butyrate was removed after 8 hours and the cells were incubated for a further 16 hours in fresh medium. Medium that is free of fetal bovine serum was used for this. This results in replication-incompetent virus vectors, which were obtained from the cell culture supernatant and concentrated by ultracentrifugation (45,000 g, 150 min., 4 ° C.).
  • a syngag-containing expression plasmid was produced by cloning the syngag gene (SEQ ID NO. 1) together with the promoter of the spleen focus-forming virus into the vector pcDNA3.1zeo (Invitrogen).
  • the plasmid pSFsyngag was thus obtained, for which reference is made to FIG. 2.
  • CpG-ODN SEQ ID NO. 2
  • mice mice (Mus musculus) of the inbred strain Balb / c were tested for 50 mg of DNA / 5 mg of CpG-ODN to test the immunogenicity in the Mm.
  • Quadriceps injected into both hind legs.
  • vectors made from pGJ2syngag and pczVSV-G were mixed with 10 mg of immunostimulatory CpG oligodinucleotides (CpG-ODN) (nucleic acid sequence 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT-3 ').
  • mice 5 x 106 infectious units of the vectors containing the CpG ODN were injected intraperitoneally. Two weeks later, the mice were sacrificed, the spleen and blood were removed, and the cytotoxic T-lymphocyte (CTL) response and the humoral immune response against the HIV gag protein were measured. As controls, Balb / c mice were immunized twice with plasmid DNA. Five animals were immunized. F) The HIV-Gag-specific CTL response was analyzed as follows: the removed spleen was crushed, the erythrocytes were lysed in hypotonic solution containing ammonium chloride and the mononuclear cells were isolated. The CTL response was examined by the ELISpot test.
  • the mononuclear cells were seeded into a membrane-equipped microtiter plate which was coated with antibodies against mouse interferon-g (IFN-g).
  • IFN-g mouse interferon-g
  • a peptide from the range of the HIV Gag / p24 protein with the amino acid sequence "AMQMLKETI” was added as an antigen in a concentration of 10 mg / ml.
  • the cells were incubated with the antigen for 40 h at 37 ° C.
  • the cells were then washed off and IFN-g production was detected using an immunological detection system, in which a streptavidin-conjugated anti-IFN-g antibody was added as detection antibody by adding alkaline peroxidase coupled to biotin and The substrate undergoes a color reaction where IFN-g was produced by antigen-specific lymphocytes and bound to the membrane of the microtiter plate
  • the spots visible in this test correspond to cytotoxic T-lymphocytes activated by the gag peptide AMQMLKETI.
  • the spots were determined using a section microscope counted and the number of spots based on 106 mononuclear spleen cells determined, for which reference is made to FIG. 3.
  • Gag-specific antibody response was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). One was
  • Example 3 Construction of a vector containing the glycoprotein of HIV-1.
  • the foamy virus genome and the 3 'part of the CMV promoter were removed from the plasmid pczHSRV2 (Moebes et al., J. Virol. 1997; 71: 7305-7311) by restriction digestion with Pmel and Ndel.
  • the HIV-1 plasmid pHXB2D (gene bank no. K03455 M38432) was digested with BssHIl and Aflll as well as with Afllll and Xbal.
  • the 3 'part of the CMV promoter and the 5' part of the R region from the HIV LTR were reconstructed using the recombinant PCR.
  • the BssHII / Afllll and Afllll / Xbal fragments from pHXB2D, the reconstructed CMV promoter / HIV-R construct digested with BssHIl and Ndel, and the Ndel / Pmel fragment of the plasmid pczHSRV2 were ligated together.
  • the cellular residual sequences were removed from pHXB2D by recombinant PCR. Digestion with Pvull and EcoRV resulted in a deletion in the 3'-U region, which removed the TATA box.
  • the nef gene was partially removed by digestion with Bpu 11021 and Asp7l8. This construct is pGJ2.
  • the plasmid pHXB2 was cut with the restriction enzymes Sall and Xhol. This creates a 3.1 kb fragment that contains, among other things, the entire reading frame of the env gene. This fragment was cloned into the pC-DNA (-) vector (Invitrogen) via an Xhol site. This plasmid was cut with Bpil and Xhol and the Bpil / Xhol fragment thus obtained contains the complete reading frame of the env gene. The 5 'overhangs of the interfaces were filled in by treatment with the Klenow polymerase.
  • the eukaryotic expression plasmid pCI (Promega), which contains an intron and a CMV promoter, was cut with Smal and the Bpil / Xhol fragment was cloned into it. This gave the plasmid pEnv (Lig), in which the HIV-1 env gene is under the control of the CMV promoter, for which reference is made to FIG. 5.
  • the 5 'end of the expression cassette from pGJ2syngag is amplified by PCR below the CMV promoter, with the immediate early promoter p7.5 from vaccinia virus and interfaces for the restriction enzymes Eagl and Xhol being added at the 5' end.
  • the 3 'end of the expression cassette of pGJ2syngag is also amplified by PCR, with the vaccinia virus immediate early gene stop signal TTTTTGT being inserted behind the 3' R region at the same time.
  • the fragments are ligated together with the middle part of the expression cassette from pGJ2syngag into the plasmid pBK-CMV.
  • the modified pGJ2syngag vector genome is then cut out by the restriction enzyme Eagl and cloned into the NotI site of a vaccinia virus (Copenhagen strain).
  • a vaccinia virus Copenhagen strain.
  • 143B Tk cells are transfected with the ligated vaccinia virus DNA and, after incubation for 24-72 h, recombinant vaccinia viruses are obtained from the cell lysate.
  • Vaccinia viruses are cloned and recombinant vaccinia viruses expressing pGJ2-syngag vector components are selected.
  • the 5 'end of the expression cassette of pGJ2syngag is amplified by PCR below the CMV promoter, with the immediate early promoter p7.5 from vaccinia virus and interfaces for the restriction enzymes Eagl and Xhol being added at the 5' end.
  • the 3 'end of the expression cassette of pGJ2syngag is also amplified by PCR, with the vaccinia virus immediate early gene stop signal TTTTTGT being inserted behind the 3' R region at the same time.
  • the fragments are ligated together with the middle part of the expression cassette from pGJ2syngag into the plasmid pBK-CMV.
  • the gene regions for the 3 ′ region of gag, pol, vif, vpr, rev, tat and env are then removed by restriction digestion with Bael and Bsml.
  • the pVeksyngag vector genome is cut out by the restriction enzyme Eagl and cloned into the NotI site of a vaccinia virus (Copenhagen strain) in the presence of the restriction enzyme Notl.
  • 143B Tk cells are transfected with the ligated vaccinia virus DNA, infected with fowlpox virus, and after incubation for 3-5 days, recombinant vaccinia viruses are obtained from the cell lysate.
  • Vaccinia viruses are cloned in cell culture and viruses that express pVeksyngag-RNA are selected.
  • the gag / pol gene under the control of the vaccinia virus H6 promoter is cloned into the thymidine kinase gene (tk) locus of the recombinant vaccinia virus containing pVeksyngag by homologous recombination, for which reference is made to FIG. 7.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Virusvektoren und deren Verwendung zur Erzeugung einer Immunantwort gegen Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV), zur Immuntherapie und Immunisierung.

Description

Immunisierung gegen Bestandteile des Humanen Immunschwächevirus (HIV)
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Erzeugung einer Immunantwort gegen Bestandteile des Humanen Immunschwächevirus (HIV) durch lentivira- le, vermehrungsunfähige Vektoren, die als Transgen ein oder mehre- re HIV-Gene enthalten, sowie ein besonders geeignetes Verfahren für die Applikation der Vektorkonstrukte'.
Das Humane Immunschwächevirus (HIV) ist ein Virus aus der Familie der Retroviren, Subfamilie Lentiviren. Die Infektion mit HIV führt nach mehreren Jahren klinischer Latenz zur Entwicklung des Erwor- benen Immunschwächesyndroms (AIDS) und Tod durch opportunistische Infektionen, Tumoren, Enzephalopathie oder Schwindsucht („wasting disease") (Fauci und Lane (1998), "Human immunodefi- ciency virus (HIV) disease: AIDS and related disorders" in: Harrison's Principles of Infernal Medicine, 14. Aufl., S.1791-1855). Es hat sich gezeigt, dass Aufklärung mit dem Ziel das Risiko der sexuellen Übertragung zu reduzieren, die Zahl der HIV-Übertragungen verringern kann (Joint United Nations Programme on HIV/AIDS (2001), "AIDS epidemic update" UNAIDS, Genf). Auch in den entwickelten Ländern kann durch diese Maßnahmen Neuinfektionen nicht vollständig ver- hindert werden. Um die Infektionskette wirksam zu durchbrechen wird deshalb große Hoffnung in die Entwicklung eines HIV-Impfstoffs gesetzt.
Es ist bekannt, dass die Immunisierung eines Menschen oder eines Tieres diese gegenüber einer Infektion mit dem gleichen oder einem ähnlichen, verwandten Erreger schützt. Das heißt, dass die auf die Impfung folgende Infektion entweder nicht zur Symptomatik der Erkrankung führt oder dass die Erkrankung wesentlich milder verläuft. Es ist auch bekannt, dass eine Immunantwort gegen einen viralen Infektionserreger durch verschiedene Verfahren erzeugt werden kann. Dazu gehören Lebend-, Tot- Protein-, Peptidimpfstoffe, Virusähnliche Partikel, DNA-Vakzine, virale und bakterielle Vektorimpf- Stoffe und Kombinationen dieser Verfahren (Keusch und Bart (1998), „Immunization principles and vaccine use" in: Harrison's Principles of Infernal Medicine, 14. Aufl., S. 758 ff., MacGraw-Hill-Verlag, New York, NY, U. S. A.). Diese Verfahren und davon abgeleitete Modifikationen sind auch für die HIV-Infektion in Erprobung (International AIDS Vaccine Initiative Database of Preventive AIDS Vaccines in Human Trials (URL: http://www.iavi.org/trialsdb/searchresults.asp9list =vaccine&vt=.&ts=.).
Lebendvirusimpfstoffe sind abgeschwächte (attenuierte) Viren oder verwandte, apathogene Erreger, die im Geimpften eine Immunant- wort induzieren, die auch gegen das pathogene Virus wirksam ist. Entscheidender Vorteil von Lebendimpfstoffen ist, dass sie sich im Geimpften vermehren und dadurch die Antigenmenge, mit der der Geimpfte in Kontakt kommt, erhöhen. Lebendimpfstoffe erreichen die Zielzellen im Organismus die am relevantesten für die Erzeugung einer Immunantwort sind. Dadurch werden üblicherweise mehrere Arme der Immunantwort wie Antikörper und zytotoxische T- Lymphozyten (CTL), lokaler und systemischer Immunschutz gleichzeitig induziert. Lebend impfstoffe müssen meist nur einmal appliziert werden um eine langanhaltende Immunität zu erzeugen (Keusch und Bart (1998), „Immunization principles and vaccine use" in: Harrison's Principles of Infernal Medicine, 14. Aufl., S. 758 ff., MacGraw-Hill- Verlag). Gentechnologisch modifizierte Lebendviren, die eine Immunantwort gegen die durch Immunschwächeviren hervorgerufene Krankheit bewirken, sind aus dem Tiermodell bekannt (Daniel et al. (1992), "Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene" Science 258:1938-1941). Impfstoffe gegen HIV auf der Basis von replikationsfähigen, abgeschwächten HI-Viren gelten als zu riskant für die Anwendung beim Menschen, da sie, wie durch Tierversuche festgestellt wurde, im Organismus persistieren, sich vermehren und unter bestimmten Bedingungen selbst die tödliche Immunschwächekrankheit AIDS hervorrufen können (Baba et al. (1999), "Live attenuated, multiply deleted simian immunodeficiency virus causes AIDS in infant and adult macaques" Nat. Med. 5(2): 194- 203).
Totimpfstoffe sind chemisch inaktivierte Viren. Bekannt ist die Impfung bereits infizierter Personen mit inaktivierten HI-Viren zur Verstärkung der HIV-spezifischen Immunantwort (Kahn et al. (2000), "Evaluation of HIV-1 immunogen, an immunologic modifier, adminis- tered to patients infected with HIV having 300 to 549 x 10(6)/L CD4 cell counts: A randomized controlled trial" Jama 284(17):2193-202). Das Verfahren zur Herstellung der HIV-Totimpfstoffe führt allerdings dazu, dass der äußere Teil der Hüllglykoproteine (gp120) verloren geht. Deswegen können solchermaßen hergestellte Impfkonstrukte keine neutralisierenden Antikörper, die eine wesentliche Komponente der antiviralen Immunantwort darstellen, induzieren.
Protein-Vakzine sind synthetisch hergestellte Kopien einzelner viraler Proteine oder aufgereinigte Virusbestandteile. Sie induzieren in erster Linie eine Antikörperantwort. Experimentelle und Klinische Stu- dien zeigen, dass HIV-Glykoproteine in der Lage sind, neutralisierende Antikörper, das sind Antikörper, die eine Virusinfektion blo- ckiern können, zu induzieren (Belshe et al. (1993), "Safety and im- munogenicity of a fully glycosylated recombinant gp160 human im- munodeficiency virus type 1 vaccine in subjects at low risk of infec- tion" J Infect Dis 168(6): 1387-95; Gorse et al. (1999), "HIV-1MN re- combinant glycoprotein 160 vaccine-induced cellular and humoral immunity boosted by HIV-1MN recombinant glycoprotein 120 vac- eine" AIDS Res Hum Retroviruses 15(2):115-32; McElrath et al. (2000), "A phase II study of two HIV type 1 envelope vaccines, com- paring their immunogenicity in populations at risk for acquiring HIV type 1 infection" AIDS Res Hum Retroviruses 16(9):907-19). Neben Glykoproteinen von HIV-Laborstämmen werden zur Immunisierung Proteine, deren Aminosäuresequenz denen von Wildtyp-Viren entsprechen, verwendet (Mascola et al. (1996), "Immunization with envelope subunit vaccine produets elicits neutralizing antibodies a- gainst laboratory-adapted but not primary isolates of human immu- nodeficiency virus type 1" J Infect Dis 173(2):340-8). Außerdem sind auch Impfungen mit anderen HIV-Proteinen bekannt (Le Buanec et al. (1998), "A prophylactic and therapeutic AIDS vaccine containing as a component the innoeuous Tat toxoid" Biomed Pharmacother 52(10):431-5).
Peptid-Impfstoffe enthalten einzelne Peptide oder Ketten mehrerer Sequenzen von 10-25 Aminosäuren Länge, die Proteinabschnitte repräsentieren, die besonders häufig oder effizient durch das Immunsystem erkannt werden (immunogene Epitope). Um sie dem Immunsystem in optimaler Weise zu präsentieren, werden die Peptide chemisch an weitere Molekülen, z. B. in Form von Lipopeptiden, gekoppelt oder unter Zusatz geeigneter Adjuvanzien appliziert (Gorse et al. (1996), "A dose-ranging study of a prototype synthetic HIV- 1 MN V3 branched peptide vaccine" J Infect Dis 173(2):330-9.; Kelleher et al. (1997), "Safety and immunogenicity of UBI HIV-1MN oc- tameric V3 peptide vaccine administered by subeutaneous injeetion" AIDS Res Hum Retroviruses 13(1):29-32.; Pialoux et al. (2001), "Li- popeptides induce cell-mediated anti-HIV immune responses in seronegative volunteers" Aids 15(10): 1239-49.).
Pseudovirionen (Virus-like particles, VLP) sind in ihrer äußeren Struktur dem Virus ähnliche Partikel. Sie werden gentechnisch hergestellt, indem virale Strukturgene, insbesondere die HIV-gag-Gene, in Zellen zur Expression gebracht werden. Zusätzlich zu den Gag- Proteinen können Pseudovirionen auch weitere HIV-Proteine enthalten, insbesondere Pol- und Env-Proteine (Paliard et al. (2000), "Priming of strong, broad, and long-lived HIV type 1 p55gag-specific CD8+ cytotoxic T cells after administration of a virus-like particle vaccine in rhesus macaques" AIDS Res Hum Retroviruses 16(3):273-82.; Montefiori et al. (2001), "Induction of neutralizing anti- bodies and gag-specific cellular immune responses to an R5 primary isolate of human immunodeficiency virus type 1 in rhesus macaques" J Virol 75(13):5879-90.; Buonaguro et al. (2002), "Induction of neutralizing antibodies and cytotoxic T lymphocytes in Balb/c mice im- munized with virus-like particles presenting a gp120 molecule from a HIV-1 isolate of clade A" Antiviral Res 54(3):189-201.; Dale et al. (2002), "Chimeric Human Papilloma Virus-Simian/Human Immunodeficiency Virus Virus-Iike-Particle Vaccines: Immunogenicity and Protective Efficacy in Macaques" Virology 301(1): 176.). Pseudovirionen enthalten kein Genom und sind nicht infektiös (Griffiths et al. (1993), "Hybrid human immunodeficiency virus Gag particles as an antigen carrier system: induction of cytotoxic T-cell and humoral responses by a Gag:V3 fusion" J Virol 67(6):3191-8.; Martin et al. (1993), "Immunization of human HlV-seronegative volunteers with recombinant p17/p24:Ty virus-like particles elicits HIV-1 p24-specific cellular and humoral immune responses" Aids 7(10):1315-23.; Kelle- her et al. (1998), "Safety and immunogenicity of a candidate thera- peutic vaccine, p24 virus-like particle, combined with zidovudine, in asymptomatic subjects" Aids 12(2): 175-82.).
Induktion einer HIV-spezifischen Immunantwort durch Applikation von DNA (DNA-Vakzine). Das Prinzip der Immunisierung mit DNA- Plasmiden beruht auf der Beobachtung, dass die Applikation von DNA eine Immunantwort gegen ein auf dem Plasmid kodiertes Protein induzieren kann (Wolff et al. (1990), "Direct gene transfer into mouse muscle in vivo" Science 247(4949 Pt 1): 1465-8). In bestimm- ten Tiermodellen können DNA-Impfstoffe eine protektive Immunantwort hervorrufen (Ulmer et al. (1993), "Heterologous protection a- gainst influenza by injection of DNA encoding a viral protein" Science 259(5102): 1745-9). Verschiedene Verfahren zur DNA- Immunisierungen gegen das HI-Virus oder das mit ihm verwandte Affenimmunschwächevirus (SIV) sind bekannt (Akahata et al. (2000), "DNA vaccination of macaques by a füll genome HIV-1 plasmid which produces noninfectious virus particles" Virology 275(1): 116-24; Weber et al. (2001), "Phase I clinical trial with HIV-1 gp160 plasmid vaccine in HIV-1- infected asymptomatic subjects" Eur J Clin Micro- biol Infect Dis 20(11):800-3; Graham (2002), "Clinical trials of hiv vaccines*" Annu Rev Med 53:207-21). Unter anderem werden neben Plasmiden mit natürlicher HIV- oder SlV-Sequenz Plasmide mit modifizierter, synonymer Virus-Gensequenz (Demi et al. (2001), "Multiple effects of codon usage optimization on expression and immuno- genicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein" J Virol 75(22):10991-1001 ; Shiver et al. (2002), "Replication-incompetent adenoviral vaccine vector eli- cits effective anti-immunodeficiency-virus immunity" Nature 415(6869):331-5) verwendet. Zusätzlich sind Verfahren bekannt, bei denen die DNA zusammen mit immunogenen Hilfsstoffen wie CpGs (Demi et al. (2001), "Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein" J Virol 75(22):10991-1001) oder Zytokinen (Barouch et al. (2000), "Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cy- tokine-augmented DNA vaccination" Science 290(5491 ):486-92) appliziert werden. In einer weiteren Variante der DNA-Immunisierung wird zur Immunstimulation zusätzlich zur HIV-DNA gleichzeitig die DNA des Glykoprotein-Gens des Vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) appliziert (Marsac et al. (2002), "Enhanced presentation of major histocompatibility complex class I- restricted human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag-specific epitopes after DNA immunization with vectors coding for vesicular stomatitis virus glycoprotein- pseudotyped HIV-1 Gag particles" J Virol 76(15):7544-53).
Präsentation von HIV-Antigenen durch Trägerviren (Virale Vektoren). Es ist bekannt, dass zur Immunisierung Virusproteine über virale Vektoren in einen Organismus eingebracht werden können. Virale Vektoren sind Derivate von apathogenen Viren, die gentechnisch so verändert werden, dass sie Gene fremder Organismen tragen können. Im Falle einer Immunisierung gegen HIV ist es Aufgabe der Trägerviren, HIV-Gene in den Organismus einzubringen. Diese Gene werden in virusinfizierten Zellen abgelesen (transkribiert) und daraus HIV-Proteine hergestellt, die dem Immunsystem anschließend prä- sentiert werden. Virale Vektoren können vemehrungsfähig oder vermehrungsunfähig sein. Nach Infektion durch vermehrungsunfähige Vektoren werden keine vollständigen Viruspartikel sondern nur einzelne Gene des Virusvektors einschließlich der eingeschleusten Fremdgene aktiviert und exprimiert. Für HlV-lmpfstudien wurden un- ter anderem verschiedene Vakzinia-Virus- und Vogel-Pockenvirus- Konstrukte, die eines oder mehrere HIV-Gene beinhalten, hergestellt, sowie rekombinante Viren auf Basis von Adenovirus, Rhabdo- viren, Herpes-simplex-Virus, Poliovirus, Adenoassoziiert.es Virus und Alphaviren, wie Semliki-Forest-, Sindbis- und Venezuelanisches Pferdeenzephalitis-Virus, konstruiert (Robinson (2002), "New hope for an AIDS vaccine" Nat Rev Immunol 2(4):239-50). Vakzinia- und Kanarienpockenviruskonstrukte, die HIV-Gene tragen, sowie Impfverfahren auf Basis eines Adenovirus Typ 5 werden zur Zeit am Menschen getestet (Zagury et al. (1988), "A group specific anamnes- tic immune reaction against HIV-1 induced by a candidate vaccine against AIDS" Nature 332(6166):728-31 ; Graham et al. (1993), "Augmentation of human immunodeficiency virus type 1 neutralizing antibody by priming with gp160 recombinant vaccinia and boosting with rgp160 in vaccinia-naive adults" J Infect Dis 167(3):533-7; Bel- she et al. (1998), "Induction of immune responses to HIV-1 by canarypox virus (ALVAC) HIV-1 and gp120 SF-2 recombinant vaccines in uninfected volunteers" Aids 12(18):2407-15; Clements-Mann et al. (1998), "Immune responses to human immunodeficiency virus (HIV) type 1 induced by canarypox expressing HIV-1 MN gp120, HIV-1SF2 recombinant gp120, or both vaccines in seronegative adults" J Infect Dis 177(5): 1230-46; Hanke und McMichael (2000), "Design and con- struction of an experimental HIV-1 vaccine for a year 2000 clinical trial in Kenya" Nat Med 6(9):951-5; Johnston und Flores (2001), "Progress in HIV vaccine development" Curr Opin Pharmacol 1(5):504-10.). Die Expression des HIV-Gens gag zusammen mit pol und env durch Pockenviruskonstrukte führt zur Bildung von Pseudovirionen (Karacostas et al. (1989), "Human immunodeficiency virus- like particles produced by a vaccinia virus expression vector" Proc Natl Acad Sei U S A 86(22):8964-7; Haffar et al. (1990), "Human immunodeficiency virus-like, nonreplicating, gag-env particles as- semble in a recombinant vaccinia virus expression system" J Virol 64(6):2653-9).
Präsentation von HIV-Antigenen durch Trägerbakterien (Bakterielle Vektoren). Bekannt ist, attenuierte oder apathogene Bakterien, zum Beispiel Salmonella typhi (Impfstamm CVD 908) und Streptococcus gordonii, die molekulargenetisch so modifiziert wurden, dass sie HIV- Gene tragen, zur Immunisierung über die Schleimhäute zu verabrei- chen (Di Fabio et al. (1998), "Vaginal immunization of Cynomolgus monkeys with Streptococcus gordonii expressing HIV-1 and HPV 16 antigens" Vaccine 16(5):485-92; Johnston et al. (2001), "Progress in HIV vaccine development" Curr Opin Pharmacol 1(5):504-10).
Es ist bekannt, aus Retroviren, einschließlich Vertretern der retrovira- len Subfamilie der Lentiviren, durch gentechnische Manipulationen Konstrukte herzustellen, die infektiös sind jedoch unfähig zur Vermehrung (Curran et al. (2000), "Efficient transduetion of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors" Mol Ther 1(1):31-8; Negre et al. (2000), "Characterization of novel safe lentivi- ral vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) that efficiently transduce mature human dendritic cells" Gene Ther 7(19): 1613-23; Ailles und Naldini (2002), "HIV-1 -derived lentiviral vectors" Curr Top Microbiol Immunol 261:31-52). Solche Konstrukte entsprechen in ihrer Größe und Form ihren Ursprungsviren und wer- den vermehrungsunfähige (replikationsinkompetente) retrovirale Vektoren genannt. Lentivirale Vektoren sind gentechnisch von Lentiviren abgeleitete Konstrukte, die unter anderem aus dem Humanen Immunschwächevirus (HIV) sowie dem Affenimmunschwächevirus (SIV) entwickelt wurden. Die Vektoren tragen meist einen Teil, nie jedoch das vollständige Genom des Ausgangsvirus (Kim et al. (1998), "Minimal requirement for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1" J Virol 72(1 ):811-6). Es ist bekannt, retrovirale Vektoren einschließlich Vektoren hergeleitet von HIV und SIV solchermaßen genetisch zu gestalten, dass sie ein Fremdgen enthalten, welches in infizierten Zellen zur Expression kommt. Das Fremdgen (Transgen) stammt in der Regel von einem anderen Organismus oder Virus und steht unter der regulatorischen Kontrolle eines eigenen Promotors. Die Infektion (Transduktion) von Zellen durch einen lentiviralen Vektor führt zur Expression des Transgens in der infizierten (transduzierten) Zelle. (Curran et al. (2000), "Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors" Mol Ther 1(1):31-8; Negre et al. (2000), "Char- acterization of novel safe lentiviral vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) that efficiently transduce mature human dendritic cells" Gene Ther 7(19):1613-23; Ailles et al. (2002), "HIV-1 -derived lentiviral vectors" Curr Top Microbiol Immunol 261 :31- 52).
Replikationsinkompetente retrovirale Vektoren zeichnen sich dadurch aus, dass die Vektoren zwar in der Lage sind, Zielzellen einmalig zu infizieren und ein Transgen zu exprimieren, dass die virale Replikation jedoch unterdrückt ist. Hierzu können beispielsweise Gene von Strukturproteinen (zum Beispiel das env-Gen) deletiert und in separaten Expressionsplasmiden oder Verpackungszellinien in trans zur Verfügung gestellt werden. Außerdem können regulatorische Gene (bei HIV beispielsweise das tat-Gen) entfernt oder unterdrückt werden. Ebenso können alternativ oder ergänzend Gene für kritische Virulenzfaktoren (bei HIV beispielsweise das vif-Gen) entfernt oder unterdrückt werden. Schließlich können auch regulatorische Sequenzen im Bereich des Long Terminal Repeat entfernt werden, die dazu führen, dass ein sogenannter „selbst-inaktivierender" lentiviraler Vektor gebildet wird (Kim et al. (1998), "Minimal requirement for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1" J Virol 72(1):811-6). Durch solche gentechnischen Manipulationen veränderte Virusvektoren sind in ihrer Replikationsfähigkeit und der Fähigkeit zur homologen Rekombination eingeschränkt und gelten als apathogen hinsichtlich der urspünglichen Pathogenität der Aus- gangsviren (Ailles et al. (2002), "HIV-1 -derived lentiviral vectors" Curr Top Microbiol Immunol 261 :31-52).
Es sind mehrere Verfahren bekannt, wie retrovirale Vektoren in vitro hergestellt werden. Es ist möglich, Zielzellen, sogenannte Vektorproduktionszellen, mit zwei oder mehr Plasmiden gleichzeitig transient zu transfizieren und anschließend die Vektoren dem Zellkulturüber- stand zu entnehmen. Es ist auch möglich, Vektorproduktionszellli- nien herzustellen, die konstitutiv oder nach Induktion einzelne oder alle Bestandteile für die Vektorproduktion generieren (Zufferey (2002), "Production of lentiviral vectors" Curr Top Microbiol Immunol 261 :107-21).
Es ist schließlich auch bekannt, das Genom replikationsinkompeten- ter retroviraler Vektoren in anderen Viren zu verpacken. So wurden Teile replikationsinkompetenter retroviraler Vektoren in rekombinante Semliki-Forest-Viren (Wahlfors et al. (1997), "Semliki Forest virus- mediated production of retroviral vector RNA in retroviral packaging cells" Hum Gene Ther 8(17):2031-41 ; Li und Garoff (1998), "Packaging of intron-containing genes into retrovirus vectors by alphavirus vectors" Proc Natl Acad Sei U S A 95(7): 3650-4), Herpesviren (Sa- vard et al. (1997), "Defective herpes simplex virus type 1 vectors harboring gag, pol, and env genes can be used to rescue defective retrovirus vectors" J Virol 71(5):4111-7), Adenovirale Vektoren (Feng et al. (1997), "Stable in vivo gene transduction via a novel adenovi- ral/retroviral chimeric vector" Nat Biotechnol 15(9):866-70) und Viren aus der Familie der Pockenviren (Holzer et al. (1999), "Poxvi- ral/retroviral chimeric vectors allow cytoplasmic production of trans- ducing defective retroviral particles" Virology 253(1): 107-14; Konet- schny et al. (2002), "Retroviral vectors produced in the cytoplasmic vaccinia virus system transduce intron-containing genes" J Virol 76(3): 1236-43) (US Patent 6,352,856) verpackt.
Lentivirale Vektoren auf der Basis von Immunschwächeviren wurden bisher für die virologische Grundlagenforschung sowie für die In vitro- und In-vivo-Anwendung in der experimentellen Gentherapie hergestellt. Die experimentelle Gentherapie zielt in erster Linie auf den Ersatz defekter Gene im menschlichen Organismus sowie der Tumortherapie (Amado und Chen (1999), "Lentiviral vectors-the promise of gene therapy within reach?" Science 285(5428):674-6; Holzer et al. (1999), "Poxviral/retroviral chimeric vectors allow cyto- plasmic production of transducing defective retroviral particles" Virology 253(1): 107-14; Klimatcheva et al. (1999), "Lentiviral vectors and gene therapy" Front Biosci 4:D481-96; Deglon et al. (2000), "Self- inactivating lentiviral vectors with enhanced transgene expression as Potential gene transfer system in Parkinson's disease" Hum Gene Ther 11 (1): 179-90; Deglon und Aebischer (2002), "Lentiviruses as vectors for CNS diseases" Curr Top Microbiol Immunol 261 :191-209; Galimi und Verma (2002), "Opportunities for the use of lentiviral vectors in human gene therapy" Curr Top Microbiol Immunol 261 :245- 54; Konetschny et al. (2002), "Retroviral vectors produced in the cy- toplasmic vaccinia virus system transduce intron-containing genes" J Virol 76(3): 1236-43; Maurice et al. (2002), "Efficient gene transfer into human primary blood lymphocytes by surface- engineered lentiviral vectors that display a T cell-activating polypeptide" Blood 99(7):2342-50; Nguyen et al. (2002), "Highly efficient lentiviral vector- mediated transduction of nondividing, fully reimplantable primary he- patocytes" Mol Ther 6(2): 199-209) (US Patente 6,013,516; 6,352,856; 6,451 ,595). Darüber hinaus wird auch erprobt, die HIV- Infektion mit lentiviralen Vektoren zu behandeln. Ziel dieser Entwick- lungen ist es, durch Gentherapie die Zielzellen für die HIV-Infektion, die Lymphozten, widerstandsfähig gegen eine HIV-Infektion zu machen (Klimatcheva et al. (2001), "Defective lentiviral vectors are effi- ciently trafficked by HIV-1 and inhibit its replication" Mol Ther 3(6):928-39; Amado et al. (2002), "Lentiviral vectors for gene therapy of HlV-induced disease" Curr Top Microbiol Immunol 261 :229-43).
Neben Anwendungen in virologischer Grundlagenforschung und experimenteller Gentherapie sind Verfahren bekannt, bei denen HIV- Vektoren für die Sensitivitäts- und Resistenztestung von HIV gegen antivirale Substanzen eingesetzt werden (Järmy et al. (2001), "Phe- notypic analysis of the sensitivity of HIV to revese transcriptase, pro- tease and integrase inhibitors using a self-inactivating virus vector system" J. Med. Virol. 64(3):223-231) (U. S: Patente 6,103,462; 6,242,187).
In Hinsicht auf eine Immunreaktion gegenüber retroviralen Vektoren ist bekannt, dass ähnlich wie bei der Verwendung von Vektoren auf der Basis anderer, nicht-retroviraler Viren die Immunantwort, die nach der Applikation eines retroviralen Vektorkonstrukts erzeugt wird, gegen die Vektorstrukturproteine selbst gerichtet sein kann. Dieser Effekt wird in Hinsicht auf die Verwendung von retroviralen Vektoren für die Gentherapie als unerwünscht und hinderlich angesehen (McCormack et al. (1997), "Anti-vector immunoglobulin induced by retroviral vectors" Hum Gene Ther 8(10): 1263-73).
Unter Pseudotypisierung versteht man die Bildung von viralen Vektoren, welche die Hüllglykoproteine einer anderen Virusgattung tragen. Lentivirale Vektoren können mit Glykoproteinen verschiedener Viren kombiniert werden. Es ist bekannt, dass Dendritische Zellen, durch replikationsinkompetente HIV-Vektoren, die mit dem Glykoprotein des Vesikulären Stomatitisvirus (VSV-G) pseudotypisiert wurden, in vitro infiziert werden. Werden Dendritische Zellen infiziert, können sie eine virusspezifische T-Lymphozyten-Immunreaktion gegen HIV- Strukturen in Zellkultur erzeugen (Granelli-Pipemo et al. (2000), "Dendritic cells, infected with vesicular stomatitis virus-pseudotyped HIV-1 , present viral antigens to CD4+ and CD8+ T cells from HIV-1- infected individuals" J Immunol 165(11):6620-6; Gruber et al. (2000), "Dendritic cells transduced by multiply deleted HIV-1 vectors exhibit normal phenotypes and functions and elicit an HlV-specific cytotoxic T- lymphocyte response in vitro" Blood 96(4): 1327-33).
Es ist bekannt, retrovirale Vektoren auf der Basis von Murinen Leukämieviren, die als Transgen ein oder mehrere HIV-Gene enthalten, als Immunstimulans zur therapeutischen Immunisierung bei HIV- Infizierten anzuwenden. Die Immunstimulation wird dabei entweder durch direkte Verabreichung der Vektoren in den Organismus erzielt oder durch Injektion von autologen Zellen, die zuvor in vitro mit retroviralen Vektoren, die HIV-Gene tragen, transduziert wurden (Warner et al. (1991), "Induction of HlV-specific CTL and antibody responses in mice using retroviral vector-transduced cells" AIDS Res Hum Ret- roviruses 7(8):645-55; Irwin et al. (1994), "Direct injection of a recombinant retroviral vector induces human immunodeficiency virus- specific immune responses in mice and nonhuman primates" J Virol 68(8):5036-44; Ziegner et al. (1995), "Cytotoxic T-lymphocyte induc- tion in asymptomatic HIV-1 -infected patients immunized with Ret- rovector-transduced autologous fibroblasts expressing HIV-1 IIIB Env/Rev proteins" Aids 9(1):43-50; Warner et al. (1998), "Human immunodeficiency virus immunotherapy using a retroviral vector" Curr Top Microbiol Immunol 226:145-60) (U. S. Patent 5,716,826).
Die bekannten Verfahren zur Immunisierung gegen Proteine des HI- Virus und die bisher dazu verwendeten Reagenzien haben unter anderem die folgenden Nachteile: Lebendimpfstoffe auf der Basis von Immunschwächeviren sind zwar die potentesten unter den bekannten Immunogenen, doch tragen sie ein hohes Pathogenitätsrisiko und sind deshalb als Impfstoffe gegen HIV nicht geeignet.
Protein- und Peptidimpfstoffe sowie Pseudovirionen enthalten nur Teile des Virus. Eine Immunantwort gegen HIV sollte jedoch möglichst breit angelegt sein und gegen möglichst viele Virusstrukturkomponenten gerichtet sein.
Da DNA-Impfstoffe keine Proteinstrukturen präsentieren, können durch solche Immunogene keine Antikörper gegen Konformationse- pitope, die durch die Tertiär- und Quartärstruktur von Proteinen entstehen, induziert werden. Insbesondere erzeugen sie keine neutralisierenden Antikörper gegen HIV. Gleichermaßen können durch be- kannte Peptidimpfstoffe keine Antikörper gegen Epitope gebildet werden, die erst durch die Konformation der natürlichen Proteine entstehen. Da Impfstoffe wie Totimpfstoffe, Protein- und Peptidimpfstoffe, Pseudovirionen und DNA sich im Körper des Geimpften nicht vermehren, entspricht die eingesetzte Antigenmenge der maximalen Antigenmenge, der das Immunsystem eines Organismus ausgesetzt ist. Nicht replizierende Impfstoffe sind deswegen zwar prinzipiell sicher, aber weit weniger immunogen als Impfstoffe, die sich im Geimpften zunächst noch vermehren. Dies bedeutet, dass zur Erzeugung einer kräftigen und lang anhaltenden Immunantwort eine mehrmalige Applikation des Impfstoffs erforderlich ist. Je geringer die Anzahl der Impfungen, um so leichter lässt sich ein umfassender Immunschutz in einer Bevölkerung erzielen. Impfschemata, bei denen mehrmals immunisiert werden muss, sind wesentlich schwieriger in der Praxis umzusetzen. Dies trifft insbesondere auf solche Länder zu, in denen das Gesundheitssystem nur unzureichend entwickelt ist. Außerdem bedeuten Mehrfachimpfungen nicht nur aufwendigere Logistik und Kosten in der Anwendung sondern grundsätzlich höhere Produktionskosten.
Nachteile von Totimpfstoffen und Impfstoffen bestehend aus einzelnen Viruskomponenten sowie DNA-Immunogenen ist, dass sie meist keine lokale Immunantwort auf Schleimhäuten induzieren, weil effiziente Transportsysteme, die sie zu den lokalen antigenprozessie- renden Zellen transportieren, fehlen (Keusch und Bart (1998), „Immunization principles and vaccine use" in: Harrison's Principles of Infernal Medicine, 14. Aufl., S. 758 ff., MacGraw-Hill-Verlag). Des- halb müssen bei der Anwendung solcher Impfstoffe zusätzliche im- munstimulatorische Maßnahmen ergriffen werden, um auch eine Immunreaktion auf Schleimhäuten zu erzielen, falls diese, wie bei der HIV-Infektion, erwünscht ist. Ein Nachteil der Immunisierung mit Viralen Vektoren ist, dass sie nur einmal appliziert werden können, da bereits nach der erstmaligen Anwendung der Vektoren das Immunsystem massiv auf das Trägervirus reagiert und diese Immunreaktion bei einer Applikation die Im- munantwort gegen die transportierten HIV-Proteine überlagert.
Nachteil von Impfstoffen auf Basis von Bakteriellen Vektoren ist, dass sie lokal verabreicht nur eine Schleimhautimmunität, nicht jedoch eine systemische Immunantwort hervorrufen.
Hinsichtlich der Erzeugung einer Immunantwort durch „Targeting" von Dendritischen Zellen ist zu prüfen, ob eine Anwendung von VSV-G-pseudotypisierten Vektoren in vivo möglich ist, denn VSV-G- pseudotypisierte lentivirale Vektoren werden durch humanes Serum inaktiviert (DePolo et al. (2000), "VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human se- mm" Mol Ther 2(3):218-22). Außerdem haben die Dendritischen Zellen ihre herausgehobene Rolle in der HlV-Pathogenese darin, dass sie einen besonderen Rezeptor (DC-SIGN) für das HIV-Glykoprotein gp120 besitzen, der es ermöglicht HI-Viren zu den lymphatischen Organen zu transportieren. Lentivirale Vektoren ohne HIV- Glykoprotein oder ein äquivalentes Molekül aus verwandten Immunschwächeviren erfahren nicht den natürlichen Ausbreitungsweg im Organismus. Dies ist ein Nachteil in Hinsicht auf die Erzeugung einer Immunantwort über einen Weg, der der natürlichen Infektion ähnelt.
In Bezug auf die direkte Immunisierung eines Organismus ist die Verwendung von retroviralen Vektoren auf Basis von Oncoretroviren wie den Murinen Leukämieviren nachteilig, da dadurch eine Immunantwort gegen Antigene der Oncoretroviren erzeugt wird und eine mehrmalige Applikation der Vektoren deshalb nicht sinnvoll ist. Auch werden von solchen Vektoren die natürlichen Zielzellen einer HIV- Infektion nicht erreicht.
Der Erfindung liegt daher das Problem zugrunde, eine Immunantwort gegen das Humane Immunschwächevirus (HIV) zu erzeugen, wobei das Immunogen strukturell von HIV abgeleitet und infektiös aber nicht vermehrungsfähig, zur Expression eines oder mehrerer HIV- Proteine geeignet und zur Erzeugung einer gegen Virusbestandteile gerichteten Immunantwort in vivo tauglich sein soll. Der Erfindung liegt weiterhin das technische Problem zugrunde, einen lentiviralen Vektor, der als Transgen ein oder mehrere HIV-Gene enthält, und zur Erzeugung einer Immunantwort gegen Bestandteile des Humanen Immunschewächevirus (HIV) geeignet ist, zur Verfügung zu stellen. Schließlich liegt der Erfindung das Problem zugrunde, ein Trä- gersystem auf Basis rekombinanter Poxviren zur Verfügung zu stellen, mit dem der lentivirale Vektor besonders effizient appliziert werden kann.
Die Grundkonzeption der Erfindung besteht in der Verwendung von replikationsinkompetenten lentiviralen Vektoren zur Immunisierung, das heißt zur Erzeugung einer Immunantwort, gegen Bestandteile des HIV. Bei den replikationsinkompetenten lentiviralen Vektoren handelt es sich um infektiöse Partikel, die alle für die Infektion einer Zelle notwendigen Virusbestandteile enthalten. Die genetische Information der Vektoren stammt aus einem Lentivirus, bevorzugt aus HIV-1 , HIV-2 oder SIV. Das Genom der replikationsinkompetenten viralen Vektoren ist jedoch unvollständig. Daher können erfindungsgemäße replikationsinkompetente lentivirale Vektoren Zielzellen zwar infizieren, im Gegensatz zu den ursprünglichen Viren bilden sich in infizierten Zellen jedoch nicht erneut infektiöse Viruspartikel. Die Vektoren enthalten ein Transgen unter der transkriptionellen Kontrolle eines eukaryoten Promotors. Das Transgen eines Vektors für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist ein Gen oder eine Kombi- nation von Proteingenen aus der Gruppe bestehend aus den HIV- Genen „gag, pol, env, nef, vif, vpr, vpu, vpx, tat, rev". Die Vektoren enthalten in ihrer Hülle Glykoproteine aus HIV-1 , HIV-2 oder SIV.
Zur Immunisierung werden Vektoren in definierter Konzentration und Menge ohne oder unter Zusatz eines Adjuvans einmal oder mehr- mals verabreicht. In einer Modifikation wird die Immunisierung mit den Vektoren kombiniert mit Immunisierungen durch andere Verfahren, insbesondere mit rekombinanten Vektoren auf der Basis von Adeno- oder Pockenviren oder mit DNA-Plasmiden, Proteinen, Pep- tiden, Lipopeptiden oder bakteriellen Vektoren enthaltend Gene des HI-Virus.
In einer besonderen Ausführung der Erfindung wird das Genom der erfindungsgemäßen lentiviralen Vektoren in Viren aus der Familie der Poxviren verpackt. Dazu werden das Transgen und die cis- aktiven Elemente sowie die zur Transkomplementierung erforderli- chen genetischen Strukturen in das Genoms eines Poxvirus integriert. Cis-aktive Elemente sind solche Genstrukturen des Retrovirus, die für die Transkription, Verpackung und Integration eines retroviralen Genoms essentiell sind. In trans werden diejenigen Elemente zur Verfügung gestellt, die zur Produktion eines reifen Vektorpartikels notwendig sind, insbesondere weitere reglulatorische Proteine sowie die Strukturproteine gag, pol und env. Damit die lentiviralen Vektorgene sowie das Transgen mit seinen cis-aktiven Elementen transkribiert werden, werden spezielle Promotoren zur Transkription der Vektorgene im Zytoplasma eingeführt. Das Transgen selbst steht unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryoten Promotors, der im Zellkern aktiv ist.
Zur Immunisierung werden die rekombinanten Poxviruskonstrukte enthaltend die lentiviralen Vektoren verabreicht, indem eine bestimmte Menge intracutan, subcutan, transcutan, intramuskulär, in- taperitoneal, intravenös oder auf Schleimhäute verabreicht wird. Die Verabreichung kann einmalig oder mehrfach, alleine oder in Kombination mit anderen HIV-Impfstoffen, als einzelner Wirkstoff oder zu- sammen mit immunstimulatorischen Substanzen erfolgen.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Herstellung von lentiviralen Vektoren zur Immunisierung. Lentivirale Vektoren für ein erfindungsgemäßes Vefahren werden in Zellkultur durch Transfektion von Zellen durch geeignete Plasmide hergestellt. Vektoren bilden sich dabei in den transfizierten Zellen und werden aus dem Zellkulturüberstand gewonnen.
Ein für ein erfindungsgemäßes Verfahren geeignetes Vektorplasmid enthält außer den für die Replikation und Genexpression in Bakterien notwendigen Genen und Antibiotika-Resistenzgenen eine Kasset- te, die die cis-aktiven Bereiche des lentiviralen Genoms und ein Transgen enthält. Zu den cis-aktiven Regionen zählen insbesondere, aber nicht ausschließlich, Teile der Long-Terminal-Repeat (LTR)- Regionen, die Primerbindungsstelle und das Verpackungssignal. Das Transgen steht unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryo- ten, nuklear aktiven Promotors. Die Genkassette steht unter der Kontrolle eines eigenen Promotors, wie beispielhaft dem CMV- Promotor. Innerhalb der Genkassette liegen optional weitere Gene des Lentivirus. So ist es in einer besonderen Ausführungsform vorteilhaft, dass sich gag, pol und rev sowie das rev-responsive Element (RRE) zusammen mit der Kassette auf dem Plasmid befindet. In keinem Fall jedoch enthält das Plasmid das vollständige Genom eine Lentivirus. Auf einem zweiten und gegebenenfalls einem dritten oder auf weiteren Plasmiden befinden sich die lentiviralen Gene, die als trans-aktive Gene für die Produktion eines Virusvektors notwendig sind. Dazu gehören die Gene env, gag, pol, rev sowie optional die Gene vif, vpr, vpu, nef, tat. In diesen Verpackungsplasmiden stehen die HIV-Gene unter der transkriptionellen Kontrolle eines eukaryoten Promotors. Die Verpackungssequenz Psi sowie alle weiteren cis- aktiven Regionen befinden sich immer auf dem Plasmid mit dem Transgen.
In einer besonderen Ausführungsform werden für die Herstellung des Vektorplasmids ausgehend von einem proviralen HIV-Konstrukt mehrere für die HIV-Replikation notwendige Genabschnitte deletiert, insbesondere das Glykoprotein-Gen und ein Abschnitt im 3'U3- Bereich, der die virale TATA-Box enthält. In dieses Konstukt wird die genetische Information für ein Transgen unter Kontrolle eines hete- rologen, eukaryoten Promotors integriert. In diesem Plasmid werden zusätzlich zu env-Gen und 3'U3 weitere Gene deletiert, unter anderem die Gene vif, vpu, vpr, tat und nef. Außerdem wird der HIV- Promotor durch den CMV-Promotor ersetzt. Dadurch enthält das Plasmid zusätzlich zur Transgenkassette die HIV-Gene gag, pol und rev sowie das RRE.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform werden anstelle der HIV-1 gag-, pol-, env- und rev-Gene die entsprechenden Gensequenzen von HIV-2 oder SIV verwendet. In einer weiteren Ausfüh- rungsform werden anstelle eines oder mehrerer natürlicher Gene aus der Gruppe „gag, pol, env, rev" synonyme, Kodon-optimerte Gensequenzen verwendet, das sind Gene, die andere, synonyme Kodons für die Kodierung der gleichen Peptidsequenz besitzen. Es ist auch möglich, modifizierte gag-pol-Gene, deren Kernretentions- signale entfernt wurden, zu verwenden um den Export der gag-pol mRNAs aus dem Zellkern zu gewährleisten.
Die genetische Information des Glykoprotein-Gens wird durch Restriktionsverdau oder ähnliche Verfahren aus einem Virus- Laborstamm gewonnen und in ein Expressionsplasmid inseriert. E- benso ist es möglich, nach Reverser Transkription der Virus-RNA durch Amplifikation der viralen Nukleinsäure, insbesondere durch Polymerase-Kettenreaktion, das Glykoprotein-Gen aus einem Laborstamm oder aus Probandenmaterial zu gewinnen und in ein Expres- sionsplasmid zu inserieren. Es ist gleichermaßen möglich, das env- Gen synthetisch herzustellen.
Das Transgen für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist ein HIV- Genbereich oder eine Kombination mehrerer Genabschnitte aus der Gruppe „gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, nef". Die genetischen Strukturen, insbesondere die Glykoproteingene, entstammen aus Viren der Gruppe „HIV-1 , HIV-2, SIV" oder sind diesen analog. Optional enthält das Transgens synthetisch modifizierte Genomsequenzen. So ist es vorteilhaft, synonyme Gensequenzen zu verwenden. Die synonyme Sequenz hat den Vorteil, dass die Expression des Gens dadurch verbessert wird und die Gefahr einer homologen Rekombination und die Bildung pathogener Viren verringert wird. Das Transgen enthält Sequenzen aus HIV-1 , HIV-2 oder SIV. Optional besitzt es jedoch zusätzlich weitere Gene, deren Expressionsprodukte zur verstärkten Immunisierung beitragen, wie z. B. Zytoki- ne, Chemokine, Antikörper, Hormone, Tetanus-, Diphtherie oder ein anderes Toxoid. Dabei stehen diese Gene unter der transkriptioneilen Kontrolle eines eigenen Promotors oder sind mit dem HIV- Transgen über eine Interne Ribosomen-Eintrittsstelle verknüpft.
Die Plasmide werden in Bakterien, vorzugsweise in E. coli, vermehrt und anschließend aufgereinigt. Mit den Plasmiden werden durch dem Fachmann bekannte Standardverfahren eukaryote Zellen, vorzugsweise Zellen ohne HIV-Rezeptoren, wie die humane embryonale Nierenfibroblasten-Zelllinie HEK 293T, transfiziert. Die Transfekti- on der Plasmide in HEK 293T-Zellen führt dort zur Bildung von Vektorpartikeln, deren Genom die Regionen enthält, die auf dem Plas- mid, das die cis-aktiven Regionen und das Transgen enthält, kodiert sind. Nach einigen Tagen, vorzugsweise nach 48-72 Stunden, werden die Vektoren aus dem Zellkulturmedium gewonnen, optional außerdem noch konzentriert durch Zentrifugation oder Filtrierung und die Konzentration infektiöser Vektoren bestimmt. Die Vektoren kön- nen eingefroren gelagert werden. Die Vektorpartikel gleichen in Form und Struktur natürlichen, infektiösen Lentiviren. Werden mit den lentiviralen Vektoren eukaryote Zellen infiziert, wird das Transgen exprimiert. Die Einführung der Fremd-Nukleinsäure in die Zellen wird als Transduktion bezeichnet. Eine Bildung von infektiösen Partikeln findet nicht statt.
Ein lentiviraler Vektor für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist beispielsweise dadurch erhältlich, daß a) in ein Ausgangskonstrukt, insbesondere ein Plasmid oder Cosmid, ein virales Genom inseriert wird, b) in dem Zielvirusgenom enthaltenden Konstrukt aus Stufe a) zumindest env und eine für die Genexpression des Virus notwendige Sequenz, insbesondere im 3'U3-Bereich modifiziert oder daraus deletiert werden, c) in das Produkt aus Stufe b) die genetische Informa- tion zur Expression der Markersubstanz inseriert wird, d) das Vektor- konstrukt aus Stufe c) zusammen mit einem Vektorkonstrukt enthaltend die genetische Information für ein HIV- oder SIV-env-Gen in ein Vektorproduktionssystem eingebracht und darin exprimiert wird, e) optional ein in Stufe b) deletiertes Protein in trans über ein Konstrukt, insbesondere ein Plasmid, oder eine Verpackungszelllinie in Stufe d) eingeführt wird und f) der in Stufe d) bzw. e) erzeugte virale Vektor nach seiner Produktion mittels des Vektorproduktionssystems, ggf. nach Zeil-Kultivierung, isoliert wird.
Das Vektorproduktionssystem kann eine Verpackungszelllinie sein. Eine Verpackungszelllinie produziert bereits konstitutiv eines oder mehrere für die Bildung der Viruspartikel notwendigen Virusbestandteile, insbesondere das env-Gen. Die Isolierung kann darin bestehen, Zellkulturüberstand abzunehmen. Erfindungsgemäße lentivirale Vektoren können auch dadurch erzeugt werden, dass die Gene des Vektors stabil in eine Zelllinie integriert werden. Dazu werden durch dem Fachmann bekannte Verfahren eukaryote Zellen mit Plasmiden „stabil" transfiziert, Vektor-exprimierende Zellen identifiziert, und selektiert. Lentivirale Vektoren werden dabei aus dem Zellkulturüberstand der Produktionszelllinie isoliert.
Die Erfindung betrifft insbesondere auch die Herstellung von rekom- binanten Poxviren enthaltend das Genom zur Bildung lentiviraler Vektoren zur Immunisierung. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die gene- tischen Strukturen, die für die Bildung von erfindungsgemäßen infektiösen, replikationsinkompetenten lentiviralen Vektoren notwendig sind, in das Genom eines Virus aus der Familie der Poxviren integriert. Dazu werden cis-aktive Regionen zusammen mit dem Trans- gen und die anderen für die Vektorbildung notwendigen Genstrukturen an einer, zwei oder mehreren Genorten des Poxvirus eingefügt. Cis-aktive Bereiche zusammen mit dem Transgen sowie alle anderen Gene stehen unter transkriptioneller Kontrolle zytoplasmatisch aktiver Promotoren. Vorteilhaft sind dazu Poxviruspromotoren, ins- besondere Frühe Promotoren wie der p7,5-Promotor. Zur Expression in Poxviren werden in den zu integrierenden lentiviralen Vektor- Genen alle kryptischen Transkriptions-Stopp-Sequenzen entfernt. Bei Verwendung Früher Poxvirus-Promotoren werden Abschnitte mit der Nukleotidsequenz TTTTTNT eliminiert. Unterhalb der zu transk- ribierenden Gensequenzen werden Stopp-Signale eingeführt. Bei Verwendung Früher Poxvirus-Promotoren wird die Sequenz TTTTTNT hinter die zu transkribierende Sequenz eingeführt. Es ist für ein erfindungsgemäßes Verfahren auch möglich, andere Poxviruspromotoren einschießlich Später oder Früh/Später Promotoren zu verwenden.
Falls das verwendete Poxvirus ein Vakziniavirus ist, ist es vorteilhaft die Gene der lentiviralen Vektoren in den Bereich der Notl- Schnittstelle des Vakziniavirusgenoms sowie in das Thymidinkinase- Gen zu integrieren. Rekombinierte Poxviren werden durch dem Fachmann bekannte Verfahren selektiert, in eukaryoten Zellen angezüchtet und optional durch Zentrifugation konzentriert.
In einer besonderen Ausführungsform werden mehrere Expressionskassetten für einzelne HIV-Proteine gleichzeitig in das Poxvirusge- nom eingefügt, wobei die Gensequenzen der zugrundeliegenden Lentiviren unterschiedlichen HIV-Stämmen oder unterschiedlichen Viren aus der Gruppe „HIV-1 , HIV-2, SIV" entsprechen und entweder mit natürlichen Genen übereinstimmen oder modifizierte, optional synthetische, synonyme Nukleotidsequenzen besitzen.
Bevorzugt werden aus der Familie der Poxviren die Orthopoxviren, insbesondere das Vakziniavirus sowie Poxviren, die in ihrer Vermehrung im menschlichen Organismus eingeschränkt sind, wie das Modifizierte Vakziniavirus vom Typ Ankara (MVA) und Avipoxviren.
Zur Immunisierung werden erfindungsgemäße infektiöse, replikationsinkompetente lentivirale Vektoren in definierter Konzentration und Menge ohne oder zusammen mit Adjuvans auf die Schleimhaut, intracutan, subcutan, transdermal, intranasal, intramusculär, intrape- ritoneal, intravenös oder auf anderem Weg einmal oder mehr als einmal appliziert. In einer besonderen Ausführungsform wird die Immunisierung mit den lentiviralen Vektoren kombiniert mit Immunisierungen durch ein anderes Verfahren, insbesondere zusammen mit rekombinanten Vektoren auf der Basis von Adeno- oder Pockenviren oder mit geeigneten DNA-Plasmiden, Protein-, Peptid-, Lipopeptid- Vakzinen oder bakteriellen Vektoren enthaltend Gene des HI-Virus. Als Adjuvans sind alle Substanzen geeignet, die zur Immunstimulation und -modulation beitragen ohne selbst ein HIV-Antigen darzustellen. Insbesondere, aber nicht ausschließlich, können dies Freund'sches Adjuvans, CpG-ODN, Derivate von Saponin und ande- ren Detergenzien, Zytokine, Chemokine, Toxoide wie Tetanus-, Diphtherie und Choleratoxin, Antikörper und Hormone sein. Die rekombinanten Poxviruskonstrukte enthaltend die lentiviralen Vektoren werden verabreicht, indem eine bestimmte Konzentration und Menge ohne oder zusammen mit Adjuvans auf die Schleimhaut, intracutan, subcutan, transdermal, intranasal, intramusculär, intrape- ritoneal, intravenös oder auf anderem Weg appliziert wird. Die Verabreichung kann einmalig oder mehrfach, alleine oder in Kombination mit anderen HIV-Impfstoffen, als einzelner Wirkstoff oder zusammen mit immunstimulatorischen Substanzen erfolgen.
Ein erfindungsgemäßer lentiviraler Vektor für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist abgeleitet vom Genom eines einzigen HIV-1 -Stamms. Sequenzen aus mehreren unterschiedlichen HIV-1 -Sequenzen können als Ausgangsbasis für die Konstruktion von erfindungsgemäßen lentiviralen Vektoren und Verfahren verwendet werden. Chimäre Lentiviren enthaltend Elemente aus HIV und SIV können hergestellt werden. Es ist insbesondere vorgesehen, dass an Stelle oder zusätzlich zu Sequenzen aus HIV-1 auch Sequenzen aus HIV-2 oder dem Affenimmunschwächevirus SIV im Vektor enthalten sind, bevorzugt wenn dadurch ein funktionsfähiger lentiviraler Vektor gebildet wird. Dabei können die Virussequenzen sowohl von Laborstämmen als auch von Virus-Primärisolaten stammen. Es ist dabei möglich Gene, die für HIV-Proteine kodieren, zu modifizieren, zu kürzen oder durch synthetische, synonyme Gensequenzen zu ersetzen.
Vorteilhaft ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und dazu geeigneten Vakzinierungskonstrukten die Verwendung von HIV-1- Glykoprotein-Genen. Es ist jedoch auch möglich, zusätzlich oder anstelle der HIV-1-Gene die Glykoprotein-Gene der mit HIV-1 verwandten Viren HIV-2 und SIV zu verwenden. Um den Vektor biologisch sicher zu machen ist es nützlich, bestimmte regulatorische Genabschnitte zu entfernen. Insbesondere ist es vorteilhaft, durch Entfernung einer Region im 3'U3 des 3'-LTR- Bereichs einen „selbst-inaktivierenden" Vektor herzustellen. Außer- dem kann durch Ersatz natürlicher Gensequenzen durch synonyme Kodon-veränderte Gene das Risiko einer homologen Rekombination reduziert werden.
Weiter ist vorgesehen, dass in lentiviralen Vektoren für erfindungsgemäße Verfahren und den davon abgeleiteten rekombinanten Pox- viren mehrere HIV-Gene als Transgen enthalten sind. Neben der Integration eine Genomabschnitts aus dem Bereich des gag-Gens werden bevorzugt weitere oder andere HIV-Genomabschnitte aus der Gruppe „gag, pol, env, rev, tat, vif, vpr, vpu, nef" als Transgen in den gegebenenfalls in Poxviren verpackten lentiviralen Vektor inkor- poriert. Neben der Verwendung von HIV-Gensequenzen als Transgen, die natürlichen HIV-Sequenzen entsprechen, ist es vorteilhaft, synthetische Gensequenzen mit veränderten Kodonsequenzen, die für die gleichen Proteine kodieren, einzusetzen.
Weiter ist vorgesehen, innerhalb des Genoms des lentiviralen Vek- tors zusätzlich zum Transgen Gene zur Expression immunregulatori- scher Proteine wie Zytokine, Chemokine, Antikörper, Hormone, Tetanus-, Diphtherie-, Cholera- oder ein anderes Toxoid zu integrieren.
Es ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Vektoren einmal zu verabreichen. Vorteilhaft ist jedoch die mehrmalige Applikation, da da- durch eine Verstärkung der Immunantwort, insbesondere gegen die Glykoproteine, erzielt werden kann. Es ist weiter vorgesehen, die Vektoren in Kombination mit anderen HIV-Impfstoffen zu verabrei- chen. Es ist auch vorgesehen, unterschiedliche erfindungsgemäße Vektoren, die genetisch von verschiedenen Immunschwächeviren abgeleitet wurden, zu kombinieren und entweder gemeinsam oder nacheinander zu verabreichen. Es ist auch vorgesehen, Vektoren bei der Anwendung mit anderen bekannten und neu zu entwickelnden Adjuvanzien zu kombinieren.
Besonders zweckmäßig zur Vermehrung und Verabreichung des erfindungsgemäßen lentiviralen Vektors ist die Verpackung seines Genoms in Viren aus der Familie der Poxviren. Darunter sind beson- ders Vakziniavirus aus der Subfamilie der Orthopoxviren sowie Avi- poxviren einschließlich Geflügelpocken- und Kanarienpockenviren und andere Poxviren, deren Replikationsfähigkeit im menschlichen Organismus eingeschränkt ist, wie der Vakziniavirus-Stamm Modifiziertes Vakzinia-Virus Typ Ankara, MVA. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, in Poxviruskonstrukten die Gene, die für die Herstellung von lentiviralen Vektoren in der Zelle notwendig sind, an ein, zwei oder mehr unterschiedlichen Orten zu integrieren. Es ist insbesondere vorgesehen und vorteilhaft, cis-aktive Sequenzen zusammen mit dem Transgen von den Genen, die zur Komplementation in trans notwendig sind, zu trennen.
Weiter ist dabei vorgesehen, gleichzeitig auch mehrere genetisch unterschiedliche, jedoch analoge lentivirale Gene an einem oder mehreren Orten des Poxvirusgenoms zu integrieren, so dass die in Poxvirus-infizierten Zellen entstehenden Vektorpartikel Proteinkom- ponenten von verschiedenen Lentiviren der Gruppe „HIV-1 , HIV-2, SIV" enthalten. Insbesondere ist vorgesehen und vorteilhaft, zur Herstellung erfindungsgemäßer rekombinanter Poxviren mehrere HIV-Glykoproteingene in das Poxvirus zu integrieren. Zwei oder mehr Glykoproteingene können dabei entweder an einem einzigen Genlocus, insbesondere im Bereich des tk-Gens, oder an zwei oder mehr unterschiedlichen Genloci integriert werden. Dadurch werden in infizierten Zellen rekombinante lentivirale Vektoren gebildet, die die Glykoproteine von unterschiedlichen HIV-Stämmen tragen.
Es ist gleichermaßen vorgesehen, zwei oder mehr Kassetten für andere HIV-Struktur- und Regulatorgene sowie zwei oder mehr Kassetten enthaltend die cis-aktiven Elemente und unterschiedliche Transgene in das Poxvirusgenom zu integrieren. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten der Anzahl und Anordnung von Komponenten zur Produktion von lentiviralen Vektoren enthaltend HIV-Transgene und Glykoproteingene aus Immunschwächviren erzeugt werden. Das Einfügen von zusätzlichen genetisch andersartigen HIV-Genen hat den Vorteil, dass dem Im- munsystem gleichzeitig Proteine von mehreren unterschiedlichen Hl- Virusstämmen präsentiert werden und eine breite, kreuzreaktive Immunantwort erzielt werden kann. Es ist besonders bevorzugt, dass dabei auch gleichzeitig Genkomponenten von HIV-2 und SIV mit zu integrieren.
Es ist auch vorgesehen, dass Gene für immunregulatorische Proteine wie Zytokine, Chemokine, Antikörper, Hormone, Tetanus-, Diphtherie-, Cholera- oder ein anderes Toxoid in das Poxvirusgenom außerhalb oder innerhalb der Expressionskassetten für die Gene der lentiviralen Vektoren einzuführen, um damit bei der Vakzinierung eine Immunmodulation zu erzielen.
Poxviruskonstrukte werden bevorzugt einmalig aber auch mehrfach hintereinander verabreicht, wobei es bei einem bevorzugten Verfah- ren zunächst unerheblich ist, ob die Verabreichung im Abstand von Tagen oder Wochen oder erst von mehreren Jahren erfolgt. Es ist auch vorgesehen, mehrere Poxviruskonstrukte, die jeweils die Genome von lentiviralen Vektoren auf Basis von genetisch unterschied- liehen HIV-Stämmen besitzen, gleichzeitig oder in Folge zu verabreichen. Außerdem ist bevorzugt, rekombinante Poxviruskonstrukte in bestimmter zeitlicher Reihenfolge oder Lokalisation zusammen mit anderen Vakzinen gegen HIV auf der Basis von Substanzen aus der Gruppe „Protein-, Peptid-, Lipopeptid-, DNA-Vakzine, Pseudovirion, bakterieller und viraler Vektor" oder anderen, bisher noch unbekannten Impfstoff zu verabreichen. Poxviruskonstrukte werden bevorzugt auch mit immunregulatorischen Substanzen in bestimmter zeitlicher Reihenfolge oder Lokalisation zusammen verabreicht. Es ist auch bevorzugt, zwei oder mehrere Poxviruskonstrukte, die jeweils zumin- dest teilweise unterschiedliche lentivirale Genomsequenzen enthalten, gemeinsam oder nacheinander zu applizieren, um eine breite immunisierende Wirkung gegenüber einer Vielzahl von antigenen HIV-Varianten zu induzieren.
Die in Poxviren verpackten lentiviralen Vektoren enthaltend HIV- Transgene werden bevorzugt für ein Verfahren der Erzeugung einer Immunantwort über verschiedene Wege appliziert. So ist es möglich, die Poxviruskonstrukte intracutan, subcutan, transdermal, intramuskulär, intravenös, intraperitoneal oder auf Schleimhäute der Atemwege, der Verdauungsorgane einschließlich dem Darm oder der Ge- schlechtsorgane zu verabreichen.
Retrovirale Vektoren gelten als nur schwach immunogen (McCor- mack et al. (1997), "Anti-vector immunoglobulin induced by retroviral vectors" Hum Gene Ther 8(10): 1263-73). Es ist deshalb überra- sehend, dass im Mausmodell durch replikationsinkompetente lentivirale Vektoren enthaltend Syngag eine beachtliche humorale und zelluläre Immunantwort gegen das HIV-Gag-Protein, deren Ausmaß der anderer Immunisierungsverfahren entspricht oder sie sogar übertrifft sowie gleichzeitig eine neutralisierende Antikörperantwort gegen das Glykoprotein erzielt werden kann.
Darüber hinaus zeigt die Erfindung einen Weg auf, mit dem gleichzeitig mehrere elementare Schwierigkeiten bei der Erzeugung einer HIV-spezifischen Immunantwort gelöst werden. Dazu zählen die Möglichkeit einer Vakzinierung durch einen Impfstoff, der wie ein Lebendimpfstoff die Zellen, die natürliche Zielzellen der HIV-Infektion sind, infiziert, gleichzeitig jedoch eine hohe biologische Sicherheit besitzt. Die natürliche Expression der HIV-Glykoproteine an der Virusoberfläche ermöglicht die Induktion einer neutralisierenden Anti- körperantwort, gleichzeitig werden durch die Expression und intrazelluläre Prozessierung von Virusproteinen in infizierten Zellen zytotoxi- sche T-Lymphoyzten, denen eine entscheidende Bedeutung bei der HIV-Abwehr beigemessen wird, aktiviert. Die Integration des Transgens ermöglicht eine Weitergabe des Transgens bei der Zellteilung und damit eine Vermehrung des Antigens in vivo. Durch die Wahl geeigneter Promotoren ist kann die Expression von HIV-Protein aus transduzierten Zellen längere Zeit anhalten oder nach einer Latenzzeit zu einem erneuten Antigenkontakt „von innen" führen. Dadurch ist eine länger anhaltende HIV-spezifische Immunaktivierung im einmal immunisierten Organismus möglich.
Mit der Erfindung werden folgende weitere Vorteile gegenüber der Immunisierung mit anderen Verfahren erhalten. Durch die Immunisierung mit Vektoren werden Partikel verabreicht, die in ihrer Größe und Form sowie der Proteinzusammensetzung und Glykoprotei- nexpression dem pathogenen Ausgangsvirus ähneln, wobei die natürliche Infektion in optimaler Weise nachgeahmt wird. Ein Vorteil von lentiviralen Vektoren, die die Glykoproteine von HIV oder SIV tragen ist, dass Dendritische Zellen diese Vektoren zu den Organen des Immunsystems transportieren können. Bei der natürlichen Infektion ist die Bindung von HIV über sein Glykoprotein gp120 an Dendritische Zellen und der Transport durch diese Zellen zu den lymphatischen Organen, wo das Virus auf die eigentlichen Zielzellen, die Makrophagen und die CD4+ T-Lymphozyten, trifft und diese infiziert, ein wichtiges pathogenetisches Element der HIV-Infektion. Dieser pathogenetische Prozess kann durch erfindungsgemäße Vektoren nachvollzogen werden.
Die Infektion über das CD4-Molekül ermöglicht auch die Infektion von solchen Zellen, die weil sie viele Jahre leben als Reservoir einer HIV-Infektion betrachtet werden (Finzi et al. (1997), "Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy" Science 278(5341):1295-300). Dadurch kann möglicherweise eine langanhaltende Immunaktivierung erzielt werden.
Anders als bei der Immunisierung mit Totimpfstoff enthalten die Vektor-Partikel für ein erfindungsgemäßes Verfahren HIV- oder SIV- Glykoproteine in ihrer natürlichen Konfiguration. Dies begünstigt die Bildung neutralisierender Antikörper.
Ein besonderer Vorteil durch die Verwendung von erfindungsgemä- ßen lentiviralen Vektoren gegenüber Vektoren auf Basis von Oncoretroviren ist, dass damit eine Immunantwort gegen Nicht- Immunschwächeviren, die eine Auffrischimpfung blockieren würde, nicht erzeugt wird. Im Gegensatz zu anderen viralen Vektoren einschließlich oncoretroviraler Vektoren, die HIV-Gene enthalten, ist eine mehrfache Verabreichung der erfindungsgemäßen lentiviralen Vektoren sinnvoll, denn sie verstärkt die Immunantwort gegen die Virus-Glykoproteine.
Bei dem Verfahren zur Immunisierung unter Verwendung von re- kombinanten Poxviren enthaltend Gene lentiviraler Vektoren kommt es zu einer Reihe weiterer wesentlicher Vorteile: Poxviruskonstrukte sind physikalisch-chemisch wesentlich stabiler als die Immunschwä- cheviren und lentivirale Vektoren. Sie lassen sich deshalb zu höheren Titern konzentrieren und widerstehen Einfrier- und Auftauvorgänge wesentlich besser. Sie sind deshalb weniger empfindlich gegenüber Unterbrechungen der Kühlkette, einem kritischen Punkt bei der Anwendung von Impfstoffen, insbesondere in heißen und ärme- ren Ländern.
Die Verabreichung von rekombinanten Poxviren führt im Körper zunächst zu einer umfangreichen Vermehrung der Poxviruskonstrukte über mehrere Tage. Da das lentivirale Genom stabil in den Pockenviren verpackt ist, kommt es gleichzeitig zu einer massiven Produkti- on von Vektorpartikeln, die ihrerseits CD4+ Zellen infizieren und transduzieren, wobei das Transgen exprimiert wird. Dadurch wird durch die Verabreichung rekombinanter Poxviruskonstrukte eine drastische Steigerung der Vektorzahl und eine Potenzierung der Antigenmenge in vivo erzielt. Bei diesem Verfahren wird mit nur einer einzigen Immunisierung dem Immunsystem auf dreieriei Weise HIV- Antigen dargeboten: 1. Zunächst präsentieren die rekombinanten Poxviren lentivirale Glykoproteine, so dass die Poxviruspartikel selbst bereits eine neutralisierende Antikörperantwort hervorrufen. 2. Es werden in infizierten Zellen HlV-Vektorpartikel produziert, zur erweiterten Aktivierung einer Immunantwort gegen Vektor- Strukturbestandteile. 3. In infizierten Zellen wird das Transgen exprimiert, prozessiert und ermöglicht so insbesondere die Aktivie- rung zytotoxischer T-Lymphozyten.
Es ist weiterhin besonders vorteilhaft, dass durch und in rekombinanten Poxviren Antigene von mehreren genetisch unterschiedlichen HIV-Stämmen gleichzeitig verabreicht werden können. Dadurch ist das Verfahren geeignet, mit einem einzigen Impfstoff und einer ein- zigen Verabreichungsdosis eine kräftige, breit angelegte, kreureakti- ve Immunantwort zu erzeugen. Es ist damit besonders geeignet, die Anzahl der notwendigen Immunisierungen und die benötigte Impfstoffmenge zu reduzieren.
Bevorzugt ist ein Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort ge- gen Proteine des Humanen Immunschwächevirus (HIV), dadurch gekennzeichnet, dass ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virusvektor appliziert wird, der ein oder mehrere HIV-Gene als Transgen enthält, wobei optional das Transgen Komponenten von zwei oder mehr unterschiedlichen HIV-Stämmen enthält. Bevorzugt ent- hält der Virusvektor Glykoproteine eines Lentivirus aus der Gruppe „HIV-1 , HIV-2, SIV". Bevorzugt enthält der Virusvektor weitere Gene zur Expression von immunregulatorischen Substanzen.
Bevorzugt wird ein Poxvirus enthaltend die Genombestandteile eines replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektors, der ein oder mehrere HIV-Gene als Transgen enthält, verabreicht, wobei optional das Transgen Komponenten von zwei oder mehr unterschiedlichen HIV-Stämmen enthält. Bevorzugt enthält das Poxvirusgenom zusätz- lieh zu allen für die Erzeugung eines lentiviralen Vektors notwendigen Genen eine oder mehrere weitere Kopien von Genen aus der Gruppe „gag, pol, env, tat, rev, vif, vpu, vpr, nef" aus genetisch unterschiedlichen Virusstämmen der Gruppe „HIV-1 , HIV-2, SIV" unter transkriptioneller Kontrolle eines im Zytoplasma aktiven Promotors enthält.
Bevorzugt wird ein Orthopoxvirus, besonders bevorzugt ein Vakziniavirus, enthaltend Genombestandteile replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren appliziert. Weiter bevorzugt wird ein in huma- nen Zellen replikationsinkompetentes Poxvirus enthaltend Genombestandteile replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren appliziert. Weiter bevorzugt wird ein Avipoxvirus enthaltend Genombestandteile replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren appliziert.
Bevorzugt sind zusätzlich Gensequenzen für immunregulatorische Proteine im lentiviralen Vektor enthalten. Auch bevorzugt sind zusätzlich Gensequenzen für immunregulatorische Proteine im Poxvi- rus-Vektor enthalten. Bevorzugt werden zusätzlich zum rekombinanten Poxvirusvektor immunregulatorische Substanzen appliziert. Be- vorzugt wird der rekombinante Poxvirusvektor einem Individuum mehrmals verabreicht wird. Bevorzugt wird der rekombinante Pox- vektor in Zusammenhang hinsichtlich zeitlicher Reihenfolge oder Lokalisation mit der Applikation eines weiteren Immunogens aus der Gruppe „Protein-, Peptid-, Lipopetid-, DNA-Plasmid-Impfstoff, Viraler und Bakterieller rekombinanter Vektor-Impfstoff, Pseudovirion" oder einem anderen zukünftig noch zu entwickelnden Impfstoff prinzip kombiniert verabreicht. Weiter bevorzugt werden zwei oder mehr verschiedene rekombinante Poxviren, die Vektoren enthalten, welche auf genetischer Basis von unterschiedlichen HIV-Stämmen hergestellt wurden, verabreicht.
Bevorzugt ist auch ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virus- vektor, der dadurch gekennzeichnet ist, dass der Vektor von einem Virus der Gruppe „HIV-1 , HIV-2, SIV" abgeleitet ist. Bevorzugt enthält er ein oder mehrere HIV-Gene als Transgen, wobei optional das Transgen Komponenten von zwei oder mehr unterschiedlichen HIV- Stämmen enthält. Besonders bevorzugt enthält er Glykoproteine ei- nes Lentivirus aus der Gruppe „HIV-1 , HIV-2, SIV". Bevorzugt ruft der lentivirale, replikationsinkompetente Virusvektor eine Immunantwort gegen HlV-Strukturbestandteile hervor. Bevorzugt ist der lentivirale, replikationsinkompetente Virusvektor dadurch gekennzeichnet, dass das Transgen eine kodonoptimierte Nukleinsäuresequenz be- sitzt. Bevorzugt ist der lentivirale, replikationsinkompetente Virusvektor dadurch gekennzeichnet, dass er ein selbst-inaktivierender Vektor ist. Bevorzugt ist er auch dadurch gekennzeichnet, dass er weitere Gene zur Immunstimulation einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zytokine, Hormone, Antikörper, Bakterientoxin unter transkripti- oneller Kontrolle eines eukaryoten Promotors enthält.
Bevorzugt ist der lentivirale, replikationsinkompetente Virusvektor dadurch gekennzeichnet, dass die Genom-Bestandteile des Vektors in einem Poxvirus verpackt sind. Bevorzugt ist auch ein Poxvirus, worin Genombestandteile von zwei oder mehr replikationsinkompe- tenten lentiviralen Virusvektoren enthalten sind, wobei die Genomteile der lentiviralen Vektoren von zwei oder mehr unterschiedlichen HIV-Stämmen abgeleitet ist. Bevorzugt sind im Poxvirusgenom Genombestandteile von einem replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektor und zusätzlich Gene von einem, zwei oder mehr unterschiedlichen HIV-Stämmen enthalten. Bevorzugt sind Bestandteile des Vektors in einem Orthopoxvirus, insbesondere in einem Vakziniavirus, verpackt. Bevorzugt sind Bestandteile des Vektors in einem in humanen Zellen replikationsinkompetenten Poxvirus verpackt. Bevorzugt sind Bestandteile des Vektors in einem Avipoxvirus verpackt. Bevorzugt sind cis-aktive Regionen zusammen mit dem Transgen sowie die trans-aktiven Strukturgene am gleichen Ort des Poxvirus- genoms integriert. Auch bevorzugt sind cis-aktive Regionen zusam- men mit dem Transgen und die trans-aktiven Strukturgene an getrennten Orten des Poxvirusgenoms integriert.
Bevorzugt sind Bestandteile mehrerer Vektorgenome auf Basis unterschiedlicher HIV-Stämme gleichzeitig im Poxvirusgenom verpackt. Bevorzugt sind zwei oder mehr Glykoproteingene von genetisch ver- schiedenen HIV-Stämmen gleichzeitig im Poxvirusgenom verpackt.
Bevorzugt wird der Virusvektor intracutan, subcutan, intramuskulär, transdermal, intravenös, intraperitoneal, oder auf Schleimhäute appliziert. Bevorzugt wird der Virusvektor nur einmal appliziert. Auch bevorzugt wird der Virusvektor mehr als einmal appliziert. Bevorzugt wird der Virusvektor in Zusammenhang hinsichtlich zeitlicher Reihenfolge oder Lokalisation mit der Applikation eines weiteren Immunogens aus der Gruppe „Protein-, Peptid-, Lipopetid-, DNA-Plasmid- Impfstoff, Viraler und Bakterieller rekombinanter Vektor-Impfstoff, Pseudovirion" oder einem anderen zukünftig noch zu entwickelnden Impfstoffprinzip kombiniert verabreicht. Bevorzugt werden zwei oder mehr verschiedene rekombinante Poxviren, die Vektoren enthalten, welche zumindest teilweise auf genetischer Basis von unterschiedlichen HIV-Stämmen hergestellt wurden, verabreicht. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektor, der zur Erzeugung einer Immunantwort gegen Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV) geeignet ist. Erfindungsgemäß ist der replikationsinkompetente lentivirale Vi- rusvektor abgeleitet von mindestens einem Stamm, das heißt „strain", der Gruppe der Viren bestehend aus HIV-1 , HIV-2 und SIV. Der erfindungsgemäße replikationsinkompetente lentivirale Virusvektor enthält im Genom, insbesondere als mindestens ein Transgen, ein erstes Lentivirusgen einer Gengruppe, welches aus einem ersten Stamm, das heißt „strain", der Gruppe der Viren bestehend aus HIV- 1 , HIV-2 und SIV abgeleitet ist, und ein zweites oder weiteres Lentivirusgen, insbesondere der gleichen Gengruppe, welches aus einem zweiten oder weiteren Stamm, das heißt „strain", der Gruppe der Viren bestehend aus HIV-1 , HIV-2 und SIV, der von dem ersten Stamm genetisch verschiedenen ist, das heißt insbesondere ein anderer Stamm ist, abgeleitet ist
In einer bevorzugten Ausführungsform des Virusvektors kodiert das Lentivirusgen, insbesondere das mindestens eine Transgen, ein Glykoprotein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Virusvektors ist das Lentivirusgen, insbesondere das mindestens eine Transgen, ein Gen der Gruppe der Gene bestehend aus gag, pol und nef. Besonders bevorzugt sind erstes und zweites und weiteres Lentivirusgen Gene der gleichen Gengruppe, vorzugsweise der Gengruppe bestehend aus gag, pol und nef.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der lentivirale Vektor ein selbst-inaktivierender Vektor. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Virusvektors steht das Transgen unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryoten nuklear aktiven Promotors. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor der SFFV-Promotor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Virusvektors enthält das Genom, insbesondere das Transgen, mindestens ein weiteres Gen zur Expression mindestens einer immunregulatori- schen Substanz. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert das mindestens eine weitere Gen ein Zytokin, Hormon, Anti- körper oder Bakterientoxin unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryoten nuklear aktiven Promotors.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Virusvektor, insbesondere abgeleitet von einem Lentivirusstamm aus der Gruppe der Viren bestehend aus HIV-1 , HIV-2 und SIV, der im Ge- nom mindestens eine Kopie einer kodonoptimierten Nukleinsäurese- quenz, insbesondere dargestellt in SEQ ID NO. 1 , nämlich die syn- gag-Sequenz, enthält.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Poxvirusvektor, der insbesondere zur Erzeugung einer Im- munantwort gegen Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV), bevorzugt zur Immunisierung und/oder Immuntherapie, geeignet ist. Der erfindungsgemäße rekombinante Poxvirusvektor ist abgeleitet aus einem Poxvirus. Der erfindungsgemäße rekombinante Poxvirusvektor enthält im Genom (a) erste Genombestandteile eines lentiviralen Virusvektors zur Expression lentiviraler Virusvektoren, enthaltend (i) mindestens eine erste lentivirale Expressionskassette, (ii) mindestens ein erstes env-Gen und (iii) mindestens ein erstes gag-Gen, insbesondere in Verbindung mit einem pol-Gen, bevorzugt gag- und pol-Gene, wobei die ersten Genombestandteile jeweils abgeleitet sind von einem ersten Stamm („strain") der Gruppe der Viren HIV-1 , HIV-2 oder SIV, und; (b) mindestens einen weiteren, insbe- sondere von den ersten Genombestandteilen genetisch verschiedenen, Genombestandteil, der aus einem zweiten Stamm („strain") der Gruppe der Viren HIV-1 , HIV-2 oder SIV abgeleitet ist und mindestens ersten Genombestandteilen (i) bis (iii) entspricht oder darin enthalten ist, mit der Maßgabe, dass der zweite oder weitere Stamm der Gruppe der Viren HIV-1, HIV-2 oder SIV vom ersten Stamm der Gruppe der Viren HIV-1 , HIV-2 oder SIV genetisch verschieden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der mindestens eine weitere Genombestandteil ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einer zweiten oder weiteren lentiviralen Expressionskassette, welche aus dem zweiten Stamm der Viren HIV-1 , HIV-2 oder SIV abgeleitet ist, (b) einem Transgen mit einem ersten Lentivirusgen einer Gengruppe abgeleitet aus dem ersten Stamm und einem zweiten oder weiteren davon genetisch verschiedenen Lentivirusgen der gleichen Gengruppe, also bevorzugt ein entsprechendes ein Gly- koprotein kodierendes Gen, gag-Gen, pol-Gen oder nef-Gen, das aus dem zweiten Stamm abgeleitet ist, (c) einem zweiten oder weiteren env-Gen aus dem zweiten Stamm, (d) einem zweiten oder weiteren gag-Gen aus dem zweiten Stamm, insbesondere in Verbindung mit dem ersten pol-Gen oder einem weiteren pol-Gen aus dem zwei- ten Stamm.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Transgen als der mindestens eine weitere Genombestandteil in der ersten lentiviralen Expressionskassette lokalisiert. In einer weiteren bevorzugten Ausfüh- rungsform ist das Transgen als der mindestens eine weitere Genombestandteil in der zweiten oder weiteren lentiviralen Expressionskassette lokalisiert.
Erfindungsgemäß enthält der Poxvirusvektor also Genombestandtei- le aus mindestens einem lentiviralen Virusvektor, die die Expression von infektiösen Partikeln wie lentivirale Virusvektoren erlauben, wobei mindestens ein Genombestandteil, insbesondere Gen, bevorzugt gag- und env- Gen beziehungsweise ein Gen kodierend ein oder mehrere Glykoproteine, mindestens zweifach enthalten ist, wobei die erste Kopie des Gens von einem ersten Stamm der Gruppe der Viren HIV-1 , HIV-2 oder SIV abgeleitet ist und die zweite und/oder weitere Kopie von einem zweiten oder weiteren Stamm der Gruppe der Viren HIV-1 , HIV-2 oder SIV abgeleitet ist, wobei der zweite oder weitere Stamm vom ersten Stamm genetisch verschiedenen ist.
Bevorzugt sind zwei oder mehr gag-pol-Gene von genetisch verschiedenen HIV-Stämmen gleichzeitig im Poxvirusgenom verpackt. Bevorzugt ist für die Erzeugung eines lentiviralen Vektors enthaltend ein exprimierbares Transgen sind in dem rekombinanten Poxvirusvektor verpackt: Mindestens eine lentivirale Expressionskassette (A) enthaltend mindestens eine 5'-LTR, mindestens eine Verpackungssequenz, mindestens einen nuklear aktiven eukaryoten Promotor, das Transgen oder mehrere dieser Transgene, mindestens eine 31- LTR, wobei die LTR-Regionen bevorzugt zumindest Integrationsstellen zur Integration ins Wirtszellgenom, mindestens ein Transkripti- onsstartsignal, vorzugsweise TATA-Box, und mindestens eine Primer-Bindungsstelle (zum Start der Reversen Transkription) enthalten. Diese Kassette steht unter Kontrolle mindestens eines zy- toplasmatisch aktiven Promotors, beispielsweise eines Poxviruspro- motors, insbesondere eines frühen Poxviruspromotors; und (B) Gene für die Strukturproteine gag und env und mindestens ein pol-Gen, das die für die Replikation notwendigen Enzyme kodiert, wobei diese Gene bevorzugt unter Kontrolle zytoplasmatisch aktiver Promotoren stehen. Vorzugsweise liegen diese Gene in Form von gag-pol- Genkassetten und env-Genkassetten, insbesondere besitzen die gag-pol-Genkassette und die env-Genkassette jeweils einen eigenen zytoplasmatisch aktiven Promotor. Gag-pol kann mit einem gemeinsamen Promotor oder getrennt als gag und pol-Gene mit eigenen Promotoren versehen sein. Besonders bevorzugt liegt das gag-pol- Leseraster zusammen mit der lentiviralen Expressionskassette (A) zwischen den 5'-LTR und 3'-LTR und verwendet bevorzugt den gleichen Promotor (Figur 6). Es kann jedoch auch an einer anderen Stelle in das Poxvirusgenom integriert sein (Figur 7). Weiterhin be- vorzugt liegt das env-Gen zusammen mit seinem zytoplasmatisch aktiven Promotor außerhalb der lentiviralen Expressionskassette (A). Die verpackte mindestens eine lentivirale Expressionskassette (A) enthält, bevorzugt als mindestens ein Transgen, ein oder mehrere lentivirale Gene, insbesondere HIV-Gene. Besonders bevorzugt ist ein Transgen ein Teil mindestens eines gag-Gens, bei dem bevorzugt zusätzlich der Codon-Gebrauch geändert wurde. In einer weiteren bevorzugten Variante ist ein Transgen von einem gag-pol-Gen, einem gag-pol-nef-Gen, einem env-Gen und/oder eine andere Kombination von lentiviralen Genen, insbesondere HIV-Genen abgeleitet, gegen die bevorzugt eine Immunantwort erzeugt werden soll.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind in das Genom des Poxvirusvektors alle Genkassetten mehrfach eingebaut. So sind vorzugsweise zwei oder mehr lentivirale Expressionskassetten, zwei oder mehr env-Gene, und/oder zwei oder mehr gag-pol- Genkassetten eingebaut. Durch die Verwendung mehrerer Gen- Kassetten (einer Art), wobei jeweils die zwei oder mehr Transgene, die zwei oder mehr gag-pol-Gene und die zwei oder mehr env-Gene aus unterschiedlichen Virusstämmen stammen, werden in den Pox- virus-infizierten Zellen eine Vielzahl unterschiedlicher lentiviraler, infektiöser vermehrungsunfähiger Vektoren gebildet. Besonders bevorzugt ist, dass mehrere Genkassetten für das env-Gen, das auch in der Natur besonders variabel ist, eingebaut sind. Der so erfindungsgemäß bereitgestellte "Schwärm" ähnlicher Vektoren enthält besonders vorteilhaft sehr viel mehr immunogene Epitope als ein Vektor gebildet aus einem einzelnen Virusstamm und erzeugt dadurch eine breiter angelegte Immunantwort.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Poxvirusvektor Genombestandteile von mindestens zwei genetisch verschiedenen lentiviralen Virusvektoren, abgeleitet von jeweils einem anderen genetisch verschiedenen Virusstamm von HIV-1 , HIV-2 oder SIV.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erste und/oder zweite oder weitere lentivirale Expressionskassette die gag- und pol- Gene als gag-pol-Leseraster.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt das erste env- Gen, insbesondere zusammen mit einem zytoplasmatisch aktiven Promotor, dass außerhalb der ersten und/oder zweiten oder weiteren lentiviralen Expressionskassette vor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stehen die im Ge- nom des Poxvirusvektors enthaltenen Genombestandteile des lentiviralen Virusvektors unter transkriptioneller Kontrolle eines im Zytoplasma aktiven Promotors. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind im Genom des Poxvirusvektors in der ersten und/oder zweiten oder weiteren lentiviralen Expressionskassette mindestens ein cis-aktiver Bereich eines lentiviralen Virusvektors zusammen mit mindestens einem Transgen des lentiviralen Virusvektors und mindestens einem trans-aktiven gag- und/oder env-Gen am gleichen Ort im Genom des Poxvirus integriert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind im Genom des Poxvirusvektors in der ersten und/oder zweiten oder weiteren lentiviralen Expressionskassette mindestens ein cis-aktiver Be- reich eines lentiviralen Virusvektors zusammen mit mindestens einem Transgen des lentiviralen Virusvektors und mindestens einem trans-aktiven gag- und/oder env-Gen an getrennten Orten im Genom des Poxvirus integriert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Poxvirusvektors ist das Poxvirus, von dem der Poxvirusvektor abgeleitetet ist, ausgewählt aus der Gruppe der Poxviren bestehend aus Orthopoxviren, insbesondere Vakziniaviren, und Avipoxviren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist im Genom des Poxvirusvektors mindestens ein Gen kodierend für ein immunregula- torisches Protein enthalten. Das immunregulatorische Gen liegt bevorzugt als Transgen vor und/oder separat im Poxvirusgenom. Als Transgen ist es vorzugsweise entweder innerhalb einer einzelnen lentiviralen Expressionskassette zusammen mit dem Transgen, das für ein oder mehrere lentivirale Gene, insbesondere HIV-Gene, ko- diert, integriert, wobei das immunregulatorische Gen einen eigenen nuklear aktiven Promotor besitzt, oder es liegt als Transgen in einer eigenen lentiviralen Expressionskassette vor, wenn zumindest eine weitere lentivirale Expresssionskassette enthaltend ein oder mehrere HIV-Gene im Poxvirusgenom integriert ist. Liegt das immunregulatorische Gen nicht als Transgen sondern im Poxvirusgenom separat integriert vor, so erhält es bevorzugt einen eigenen zytoplasmatisch aktiven Promotor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Poxvirusvektors ist dieser dadurch gekennzeichnet, dass in dem Genombestandteil aus dem lentiviralen Virusvektor mindestens ein Gen kodierend mindestens ein immunregulatorisches Protein enthalten ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektors zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV) sowie zur Herstellung eines Arzneimittelkits zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).
In diesem Zusammenhang wird unter Immuntherapie ein therapeutisches Verfahren verstanden, bei der ein Krankheitszustand durch ein immunologisches Verfahren behandelt wird. In diesem Zusammenhang wird unter Immunisierung ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Verfahren, insbesondere Impfung, verstanden, bei der im tierischen oder menschlichen Organismus, insbesondere dem Körper (in vivo), aber auch in Gewebe und Zellkulturen (in vitro), eine Immunantwort hervorgerufen wird, damit es bei einem späteren Kontakt mit dem Krankheitserreger nicht zu einer Erkrankung kommt. Die erfindungsgemäß bereitgestellten Konstrukte sind bevorzugt für beides geeignet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines Poxvirusvektors, enthaltend im Genom mindes- tens zwei genetisch verschiedene Lentivirusgene aus jeweils einem anderen Virusstamm aus HIV-1 , HIV-2 oder SIV zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV) sowie zur Herstellung eines Arzneimittelkits zur Immunthe- rapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines Poxvirusvektors, enthaltend im Genom genetische Strukturen zur Bildung infektiöser replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren, welche in mindestens einem Transgen mindestens ein Lentivirusgen aus Stämmen ausgewählt aus der Gruppe der Viren bestehend aus HIV-1 , HIV-2 oder SIV aufweisen, zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV) sowie zur Herstellung eines Arzneimit- telkits zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines Poxvirusvektors zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV) so- wie zur Herstellung eines Arzneimittelkits zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV)
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung enthaltend mindes- tens einen replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektor.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung enthaltend mindes- tens einen Poxvirusvektor. In einer bevorzugten Variante enthält das Kit zusätzlich immunregulatorische Substanzen. In einer weiteren bevorzugten Variante enthält das Kit mindestens ein weiteres Immunogen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein-, Peptid-, Lipopetid-, DNA-Plasmid-Impfstoffen, Impfstoffen viraler und bakterieller rekombinanter Vektoren und Pseudovirionen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV) im tierischen oder menschli- chen Organismus, das die Schritte des Bereitsteilens des replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektors (Schritt a), der Applikation, das heißt Verabreichen, insbesondere Impfen, des replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektors in den tierischen oder menschlichen Organismus, insbesondere den Körper (in vivo), aber auch in Gewebe und Zellkulturen (in vitro) (Schritt b), und der Induktion, das heißt Erzeugen, einer Immunantwort, insbesondere Immunisierung, gegen Proteine des HIV im tierischen oder menschlichen Organismus (Schritt c) enthält, insbesondere daraus besteht.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV) im tierischen oder menschlichen Organismus, das die Schritte des Bereitsteilens des rekombinanten Poxvirusvektors (Schritt a), der Applikation, das heißt Verabreichen, insbesondere Impfen, des Poxvirusvektors in den tieri- sehen oder menschlichen Organismus, insbesondere den Körper (in vivo), aber auch in Gewebe und Zellkulturen (in vitro) (Schritt b) und der Induktion einer Immunantwort, insbesondere Immunisierung, gegen Proteine des HIV im tierischen oder menschlichen Organismus (Schritt c) enthält, insbesondere daraus besteht.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird die Applikation des Virusvektors in den tierischen oder menschlichen Organismus (Schritt b) einmal durchgeführt. In einer weiteren bevorzugten Variante wird der Virusvektor in den tierischen oder menschlichen Organismus (Schritt b) mehrfach wiederholt appliziert, das heißt verabreicht, insbesondere geimpft.
In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden in Schritt b) zusätzlich mindestens eine immunregulatorische Substanz appliziert, das heißt verabreicht, insbesondere geimpft.
In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens wird in Schritt b) zusammen mit dem Virusvektor am gleichen Ort, insbesondere am gleichen Applikationsort, insbesondere gleichzeitig oder zu einem späteren Zeitpunkt, und/oder gleichzeitig und bevorzugt an einem anderen Applikationsort, mindestens ein weiteres Immunogen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Protein Impfstoffen, Peptid- Impfstoffen, Lidopeptid-Impfstoffen, DNA-Plasmid-Impfstoffen, Impfstoffen virale rekombinante Vektor-Impfstoffen, bakterieller rekombi- nanter Vektor-Impfstoffen und Pseudovirionen, appliziert, das heißt verabreicht, insbesondere geimpft.
In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens erfolgt die Applikation in Schritt b) auf die Schleimhaut, intracutan, subcutan, transdermal, intranasal, intramusculär, intraperitoneal und/oder intra- venös, ohne oder zusammen mit Adjuvans. In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden in Schritt a) mindestens zwei genetisch verschiedene rekombinante Poxviren nach einem der Ansprüche 9 bis 17 bereitgestellt werden, wobei die verschiedenen Poxviren jeweils Genombestandteile von mindestens zwei verschiedenen lentiviralen Virusvektoren, abgeleitet von jeweils einem anderen Lentivirusstamm aus der Gruppe bestehend aus HIV-1 , HIV-2 und SIV, enthalten, und in Schritt b) die mindestens zwei genetisch verschiedenen Poxviren appliziert.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind auch die Ver- fahren zur Herstellung der Virusvektoren, insbesondere des replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektors und des rekombinanten Poxvirusvektors.
Schließlich sind Gegenstände der vorliegenden Erfindung auch Antikörper, monoklonale sowie polykonale, gerichtet gegen den replikati- onsinkompetenten lentiviralen Virusvektor und/oder den rekombinanten Poxvirusvektors, insbesondere spezifisch bindend an Epitope der Proteine oder Strukturen der Vektoren und/oder von den Vektoren und/oder den damit infizierten Wirtszellen gebildeten Proteine oder Strukturen.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von nicht beschränkenden Ausführungsbeispielen und Figuren näher erläutert.
Es zeigen
Figur 1 : Plasmid pGJ2syngag zur Herstellung eines Vektors für ein erfindungsgemäßes Verfahren Figur 2: Plasmid pSFsyngag als HIV-gag-Expressionsplasmid zur Impfung in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Vektorkonstrukt
Figur 3: Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Antwort in Balb/c- Mäusen nach Impfung mit einer Kombinationsimpfung aus
DNA-Vakzine pSFsyngag und lentiviralem Vektor pGJ2syngag enthaltend das Syngag-Protein.
Figur 4: HIV-Gag/p55-spezifische humorale Immunantwort in Balb/c-Mäusen nach Impfung mit einer Kombinationsimp- fung aus DNA-Vakzine pSFsyngag und lentiviralem Vektor pGJ2syngag enthaltend das Syngag-Protein.
Figur 5: Plasmid pEnv(Lig) zur Herstellung eines Vektors für ein erfindungsgemäßes Verfahren enthaltend die Glykoproteine von HIV-1.
Figur 6: Konstruktion eines rekombinanten Vakzinia-Virus (Stamm Copenhagen) enthaltend die Gensequenzen eines lentiviralen, replikationsinkompetenten Vektors auf Basis von pGJ2syngag und der HIV-1 -Glykoproteine.
Figur 7: Konstruktion eines rekombinanten Vakzinia-Virus enthal- tend die cis-aktiven Elemente sowie das Transgen eines lentiviralen Vektors auf Basis von pVeksyngag sowie die HIV-Gene gag-pol und env unter transkriptioneller Kontrolle von Vakziniavirus-Promotoren eingefügt in unterschiedliche Genorte des Vakzinia-Virusgenoms. Das Sequenzprotokoll enthält:
SEQ ID NO. 1 Die Nukleotidsequenz von „syngag", einem synthetisch hergestellten Gen, dessen Gensequenz für die HIV-Gag-Proteine p17 und p24 kodiert;
SEQ ID NO. 2 Die Nukleotidsequenz des immunstimulatori- schen CpG-Oligodinukleotids (CpG-ODN).
Beispiel 1 : Immunisierung mit einem HIV-1 -Vektor enthaltend humanisiertes, synonymes gag/p39 (syngag)
A) Aus dem Plasmid pczHSRV2 (Moebes et al., J. Virol. 1997; 71 :7305-7311) wurde das Foamyvirus-Genom und der 3'-Teil des CMV-Promotors durch Restriktionsverdau mit Pmel und Ndel entfernt. Das HIV-1 -Plasmid pHXB2D (Gen-Bank Nr. K03455 M38432) wurde mit BssHIl und Aflll sowie mit Afllll und Xbal verdaut. Der 3'- Teil des CMV-Promotors und der 5'-Teil der R-Region aus dem HIV- LTR wurden mit Hilfe der rekombinanten PCR rekonstruiert. Die BssHII/Afllll und Afllll/Xbal-Fragmente aus pHXB2D, das rekonstruierte CMV-Promotor/HIV-R-Konstrukt, verdaut mit BssHIl und Ndel, und das Ndel/Pmel-Fragment des Plasmids pczHSRV2 wurden miteinander ligiert. Durch rekombinante PCR wurden die zellulä- ren Restsequenzen aus pHXB2D entfernt. Durch Verdau mit Pvull und EcoRV wurde eine Deletion in der 3'-U-Region vorgenommen, wodurch die TATA-Box entfernt wurde. Durch Verdau mit Bpu 11021 und Asp7l8 wurde das nef-Gen teilweise entfernt. Dadurch wurde das Konstrukt pGJ2 erhalten. Anschließend wurde das syngag-Gen zusammen mit dem Spleen Focus-Forming Virus (SFFV)-Promotor in den Bereich der Esp3l-Schnittstelle in pGJ2 hineinligiert. Syngag, dargestellt in SEQ ID No. 1 , ist ein synthetisch hergestelltes Gen, dessen Gensequenz für die HIV-Gag-Proteine p17 und p24 kodiert. Dadurch wurde das Plasmid pGJ2syngag erhalten, wozu auf Figur 1 hingewiesen wird.
A) pczVSV-G wurde hergestellt gemäß der Literaturstelle (Pietschmann et al (2000), „Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export" J. Virol.73: 2613-2621).
B) Die Plasmide pGJ2syngag und pczVSV-G wurden durch die CaCI2-Methode (Soneoka et al. Nucl. Acids Research 1995. Vol. 23. No.4. 628-633) in 293T-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden für 8 h bei 37°C inkubiert, das Medium gewechselt und für weitere 16 h inkubiert. Anschließend wurde mit Natrium-Butyrat die Transkription der Vektor-DNA induziert, nach 8h das Natrium-Butyrat-haltige Medium entfernt und die Zellen für weitere 16 h in frischem Medium in- kubiert. Dazu wurde zu diesem Zeitpunkt Medium verwendet, das frei von fötalem Rinderserum (FCS) ist. Dabei entstehen replikationsinkompetente Virus-Vektoren, die aus dem Zellkulturüberstand isoliert und durch Ultrazentrifugation (45 000 g, 150 min., 4° C) konzentriert wurden.
C) Die Expression des Transgens wurde getestet indem zu HEK 293-Zellen Zellkulturüberstand enthaltend die replikationsinkompetenten Virusvektoren gegeben und die Zellen für 48 - 72 Stunden bei 37° C inkubiert wurden. Anschließend wurden die Zellen lysiert und das Lysat durch Western-Blot-Test analysiert. Dabei wurde ein HIV-Gag/p24-spezifischer monoklonaler Antikörper zum Protein- Nachweis eingesetzt. Die Untersuchung zeigt die Expression eines Gag-Proteins in transduzierten Zellen mit einem Molekulargewicht von etwa 39 kD.
D) Die Vektoren wurden direkt vor der Applikation mit 10 mg im- munstimulatorischen CpG-Oligodinukleotiden (CpG-ODN) mit der Nukleinsäuresequenz 5!-TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT-3', dargestellt in SEQ ID NO. 2, gemischt. Für die Austestung der Immuno- genität wurde Mäusen (Mus musculus) des Inzuchtstamms Balb/c 5 x 106 infektiöse Einheiten der Vektoren enthaltend die CpG-ODN (SEQ ID NO. 2) intraperitoneal injiziert. Die Immunisierung wurde nach 2 Wochen wiederholt. Weitere 12 Tage später wurden die Mäuse getötet, Blut entnommen und die humorale Immunantwort gegen Vektorbestandteile untersucht. Es wurden fünf Tiere immunisiert.
E) Die Gag-spezifische Antikörperantwort wurde durch Enzyme- linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt. Dabei wurde eine
Mikrotiterplatte mit in E. coli hergestelltem HIV-1 Gag/p55-Protein (2,5 mg/ml) beschichtet. Anschließend wurde Serum aus immunisierten Mäusen gewonnen und in einer Verdünnungsreihe auf die Platte pipettiert. Daraufhin wurde ein Detektionsantiserum (Kaninchen-anti- Maus-IgG), das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, zugegeben sowie anschließend Substrat. Die Extinktion bei 450 nm wurde photometrisch bestimmt und der Titer an Gag/p55-spezifischen Antikörpern wurde ermittelt als das Reziprok der Serumverdünnung, deren Extinktion größer war als die Extinktion von Kontrollserum nicht immunisierter Tiere. Diese Untersuchung zeigt die Induktion einer Gag-spezifischen Antikörperantwort im Blut von Mäusen, die mit dem Vektor pGJ2-syngag geimpft wurden, wozu auf Tabelle 1 hingewiesen wird. Tabelle 1 : Titer anti-Gag/p55-spezifischer Antikörper in Mäusen nach zweimaliger Impfung mit pGJ2syngag
Figure imgf000056_0001
F) Die Konzentration an neutralisierenden Antikörpern wurde durch den Neutralisationstest bestimmt. Dabei wurde Serum in Form einer Verdünnungsreihe zu 100 TCID50 von mit VSV-G pseudotypi- sierten pGJ2-GFP-Vektoren, das sind pGJ2syngag-ähnliche Vektoren, die als Transgen anstelle von syngag das Grün-fluoreszierende Protein GFP tragen, gegeben und mikroskopisch untersucht, bis zu welcher Serumverdünnung die Markergenexpression unterdrückt werden kann. Der Neutralisationstiter entspricht dem Reziprokwert der höchsten Verdünnung, bei der noch eine vollständige Hemmung der GFP-Expression beobachtet wurde. Diese Untersuchung zeigt die Induktion einer Vektor-neutralisierenden Antikörperantwort im Blut von Mäusen, die mit dem Vektor pGJ2syngag geimpft wurden, wozu auf Tabelle 2 hingewiesen wird.
Tabelle 2: Titer neutralisierender, anti-VSV-G-Glykoprotein- spezifischer Antikörper in Mäusen nach zweimaliger Impfung mit pGJ2syngag
Figure imgf000056_0002
Beispiel 2: Immunisierung mit einem H1V-1 -Vektor enthaltend humanisiertes, synonymes gag/p39 (syngag) in Kombination mit einem DNA-Plasmid
A) Aus dem Plasmid pczHSRV2 (Moebes et al., J. Virol. 1997; 71 :7305-7311) wurde das Foamyvirus-Genom und der 3'-Teil des
CMV-Promotors durch Restriktionsverdau mit Pmel und Ndel entfernt. Das HIV-1-Plasmid pHXB2D (Gen-Bank Nr. K03455 M38432) wurde mit BssHIl und Aflll sowie mit Afllll und Xbal verdaut. Der 3'- Teil des CMV-Promotors und der 5'-Teil der R-Region aus dem HIV- LTR wurden mit Hilfe der rekombinanten PCR rekonstruiert. Die BssHII/Afllll und Afllll/Xbal-Fragmente aus pHXB2D, das rekonstruierte CMV-Promotor/HIV-R-Konstrukt, verdaut mit BssHIl und Ndel, und das Ndel/Pmel-Fragment des Plasmids pczHSRV2 wurden miteinander ligiert. Durch rekombinante PCR wurden die zellulä- ren Restsequenzen aus pHXB2D entfernt. Durch Verdau mit Pvull und EcoRV wurde eine Deletion in der 3'-U-Region vorgenommen, wodurch die TATA-Box entfernt wurde. Durch Verdau mit Bpu 11021 und Asp7l8 wurde das nef-Gen teilweise entfernt. Dieses Konstrukt ist pGJ2. Anschließend wurde das syngag-Gen zusammen mit dem Spleen Focus-Forming Virus (SFFV)-Promotor in den Bereich der Esp3l-Schnittstelle in pGJ2 hineinligiert. Dadurch wurde das Plasmid pGJ2syngag erhalten, wozu auf Figur 1 hingewiesen wird.
B) pczVSV-G wurde hergestellt gemäß der Literaturstelle (Pietschmann et al (2000), „Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export" J. Virol.73: 2613-2621 ).
C) Die beiden rekombinanten Plasmid-DNAs wurden durch die CaCI2-Methode (Soneoka et al. Nucl. Acids Research 1995. Vol. 23. No.4. 628-633) in 293T-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden für 8 h bei 37°C inkubiert, das Medium gewechselt und für weitere 16 h inkubiert. Anschließend wurde mit Natrium-Butyrat die Transkription der Vektor-DNA induziert, nach 8h das Natrium-Butyrat-haltige Me- dium entfernt und die Zellen für weitere 16 h in frischem Medium inkubiert. Dazu wurde Medium verwendet, das frei von fötalem Rinderserum ist. Dabei entstehen replikationsinkompetente Virus-Vektoren, die aus dem Zellkulturüberstand gewonnen und durch Ultrazentrifu- gation (45 000 g, 150 min., 4° C) konzentriert wurden.
D) Ein syngag-enthaltendes Expressionsplasmid wurde hergestellt, indem das syngag-Gen (SEQ ID NO. 1) zusammen mit dem Promotor des Spleen Focus-Forming Virus in den Vektor pcDNA3.1zeo (Invitrogen) kloniert wurde. Dadurch wurde das Plasmid pSFsyngag erhalten, wozu auf Figur 2 hingewiesen wird.
E) 100 mg pSFsyngag Plasmid-DNA wurden mit 10 mg CpG- ODN (SEQ ID NO. 2) gemischt und zur Austestung der Immunogeni- tät Mäusen (Mus musculus) des Inzuchtstamms Balb/c je 50 mg DNA/5 mg CpG-ODN in die Mm. quadriceps beider Hinterbeine injiziert. Drei Wochen später wurden aus pGJ2syngag und pczVSV-G hergestellte Vektoren mit 10 mg immunstimulatorischen CpG- Oligodinukleotiden (CpG-ODN) (Nukleinsäuresequenz 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT-3') gemischt. 5 x 106 infektiöse Einheiten der Vektoren enthaltend die CpG-ODN wurden intraperitoneal injiziert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse getötet, die Milz und Blut entnommen und die zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Antwort sowie die humorale Immunantwort gegen das HIV-Gag-Protein gemessen. Als Kontrollen wurden Balb/c-Mäuse zweimal mit Plasmid- DNA immunisiert. Es wurden je fünf Tiere immunisiert. F) Die HIV-Gag-spezifische CTL-Antwort wurde wie folgt analysiert: Die entnommene Milz wurde zerkleinert, die Erythrozyten in Ammoniumchlorid-haltiger hypotoner Lösung lysiert und die mono- nukleären Zellen isoliert. Die CTL-Reaktion wurde durch den ELIS- pot-Test untersucht. Dafür wurden die mononukleären Zellen in eine mit einer Membran versehene Mikrotiterplatte, die mit Antikörpern gegen Maus-Interferon-g (IFN-g) beschichtet war, ausgesät. Zusätzlich wurde als Antigen ein Peptid aus dem Bereich des HIV-Gag/p24- Proteins mit der Aminosäuresequenz „AMQMLKETI" in einer Kon- zentration von 10 mg/ml zugegeben. Die Zellen wurden mit dem Antigen für 40 h bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abgewaschen und die IFN-g-Produktion mit einem immunologischen Detektionssystem nachgewiesen. In diesem De- tektionssystem wurde ein mit Streptavidin konjugierter Anti-lFN-g- Antikörper als Nachweisantikörper zugegeben. Durch Zugabe von an Biotin gekoppelter Alkalischer Peroxidase und Substrat läuft eine Farbreaktion dort ab, wo durch antigenspezifische Lymphozyten IFN- g produziert und an die Membran der Mikrotiterplatte gebunden wurde. Die in diesem Test sichtbar werdenden Spots entsprechen durch das Gag-Peptid AMQMLKETI aktivierten zytotoxischen T- Lymphozyten. Die Spots wurden mithilfe eines Sektionsmikroskops ausgezählt und die Anzahl der Spots bezogen auf 106 mononukleä- re Milzzellen ermittelt, wozu auf Figur 3 hingewiesen wird.
G) Die Gag-spezifische Antikörperantwort wurde durch Enzyme- linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt. Dabei wurde eine
Mikrotiterplatte mit in E. coli hergestelltem HIV-1 Gag/p55-Protein (2,5 mg/ml) beschichtet. Anschließend wurde Serum aus immunisierten Mäusen gewonnen und in einer Verdünnungsreihe auf die Platte pipettiert. Daraufhin wurde ein Detektionsantiserum (Kaninchen ge- gen Maus-IgG), das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, zugegeben sowie anschließend Substrat. Die Extinktion bei 450 nm wurde photometrisch bestimmt und der Titer an Gag/p55-spezifischen Antikörpern wurde ermittelt als das Reziprok der Serumverdünnung, deren Extinktion größer war als die Extinktion von Kontrollserum nicht immunisierter Tiere. Diese Untersuchung zeigt die Induktion einer Gag-spezifischen Antikörperantwort im Blut von Mäusen, die mit pSFsyngag und dem Vektor pGJ2-syngag geimpft wurden, wozu auf Figur 4 hingewiesen wird.
Beispiel 3: Konstruktion eines Vektors, der das Glykoprotein von HIV-1 enthält.
A) Aus dem Plasmid pczHSRV2 (Moebes et al., J. Virol. 1997; 71 :7305-7311) wurde das Foamyvirus-Genom und der 3'-Teil des CMV-Promotors durch Restriktionsverdau mit Pmel und Ndel ent- fernt. Das HIV-1 -Plasmid pHXB2D (Gen-Bank Nr. K03455 M38432) wurde mit BssHIl und Aflll sowie mit Afllll und Xbal verdaut. Der 3'- Teil des CMV-Promotors und der 5'-Teil der R-Region aus dem HIV- LTR wurden mit Hilfe der rekombinanten PCR rekonstruiert. Die BssHII/Afllll und Afllll/Xbal-Fragmente aus pHXB2D, das rekon- struierte CMV-Promotor/HIV-R-Konstrukt, verdaut mit BssHIl und Ndel, und das Ndel/Pmel-Fragment des Plasmids pczHSRV2 wurden miteinander ligiert. Durch rekombinante PCR wurden die zellulären Restsequenzen aus pHXB2D entfernt. Durch Verdau mit Pvull und EcoRV wurde eine Deletion in der 3'-U-Region vorgenommen, wodurch die TATA-Box entfernt wurde. Durch Verdau mit Bpu 11021 und Asp7l8 wurde das nef-Gen teilweise entfernt. Dieses Konstrukt ist pGJ2. Anschließend wurde das syngag-Gen zusammen mit dem Spleen Focus-Forming Virus (SFFV)-Promotor in den Bereich der Esp3l-Schnittstelle in pGJ2 hineinligiert. Dadurch wurde das Plasmid pGJ2syngag erhalten, wozu auf Figur 1 hingewiesen wird.
B) Das Plasmid pHXB2 wurde mit den Restriktionsenzymen Sall und Xhol geschnitten. Dabei entsteht ein 3,1 kb großes Fragment, welches unter anderem das gesamte Leseraster des env-Gens enthält. Dieses Fragment wurde über eine Xhol-Schnittstelle in den pC- DNA(-) Vektor (Invitrogen) kloniert. Dieses Plasmid wurde mit Bpil und Xhol geschnitten und das so erhaltene Bpil/Xhol-Fragment enthält das komplette Leseraster des env-Gens. Die 5'-Überhänge der Schnittstellen wurden durch die Behandlung mit der Klenow- Polymerase aufgefüllt. Das eukaryotische Expressionsplasmid pCI (Promega), welches ein Intron und einen CMV-Promotor enthält, wurde mit Smal geschnitten und das Bpil/Xhol Fragment hinein kloniert. Dadurch wurde das Plasmid pEnv(Lig), bei dem das HIV-1- env-Gen unter Kontrolle des CMV-Promotors steht, erhalten, wozu auf die Figur 5 hingewiesen wird.
C) Die beiden rekombinanten Plasmid-DNAs werden durch die CaCI2 Methode (Soneoka et al. Nucl. Acids Research 1995. Vol. 23. No.4. 628-633) in 293T-Zellen transfiziert. Die Zellen werden für 8 h bei 37°C inkubiert, das Medium gewechselt und für weitere 16 h inkubiert. Anschließend wird mit Natrium-Butyrat die Transkription der Vektor-DNA induziert, nach 8h das Natrium-Butyrat-haltige Medium entfernt und die Zellen für weitere 16 h in frischem Medium inkubiert. Dabei entstehen replikationsinkompetente Virus-Vektoren, die aus dem Zellkulturüberstand isoliert werden. Beispiel 4: Konstruktion eines rekombinanten Vakzinia-Virus zur Expression des Vektors pGJ2syngag
Durch PCR wird das 5'-Ende der Expressionskassette von pGJ2syngag unterhalb des CMV-Promotors amplifiziert, wobei gleichzeitig am 5' Ende der Immediate Early-Promotor p7.5 aus Vakziniavirus sowie Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Eagl und Xhol angefügt werden. Durch PCR wird auch das 3'-Ende der Expressionskassette von pGJ2syngag amplifiziert, wobei gleichzeitig das Vakziniavirus-Immediate Early Gen Stop-Signal TTTTTGT hinter der 3' R-Region eingefügt wird. Die Fragmente werden zusammen mit dem mittleren Teil der Expressionskassette aus pGJ2syngag in das Plasmid pBK-CMV ligiert. Anschließend wird das modifizierte pGJ2syngag-Vektorgenom durch das Restriktionsenzym Eagl herausgeschnitten und in die Notl-Schnittstelle eines Vakziniavirus (Stamm Copenhagen) hineinkloniert. 143B Tk — Zellen werden mit der ligierten Vakziniavirus-DNA transfiziert und nach Inkubation für 24 - 72 h rekombinante Vakziniaviren aus dem Zelllysat gewonnen. Vakziniaviren werden kloniert und rekombinante Vakzinaviren, die pGJ2-syngag-Vektorkomponenten exprimieren, selektiert. Eine Ex- pressionskassette enthaltend das HIV-1 -env-Gen, aus dem die Transskriptionsstopps entfernt wurden, unter transkriptioneller Kontrolle des Immediate Early-Promotor p7.5 aus Vakziniavirus wird durch homologe Rekombination in den Thymidinkinasegen (tk)- Locus des Vakziniavirus enthaltend pGJ2syngag hineinkloniert, wozu auf Figur 6 hingewiesen wird. Beispiel 5: Konstruktion eines rekombinanten Vakzinia-Virus zur Expression des Vektors pVeksyngag
Durch PCR wird das 5'-Ende der Expressionskassette von pGJ2syngag unterhalb des CMV-Promotors amplifiziert, wobei gleichzeitig am 5'-Ende der Immediate Early-Promotor p7.5 aus Vakziniavirus sowie Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Eagl und Xhol angefügt werden. Durch PCR wird auch das 3'-Ende der Expressionskassette von pGJ2syngag amplifiziert, wobei gleichzeitig das Vakziniavirus-Immediate Early Gen Stop-Signal TTTTTGT hinter der 3' R-Region eingefügt wird. Die Fragmente werden zusammen mit dem mittleren Teil der Expressionskassette aus pGJ2syngag in das Plasmid pBK-CMV ligiert. Anschließend werden die Genbereiche für den 3'-Bereich von gag, pol, vif, vpr, rev, tat und env durch Restriktionsverdau mit Bael und Bsml entfernt. Dadurch wird eine Genkassette erhalten, die am 5'-Ende den Promotor p7.5, die HIV- LTR-Strukturen R und U5, das 5'-Teil des gag-Leserasters, den Promotor pSFFV und das Transgen syngag sowie die partiell dele- tierte und verkürzte 3'-HIV-LTR-Region enthält (pVeksyngag). Das pVeksyngag-Vektorgenom wird durch das Restriktionsenzym Eagl herausgeschnitten und in die Notl-Schnittstelle eines Vakziniavirus (Stamm Copenhagen) in Gegenwart des Restriktionsenzyms Notl hineinkloniert. 143B Tk Zellen werden mit der ligierten Vakziniavi- rus-DNA transfiziert, mit Geflügelpockenvirus infiziert, und nach Inkubation für 3-5 Tage werden rekombinante Vakziniaviren aus dem Zelllysat gewonnen. Vakziniaviren werden in Zellkultur kloniert und Viren, die pVeksyngag-RNA exprimieren, selektiert. Eine Expressionskassette enthaltend das HIV-1 -env-Gen ohne kryptische Transkriptionsstoppsequenzen unter transkriptioneller Kontrolle des Immediate Early-Promotor p7.5 aus Vakziniavirus sowie das HIV-1- gag/pol-Gen unter Kontrolle des Vakziniavirus-H6-Promotors wird durch homologe Rekombination in den Thymidinkinasegen (tk)- Locus des rekombinanten Vakziniavirus enthaltend pVeksyngag hineinkloniert, wozu auf Figur 7 hingewiesen wird.

Claims

Patentansprüche
1. Zur Erzeugung einer Immunantwort gegen Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV) geeigneter replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektor, abgeleitet von einem Stamm der Viren HIV-1 , HIV-2 oder SIV und im Genom enthaltend, insbesondere als mindestens ein Transgen, ein erstes Lentivirusgen einer Gengruppe, welches aus einem ersten Stamm der Viren HIV-1 , HIV-2 oder SIV abgeleitet ist, und ein zweites oder weiteres Lentivirusgen der gleichen Gengruppe, welches aus einem zweiten oder weiteren Stamm der Viren HIV-1 , HIV-2 oder SIV, der vom ersten Stamm genetisch verschiedenen ist, abgeleitet ist.
2. Virusvektor nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Gengruppe der Lentivirusgene Glykoproteine kodiert.
3. Virusvektor nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Gengruppe der Lentivirusgene ausgewählt ist aus der Gruppe der Gene bestehend aus gag, pol und nef.
4. Virusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der lentivirale Vektor ein selbst-inaktivierender Vektor ist.
5. Virusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Transgen unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryoten nuklear aktiven Promotors steht.
6. Virusvektor nach vorstehendem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor der SFFV-Promotor ist.
7. Virusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein weiteres Gen zur Expression mindestens einer immunregulatorischen Substanz enthalten ist.
8. Virusvektor nach vorstehendem Anspruch, dadurch gekenn- zeichnet, dass das mindestens eine weitere Gen ein Zytokin, Hormon, Antikörper oder Bakterientoxin unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryoten nuklear aktiven Promotors kodiert.
9. Virusvektor, insbesondere nach einem der vorstehenden Ansprüche, im Genom enthaltend mindestens eine Kopie einer kodo- noptimierten Nukleinsäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NO. 1.
10. Rekombinanter Poxvirusvektor, im Genom enthaltend a) erste Genombestandteile eines lentiviralen Virusvektors, enthaltend i) eine erste lentivirale Expressionskassette, ii) ein erstes env-Gen und iii) erste gag- und pol-Gene, wobei die ersten Genombestandteile jeweils abgeleitet sind von einem ersten Stamm der Viren HIV-1 , HIV-2 oder SIV, und b) mindestens einen weiteren Genombestandteil, der ersten Ge- nombestandteilen (i) bis (iii) entspricht oder darin enthalten ist und der aus einem zweiten Stamm der Viren HIV-1 , HIV-2 oder SIV abgeleitet ist, wobei der zweite Stamm von dem ersten Stamm genetisch verschieden ist.
11. Poxvirusvektor nach vorstehendem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine weitere Genombestandteil, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) einer zweiten oder weiteren lentiviralen Expressionskassette, welche aus dem zweiten Stamm der Viren HIV-1 , HIV-2 oder SIV abgeleitet ist, b) einem Transgen mit einem ersten Lentivirusgen einer Gengruppe abgeleitet aus dem ersten Stamm und einem zweiten oder weiteren davon genetisch verschiedenen Lentivirusgen der glei- chen Gengruppe abgeleitet aus dem zweiten Stamm, c) einem zweiten oder weiteren env-Gen aus dem zweiten Stamm, und d) einem zweiten oder weiteren gag-Gen aus dem zweiten Stamm
12. Poxvirusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, da- durch gekennzeichnet, dass das Transgen als der mindestens eine weitere Genombestandteil auf der ersten lentiviralen Expressionskassette lokalisiert ist.
13. Poxvirusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Transgen als der mindestens eine weitere Genombestandteil auf der zweiten oder weiteren lentiviralen Expressionskassette lokalisiert ist.
14. Poxvirusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und/oder zweite lentivirale Expressionskassette abgeleitet ist von einem lentiviralen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
15. Poxvirusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und/oder zweite lentivirale Expressionskassette die gag- und pol-Gene als gag-pol-Leseraster enthält.
16. Poxvirusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste env-Gen zusammen mit einem zytoplasmatisch aktiven Promotor außerhalb der ersten und/oder zweiten lentiviralen Expressionskassette vorliegt.
17. Poxvirusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, da- durch gekennzeichnet, dass in der ersten und/oder zweiten oder weiteren lentiviralen Expressionskassette mindestens ein cis-aktiver Bereich eines lentiviralen Virusvektors zusammen mit mindestens einem Transgen des lentiviralen Virusvektors und mindestens einem trans-aktiven gag- und/oder env-Gen an getrennten Orten im Genom des Poxvirus integriert sind.
18. Poxvirusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der ersten und/oder zweiten oder weiteren lentiviralen Expressionskassette mindestens ein cis-aktiver Bereich eines lentiviralen Virusvektors zusammen mit mindestens ei- nem Transgen des lentiviralen Virusvektors und mindestens einem trans-aktiven gag- und/oder env-Gen am gleichen Ort im Genom des Poxvirus integriert sind.
19. Poxvirusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Genom des Poxvirusvektors enthal- tene Genombestandteile des lentiviralen Virusvektors unter transkriptioneller Kontrolle eines im Zytoplasma aktiven Promotors stehen.
20. Poxvirusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Genom des Poxvirusvektors mindestens ein Gen kodierend für ein immunregulatorisches Protein enthalten ist.
21. Poxvirusvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Poxvirus ausgewählt ist aus der Gruppe der Poxviren bestehend aus Orthopoxviren, insbesondere Vakziniaviren, und Avipoxviren.
22. Verwendung des replikationsinkompetenten lentiviralen Virus- vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung und/oder Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).
23. Verwendung des replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittelkits zur Immuntherapie und/oder Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).
24. Verwendung eines Poxvirusvektors, enthaltend im Genom mindestens zwei genetisch verschiedene Lentivirusgene aus jeweils einem anderen Stamm ausgewählt aus der Gruppe der Viren beste- hend aus HIV-1 , HIV-2 oder SIV zur Immuntherapie und/oder Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).
25. Verwendung eines Poxvirusvektors, enthaltend im Genom mindestens zwei genetisch verschiedene Lentivirusgene aus jeweils einem anderen Stamm ausgewählt aus der Gruppe der Viren beste- hend aus HIV-1 , HIV-2 oder SIV zur Herstellung eines Arzneimittel- kits zur Immuntherapie und/oder Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).
26. Verwendung eines Poxvirusvektors, enthaltend im Genom genetische Strukturen zur Bildung infektiöser replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren, welche, insbesondere in mindestens einem Transgen, mindestens ein Lentivirusgen aus Stämmen ausgewählt aus der Gruppe der Viren bestehend aus HIV-1 , HIV-2 oder SIV aufweisen, zur Immuntherapie und/oder Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).
27. Verwendung eines Poxvirusvektors, enthaltend im Genom genetische Strukturen zur Bildung infektiöser replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren, welche, insbesondere in mindestens einem Transgen, mindestens ein Lentivirusgen aus Stämmen ausgewählt aus der Gruppe der Viren bestehend aus HIV-1 , HIV-2 oder SIV aufweisen, zur Herstellung eines Arzneimittelkits zur Immuntherapie und/oder Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).
28. Verwendung eines Poxvirusvektors nach einem der Ansprüche 10 bis 21 zur Immuntherapie und/oder Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).
29. Verwendung des Poxvirusvektors nach einem der Ansprüche 10 bis 21 zur Herstellung eines Arzneimittelkits zur Immuntherapie und/oder Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).
30. Kit zur Immuntherapie und/oder Immunisierung enthaltend mindestens einen replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
31. Kit zur Immuntherapie und/oder Immunisierung enthaltend mindestens einen Poxvirusvektor nach einem der Ansprüche 10 bis
21.
32. Kit nach einem der vorstehenden Ansprüche, enthaltend immunregulatorische Substanzen.
33. Kit nach einem der vorstehenden Ansprüche, enthaltend min- destens ein weiteres Immunogen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein-, Peptid-, Lipopetid-, DNA-Plasmid-Impfstoffen, Impfstoffen viraler und bakterieller rekombinanter Vektoren und Pseudovirionen.
34. Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV) im tierischen oder menschlichen Organismus, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen des replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9; b) Applikation des Virusvektors in den tierischen oder menschlichen Organismus; und c) Induktion einer Immunantwort gegen Proteine des HIV im tierischen oder menschlichen Organismus.
35. Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV) im tierischen oder menschlichen Organismus, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Poxvirusvektors nach einem der Ansprüche 10 bis 21 ; b) Applikation des Poxvirusvektors in den tierischen oder menschlichen Organismus; und c) Induktion einer Immunantwort gegen Proteine des HIV im tierischen oder menschlichen Organismus.
36. Verfahren nach vorstehendem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt b) mehrfach wiederholt wird.
37. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) zusätzlich immunregulatorische
Substanzen appliziert werden.
38. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) zusammen mit dem Poxvirusvektor am gleichen Ort und/oder gleichzeitig mindestens ein weiteres Immunogen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein-, Peptid-, Lipopetid-, DNA-Plasmid-Impfstoffen, Impfstoffen viraler und bakterieller rekombinanter Vektoren und Pseudovirionen appliziert wird.
39. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Applikation in Schritt b) auf die Schleimhaut, intracutan, subcutan, transdermal, intranasal, intramusculär, intraperitoneal und/oder intravenös, ohne oder zusammen mit Adjuvans, erfolgt.
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