JP2008508863A - フラビウイルス科ウイルスタンパク質発現のための組換えレンチウイルスベクター、及びワクチンとしてのそれらの使用 - Google Patents

フラビウイルス科ウイルスタンパク質発現のための組換えレンチウイルスベクター、及びワクチンとしてのそれらの使用 Download PDF

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Abstract

フラビウイルス科のウイルスの少なくとも1つのタンパク質又は該タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を含む組換えレンチウイルスベクターの、感受性の種におけるフラビウイルス科ウイルス感染の予防及び／又は治療を意図する医薬組成物を製造するための使用。
【選択図】なし

Description

本発明は、フラビウイルス科ウイルス(Flaviviridae)のタンパク質の発現用の組換えレンチウイルスベクター、及び感受性の種(宿主又は保有体)におけるフラビウイルス科のウイルスでの感染の予防及び／又は治療を意図するワクチンとしてのその使用に関する。
フラビウイルス科は、3つの属に分けられる：フラビウイルス属(Flavivirus)、ペスチウイルス属(Pestivirus)及びヘパシウイルス属(Hepacivirus)又はC型肝炎ウイルスである。フラビウイルス科は、フラビウイルス科ウイルスにより誘導される多数のヒト及び獣医学的疾患の両方により、主要なヒト及び獣医学的衛生問題を表す。具体的には、例えば、フラビウイルス属には70を超える種が存在するが、これらの少なくとも50％はヒト又は獣医学的な疾患の原因である。
フラビウイルス科ウイルスは小さいエンベロープに包まれたウイルスである。そのゲノムは、フラビウイルス科に依存して9.5 kb〜12.5 kbの正の極性の一本鎖RNA分子であり、その5'及び3'端の2つの短い非コーディング領域で挟まれた単一のオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームは、ポリタンパク質に翻訳され、これがそのN-末端部分において構造タンパク質の前駆体であり、C-末端部分において非構造(NS)タンパク質の前駆体である。
より具体的には、
- フラビウイルス属について、ゲノムは約10〜12キロベースの正の極性の一本鎖RNA分子である。ゲノムRNAは、カプシドタンパク質Cのいくつかのコピーと組み合わさってヌクレオカプシドを形成する。これは、エンベロープタンパク質E及び膜タンパク質Mが固定されている小胞体(ER)膜に由来する脂質二重層からなるウイルスエンベロープにより囲まれる。フラビウイルス属のゲノムRNAは、その5'及び3'端で2つの短い非コーディング領域で挟まれた約10500ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含む。このゲノムは、約3400アミノ酸のポリタンパク質に翻訳され、これはそのN-末端部分において3つの構造タンパク質、C、prM (Mの細胞内前駆体)及びEの前駆体であり、そのC-末端部分において少なくとも5つの非構造(NS)タンパク質NS1〜NS5の前駆体である。よって、次の構造：C-prM/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5が観察される。
- ペスチウイルス属について、ゲノムRNAは12キロベースより長く、約3900アミノ酸のポリタンパク質に翻訳される単一のオープンリーディングフレームを含み、該ポリタンパク質は、11〜13のペスチウイルスタンパク質の前駆体であり、このうち4つが構造タンパク質である。次の構造：Npro-Cems-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A/4B-NS5A/5Bが観察される。
- ヘパシウイルス属について、ゲノムRNAは約9.5キロベースを含み、約3000アミノ酸のポリタンパク質に翻訳される単一のオープンリーディングフレームを含み、該ポリタンパク質は、そのN-末端部分において3つの構造タンパク質、C、E1及びE2の前駆体であり、そのC-末端部分において少なくとも7つの非構造(NS)タンパク質NS1〜NS5の前駆体である。次の構造：C-E1-E2-NS1-NS2-NS3-NS4A/4B-NS5A/5Bが観察される。
多くの深刻なヒト及び動物の病理は、この科のウイルスにより誘導される。感染性ウイルスに応じて観察される種々の症状は、一般的に発熱(周期又は非周期)、出血性の熱、下痢、脳炎、肝炎又は敗血症性ショックである。より詳細には、問題の種々のウイルスは、以下のとおりである。
- フラビウイルス属：フラビウイルス属の大多数は、カ(イエカ属(Culex)、ヤブカ属(Aedes)、ハマダラカ属(Anopheles)又はマンソニア属(Mansonia))又はダニ類(ticks)により脊椎動物宿主に伝染する。(i) カにより伝染するウイルス：デングウイルス(タイプ1〜4)、黄熱ウイルス(YFV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、西ナイルウイルス(WNV)、マリーバレー脳炎ウイルス(MVEV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、及び(ii) ダニ類により伝染するウイルス：ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、キャサヌール森林病、オムスク出血性熱ウイルス及び跳躍病ウイルス。
- ペスチウイルス属：ボーダー病(border disease)ウイルス(BDV)、ウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)、及び古典ブタ熱ウイルス(CSFV)又はブタコレラウイルス。
- ヘパシウイルス属：C型肝炎ウイルス及びG型肝炎ウイルス。
渡り鳥はこれらのウイルスのいくつか、特に西ナイルウイルスの保有体であり得、このウイルスは種の境界をウマ及びヒトにおいて越えることも注目されている。
いくつかのワクチンストラテジが今日までに提案されており(Gould EA: Flavivirus Infections in Humans, Encyclopaedia of Life Sciences, 2001; Pugazchev KVら, Internat. J. Parasitol, 2003, 33, 567〜582; Putnak Rら, Advances in Virus Research 2003, 61, 445〜468; Smith DB, Hepatitis C virus, Encyclopaedia of Life Sciences, 2001)、次のことに関係する。
- 弱毒化生ウイルス又は不活化ウイルスを含むワクチン(Pugachev KVら, 2003, 上記; Gould EA, 2001, 上記; Brinton MA, Annu. Rev. Microbiol., 2002, 56, 371〜402; Hamers C.ら, Vet. Rec., 2003, 153, 8, 236〜240; Kovacs F.ら, Vet. Microbiol., 2003, 96, 2, 117〜131)；
- ウイルスサブユニットを含むワクチン；
- 1又は複数のウイルス由来抗原を含むワクチン(Wang Tら, J. Immunol., 2001, 167, 5273〜5277)；
- キメラウイルスを含むワクチン(Pugachev KVら, 2003, 上記)；又は
- DNAワクチン(Putnak Rら, 2003, 上記; Turell MJら, Emerging Infectious Diseases, 2003, 9, 9, 1077〜1081; Davis BSら, J. Virol., 2001, 4040〜4047; Pan CHら, J. Virol., 2001, 75, 23, 11457〜11463)；これらのワクチンは、種々のベクターを用いる。特に、上記のPutnak Rら, 2003は、最適発現のためには、最も適切な調節要素が選択されるべきであり(プロモータ及びエンハンサー)、一般的に、少なくともフラビウイルス属については、CMVプロモータ(例えばプラスミドpcDNA3, Invitrogen)又はRSVプロモータを含みかつprM及びE遺伝子と、任意に、少なくとも1つの非構造タンパク質を同時発現するプラスミドを用いることが推奨されることを記載している。
例えばWNVをとると、北半球、特に米国でのその出現は、かなり最近であり、西ナイルウイルスと闘うために現在提案されている種々のワクチンストラテジは次のとおりである。
- ホルモルで不活化された、マウスの脳で産生された日本脳炎ウイルス(JE-VAX (登録商標)、Aventis-Pasteur; Monathら, Curr. Drug Targets Infect. Disord., 2001, 1, 37〜50)。西ナイルウイルス感染に対してヒト又はウマを保護できる交差防御(cross protection)の存在は証明されておらず、議論の余地がある(Monath, AM; Trop. Med. Hyg., 2002, 66, 113〜114)。さらに、マウスでの研究は、交差免疫性が、西ナイル感染の間に脳の炎症を誘導し得ることを示している。
- ホルモル不活化西ナイルウイルス(国際出願WO 03/061555)。ウマの免疫化のために提案されたこのワクチンは、いずれの病原性の影響がなく、ウマにおける西ナイルウイルスに対して効果的であることが見出されている。しかし、体液性応答の大きさが低いことから、数回の注射に続いて毎年のブースター注射が必要である。
- 黄熱ウイルスの弱毒化株に由来するキメラウイルス(17D株；ChimeriVax (商標)-WN)。より具体的には、ChimeriVax (商標)-西ナイルキメラウイルスは、弱毒化ウイルスYV 17D中に、WNV株New York 1999のprM-Eカセットを含む(国際出願WO 03/059384及びPletnev AGら, PNAS, 2002, 99, 5, 3036〜3041; Monath TPら, Curr. Drug Targets Disord., 2001, 1, 1, 37〜50)。西ナイルウイルスのprM及びE遺伝子は、黄熱ウイルス又はデングウイルスに挿入され、よってこれがベクターとしての役割を果たす。ヌクレオカプシドタンパク質及び非構造タンパク質をコードする遺伝子、及び17D又はDEN4株からの非翻訳末端領域を、組換えキメラウイルスの複製に用いる。キメラウイルスは17D又はDEN4ウイルスのような宿主において複製するが、西ナイルウイルスに対して特異的に免疫にする(Monathら, Curr. Drug Targets Infect. Disord., 上記)。キメラウイルスを用いる感染は、免疫応答の種々の経路を刺激する。さらに、キメラウイルス粒子は、重複する(redundant)中和エピトープを有する完全Eタンパク質を含む。よって、宿主におけるキメラウイルスの複製は、ウイルスの早期の伝播を防ぐ中和抗体の高い力価を誘導し、細胞傷害性T免疫性が感染細胞に継続しているウイルスを排除する。ワクチン後応答よりも迅速で強力な感染後記憶応答も、西ナイルウイルス感染に対する防御に貢献する。17D株での予めの免疫化はキメラウイルスでの感染を阻害しないが、逆に、このことは特異的抗体の産生を増大させることが示されている。マウス及び非ヒト霊長類において、ChimeriVax (商標)-JEキメラワクチンが、17D株よりも神経毒性が低いことも示されている。さらに、キメラウイルスのゲノムは、インビボ及び細胞培養での継代を繰り返しても安定である。ChimeriVax (商標)-WNキメラウイルスは、65年以上前にヒトの免疫化のために開発されかつ数億人の個体において用いられているので、ヒトにおいて無害であり有効であることが証明されているワクチン株に由来する(Monathら, Curr. Drug Targets Infect. Disord., 上記)。しかし、キメラ弱毒化生ウイルスの使用は、安全性の問題を提起する。異なる種間での非相同性組換えは、天然に発生する組換えフラビウイルスにより証明されるように、可能である(Seligman SJ及びGould EA, Lancet, 2004, 363, 2073〜2075)。
- 裸の(naked) DNA (Davisら, J. Virol., 2001, 75: 4040〜4047; Turellら, Emerg. Infect. Diseases, 2003, 9, 1077〜1081、及び国際出願WO 03/061555)。用いられる裸のDNAベクターは、サイトメガロウイルスの初期プロモータと、日本脳炎ウイルス由来のシグナルペプチドをコードする配列と、西ナイルウイルスのprM及びEタンパク質をコードする配列とを含むベクターpCBWNである。このプラスミドの単純な筋肉内注射は、マウス及びウマにおいて西ナイル感染に対する防御免疫を誘導することが示されている。
- 組換えタンパク質E (Wangら, J. Immunol., 2001, 167, 5273〜5277)；大腸菌(E. coli)において融合タンパク質の形で発現され、アフィニティクロマトグラフィーにより精製された完全Eタンパク質又はC-末端領域(残基E1〜E409)が欠失されたEタンパク質は、マウスにおいて、Eタンパク質に対して指向された中和抗体の産生を誘導する。C-末端領域が欠失された可溶性Eタンパク質は、マウスにおいて完全防御を誘導するが、完全Eタンパク質を用いると部分防御しか観察されない。
現在提案されているワクチンのほとんどが全体的に有効であるが、にもかかわらず、特にフラビウイルス科についてのDNAワクチンの分野における新規な予防的方法に対する必要性がある。特に、ヒトの医学及び獣医学におけるこれらのウイルスにより誘導される疾患の予防、及び保有体におけるこれらのウイルスの根絶の両方において有用なベクターに対する真の必要性が存在する。
実際に、例えばヘパシウイルス属、特にC型肝炎の場合、C型肝炎に罹患した患者の防御を目的とした試験は、HCVウイルスタンパク質を発現するのにワクシニアウイルスを用いると失敗する。ここで、このウイルスは、その防御的有効性が減少した短くされたウイルスタンパク質をもたらすスプライシングを引き起こす(Dumonceaux J.ら, J. Virol., 2003, 77, 24, 13418〜13424)。
さらに、ほとんど注射を必要とせず(多くて1回又は2回)、特に、その後に続く免疫化プログラムを設定するのが困難な国においてその使用が促進されるようなワクチンに対する必要性がある。
驚くべきことに、本発明者らは、フラビウイルス科のウイルスの少なくとも1の免疫原性タンパク質の発現のための組換えレンチウイルスベクターが、免疫にされた個体(ヒト又は動物)において、特に該個体をこのウイルスでの感染に対して防御できる強い免疫応答を誘導することを可能にすることを示した。
該組換えレンチウイルスベクターは、高い用量の西ナイルウイルスの攻撃に対して非常に早期で、長期持続性で、完全に防御性の免疫応答を誘導することが可能であった。
本発明者らは、レンチウイルスベクターが、病原体に対する体液性防御応答を誘導するための効果的な手段であることの最初の証拠を示す。このことは、中和体液性応答が免疫系の一つの活性な武器であるフラビウイルス科のウイルスのような病原体に対するワクチン接種手段としてのレンチウイルスベクターの適用可能性を広げる。
よって、本発明の主題は、フラビウイルス科のウイルスの少なくとも1つのタンパク質又は該タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を含む組換えレンチウイルスベクターの、感受性の種(sensitive species)におけるフラビウイルス科ウイルス感染の予防及び／又は治療を意図する免疫原性組成物を製造するための使用である。
このようなベクターは、いくつかの利点を有しており、上記で開示した必要性のために特に適する。
- これは、増大された免疫原性能力を有する。結果として、感受性の種における単回投与の後に有効である。このベクターの有効性は、(i) 特に皮下注射されたときに、抗原提示細胞又はAPC、例えば樹状細胞へのその親和性に、(ii) これらのベクターが有する興味対象の配列の細胞ゲノムへの安定な組み込みに(このことは、インビボ、特に樹状細胞での抗原の長期持続発現を可能にする)、及び(iii) 樹状細胞依存性免疫応答を刺激するその能力にすぐに関係する。よって、パルスされた樹状細胞を用いて通常得られるものよりも長い樹状細胞での抗原の発現の持続期間は、ベクターの繰り返しの投与をなくす(do away with)ことを有利に可能にする。
- これは、非複製型である。結果として、これは、感受性の種においてほとんど又は全く病原性能力を有さず、かつ感染能力を有さない。すなわち、環境中の伝播の危険性を有さない。
- これは、非腫瘍形成性である。これは、いずれの腫瘍形成性作用を引き起こさずに、宿主細胞のゲノムへの興味対象の配列の安定な組み込みをもたらす。
- これは、特に、他のウイルスからのエンベロープタンパク質、例えば水疱性口内炎ウイルス(VSV)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)のウイルス、例えば狂犬病ウイルス及びエボラウイルスの糖タンパク質Gを用いて偽型を産生することができるという事実により、種の限定を示さず、かつ細胞親和性が広げられている。結果として、これは、いずれの感受性の種において予防的及び／又は治療的免疫化のために有効である。
- これは、アジュバントの使用をなくすことを可能にする。
定義
- ポリヌクレオチド断片：「ポリヌクレオチド断片又はポリヌクレオチド」の用語は、少なくとも24塩基又は塩基対、好ましくは24〜5000塩基又は塩基対のDNA又はRNA断片、特にcDNA又はcDNA断片を意味することを意図する。
- 免疫原性断片：フラビウイルス科ウイルスでの感染に対して感受性の種において特異的体液性及び／又は細胞性応答の誘導が可能なペプチド断片。
- フラビウイルス科ウイルスの少なくとも1つのタンパク質又は該タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド断片：フラビウイルス科ウイルスの1又は複数の構造タンパク質若しくは非構造タンパク質及び／又は1又は複数の免疫原性断片をコードする上記で規定するポリヌクレオチド。フラビウイルス科ウイルスポリタンパク質のオープンリーディングフレーム(ORF)及び該ORFに含まれる種々のフラビウイルス科ウイルスタンパク質のコーディング配列は、当業者に公知であり、データベース、特にNCBIのもの(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)又は関係する研究、例えばVirus Taxonomy. Classification and nomenclature of viruses. Sixth report of the International Committee on taxonomy of viruses (F. A. Murphyら, Archives of Virology Supplement 10, 1995, Springer Verlag, Vienna, New York)において入手可能である。本発明は、いずれのフラビウイルス科ウイルスのコーディング配列及び該コーディング配列の1又は複数のヌクレオチドの変異(挿入、欠失、置換)、又は1若しくは2のヌクレオチドのオープンリーディングフレーム内でのシフト(ORF ＋1又はORF ＋2)により派生する変異形(但し、該変異は、上記のタンパク質又は上記の断片の抗原性及び／又は免疫原性の特性を実質的に変更しない)のコーディング配列を包含する。本発明は、改変されたヌクレオチド断片が、高ストリンジェントな条件下で、それらから派生した改変ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする能力を保持するという条件で、ヌクレオチドの変異(挿入、欠失、置換)により上記から派生する変異形ポリヌクレオチドを特に包含する。
- 高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件：本発明の目的のために、「高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の表現は、相補的ポリヌクレオチドの間の特異的及び選択的なハイブリダイゼーションを維持することを可能にするように選択される温度及びイオン強度の条件を意味することを意図する。説明のために、上記のポリヌクレオチドを規定する目的のための高ストリンジェントな条件は、有利には次のようである：DNA-DNA又はDNA-RNAハイブリダイゼーションは、2工程で行われる：(1) 5×SSC (1×SSCは0.15 M NaCl ＋ 0.015 Mクエン酸ナトリウムの溶液に相当する)、50%ホルムアミド、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、10×デンハルト(Denhardt's)、5%硫酸デキストラン及び1%サケ精子DNAを含有するリン酸緩衝液(20 mM、pH 7.5)中に42℃で3時間のプレハイブリダイゼーション；(2) 42℃で20時間のハイブリダイゼーション、続いて2×SSC＋2% SDS中に20℃で20分間の2回の洗浄、及び0.1×SSC＋0.1% SDS中に20℃で20分間の1回の洗浄。最後の洗浄は、0.1×SSC＋0.1% SDS中に60℃で30分間行う。
- 感受性の種：「フラビウイルス科ウイルスでの感染に感受性の種」の表現は、フラビウイルス科ウイルスにより誘導される病理を発生することができる宿主種、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物と、症状を発生することなくウイルスの伝播の原因となる保有体種、例えば特に鳥類又は爬虫類(クロコダイル)との両方を意味することを意図する。
- 組換えレンチウイルスベクター：「組換えレンチウイルスベクター」の用語は、特にプラスミド(ベクタープラスミド)に含まれるレンチウイルスベクターの組換えゲノムに対応する単離された核酸分子と、適切な細胞形で産生され、任意に他のウイルスからのエンベロープタンパク質、例えば水疱性口内炎ウイルス(VSV)、狂犬病ウイルス及びエボラウイルスの糖タンパク質Gを用いて偽型にされる、該組換えゲノムを含む組換えレンチウイルス粒子(ベクター粒子)との両方を意味することを意図する。
本発明によると、上記のレンチウイルスベクターは、HIV (ヒト免疫不全ウイルス)、例えばHIV-1又はHIV-2、CAEV (ヤギ関節炎脳炎ウイルス)、EIAV (ウマ伝染性貧血ウイルス)、VMV (ビスナ/マエディウイルス)、SIV (サル免疫不全ウイルス)又はFIV (ネコ免疫不全ウイルス)に由来するものからなる群より選択される。本発明は、少なくとも2つの異なるレンチウイルスに由来するキメラレンチウイルスをも包含する。レンチウイルスベクターの選択は、特に、感受性の種に依存する。例えば、HIV由来のベクターは、ヒトの免疫化に有利に用いられる。
レンチウイルスベクターは、当業者に公知である。これらは、(i) 翻訳及び発現のための調節シグナルの制御下に置かれた興味対象の配列(本発明の場合、フラビウイルス科ウイルスのコーディング配列)と、(ii) 包膜、逆転写及びウイルス組み込みのために必要かつ充分なレンチウイルス起源の調節配列、及び任意に、Revタンパク質のための調節配列(RRE又はrev結合要素(rev responsive element))とを含む組換えヌクレオチド配列(組換えレンチウイルスゲノム)からなる。Poznansky ら(J. Virol., 1991, 65, 532〜536)及びNaldiniら(Science, 1996, 272, 263〜267)により記載されるHIV、又はPoeschlaら(Nature Medicine, 1998, 4, 354〜357)により記載されるFIVに由来するレンチウイルスベクター、及び国際出願WO 99/32646及びWO 98/17815に記載されるような上記のものに由来する最小ベクター(minimal vectors)を特に挙げることができる。
本発明によると、上記のレンチウイルスベクターは、上記で規定されるコーディング配列を、適切な細胞系で発現できるベクターである。上記のベクターは、その制御下に上記で規定するコーディング配列が挿入される、転写のための適切な調節要素(プロモータ、エンハンサー、コザック(Kozak)コンセンサス配列、ポリアデニル化シグナルなど)を含む発現カセットを含む。上記の興味対象のコーディング配列は、上記のフラビウイルス科ウイルスのポリタンパク質において上記のコーディング配列の前にあるORFに特に由来する細胞輸送のために必要とされるシグナル、例えば小胞体への転置のためのシグナルを含む。例えば、フラビウイルス属の場合、上記のコーディング配列がEタンパク質又は該タンパク質の断片のものであるときに、上記のシグナル配列は、Mタンパク質前駆体(prM)に有利に由来する。有利には、上記の発現カセットは、サイトメガロウイルス(CMV)初期プロモータのような強力な遍在プロモータ、又はエンハンサーを有さないプロモータ、例えば伸長因子1α(EF1α)又はホスホグリセレート(PGK)プロモータを含む。
さらに、上記のベクターは、ヘルペスタイプ1チミジンキナーゼ(HSV 1-TK)のような自殺遺伝子を含むことができ、適切な薬剤、例えばHSV 1-TKの場合にアシクロビルを用いる処理により、形質導入された細胞を排除することができる。
本発明は、単純発現ベクター、及び同じプロモータ又は発現ベクターの同じ領域若しくは異なる領域に位置する異なるプロモータからいくつかのコーディング配列の同時発現を可能にする複数発現ベクターを包含する。
上記の使用の有利な実施形態によると、上記の組換えレンチウイルスベクターは、三重らせんタイプである。
三重らせんのベクターは、特に、Zennouら, Cell, 2000, 101, 173〜185並びにWO 99/55892、WO 01/27304及びWO 01/27300に記載される。
三重らせんベクターは、ウイルス逆転写の間に三重らせん(又はDNA三量体)を形成できるDNA領域を含むことを特徴とする。この三重らせんDNA領域は、セントラルイニシエーションのためのシス作用領域（cis-active region）又はポリプリン配列（polypurine tract）(cPPT)と、ターミネーションのためのシス作用領域(CTS)とからなり、これらの領域は、その合成がレンチウイルスゲノムの中央に存在するPTT領域により開始される＋鎖の転写を開始すること、及びその合成がレトロウイルスLTRの上流の3' PPT部位で開始される＋鎖の転写を中断することを可能にする。レトロウイルスベクター中のこの三重らせんDNA領域の存在は、ベクターの核の移入速度を刺激することにより、有糸核分裂細胞又は非有糸核分裂細胞の遺伝子の形質導入を明らかに改善する。
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記の組換えレンチウイルスベクターは、プロモータ及びアクチベータがU3領域から欠失された3' LTRを含む。この欠失は、さらなる安全性の特徴を与える。
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記の組換えレンチウイルスベクターは、別のウイルスの少なくとも1つのエンベロープタンパク質、好ましくは水疱性口内炎ウイルス(VSV)糖タンパク質Gで偽型にされる(pseudotyped)。該VSV糖タンパク質Gは、危険な状態のいずれの脊椎動物種：ヒト又はウマ、家禽(fowl)及び家畜(zoo animal)を含む、において、特に抗原提示細胞、例えば樹状細胞を形質導入できる高い力価のベクター粒子を得ること及び広い細胞親和性を有するベクター粒子を産生することを有利に可能にする。
本発明によると、上記のフラビウイルス科ウイルスは、上記のようにフラビウイルス属、ペスチウイルス属又はヘパシウイルス属から選択される。
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記のフラビウイルス科ウイルスは、西ナイルウイルス、デングウイルス、黄熱ウイルス及びC型肝炎ウイルスからなる群より選択される。
本発明によると、フラビウイルス科ウイルスの上記のポリヌクレオチド、特にcDNA又はcDNA断片は、(i) 1又は複数の異なる構造タンパク質(C、prM、M、E、E1、E2)及び／又は(ii) 1又は複数の異なる非構造(NS)タンパク質、及び／又は(iii) 該タンパク質の1又は複数の異なる免疫原性断片をコードし、該タンパク質又はそれらの断片は、同じフラビウイルス科ウイルス（一価ワクチン）あるいは、多価ワクチンを製造するために、種々のフラビウイルス科ウイルス及び／又は同じフラビウイルス科ウイルスの異なる血清型若しくは異なるタイプのいずれかに由来する。
上記のcDNAは、1又は2のヌクレオチドのオープンリーディングフレームにおけるシフト（リボソームフレームシフト）により、フラビウイルス科ウイルスのコーディング配列に由来することもできる。このようなcDNAは、特にC型肝炎ウイルスのCタンパク質について当業者に公知である(Xuら, EMBO, 2001, 20, 3840〜3848; Rousselら, J. Gen. Virol., 2003, 84, 1751〜1759; Vassilakiら, J. Biol. Chem., 2003, 278, 40503〜40513; 国際出願WO 99/63941)。
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記のポリヌクレオチドは、表1に列挙するNCBIデータベースのアクセッション番号に相当するフラビウイルス科ウイルスのコーディング配列の断片である。
Figure 2008508863
種々のフラビウイルス科ウイルスタンパク質のコーディング配列の位置は、表1に列挙するアクセッション番号に相当する配列中に示され、これらはフラビウイルス科ウイルスゲノムのポリタンパク質のcDNA又はDNA等価物に相当する。
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記のポリヌクレオチド断片は：
a) 西ナイルウイルス又はデングウイルスのEタンパク質と、任意にprM若しくはMタンパク質及び／又はCタンパク質及び／又は非構造タンパク質とをコードするcDNA、並びに上記のタンパク質の少なくとも8アミノ酸の1又は複数の免疫原性ペプチドをコードするcDNA、
b) C型肝炎ウイルスのE1若しくはE2タンパク質若しくはE1/E2へテロダイマー、及び／又は0、＋1若しくは＋2リーディングフレームによるCタンパク質、及び／又はNS3タンパク質をコードするcDNA、並びに上記のタンパク質の少なくとも8アミノ酸の1又は複数の免疫原性ペプチドをコードするcDNA、並びに
c) 4つのタイプのデングウイルス(タイプ1〜4又はDEN-1〜DEN-4)のうちの1つにそれぞれ相当するデングウイルスのEタンパク質の1又は複数の異なるドメインIII (位置295〜394)をコードするcDNA、好ましくはその配列が添付の配列表の配列番号1〜4で表される4つのドメインIII (DEN-1〜DEN-4)をコードするcDNA
から選択される。
上記の使用の有利な規定によると、＋1又は＋2リーディングフレームによるCタンパク質をコードする上記のcDNAは、配列番号5〜14の配列からなる群より選択される。
本発明によると、上記の膜タンパク質(prM若しくはM)及び／又はエンベロープタンパク質(E、E1、E2)は、細胞表面の細胞質膜に位置する膜型、又は分泌型、すなわち細胞から細胞外媒質へ移出された形のいずれかで、上記で規定される組換えレンチウイルスベクターにより発現される。
さらに、フラビウイルス属prM及びEタンパク質が、組み換えベクターにより形質導入された(インビトロ又はインビボで)細胞で同時に発現される場合、これらは、細胞外媒質へ分泌されるウイルス擬似粒子(pseudoparticles) (又はウイルス様粒子；VLP)として集合する。このような粒子は、特に免疫原性であり、中和抗体の産生を誘導する。
上記の膜形をコードするcDNAは、その5'端に転写開始コドン(ATG)を含む、成熟タンパク質をコードする配列とそれに先立って小胞体での移動のためのシグナルペプチドをコードする配列とを含む。フラビウイルス属の場合、上記のシグナル配列は、有利にはMタンパク質前駆体(prM)に由来する。上記の分泌形をコードするcDNAは、膜固定(anchoring)領域が欠失された短縮された成熟タンパク質と、それに先立って上記で規定するシグナルペプチドとをコードする配列を含む。
例えば西ナイルウイルスの場合：
- 成熟Eタンパク質は、Genbank配列AAL87234を参照にするポリタンパク質配列の位置291〜791に相当する。対応するヌクレオチド配列は、Genbank配列AF481864を参照にする西ナイルウイルスのゲノムの配列において位置967〜2469に位置する；
- 膜固定領域が欠失された短縮された成熟Eタンパク質は、Genbank配列AAL87234を参照にする西ナイルウイルスのポリタンパク質の配列の位置291〜732に特に相当する。対応するヌクレオチド配列は、Genbank配列AF481864を参照にする西ナイルウイルスゲノムの配列の位置967〜2292に位置する；
- Mタンパク質前駆体由来の内部シグナルペプチドは、Genbank配列AAL87234を参照にするポリタンパク質の配列の位置275〜290に相当する。対応するヌクレオチド配列は、Genbank配列AF481864を参照にする西ナイルウイルスゲノムの配列の位置919〜966に位置する。
よって、西ナイルウイルスのEタンパク質の膜型、Eタンパク質の分泌型並びにPrM及びEタンパク質のをコードするcDNAは、それぞれ、上記で規定する上記のウイルスのゲノム配列の位置919〜2469、919〜2292及び399〜2469に相当する。
本発明の主題は、フラビウイルス科ウイルスの少なくとも1つの構造タンパク質又は該タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を含む組換えレンチウイルスベクターでもある。さらに、このようなベクターの使用の関係において上述したように、上記のベクターは、1又は複数の非構造タンパク質及び／又は該タンパク質の1又は複数の免疫原性断片をコードするcDNAをも有利に含む。上記のポリヌクレオチド断片は、上記の配列から特に選択される。有利には、上記の組換えレンチウイルスベクターは、三重らせんタイプのベクターである。さらに、上記の組換えレンチウイルスベクターは、U3領域からプロモータ及びアクチベータが欠失された3' LTRを有利に含むことができる。これは、別のウイルスの少なくとも1つのエンベロープタンパク質、好ましくは水疱性口内炎ウイルス(VSV)糖タンパク質Gで偽型にされたベクターである。
上記のベクターの有利な実施形態によると、これは、西ナイルウイルス又はデングウイルスの少なくとも1つのEタンパク質と、任意にprM若しくはMタンパク質及び／又はCタンパク質及び／又は非構造タンパク質をコードするcDNA、又は上記のタンパク質の少なくとも8アミノ酸の1又は複数の免疫原性ペプチドをコードするcDNAを含む。
上記のベクターの別の有利な実施形態によると、これは、C型肝炎ウイルスのE1若しくはE2タンパク質若しくはE1/E2へテロダイマー、及び／又は0、＋1若しくは＋2リーディングフレームによるCタンパク質と、任意にNS3タンパク質をコードするcDNA、又は上記のタンパク質の少なくとも8アミノ酸の1又は複数の免疫原性ペプチドをコードするcDNAを含む。
上記のベクターの有利な規定によると、＋1又は＋2リーディングフレームによるCタンパク質をコードする上記のcDNAは、配列番号5〜14の配列からなる群より選択される。
上記のベクターの別の有利な実施形態によると、これは、デングウイルスの4つのタイプ(タイプ1〜4又はDEN-1〜DEN-4)の1つにそれぞれ相当するデングウイルスのEタンパク質のドメインIII (位置295〜394)又はいくつかの異なるドメインIIIをコードするcDNAを含み、好ましくは、これは、添付の配列表の配列番号1〜4により表される配列の4つのドメインIII (DEN-1〜DEN-4)をコードするcDNAを含む。
上記のベクターの別の有利な実施形態によると、これは、西ナイルウイルスIS-98-ST1株のEタンパク質の分泌形をコードするcDNAを含む、pTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)とよばれるベクタープラスミドであり、該ベクターは、2003年8月27日に25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures of Microorganisms]に番号I-3076で寄託された微生物中に含まれる。
本発明は、上記で規定されるベクタープラスミド、及び該ベクター粒子に由来するベクター粒子、特に、別のウイルスの少なくとも1つのエンベロープタンパク質、例えば特に水疱性口内炎ウイルス(VSV)糖タンパク質Gで偽型にされたベクター粒子をも包含する。
上記で規定される組換えレンチウイルスベクターは、それら自体で公知である標準的なプロトコル、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc., Library of Congress, USA)に記載されるものに従う従来の方法により作製される。
より詳細には、ポリヌクレオチド断片は、フラビウイルス科ウイルスのゲノムRNA若しくはmRNA、又は上記に由来するcDNA若しくはDNA断片からなるマトリックスの増幅によるか、フラビウイルス科のウイルスのゲノムに特異的なプライマを用いるPCR又はRT-PCRによるか、又は制限酵素を用いるフラビウイルス科cDNAの消化によるか、又は完全又は部分的な化学合成によるかのいずれかで得ることができる。
このようにして得られるポリヌクレオチド断片は、レンチウイルスベクターゲノムを含むベクタープラスミドにクローニングして、組換えベクタープラスミドを作製する。
組換えレンチウイルスベクターの粒子(ベクター粒子)は、上記で規定する組換えベクタープラスミドと、トランスに構造タンパク質及びウイルス粒子の酵素を提供する包膜プラスミドと、任意に、偽型にされた粒子の産生のためにウイルス、例えばVSVのエンベロープ糖タンパク質を発現するためのプラスミドとを用いる細胞の同時トランスフェクションにより作製される。
本発明の主題は、上記で規定される少なくとも1つの組み換えベクターを含むことを特徴とする免疫原性組成物でもある。
上記の組成物の有利な実施形態によると、これは、医薬的に許容される媒体(vehicle)と、任意に担体物質とを含む。
上記の医薬的に許容される媒体及び担体物質は、従来用いられるものである。
上記の担体物質は、単層リポソーム、多層リポソーム、サポニンミセル又は糖若しくは金含有の性質の固体ミクロスフェアからなる群より有利に選択される。
上記の組成物の別の有利な実施形態によると、これは、好ましくは別のウイルスのエンベロープタンパク質、好ましくは水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Gで偽型にされた上記の組換えレンチウイルスベクターの粒子(ベクター粒子)を含む。
上記の組成物の別の有利な実施形態によると、これは、上記で規定する三重らせんタイプの組換えレンチウイルスベクターを含む。
上記の組成物の有利な規定によると、これは、三重らせんタイプの上記の組換えレンチウイルスベクターの組換えゲノムに対応する単離された核酸分子を含み、該核酸分子は：(i) 包膜、逆転写及び組込みのための調節配列と、レンチウイルス起源のセントラルイニシエーション(又はポリプリン配列；cPPT)及びセントラルターミネーション(CTS)のためのシス作用配列と、任意に、Revタンパク質(RRE又はRev結合要素)のための調節配列、及び(ii) 上記で規定するフラビウイルス科ウイルスタンパク質又は該タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を含む。
本発明によると、三重らせんタイプの上記のベクターは、その制御下に上記で規定するコーディング配列が挿入される、転写のための適切な調節要素(プロモータ、エンハンサー、コザックコンセンサス配列、ポリアデニル化シグナルなど)を含む発現カセットを含み、興味対象の該コーディング配列は、任意に、上記で規定する細胞輸送に要求されるシグナルを含む。
本発明による免疫原性又はワクチン組成物は、上記で規定する感受性の種(ヒト若しくは非ヒト哺乳動物宿主、又は保有体(鳥類、爬虫類))において、全身(経口、筋肉内、皮下、腹腔内又は静脈内)、局所(鼻腔内、その他の粘膜経路)、又はこれらの経路の組み合わせにより投与できる。
好ましくは、これらは、抗原提示細胞、例えば樹状細胞を標的としてこれらの細胞における抗原の延長された発現を得るために、皮下投与される。
あるいは、本発明の免疫原性又はワクチン組成物は、宿主種の自己細胞、特に抗原提示細胞、例えば樹状細胞を改変するのに用いられる。改変された細胞は、次いで、宿主に再投与される。このような使用は、ヒト又は非ヒト宿主哺乳動物におけるフラビウイルス科ウイルスでの感染の治療のために特に有利である。
ベクターの投与量は、投与経路により、及び治療される種(ヒト又は動物)の性質および体重により変動する。
本発明の主題は、上記で規定される組み換えベクターで改変された細胞でもある。好ましくは、上記の細胞は、上記の組み換えベクターで安定に改変された真核細胞である。フラビウイルス科ウイルスの少なくとも1つのタンパク質又は少なくとも1つの抗原性ペプチドを安定に発現するこのような細胞は：
- 上記の組換えレンチウイルスベクターの粒子(ベクター粒子)の産生のため、
- フラビウイルス科ウイルスのエンベロープタンパク質及び／又は膜タンパク質、特にフラビウイルス属prM及びEタンパク質に由来する、フラビウイルス科の組換えウイルスタンパク質、該タンパク質の免疫原性断片及びフラビウイルス科のもののタイプのウイルス擬似粒子(VLP、又はウイルス様粒子)の産生のため；該擬似粒子は、感染した個体の生物学的流体中に存在する特異的免疫グロブリンの免疫捕捉によるフラビウイルス科ウイルス感染の診断用の試薬として有利に用いられる、
- 抗ウイルス化合物のスクリーニングのため、及び
- 診断試薬として
有用である。
本発明によると、フラビウイルス科のウイルスタンパク質及び／又は該タンパク質の免疫原性断片又はウイルス擬似粒子は、次の工程：
a) 上記で規定する改変細胞を、上記の組換えレンチウイルスベクターによりコードされるフラビウイルス科の1又は複数のウイルスタンパク質及び／又は該タンパク質の1又は複数の免疫原性断片の発現を可能にする条件下で培養し、そして
b) a)における培養上清又は細胞から、いずれの適切な手段により、上記のタンパク質、タンパク質断片又は擬似粒子を分離する
により作製することが可能である。
この方法によると、ウイルスタンパク質又は断片の精製は、公知の技術、例えば：
・アフィニティクロマトグラフィー：ポリヒスチジンテイルをコードするヌクレオチド配列のようなタグをベクターに導入し、タンパク質をニッケルゲル(アガロースなど)のカラムを用いて精製する；
・イムノアフィニティクロマトグラフィー：興味対象のウイルス配列を、C-末端又はN-末端で、エピトープ配列をタンパク質から後で分離するために酵素、例えばトロンビンによる切断のための部位を含むペプチドエピトープをコードするヌクレオチド配列に融合させる。有用なエピトープは、例えば、C9エピトープ(TETSQVAPA) (Mirzabekov T.ら, J. Biol. Chem., 1999, 274, 28745〜28750)又はmycエピトープである。発現されたタンパク質は、上記のエピトープに特異的な抗体(C9エピトープに対して1D14、mycエピトープに対して9E10)が結合したアフィニティカラム上で精製され、興味対象のタンパク質は、トロンビンを用いる切断により分離される；
・沈殿剤、例えばポリエチレングリコールを用いる沈殿、次いでタンパク質をペレットで回収するための遠心分離
により、上記で規定される組み換えベクターを用いて改変した細胞の培養上清又は溶解物から行うことができる。
この方法によると、フラビウイルスのもののタイプの粒子の精製は、公知の技術、例えば：
・沈殿剤、例えばポリエチレングリコールを用いる沈殿、次いで擬似粒子をペレットで回収するための遠心分離
・特にスクロース勾配での連続又は不連続勾配遠心
により、上記で規定される組み換えベクターを用いて改変した細胞の培養上清から行われる。
本発明の主題は、
- 上記で規定する組み換えベクター、特にフラビウイルス科ウイルスの非構造タンパク質、例えばNS3 (ヘリカーゼ又はプロテアーゼ)又はNS5 (ポリメラーゼ) をコードするcDNAを用いて改変した真核細胞を、試験すべきライブラリの種々の化合物と接触させ、そして
- いずれの適切な手段により、上記の化合物の存在下又は非存在下に、上記のタンパク質の活性(ヘリカーゼ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ)を測定し、そして
- 上記の活性を変更(活性化又は阻害)できる化合物を選択する
ことを含むことを特徴とする、抗ウイルス化合物をスクリーニングする方法でもある。
この活性は、当業者に知られた従来の方法、例えば特にBorowskiら, Acta Biochimica Polonica, 2002, 49, 597〜614; Steffensら, J. Gen. Virol., 1999, 80, 2583〜2590; Ryanら, J. Gen. Virol., 1998, 79, 947〜959; Bretnerら, Antivir. Chem. Chemother., 2004, 15, 35〜42に記載されるものにより評価される。
好ましくは、スクリーニングは、特定の標的組織、特に樹状細胞、神経細胞又は肝細胞に対して行われる。
本発明の主題は、感受性の種の個体からの生物学的流体試料を用いてフラビウイルス科ウイルスでの感染を診断する方法であり、少なくとも以下の工程：
a) 上記の生物学的試料を、上記で規定する少なくとも1つのフラビウイルス科ウイルス抗原(C、E、E1、E2、prM、M、NS (特にNS1))を発現する、任意に透過性にされた改変真核細胞と接触させ、
b) いずれの適切な手段により、例えばEIA、ELISA若しくはRIA又は免疫蛍光により、(a)で形成された抗原−抗体複合体を明らかにする
を含むことを特徴とする方法でもある。
本発明の主題は、感受性の種の個体からの生物学的流体試料を用いてフラビウイルス科ウイルスでの感染を診断する方法であり、少なくとも以下の工程：
a) 上記の生物学的試料を上記で規定する少なくとも1つの膜タンパク質及び／又はエンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスベクターを用いて改変された細胞の培養上清から得られるウイルス擬似粒子と接触させ、そして
b) いずれの適切な手段により、例えばEIA、ELISA若しくはRIA又は免疫蛍光により、(a)で形成された抗原−抗体複合体を明らかにする
を含むことを特徴とする方法でもある。
本発明の主題は、上記で規定される改変細胞を少なくとも含むことを特徴とする、上記で規定される方法を行うためのキットでもある。
本発明の主題は、上記で規定される組み換えベクターの、好ましくは皮下での単回投与を含むことを特徴とする、フラビウイルス科ウイルスに対する免疫化方法でもある。
上記の規定の他に、本発明は、本発明による組換えベクターの製造及び該ベクターの免疫化のための使用、並びにタンパク質の産生のための誘導される改変細胞の実施例及び添付の図面に言及する以下の記載から明らかになるその他の規定をも含む。図面において：
- 図1は、西ナイルウイルスの短縮Eタンパク質(E 1〜411) (配列番号17)をコードするcDNA (配列番号16)を含む、配列番号15の配列に相当するベクタープラスミドpTRIPΔU3CMV-sE(WNV)の模式図である。
- 図2は、1μgのTRIPΔU3CMV-sE(WNV)ベクター粒子の単回腹腔内注射で免疫されたマウスからの血清のELISA及び中和アッセイによる分析を示す。
- 図3は、西ナイルウイルスで感染させたVERO細胞の溶解物の、1μgのTRIPΔU3CMV-sE(WNV)ベクター粒子で免疫にされたマウスの血清との免疫沈降を、コントロール血清との比較で表す。
レーン1〜10：西ナイルウイルスで感染させたVERO細胞の溶解物を、次の血清を用いて沈降させた：
- レーン1： TRIPΔU3CMV-GFPベクターで免疫後D14での血清、
- レーン2： TRIPΔU3CMV-GFPベクターで免疫後D23での血清、
- レーン3： ポリクローナル抗西ナイルウイルス(IS-98-ST1株)腹水、
- レーン4： 非免疫血清、
- レーン5： TRIPΔU3CMV-sE(WNV)ベクターで免疫後D14での血清、
- レーン6: TRIPΔU3CMV-sE(WNV)ベクターで免疫後D23での血清、
- レーン7: TRIPΔU3CMV-sE(WNV)ベクターで14日間免疫されたマウスからの、攻撃後D22での血清(IS-98-ST1株を10 LD50)、
- レーン8： TRIPΔU3CMV-sE(WNV)ベクターで14日間免疫されたマウスからの、攻撃後D30での血清(IS-98-ST1株を10 LD50)、
- レーン9： TRIPΔU3CMV-sE(WNV)ベクターで30日間免疫されたマウスからの、攻撃後D22での血清(IS-98-ST1株を100 LD50)、
- レーン10： リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスで免疫されたマウスからの血清。
レーン11及び12：非感染VERO細胞の溶解物を、次の血清を用いて沈降させた：
- レーン11： ポリクローナル抗西ナイルウイルス(IS-98-ST1株)腹水
- レーン12: TRIPΔU3CMV-sE(WNV)ベクターで30日間免疫されたマウスからの、攻撃後D22での血清(IS-98-ST1株を100 LD50)。
- 図4は、腹腔内免疫され、次いで免疫後2週間で10 LD50のIS-98-ST1株によるか(A)、又は免疫後4週間で100 LD50のIS-98-ST1株によるか(B)のいずれかで同じ経路により攻撃されたマウスの生存曲線を表す。●：DPBSを接種されたコントロールマウス。▲：1μgのTRIPΔU3CMV-EGFPベクター粒子で免疫されたコントロールマウス。■：1μgのTRIPΔU3CMV-sE(WNV)ベクター粒子で免疫されたマウス。
- 図5は、西ナイルウイルスのprM及びEタンパク質を発現する組換えレンチウイルスベクターで形質導入された真核細胞の上清からのウイルス擬似粒子の精製を示す。
- 図6は、TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)ワクチン接種された129マウスからの血清中の抗WNV-sE抗体の検出を説明する。WNV感染ベロ細胞からの放射性標識された細胞溶解物を、レンチウイルスベクターをワクチン接種した129マウスからのプールした免疫血清と免疫沈降させた。(A) WNV攻撃前の血清。(B) 攻撃後の血清。HMAF = 高度免疫マウス腹水(Hyperimmune Mouse Ascitic Fluid)。コントロール血清 = 非免疫血清。MVに対する抗血清 = 麻疹ウイルスに対する抗血清。TRIP/WNsE = TRIPΔU3.CMVsE(WNV)。TRIP/GFP = TRIPΔU3.CMV-GFP。
- 図7は、組換えレンチウイルスベクター形質導入効率に対する加熱処理の効果のフローサイトメトリによる分析を示す。293T細胞を、70℃で10分間熱不活化した(加熱TRIP/GFP)か、又は不活化しなかった(TRIP/GFP) TRIPΔU3.CMV-GFPベクターとインキュベートした。非感染293T細胞(模擬)をコントロールとして用いた。48時間で、GFP蛍光強度を測定した。GFP陽性細胞のパーセンテージを示す。
実施例1：TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)組換えベクターの作製
1) pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)ベクタープラスミドの構築
ポリタンパク質(出願FR 01 04599及びGenbank AAL87234)の位置291〜732のアミノ酸に相当する、西ナイルウイルスIS-98-ST1株(出願FR 01 04599及びGenbank AF481864)のゲノムの位置967〜2292のヌクレオチド配列を示すcDNAを、下線部にBsiW部位を含むセンスプライマ：5'-TATCGTACGATGAGAGTTGTGTTTGTCGTGCTA-3' (配列番号18)と、下線部にBssH II部位を含むアンチセンスプライマ：5'-ATAGCGCGCTTAGACAGCCCTTCCCAACTGA-3' (配列番号19)とを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。添付の配列表の配列番号16の配列に相当するこのcDNAの境界は、5'位でBsiW I部位、及び3'位でBssH II部位となる。配列番号16の配列は、5'から3'に連続して：ATG、Mタンパク質前駆体由来のシグナルペプチド(prM 151〜166)をコードする配列、及び膜固定領域が欠失された短縮Eタンパク質(E 1〜441)をコードする配列を含む。これは、細胞外媒質へ分泌されるEタンパク質(sEタンパク質)をコードする。prMタンパク質由来のシグナルペプチドは、小胞体におけるEタンパク質の移動及び分泌小胞中での細胞質膜へのその輸送(ここでこれは細胞外媒質に放出される)のために用いられる。
レンチウイルスベクタープラスミドpTRIPΔU3.CMV EGFP (出願WO 01/27302)は、EGFP遺伝子を切り出すように消化され、次いで、直鎖状にされたプラスミドをBsiW I及びBssH II部位を含むリンカーとライゲーションして、pTRIPΔU3.CMV-BsiW I-BssH IIとよばれるプラスミドを得た。上記で得られたcDNAの、sEタンパク質構築物を含む1.4 kbのBsiW I-BssH II断片を、プラスミドpTRIPΔU3.CMV-BsiW I-BssH IIの同じ部位にクローニングして、pTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)又はpTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)とよばれる組換えレンチウイルスベクタープラスミドを得た(図1及び配列番号15)。pTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクタープラスミドで形質転換した大腸菌(E. coli)を、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures of Microorganisms]に、2003年8月27日に、番号I-3076の下で寄託した。
pTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)組換えベクタープラスミドの適合性を、酵素制限及びsEタンパク質構築物に相当する挿入断片を配列決定することにより確かめた。
1.4 kbのBsiW I-BssH II挿入断片の配列は、添付の配列表の配列番号16のヌクレオチド配列に相当する。これは、添付の配列表の配列番号17のアミノ酸配列に相当する、sEとよばれる分泌されるEタンパク質をコードする。
2) 水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質(VSV-G)で偽型にされたTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクターのウイルス粒子の作製
ヒト繊維芽293T細胞(ATCC)を、10%胎児ウシ血清(FCS)を補ったダルベッコ変法イーグル培地(DMEM) Glutamax (GIBCO)中に増殖させる。TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子ともよばれる、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質(VSV-G)で偽型にされたTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクターのウイルス粒子は、Zennouら, Cell., 2000, 101, 173〜185に説明されるように、293T細胞系統を、上記で規定するpTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクタープラスミドと、トランスに構造タンパク質とウイルス粒子の酵素とを提供する包膜プラスミド(pCMVΔR8.2: Naldiniら, Science, 1996, 272, 263〜267; pCMVΔR8.91又はp8.7: Zuffereyら, Nat. Biotechnol., 1997, 15, 871〜877)と、VSVウイルスエンベロープ糖タンパク質の発現用プラスミド(pHCMV-G: Yeeら, P.N.A.S., 1994, 91, 9564〜9568)とでリン酸カルシウム同時トランスフェクションすることにより作製される。
3) 組換えTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクターによる、WNVのE糖タンパク質の分泌型(WNV-sE)の発現
レンチウイルスベクターを形質導入された293T細胞におけるWNV-sEの発現を、間接的免疫蛍光により調べた。簡単に、8チャンバのGlass-Labteks (NUNC)で培養したヒト293T細胞を、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクターを用いて形質導入した。48時間後に、細胞をPBS中の3%パラホルムアルデヒド(PFA)で20分間固定し、PBS中の0.1% Triton X-100で4分間透過性にした。細胞を、PBS中の1：100期尺の抗WNV HMAFと1時間インキュベートした。PBS中の0.2% BSAでブロッキングした後、細胞をPBS 0.2% BSA中の1：500希釈のCy3-複合化抗マウスIgG抗体(AMERSHAM PHARMACIA)とさらにインキュベートした。細胞核をDAPIを用いて視覚化した。スライドを、Zeiss Axioplan顕微鏡をApoTomeシステムとともに用いて、調べた。
形質導入の48時間後に、細胞の多くの(high)画分が免疫染色された。免疫染色パターンは、WNV-sEが分泌経路を通して移動したことを示唆する。
4) 組換えTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクターの力価測定(titration)
4.1) 材料及び方法
a) ELISAによるp24抗原力価測定
濃縮したベクター粒子のp24抗原含量の定量を、市販のHIV-1 p24 ELISAキット(PERKIN ELMER LIFESCIENCES)を用いて行った。
b) 定量的PCR
プライマとプローブを、PROLIGOにより合成した。レンチウイルスベクター中のU5-R配列の検出のために、用いたプライマ及びプローブ(Brussel A及びSonigo P, J. Virol., 2003, 77, 10119〜10124)は、次のとおりである(配列番号20〜27)：
- プローブ(3'フルオレセイン(PITC)又はリン酸化(P))
LTR-FL：5'-CACAACAGACGGGCACACACTACTTGA-FITC-3'
LTR-LC：5'-RED640-CACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC-P-3'
- プライマ
AA55M：5'-GCTAGAGATTTTCCACACTGACTAA-3'
M667：5'-GGCTAACTAGGGAACCCACTG-3'。
CD3の検出のためのプライマ及びプローブの配列は、次のとおりであった：
- プローブ
CD3-P1：5'-GGCTGAAGGTTAGGGATACCAATATTCCTGTCTC-FITC-3',
CD3-P2：5'RED705-CTAGTGATGGGCTCTTCCCTTGAGCCCTTC-P-3'
- プライマ
CD3-in-F：5'-GGCTATCATTCTTCTTCAAGGTA-3'
CD3-in-R：5'-CCTCTCTTCAGCCATTTAAGTA-3'。
約3.106レンチウイルスベクターを形質導入した293T細胞からのゲノムDNAを、形質導入の48時間後に、QIAamp (登録商標) DNA Blood Mini Kit (QIAGEN)を用いて単離した。リアルタイムPCR分析のために、5μLのDNAを、1×Jumpstart (商標) Taq ReadyMix (商標) (SIGMA)、1.9mM MgCl2、1.5μMのフォワード及びリバースプライマ(AA55M/M667又はCD3-in-F/CD3-in-R)、200nMのプローブ(LTR-FL/LTR-LC又はCD3-P1/CD3-P2)及び1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)からなる15μLのPCRマスターミックスと混合した。増幅は、95℃で3分間を1サイクル、及び95℃で5秒、55℃で15秒及び72℃で10秒の40サイクルを用いて行った。ベクターストックのプラスミド汚染の可能性を考慮に入れて、加熱不活化した(70℃で10分間)ベクターで形質導入した293T細胞からのDNAを、常に平行して試験した。ネガティブコントロールとして、形質導入していない細胞からのゲノムDNA 5μLを用いた。各DNA試料を二重で試験し、平均値を報告する。関連する配列U5-R及びCD3を含む既知の濃度のプラスミドpTripCD3の10倍連続希釈を、DNA試料と平行して増幅させて標準曲線を作製した。
細胞当たりのベクターコピーの全体数を、同じゲノムDNA試料についてのCD3分子のコピー数により定量化されるように、U5-Rコピーの数を293T細胞の数に対して標準化し、加熱不活化ベクターを形質導入した細胞について得られたコピー数を減ずることにより、算出した。
4.2) 結果
この研究に用いたベクターストックの物理的粒子の数を、市販で入手可能なELISAアッセイをp24 HIV-1カプシドタンパク質に対して用いることにより、まず評価した。測定された濃度は、マイクロリットル当たり58 ngのp24であった。
ベクターストックの実際の力価を、定量PCRアッセイを用いて、標的細胞へのベクターDNAの移入に基づいて算出した。ベクター特異的配列(U5)及び細胞遺伝子座(CD3)の両方の定量は、細胞当たり平均的なDNAベクターコピー数を示す。このことは、ベクター粒子の規定された濃度を用いた形質導入の後の、ベクター調製物の力価の計算を可能にする。この研究において用いたTRIPΔU3.CMV-sEベクターストックは、ヒト293T細胞を、ml当たり5.2×107形質導入単位(TU)で滴定した。言い換えると、このTRIPΔU3.CMV-sEベクター調製物からのp24抗原1 ngが、900個のヒト293T細胞を形質導入できる。
単純化のために、以下の部分では、用いたベクター粒子の量をp24抗原のngで表す。
実施例2：BALB/cマウスでのTRIPΔU3.CMV-sEベクターの免疫原性能力の分析
1) 材料及び方法
1.1) 免疫化／ワクチン接種プロトコル
6週齢のBALB/cマウス(6匹のマウスの2群；Janvier繁殖コロニー)に、実施例1のようにして作製した1μgのTRIPΔU3.CMV-sEベクター粒子を含有する0.1 mlのダルベッコのPBS (DPBS)を腹腔内接種した。動物には、単回ワクチン注射を与えた。
コントロール群には、同じ条件下で、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクターと同様の方法で作製した1μgのTRIPΔU3.CMV-GFPベクター粒子(3匹のマウスの2群)、又はDPBS緩衝液のみ(3匹のマウスの2群)のいずれかを接種した。
マウスの血清を、ワクチン注射の14日(D14)及び23日(D23)後に採取し、抗体応答の測定の前に56℃で30分間加熱不活化した。
1.2) 西ナイルウイルス株、精製及び力価
用いた西ナイルウイルス株は、IS-98-ST1株であり、出願FR 01 04599に記載される。これは、ヤブカ属のカの細胞(AP61系統)で産生され、Despresら, Virol., 1993, 196, 209〜219に記載されるプロトコルにより精製される。より詳細には、AP61細胞に、0.4の感染多重度で、西ナイルウイルスのIS-98-ST1株を感染させる。感染の3日後に、培養上清に存在するウイルス粒子をPEG 6000 (7%)を用いて沈殿させ、次いで、不連続の30〜60%スクロース勾配及び10〜50%の直線スクロース勾配で精製する。このようにして得られるビリオンを、スクロース(30%)中に−80℃で保存する。
西ナイルウイルスは、上記のDespresらにより記載されるプロトコルに従って、AP61細胞でのフォーカスイムノアッセイ(FIA)により力価測定され、感染力価はフォーカス形成単位(FFUAP61/ml)として表す。
精製されたウイルス調製物の感染力価は、約1010 FFUAP61/mlである。
1.3) 抗WNV高度免疫腹水
抗WNV高度免疫マウス腹水(HMAF)を、成体のマウスをWNVのIS-98-ST1株で反復免疫化し、続いて肉腫180を接種することにより得た。マウスポリクローナル抗WNV抗体を、成体のWNV耐性BALB/c-MBT類似遺伝子系マウスを103 FFUのIS-98-ST1で以前に記載されたようにして(Mashimoら, PNAS, 2002, 99, 11311〜11316)免疫することにより得た。WNV-免疫血清は、初回抗原刺激の1ヵ月後に回収した。
1.4) ELISA
抗E全抗体力価を、Mashimoら, PNAS, 2002, 99, 11311〜11316に記載されるプロトコルに従って、段落1.2に記載されるようにしてスクロース勾配で精製したWN IS-98-ST1ビリオンを抗原として用いるELISAにより測定する(96ウェルマイクロプレート当たり106 FFUAP61)。1：4000希釈でのペルオキシダーゼ複合化抗マウス免疫グロブリン(H＋L) (JACKSON IMMUNO RESEARCH)、1：20000でのペルオキシダーゼ複合化抗マウスIgM (μ鎖特異的) (SIGMA)、又は1：20000希釈でのペルオキシダーゼ複合化抗マウスIgG (γ鎖特異的) (Sigma)を二次抗体として用いた。力価は、上記で規定するように、コントロールマウスからの血清の光学密度(OD)の少なくとも2倍のOD値に相当する血清の最終希釈により決定する。抗E IgG及びIgM抗体も、すでに記載されたアイソタイプ特異的ELISAを用いて測定する(Despres Pら, J. Infect. Dis., 2005, 191, 207〜214)。
1.5) 免疫沈降(RIPアッセイ)
実験プロトコルは、Despresら(J. Virol., 1995, 69, 7345〜7348)に記載されるとおりである。より詳細には、VERO細胞を、西ナイルウイルスのIS-98-ST1株を5 FFUAP61/細胞の感染多重度で用いて感染させる。感染の20時間後に、細胞タンパク質をTran35Slabel (ICN；100μCi/ml)で3時間標識する。冷PBSで3回洗浄後、細胞を、25μg/mlのアプロチニン(SIGMA)を補ったRIPA緩衝液(50 mM Tris-Cl、pH 8.0、150 mM NaCl、10 mM EDTA、0.1% SDS、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1% Triton X-100)中に＋4℃で10分間溶解させる。細胞溶解物を、＋4℃で10000 rpm、5分間の遠心分離により澄明にする。溶解物を、プロテインAセファロースの存在下に1：100の最終希釈で、試験すべき血清とインキュベートする。次いで、免疫沈降物を、非還元条件下のSDS-15% PAGEゲルで分析し、オートラジオグラフィで明らかにする。
1.6) 中和試験
西ナイルウイルスのIS-98-ST1株についての、免疫されたマウスからの血清の中和活性を、VERO細胞(ATCC)でのウイルス複製フォーカスにおける減少により測定した。より詳細には、56℃で30分間不活化した血清の連続希釈(0.1 ml)を、西ナイルウイルスのIS-98-ST1株の接種物(0.1 ml 中に100 FFUAP61)の存在下でインキュベートする。VERO細胞(12ウェルプレートのウェル当たり1.5×105細胞)を、次いで、混合物を用いて37℃で2時間感染させ、ウイルス複製フォーカスを、感染後2日で計数する。TNRF90 (ウイルス複製フォーカスにおける90％減少による中和試験(Test for Neutralization by 90% Reduction in viral replication Foci))とよばれる血清の中和抗体力価を、各ウェルに接種した100 FFUのウイルスの少なくとも90を中和する血清の最終希釈により決定する。
2) 結果
2.1) 免疫された動物からの血清の西ナイルウイルスについての反応性のELISAによる分析
西ナイルウイルスのEタンパク質に対して指向された抗体の産生を、精製西ナイルウイルスを抗原として用いて、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子の注射後14及び23日で採取したマウス血清について行うELISAアッセイにより確かめた。
図2に示す結果は、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子で免疫されたマウスからの血清の特異的抗体の力価が、ワクチン注射の14日及び23日後にそれぞれ1/10000及び1/20000であることを示す。
2.2) 免疫された動物からの血清の特異性の免疫沈降による分析
TRIPΔU3.CMV-sEベクターで免疫された動物からの血清の特異性を、免疫沈降により確かめた。TRIPΔU3.CMV-sEベクターで免疫された動物からの血清は、西ナイルウイルスのエンベロープタンパク質Eと反応する。反応性は、ワクチン注射後D14よりもD23でより強い(図3)。
2.3) 免疫された動物からの血清の西ナイルウイルスについての中和活性の分析
TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子の単回注射で免疫されたマウスからの血清の西ナイルウイルスについての中和活性を、VERO細胞でのウイルス複製フォーカス(TNRF90)における減少を測定することにより実験的に確かめた。ワクチン注射後D14及びD23での力価は、それぞれ10及び20である(図2)。
実施例3：BALB/cマウスにおけるTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクターの防御能力の分析
マウスをTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子で免疫した後に産生される抗Eタンパク質抗体の防御的役割を、WNV関連脳炎のマウスモデルにおいて試験した(Deubelら, Ann. N.Y. Acad. Sci., 2001, 951, 195〜206; Mashimoら, 2002, 上記; 国際出願WO 02/081511; Ceccaldiら, FEMS Microbiol. Lett., 2004, 233, 1〜6)。つまり、マウスを、西ナイルウイルスの高度に神経侵襲性及び神経毒性のIS-98-ST1株10 LD50 (マウスの50%において致死的である用量)又は100 LD50の腹腔内接種により攻撃した。
より詳細には、2つの攻撃プロトコルを用いた。(i) 実施例2に記載のようにして免疫した6匹のマウスの第一群は、ワクチン注射の15日後(D15)に10 LD50のIS-98-ST1株を受けた。(ii) 実施例2に記載のようにして免疫した6匹のマウスの第二群は、ワクチン接種の30日後(D30)に100 LD50のIS-98-ST1株を受けた。攻撃ウイルスは、0.2%のウシ血清アルブミン(Sigma)を補ったDPBS (pH 7.5)で希釈する。1 LD50は10 FFUAP61/mlに相当する。
マウスの第一群の生存曲線(図4A)は、DPBS又はTRIPΔU3.CMV-EGFPベクターを接種した全てのコントロールマウスが、ウイルス攻撃用量の接種の後13日で死亡することを示す。一方、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクターで免疫した6匹のマウスは、致死用量に耐性であり、罹患を示さない。
攻撃の22日後に、耐性マウスは、ELISAにより抗西ナイルウイルス抗体力価(1.7±0.1、希釈1：104)を有し、これは攻撃前に得られたものよりも大きい。攻撃されたマウスからの血清は、西ナイルウイルスのEタンパク質と強く反応し(図3)、中和抗体は、攻撃の1ヵ月後に100の力価を有する。
マウスの第二群についての生存曲線(図4B)は、DPBS又はTRIPΔU3.CMV-EGFPベクターを接種した全てのコントロールマウス(DPBS)は、ウイルス攻撃用量の接種後9日以内に死亡することを示す。一方、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクターで免疫された6匹のマウスは、致死用量に耐性であり、罹患を示さない。マウスの第一群と同様に、攻撃されたマウスからの血清は、西ナイルウイルスのEタンパク質と強く反応し(図3)、中和抗体は、攻撃の1ヵ月後に100の力価を有する。
さらに、攻撃されたマウスからの抗体の反応性が、西ナイルウイルスの非構造タンパク質について存在しないことは(図3)、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクターにより誘導される防御免疫が攻撃ウイルスでの感染を防ぐのに充分であることを示唆する。
結果は、成体マウスへの少量のTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子の単回投与は、免疫化の2週間後に中和抗体の産生を誘導し、末梢接種された西ナイルウイルスでの致死攻撃に対して防御免疫を与えることを示す。
実施例4：TRIPΔU3.CMV-prM-E (WNV)組換えベクターを用いるウイルス擬似粒子の作製
1) TRIPΔU3.CMV-prM-E (WNV)ベクターの作製
ゲノム配列(出願FR 01 04599及びGenbank AF481864)の位置399〜2469に相当する、西ナイルウイルスのIS-98-ST1株のprM及びEタンパク質をコードするcDNAを含む、三重らせんタイプの組換えHIVベクターを、実施例1に記載のようにして構築した。TRIPΔU3.CMV-prM-E (WNV)組換えベクターで形質導入された安定系統を、実施例1に記載のようにして得た。
2) ウイルス擬似粒子又はVLPの作製
TRIPΔU3.CMV-prM-E (WNV)ベクターで形質導入された細胞の培養上清を回収し、静かに攪拌しながら4℃で4〜5時間、PEG 6000 (Fluka, 7% W/V)を用いて沈殿させる。得られた沈殿物を、9000 rpmで4℃で30分間遠心分離し、VLPを含有するペレットを4 mlのTNE (20 mM Tris-HCl、pH 8.0；150 mM NaCl；2 mM EDTA)中に採取し、不連続のスクロース勾配(1×TNE中に20%〜60%スクロース)で析出させる。勾配を39000 rpmで2時間遠心分離し、20〜60%界面で乳白色のバンドを回収し、直線勾配(1×TNE 中に11〜55%スクロース)で析出させ、35000 rpmで16時間遠心分離する。勾配画分を回収し(0.5 mlの11の画分)、抗WNV免疫血清(1：20)を用いるELISA、SDS-PAGEゲル電気泳動及びクマーシーブルー染色、並びに抗WNV免疫血清を用いるウェスタンブロッティングにより分析する。図5に示すELISAの結果は、勾配の6〜10の画分に精製VLPが存在することを示す。
実施例5：129マウスでのTRIPΔU3.CMV-sEベクターの免疫原性能力及び防御能力の分析
1) 材料及び方法
1.1) 免疫化／ワクチン接種プロトコル
6〜8週齢の129マウス(6匹のマウスの6群)を、実施例1に記載のようにして調製し、0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)を補った0.1 mlのダルベッコのPBS (DPBS；pH 7.5)で希釈した種々の用量のTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子で腹腔内(i.p.)接種した。
動物は、単回ワクチン注射を受けた。
コントロール群には、同じ条件下で、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子と同様の方法で作製されたTRIPΔU3.CMV-GFPベクター粒子の500 ngのp24抗原等価物(6匹のマウスの1群)、又はDPBS緩衝液のみ(6匹のマウスの1群)を接種した。
マウスを、免疫後6、13、20又は27日(D6、D13、D20、D27)に眼窩周囲で採血し、プールした血清を56℃で30分間加熱不活化した後に、実施例2に記載のようにして抗WNV全抗体、IgG及びIgM、並びにインビトロ中和活性を測定した。
WNV攻撃を、実施例2のようにして作製された神経毒性WNV IS-98-ST1株のi.p.接種により行った。続いて、動物を、免疫後7又は14日でWNV IS-98-ST1株の1000 LD50 (i.p. LD50 =10 FFU)を用いてi.p.攻撃した。攻撃したマウスを、21日目まで、罹患又は死亡の徴候について監視した。
1.2) フローサイトメトリアッセイ
25 cm2フラスコで培養した293T細胞を、70℃で10分間加熱不活化したか、又は処理していない(ポジティブコントロール)かのいずれのTRIPΔU3.CMV-GFPベクター粒子で形質導入した。48時間後に、細胞をはがし、洗浄し、2% PFAで固定した。GFP蛍光強度をFACSスキャンにより測定し、CellQuestソフトウェアで分析した。
2) 結果
個体間の免疫応答の変動を考慮に入れるために、BALB/cマウスよりも類似遺伝子系でない129マウスを、WNV-sEを発現するレンチウイルスベクターにより誘導される体液性免疫応答を評価するために選択した。
2.1) TRIPΔU3.CMV-sEベクター粒子の腹腔内注射に続く、強い抗体応答
500 ngのp24抗原に等価なTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子の単回用量で免疫された129成体マウスにおいて、WNVに対する全抗体は、低濃度ではあるが、免疫後6日の早さで検出可能であった。比べると、TRIPΔU3.CMV-GFPで免疫したマウスの血清中に抗WNV抗体は検出されなかった。この時点で予測されたように、体液性応答はIgM抗体に対応し、IgG抗体に対応しなかった。全抗体応答は、第13日に10倍に増加してプラトーに達し、時間がたっても維持された。これらのより後の時点(第13、20、27日)において、IgM抗体は消滅して、IgGに置換された(表2)。
Figure 2008508863
これらの抗体は、RIPアッセイにより示されるように、IS-98-ST1を感染させたベロ細胞溶解物からのWNV E-糖タンパク質と反応性であった(図6A)。フォーカス低減中和試験(Focus Reduction Neutralization Test；FRNT)は、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)で免疫したマウスからの血清が、免疫後6日の早さで検出可能なレベルのWNV中和抗体を含有していたことを示した(表2)。これらのデータはともに、早期の特異的な抗WNV抗体免疫応答が、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子で免疫されたマウスで開始されることを示す。
2.2) 高用量のWNV攻撃に対するTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ワクチン接種によりマウスに付与される早期の防御
500 ngのp24抗原に等価なTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子の単回用量で免疫したマウスは、免疫後7日の早さで高ウイルス攻撃に対して完全に防御された。なぜなら、この群において罹患又は死亡が観察されなかったからである(表3)。
Figure 2008508863
ウイルス攻撃において用いられる感染性ウイルス用量は、カにかまれることにより伝染され得る最大限のウイルス接種物に相当するように選択した。この用量は、10000インビトロFFUに相当すると見積もられ(Despresら, J. Infect. Dis., 2005, 191, 207〜214; Mashimoら, 2002, 上記)、それ自体は、腹腔内経路による1000インビトロLD50に相当する。
コントロールベクター TRIPΔU3.CMV-GFP又はDPBSで免疫された全てのマウスは、攻撃の11日以内に全て死亡した(表3)。興味深いことに、WNVに対する全抗体は、攻撃後に10倍に増加し、このことは、効果的な二次応答が、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)で免疫されたマウスで開始されたことを示唆する(表3)。等しい結果が、BALB/cマウスで得られた。これらの結果は、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ワクチン接種が、高いWNV攻撃に対して非常に速い完全防御免疫応答を付与することを示す。このことは、感受性の種の防御が緊急事態である大発生の関係において、かなり重要であり得る。
2.3) レンチウイルスベクターワクチンにより与えられる免疫性は、排除性である(sterilizing)
攻撃により、ワクチン接種された動物において、WNVの第一の感染(primo-infection)が起こるか否か、すなわち、惹起された免疫応答が、排除性防御免疫を与えるかを調べるために、WNV攻撃の前及び21日後に回収された、免疫されたマウスからのプールした血清についてRIPアッセイを行った。500 ngのp24抗原に等価なTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子の単回用量で免疫後13、20及び27日目に得られた血清は、WNVのEタンパク質と反応した。しかし、免疫後第6日から得られた血清はこのタンパク質と反応しなかった(図6A)。RIPアッセイはIgMの検出ができないので、このことは、p.i.第6日ではWNVに対するIgM抗体のみが存在し、IgG抗体は存在しないことを示すELISAの結果と一致する。TRIPΔU3.CMV-GFPで免疫されたマウスからの血清は、WNV Eタンパク質と反応しなかった。
興味深いことに、WNV E以外のいずれのウイルスタンパク質に対する抗体も、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ワクチン接種されたマウスからの攻撃後の血清から検出されなかった(図6B)。WNV非構造タンパク質に対する抗体が存在しないことは、全てのTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ワクチン接種されたマウスにおいてウイルス複製が起こらなかったことを強く示唆する。よって、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)のワクチン接種は、マウスに完全排除性免疫性を与える。
このことは、ワクチンを鳥の免疫化に用いる場合に重要な利点を表す。実際に、ウマ、ヒト及びその他の哺乳動物はWNV感染の終端の宿主であると考えられているが、鳥類は、増幅宿主であることが知られており、流行の維持に関与する(Dauphinら, Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 2004, 27, 343〜355)。
2.4) TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)の単回免疫化により与えられる防御は、長期持続する。
TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)レンチウイルスベクターベースのワクチンの単回免疫化がWNVに対する長期間の防御免疫を惹起する能力があるかを決定するために、免疫化129マウスからのプールした血清を、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ワクチンの注射から3ヵ月後にELISA及びFRNTにより試験した。
500 ngのp24抗原に等価なTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子の単回用量で免疫したマウスでの抗体レベルは、注射後3ヶ月でも著しく高く(1：30000)、中和抗体は持続していた(表4)。
Figure 2008508863
TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)で免疫され、その後、1000 LD50用量のIS-98-ST1 WNVでi.p.攻撃されたマウスでは、罹患も死亡も観察されなかったが、コントロールマウスは全て死亡した(表4)。抗体全力価及び中和抗体は攻撃後に増大し、このことは有効な二次応答が、TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)で3ヶ月前に免疫されたマウスで開始されたことを示唆する(表4)。このことは、WNV-sEをコードするレンチウイルスベクターでの単回免疫化が、マウスにおいて長期持続する防御免疫を提供するのに充分であることを示す。
2.5) TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)の単回の微小用量は、完全で迅速な防御を付与するのに充分である。
完全防御免疫を達成するのに必要なベクターの最小用量を算出するために、129マウスのいくつかの群を、減少する用量のTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)又はコントロールとして500 ng用量のTRIPΔU3.CMV-GFPベクター粒子でi.p.免疫した。7日後に、全てのマウスを1000 LD50 IS-98-ST1で攻撃した。予想されたように、コントロールベクターを与えられた全てのマウスは、攻撃の11〜13日の間に死亡した。結果は、マウスの完全防御に必要とされるTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)の最小用量は、50 ngのp24抗原に等価なベクター粒子の量であることを示した(表5)。
Figure 2008508863
より低い用量は、部分的防御しか付与せず、よって、50%防御用量は、6.2 ngのp24抗原に等価なベクター粒子と計算された。これらの用量−防御実験は、ワクチン接種の7日後という早期の攻撃及び高いウイルス攻撃(1000 LD50)という最も厳しい攻撃条件で行ったことに注目すべきである。第7日と15日との間に全抗体濃度が10倍に増加したことにより、あと1週間後に算出していたならば、50%防御用量は6.2 ngより低かったであろう。50 ngのp24に等しいTRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子を与えられたマウスからの免疫血清は、検出可能な抗WNV抗体を有さなかった。このような少量のTRIPΔU3.CMV-sEが初回免疫攻撃の1週間後に完全防御を付与すると仮定すると、レンチウイルスベクターベースのワクチンは、WNVに対する先天性免疫を開始するシグナルを発生しているに違いないと予測されるだろう。
さらに、完全防御免疫に必要とされる用量は、用いられるモデルのために、低く見積もられている可能性があることに注目することが重要である。実際に、マウス細胞は、ヒト細胞を含む他の哺乳動物細胞に比べて、レンチウイルスベクター形質導入に対する許容性が低いことが示されている(Gianniniら, Hepatology, 2003, 38, 114〜122; Nguyenら, Mol. Ther., 2002, 6, 199〜209)。鳥類の細胞は、マウス細胞よりも形質導入に対してよりよい許容性を示し、少量のレンチウイルスベクターワクチン用量が家禽類で有効であろうと予測することが可能である
得られた防御が、WNV-sE抗原の実際にベクターに媒介された発現に特異的によるものであり、残存WNV-sEタンパク質又はベクターストックに混在するベクタープラスミドDNAによるものではないことを確実にするために、マウスを熱不活化(70℃で10分間) TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)ベクター粒子で免疫し、形質導入を廃止する処理を行った(図7)。WNV攻撃の後に、熱不活化TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)を注射された全てのマウスは死亡した(表5)。よって、遊離の裸のDNAが防御において役割を演じてはいないようである。
さらに、ベクター粒子を偽型にするために用いられるVSV-Gエンベロープの遍在する親和性のために、レンチウイルスベクターワクチンは、危険性のあるヒト及びウマ、家禽類及び家畜のような動物を含むいずれの脊椎動物種において、改変することなく用いることが理論的にできる。
これらの結果は、微小用量のベクター粒子は、マウスにおいて迅速で完全な防御免疫を達成するのに充分であることを証明する。このことは、この候補のワクチンの費用対効果を興味のあることに大きくし、家禽の飼育場(stock)及びウマの飼育農場における集団ワクチン接種のためのプロトコル(例えばエアロソルを介して)の設定を可能にする。
西ナイルウイルスの短縮Eタンパク質(E 1〜411) (配列番号17)をコードするcDNA (配列番号16)を含む、配列番号15の配列に相当するベクタープラスミドpTRIPΔU3CMV-sE(WNV)の模式図である。 1μgのTRIPΔU3CMV-sE(WNV)ベクター粒子の単回腹腔内注射で免疫されたマウスからの血清のELISA及び中和アッセイによる分析を示す。 西ナイルウイルスで感染させたVERO細胞の溶解物の、1μgのTRIPΔU3CMV-sE(WNV)ベクター粒子で免疫にされたマウスの血清との免疫沈降を、コントロール血清との比較で表す。 腹腔内免疫され、次いで免疫後2週間で10 LD50のIS-98-ST1株によるか(A)、又は免疫後4週間で100 LD50のIS-98-ST1株によるか(B)のいずれかで同じ経路により攻撃されたマウスの生存曲線を表す。 西ナイルウイルスのprM及びEタンパク質を発現する組換えレンチウイルスベクターで形質導入された真核細胞の上清からのウイルス擬似粒子の精製を示す。 TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)ワクチン接種された129マウスからの血清中の抗WNV-sE抗体の検出を説明する。 組換えレンチウイルスベクター形質導入効率に対する加熱処理の効果のフローサイトメトリによる分析を示す。

Claims (37)

  1. フラビウイルス科のウイルスの少なくとも1つのタンパク質又は該タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を含む組換えレンチウイルスベクターの、感受性の種におけるフラビウイルス科ウイルス感染の予防及び／又は治療を意図する免疫原性組成物を製造するための使用。
  2. 前記組換えレンチウイルスベクターが、三重らせんタイプであることを特徴とする請求項1に記載の使用。
  3. 前記組換えレンチウイルスベクターが、プロモータ及びアクチベータがU3領域から欠失された3' LTRを含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の使用。
  4. 前記組換えレンチウイルスベクターが、別のウイルスの少なくとも1つのエンベロープタンパク質を用いて偽型にされたことを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載の使用。
  5. 前記エンベロープタンパク質が、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Gである請求項4に記載の使用。
  6. 前記ポリヌクレオチド断片が、フラビウイルス科ウイルスの少なくとも1つの構造タンパク質又は該タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドをコードすることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の使用。
  7. 前記構造タンパク質が、膜タンパク質又はエンベロープタンパク質であることを特徴とする請求項6に記載の使用。
  8. 前記ポリヌクレオチド断片が、フラビウイルス科ウイルスの少なくとも1つの非構造タンパク質又は該タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドをコードすることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の使用。
  9. 前記ポリヌクレオチド断片が、フラビウイルス科ウイルスの少なくとも1つの構造タンパク質又は該タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドと、同じフラビウイルス科ウイルスの少なくとも1つの非構造タンパク質又は該非構造タンパク質の少なくとも8アミノ酸の断片との両方をコードすることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1つに記載の使用。
  10. 前記免疫原性ペプチドが、種々のフラビウイルス科ウイルスの免疫原性断片の組み合わせ、及び／又は同じフラビウイルス科ウイルスの異なる血清型免疫原性断片の組み合わせからなることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1つに記載の使用。
  11. 前記フラビウイルス科ウイルスが、西ナイルウイルス、デングウイルス、黄熱ウイルス及びC型肝炎ウイルスからなる群より選択されることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1つに記載の使用。
  12. 前記ポリヌクレオチド断片が、
    - 西ナイルウイルス若しくはデングウイルスのEタンパク質と、任意にprM若しくはMタンパク質及び／又はCタンパク質及び／又は非構造タンパク質とをコードするcDNA、並びに前記タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドの1又は複数をコードするcDNA、
    - C型肝炎ウイルスのE1若しくはE2タンパク質又はE1/E2へテロダイマー、及び／又は0、＋1若しくは＋2リーディングフレームによるCタンパク質、及び／又はNS3タンパク質をコードするcDNA、並びに前記タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドの1又は複数をコードするcDNA、
    - それぞれがデングウイルスの4つのタイプの1つに相当するデングウイルスのEタンパク質の1又は複数の異なるドメインIII (位置295〜394)をコードするcDNA
    からなる群より選択されることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の使用。
  13. 前記cDNAが、その配列が添付の配列表の配列番号1〜4により表される4つのドメインIIIをコードすることを特徴とする請求項12に記載の使用。
  14. ＋1又は＋2リーディングフレームによるCタンパク質をコードする前記cDNAが、配列番号5〜14の配列からなる群より選択されることを特徴とする請求項12に記載の使用。
  15. 前記ポリヌクレオチドが、M23027、M19197、M93130、M14931、M12294、AF481864、M18370、X03700、U27495、M73835、M31182、M31768、J04358、M62321、D90208及びM58335からなる群より選択されるNCBIデータベースのアクセッション番号に相当するフラビウイルス科ウイルスのコーディング配列の断片であることを特徴とする請求項1〜12のいずれか1つに記載の使用。
  16. 請求項6で規定されるような少なくとも1つの構造タンパク質又は該タンパク質の断片と、任意に非構造タンパク質又は該タンパク質の断片とをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1〜6及び8〜15のいずれか1つで規定される組換えレンチウイルスベクター。
  17. 三重らせんタイプであることを特徴とする請求項16に記載の組み換えベクター。
  18. - 西ナイルウイルス若しくはデングウイルスの少なくとも1つのEタンパク質と、任意にprM若しくはMタンパク質及び／又はCタンパク質及び／又は非構造タンパク質とをコードするcDNA、並びに前記タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドの1又は複数をコードするcDNA、
    - C型肝炎ウイルスのE1若しくはE2タンパク質又はE1/E2へテロダイマー、及び／又は0、＋1若しくは＋2リーディングフレームによるCタンパク質と、任意に、NS3タンパク質とをコードするcDNA、並びに前記タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドの1又は複数をコードするcDNA、並びに
    - それぞれがデングウイルスの4つのタイプの1つに相当するデングウイルスのEタンパク質のドメインIII (位置295〜394)又はいくつかの異なるドメインIIIをコードするcDNA
    からなる群より選択されるcDNAを含むことを特徴とする請求項16又は17に記載の組換えレンチウイルスベクター。
  19. ＋1又は＋2リーディングフレームによるCタンパク質をコードする前記cDNAが、配列番号5〜14の配列からなる群より選択されることを特徴とする請求項18に記載の組換えレンチウイルスベクター。
  20. 前記cDNAが、その配列が配列番号1〜4で表される4つのドメインIIIをコードすることを特徴とする請求項18に記載の組換えレンチウイルスベクター。
  21. デングウイルス又は西ナイルウイルスのEタンパク質とprMタンパク質とをコードするcDNAを含むことを特徴とする請求項18に記載の組換えレンチウイルスベクター。
  22. 西ナイルウイルスのIS-98-ST1株のEタンパク質の分泌型をコードするcDNAを含み、2003年8月27日に25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures of Microorganisms]に番号I-3076で寄託された微生物に含まれる請求項18に記載の組換えレンチウイルスベクター。
  23. 前記ポリヌクレオチド断片が、CMVプロモータの制御下にあることを特徴とする請求項16〜22のいずれか1つに記載の組換えレンチウイルスベクター。
  24. 請求項1〜23のいずれか1つで規定される少なくとも1つの組換えレンチウイルスベクターを含むことを特徴とする免疫原性組成物。
  25. 医薬的に許容される媒体と、任意に担体物質とを含むことを特徴とする請求項24に記載の組成物。
  26. 前記組換えレンチウイルスベクターが、三重らせんタイプのものであることを特徴とする請求項24又は25に記載の組成物。
  27. 別のウイルスのエンベロープタンパク質を用いて偽型にされた前記組換えレンチウイルスベクターのウイルス粒子を含むことを特徴とする請求項24〜26のいずれか1つに記載の組成物。
  28. 前記エンベロープタンパク質が、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Gであることを特徴とする請求項27に記載の組成物。
  29. 三重らせんタイプの前記レンチウイルスベクターの組換えゲノムに相当する単離された核酸分子を含み、該核酸分子が(i) 包膜、逆転写及び組込みのための調節配列と、レンチウイルス起源のセントラルイニシエーション及びターミネーションのためのシス作用配列と、任意にRevタンパク質のための調節配列、及び(ii) 請求項1及び6〜15のいずれか1つで規定するフラビウイルス科ウイルスタンパク質又は該タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を含むことを特徴とする請求項26に記載の組成物。
  30. 請求項1〜23のいずれか1つで規定される組換えレンチウイルスベクターで改変された好ましくは真核細胞である細胞。
  31. 次の工程：
    a) 請求項30に記載の改変された細胞を、前記組換えレンチウイルスベクターによりコードされるフラビウイルス科ウイルスの1又は複数のウイルスタンパク質及び／又は該タンパク質の1又は複数の免疫原性断片の発現を可能にする条件下で培養し、そして
    b) 前記タンパク質、タンパク質断片又はウイルス擬似粒子を、a)の培養上清又は細胞から分離する
    を少なくとも含むことを特徴とする、フラビウイルス科のウイルスタンパク質及び／又は該タンパク質の免疫原性断片あるいはウイルス擬似粒子を製造する方法。
  32. - 請求項30に記載の改変真核細胞、特にフラビウイルス科ウイルスの非構造タンパク質、例えばNS3又はNS5をコードするcDNAを含むベクターで改変された真核細胞を、試験すべきライブラリの種々の化合物と接触させ、
    - 前記タンパク質の活性を、前記化合物の存在下又は非存在下で測定し、そして
    - 前記活性を変更できる化合物を選択する
    ことを含むことを特徴とする、抗ウイルス化合物をスクリーニングする方法。
  33. 前記真核細胞が、樹状細胞、神経細胞及び肝細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項32に記載の方法。
  34. 感受性の種の個体からの生物学的流体試料を用い、次の工程：
    a) 前記生物学的試料を、請求項30で規定される少なくとも1つのフラビウイルス科ウイルス抗原を発現する改変真核細胞と接触させ、そして
    b) (a)で形成された抗原−抗体複合体を明らかにする
    を少なくとも含むことを特徴とする、フラビウイルス科ウイルスでの感染を診断する方法。
  35. a)の前記改変真核細胞が、透過性にされることを特徴とする請求項34に記載の方法。
  36. 感受性の種の個体からの生物学的流体試料を用い、次の工程：
    a) 前記生物学的試料を、請求項7、9〜12、15〜18及び21〜23のいずれか1つで規定される少なくとも1つの膜タンパク質及び／又はエンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスベクターで改変された細胞の培養上清から得られるウイルス擬似粒子と接触させ、そして
    b) (a)で形成された抗原−抗体複合体を明らかにする
    を少なくとも含むことを特徴とする、フラビウイルス科ウイルスでの感染を診断する方法。
  37. 請求項30に記載の改変細胞を少なくとも含むことを特徴とする、請求項31〜36のいずれか1つに記載の方法を行うためのキット。
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