JP2013535693A - 非診断用分析物のためのラテラルフローアッセイ - Google Patents

Abstract

【解決手段】非診断用試料中に非診断用分析物が存在するか否かを決定する方法を提供する。本方法の態様は、ラテラルフローアッセイデバイスの試料受容領域に非診断用試料を塗布する過程と、非診断用試料中に非診断用分析物が存在するか否かを決定するために検出領域を読み取る過程とを有する。また、本発明の方法を実践する際に使用されるキットも提供される。

Description

診断目的用の生体試料中の分析物の存在、不在、または量を調べるために、種々のラテラルフローアッセイ用の試験ストリップが利用されている。従来のラテラルフロー試験ストリップは、試料受容エリアおよび標的捕捉帯がその上に支持される固体支持体を特徴とする。固体支持体の材料は、試料受容エリアおよび標的捕捉帯を支持することが可能であり、また、ラテラルフロー試験ストリップが、試料の担体液体として作用する適切な溶媒または緩衝液に曝露されたときに、試料受容エリアから標的捕捉帯へと試料の毛細管流動を提供することが可能な材料である。支持体として使用され得る一般的なクラスの材料は、有機または無機ポリマー、ならびに天然および合成ポリマーを含む。好適な固体支持体のより具体的な例として、限定されないが、ガラス繊維、セルロース、ナイロン、架橋テキストラン、種々のクロマトグラフィーペーパー、およびニトロセルロースが挙げられる。

従来のラテラルフロー試験ストリップは、１つ以上の標的捕捉線を含む。試料受容エリアからの試料の流れが各々の捕捉線と順次接触するように、これらの捕捉線は、試料受容エリアと平行にストリップ上に位置する。使用中、試料のアリコートが、ラテラルフロー試験ストリップの試料受容エリア上に堆積され、次いで、該エリアは、ストリップを横切って流れ、試験ストリップの端部に位置する吸収パッドに向かって標的捕捉帯を横切って試料材料を運ぶ溶媒または担体液に曝露されてもよい。

従来のラテラルフロー試験ストリップは、特定のサイズのプラスチック筐体に嵌合するようにサイズ決定される。筐体は、典型的には、試料パッドに試料を塗布するための開口部と、アッセイの結果を読み取るための捕捉線の上方にある別の開口部または窓とを有する上部を有する。

米国特許出願公開第２０１０／０１３６５３１号明細書

非診断用試料中に非診断用分析物が存在するか否かを決定する方法は提供される。本方法の態様は、ラテラルフローアッセイデバイスの試料受容領域に非診断用試料を塗布する過程と、検出領域を読み取り、非診断用試料中に非診断用分析物が存在するかどうかを決定する過程とを含む。また、本発明の方法を実践する際に使用されるキットも提供される。

本発明の一実施形態によるラテラルフローアッセイデバイスを示す図である。 図１に示されるデバイスによって得られた陰性の結果を示す図である。 図１に示されるデバイスによって得られた陽性の結果を示す図である。

非診断用試料中に非診断用分析物が存在するか否かを決定する方法は提供される。本方法の態様は、ラテラルフローアッセイデバイスの試料受容領域に非診断用試料を塗布する過程と、検出領域を読み取り、非診断用試料中に非診断用分析物が存在するかどうかを決定する過程とを含む。また、本発明の方法を実践する際に使用されるキットも提供される。

本発明をより詳細に説明する前に、本発明は、記載されるある実施形態に限定されるものではなく、それ自体、当然のことながら、異なり得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は、ある実施形態を説明することのみを目的とするのであって、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の、文脈上、そうではないという明確な指示のない限りは小数点第２位までの各中間値、およびその記載された範囲内の任意の他の記載された値または中間値が、本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、また、本発明の範囲にも包含され、記載される範囲内の任意の具体的に除外された範囲に従うものとする。記載される範囲が、限度のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含された限度のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。

本明細書において、数値の前に「約」という用語を付けて、ある範囲が提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数字、およびその用語が先行する数字に近接または近似する数字に逐語的支持を提供するために本明細書において使用される。ある数字が、具体的に列挙された数字に近接または近似するかどうかを判断する際に、列挙されていない近接または近似する数字は、それが提示された文脈において、具体的に列挙された数字の実質的な均等性を提供する数字であり得る。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似するかまたは均等な方法および材料は、本発明の実践または試験において使用することができるが、代表的な例示的方法および材料を次に説明する。

本明細書に引用される全ての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許のそれぞれが参照により組み込まれることが具体的にかつ個々に示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されていることに関連する方法および／または材料を開示および記載するように、参照によって本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示のためであって、本発明が、先行発明を理由にして、そのような刊行物に先行する権利を有さないと認めるものであると解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は、実際の公開日とは異なる可能性があり、独立して確認する必要があり得る。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上、そうではないという明確な指示のない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数形の指示対象も含むことに留意されたい。さらに、特許請求の範囲は、いかなる任意選択的な要素も除外するように記述され得ることに留意されたい。したがって、この記述は、請求要素の列挙に関連する「〜だけ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「〜のみ（ｏｎｌｙ）」等の排他的な用語の使用、または「否定的な」限定の使用に対する先行詞としての役割を果たすことが意図される。

本開示を読むと当業者には明らかなように、本明細書において記載および例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または主旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に分離され得るか、またはそれと組み合わされ得る、異なる構成要素および特徴を有する。列挙されるいずれの方法も、列挙される事象の順番で、または論理的に可能な任意の他の順番で、実行することができる。

方法
本発明の態様は、非診断用のラテラルフローアッセイ法を含む。したがって、本発明の方法は、非診断用の方法である。本方法は、「非診断用の方法」であるため、それらは、哺乳類、例えばヒト等の生体における疾患（例えば、病気）または状態（例えば、妊娠）を決定しない方法である。そのため、本発明の方法は、生きた対象が所与の疾患または状態を有するかどうかを決定するために用いられる方法ではない。

非診断用の方法の態様は、非診断用試料中に非診断用分析物が存在するかどうかを決定することを含む。「非診断用試料」とは、診断を下すために、生きた多細胞生物、例えば哺乳類から得られていないかまたはそれに由来していない試料を意味する。換言すると、試料は、疾患または状態を診断するために、１つより多くの疾患分析物の存在を決定するために得られていない。対象となる非診断用試料は、例えば、後により詳細に記載されるように、インビトロ源、例えば、細胞培養、組織培養、非診断用の動物組織試料または体液（すなわち、診断のために使用されない場合のそのような試料）、カラムクロマトグラフィーデバイス等から得られたものを含む。いくつかの場合において、本発明のラテラルフロー法を使用して試験される非診断用試料は、実験室で作製される試料、例えば、バイオテクノロジーの研究実験（生細胞、組換えベクター、合成タンパク質等を用いてもまたは用いなくてもよいインビトロ実験等）を含む研究実験から得られる試料である。研究実験試料の例として、限定されないが、細胞および組織培養（ならびにそれらの誘導体、例えば、上清等）；非診断用の動物組織試料および体液；非細胞性試料、例えば、カラム溶出液、無細胞生体分子（例えば、タンパク質および核酸）合成反応混合物、核酸増幅反応混合物；インビトロ生化学もしくは酵素反応またはアッセイ溶液、あるいは他のインビトロおよびインビボ反応の産物等が挙げられる。本明細書で使用される場合、研究実験試料は、環境試料、例えば、１つ以上の毒素、ペプチド、タンパク質、核酸、または小分子等の存在等の、環境の何らかの質または態様を判定するために環境から得られる試料を除外する。

本発明の方法に従って検査することができる一種の非診断用試料は、ウイルスベクターのパッケージングによる上清である。ウイルスベクターのパッケージングによる上清は、標的細胞に形質導入するために実験室で作製されてもよい。ウイルスベクターのパッケージングによる上清は、ＨＥＫ２９３細胞、Ｓｆ２１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等のパッケージング細胞株を、限定されないが、ｐＬＶＸおよびその誘導体、ｐＢａｃＰＡＫ８およびその誘導体、ｐＳｈｕｔｔｌｅ２およびその誘導体、ｐＲｅｔｒｏ−Ｌｉｂ、ＭＭＬＶ由来のプラスミド（ｐＬＸＲＮ、ｐＬＮＨＸ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＮＣＸ２等）等のコンピテントベクターでトランスフェクトすることによって実験室で作製することができる。トランスフェクション後、所望のウイルス力価を達成するために細胞を好適な増殖培地で増殖させる。次に、細胞培養は、細胞から上清を分離するために遠心分離および／または濾過に供されてもよい。得られた上清は、成熟ウイルス粒子と、限定されないが、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、グルコース、Ｌ−グルタミン、炭酸水素ナトリウム、ウシ胎仔血清、ビルビン酸ナトリウム等の増殖培地中に見られる構成要素を含む、増殖培地に由来する構成要素とを含み得る。対象となる上清は、一方の種類の試料には存在するが他方の種類の試料には存在しない１つ以上の構成要素に基づいて、診断目的で得られる生理学的試料等の他の種類の試料と区別され得る。例えば、上清には、血液由来試料中に見られる構成要素が欠如している可能性があり、上清中には見られない血液由来試料の構成要素は、全細胞、凝固因子、抗体、細胞外タンパク質、電解質、および例えば上記の非診断用の上清には存在しない他の物体を含み得る。

別の対象となる非診断用試料は、インビトロｍＲＮＡ転写反応混合物である。当該技術分野において既知であるように、そのような反応混合物は、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の合成を誘導するためにインビトロ翻訳システムに加えられてもよい。インビトロｍＲＮＡ転写反応混合物は、ＤＮＡの鋳型をＲＮＡポリメラーゼ、三リン酸ヌクレオチド、および適切な緩衝液と組み合わせ、得られたものを適切な温度で種々の期間インキュベートすることによって作製することができる。良好な反応完了混合物は、合成ｍＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに限定されないが、緩衝液（例えば、トリス、トリシン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ等）、塩（例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、リン酸カルシウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等）、および他の小分子（例えば、ヌクレオチド、還元剤（ジチオスレイトール等））等の種々の他の構成要素を含み得る。

また、対象となる非診断用試料は、細胞可溶化物およびその誘導体、細菌、酵母、昆虫、または哺乳類細胞の可溶化物を含有する核酸およびタンパク質も含む。例えば、非診断用試料として対象となるのは、溶解した細菌細胞から得られた核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）調製物である。そのような組成物は、例えば、遠心分離により細菌を採取することによって、例えば、ボルテックスすることにより細菌を再懸濁および溶解させることによって、例えば、エタノールを加えることにより可溶化物から核酸、例えば、ＤＮＡを沈殿させることによって、例えば、カラム精製または遠心分離および再懸濁により可溶化物から沈殿させた核酸を収集することによって、細菌培養から作製することができる。そのような手段によって得られる核酸調製物は、ＤＮＡ、および溶出緩衝液または再懸濁緩衝液（例えば、トリス、トリシン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ等）、ならびに塩（例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、リン酸カルシウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等）を含み得る。また、組成物は、混入物質、例えば、菌体内毒素等をさらに含み得る。

対象となる非診断用試料のさらに別の例は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）カラムからの溶出液等のクロマトグラフィー溶出液である。そのような溶出液は、サイズ排除カラム、アフィニティーカラム、イオン交換カラム、疎水性相互作用カラム等のクロマトグラフィーカラムに、当該技術分野で既知である任意の好適な方法を使用して試料（例えば、細菌、酵母、昆虫、または哺乳類細胞の可溶化物の生成物）を通液し、例えば、ＦＰＬＣポンプを使用して、カラムを通してタンパク質試料を移動させ、複数の画分のカラム溶出液を収集することによって得ることができる。任意の所与の画分は、対象となる多数のタンパク質、対象ではないタンパク質、カラム緩衝液、および試料緩衝液（例えば、トリス、トリシン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ等）、塩（例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、リン酸カルシウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等）、ならびに他の小分子（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖類、ならびに、ジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノール等の還元剤等）を含み得る。

これらの非診断用試料の各々は、診断用試料中には見られない構成要素を含むことによって、および／または診断用試料中に見られる構成要素が欠如していることによって、診断用試料とは異なる。場合によっては、非診断用試料の内容は、所定の制御された条件およびプロトコルの下で、実験室において既知の出発材料から調製されているため、非診断用試料の内容物は容易に決定される。対照的に、個体は、遺伝子構造および環境条件への曝露という点において異なるため、診断目的のために得られる生物学的試料は、本質的に未知の内容である。

上述のように、本発明の方法は、非診断用試料中に非診断用分析物が存在するかどうかを決定する方法である。本方法は、非診断用試料中に非診断用分析物が存在するかどうかを決定する方法であるため、本方法は、その中に対象となる分析物が存在してもまたは存在しなくてもよい試料を評価する方法である。さらに、アッセイを行う前は、試料中に分析物が存在するかどうかは未知である。そのため、本方法は、試料中に存在することが既知の分析物抗体の特定のアイソトープを決定するために試料が検査される場合のような、分析物が存在することは既知であるが、分析物の特定のアイソトープは未知である方法とは区別される。

「非診断用分析物」とは、生きた対象、例えば哺乳類の疾患または他の状態について診断を下すために本発明の方法において用いられない分析物を意味する。対象となる非診断用分析物は、本発明の方法が用いられる特定の研究実験に応じて大きく異なり得る。対象となる非診断用分析物は、限定されないが、ベクター、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス粒子等；発現マーカー、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、エピトープタグ等のレポーター酵素およびタンパク質；発現産物、例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、核タンパク質複合体等；治療用核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等；実験汚染物質、例えば、マイコプラズマ、内毒素、酵母、細菌、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ドキシサイクリン）、望ましくない成長因子および分化因子等；細胞培養の状態を評価するための細胞代謝物等を含む。

上で概説したように、本発明の方法は、ラテラルフローアッセイ法である。そのため、本発明の方法は、ある体積の非診断用試料をラテラルフローアッセイデバイス、例えば、ラテラルフローアッセイ用試験ストリップに塗布するステップを含む。アッセイデバイスは、「ラテラルフロー」アッセイデバイスであるため、それらは、試料受容領域で対象となる試料を受容し、試料が試料受容領域から吸湿性メンバー（ｍｅｍｂｅｒ）を通って検出領域へと横方向にウィッキングされるように、吸湿性材料（すなわち、吸湿性メンバー）を通って検出領域へと毛細管作用により試料を横方向に移動させるように構成される。

本発明のデバイスの吸湿性メンバーは、任意の従来の材料から製造されてもよい。対象となる吸湿性材料の例として、限定されないが、有機または無機ポリマー、ならびに天然および合成ポリマーが挙げられる。好適な固体支持体のより具体的な例として、限定されないが、ガラス繊維、セルロース、ナイロン、架橋テキストラン、種々のクロマトグラフィーペーパー、およびニトロセルロースが挙げられる。

ラテラルアッセイデバイスの吸湿性メンバーおよび全体的な構成は異なってもよいが、ある実施形態において、吸湿性メンバーはストリップ構成を有する。吸湿性材料がストリップとして構成される場合、吸湿性メンバーは、その幅よりも長い長さを有する。任意の実用的な構成が用いられてもよいが、場合によっては、１．５倍以上、例えば、２倍以上、例えば、２０倍以上を含む１０倍以上等だけ長さが幅よりも長い。場合によっては、吸湿性メンバーの長さは、０．５〜２０ｃｍ、例えば、１．０〜１５ｃｍ、例えば、２．０〜１０ｃｍの範囲であり、幅は、０．１〜５．０ｃｍ、例えば、０．５〜２．５ｃｍ、例えば、１〜２ｃｍに及ぶ。また、吸湿性メンバーの厚さも、場合によっては、０．０１〜０．５ｃｍ、例えば、０．１〜０．４ｃｍ、例えば、０．１〜０．２５ｃｍの範囲で異なってもよい。

吸湿性メンバーに加えて、本発明のデバイスは試料受容領域を含む。試料受容領域は、例えば、吸湿性メンバーの一方の端部付近に位置する、吸湿性メンバーの第１の領域であってもよい。代替として、試料受容領域は、吸湿性メンバーとは別個であってもよいが、試料受容領域に試料を塗布すると、吸湿性メンバー内に試料の流体連通を提供するように構成されてもよい。試料受容領域は、様々な体積の試料を受容するように構成されてもよく、場合によっては、試料受容領域は、０．１〜１０００μｌ、例えば、５０〜２００μｌを含む５〜２０μｌの範囲の体積を有する試料を受容するように構成される。場合によっては、試料受容領域は、特定の量の試料を吸湿性メンバー内に計り入れるように構成される計量デバイスを含んでもよい。対象となる計量デバイスの例として、米国公開特許出願第２００８０１４５２７２号、２００７０１３４８１０号、２００６０００８８４７号、および２００５０２２７３７０に記載されるものが挙げられる。

試料受容領域に加えて、本発明のラテラルフローアッセイデバイスは、検出領域をさらに含む。検出領域は、デバイスの使用中にそこから結果を読み取ることができる吸湿性メンバーの領域である。検出領域は、デバイスの試料受容領域から若干離れて下流に位置する。「下流」とは、毛細管作用によって試料が流れる横方向、すなわち、試料受容領域からの流体流の方向を意味する。試料受容領域と検出領域との間の距離は、場合によっては、０．３〜１５ｃｍ、例えば、５〜１０ｃｍを含む１〜１５ｃｍ、例えば、１〜５ｃｍの範囲で異なってもよい。

検出領域は、少なくとも１つの別個の捕捉プローブ領域を含む領域である。捕捉プローブ領域は、捕捉プローブ領域内の吸湿性メンバーと安定に会合するある量の捕捉プローブを含む領域である。捕捉プローブ領域のサイズは異なってもよく、場合によっては、捕捉プローブ領域は、０．０１〜０．５ｃｍ² 、例えば、０．１〜０．２ｃｍ² を含む０．０５〜０．１ｃｍ² の範囲の面積を有する。捕捉プローブ領域は、様々な異なる構成を有してもよく、その場合の構成は、直線、円形、長方形、または他の複雑な形状、必要に応じて、例えば「＋」等であってもよい。

上に示したように、捕捉プローブ領域は、吸湿性メンバーの吸湿性材料と安定に会合する捕捉プローブを含む。「〜と安定に会合する」とは、捕捉プローブと吸湿性メンバーとが、使用条件下、例えば、アッセイ条件下で、空間において互いに対するそれらの位置を維持することを意味する。そのため、捕捉プローブおよび吸湿性メンバーは、互いに非共有結合的または共有結合的に安定に会合することができる。非共有結合的な会合の例として、非特異的吸着、静電気に基づく結合（例えば、イオン‐イオン対相互作用）、疎水性相互作用、水素結合相互作用等が挙げられる。共有結合の例として、捕捉プローブと吸湿性材料上に存在する官能基との間に形成される共有結合が挙げられる。

捕捉プローブは、対象となる分析物に特異的に結合する分子である。「特異的結合」、「特異的に結合する」等の用語は、捕捉プローブが、吸湿性メンバー内に存在し得る溶液または反応混合物中の他の分子もしくは部分と比較して、対象となる分析物に優先的に直接結合する能力を指す。ある実施形態において、結合複合体中で捕捉プローブおよび分析物が互いに特異的に結合した場合の、捕捉プローブとそれが特異的に結合する分析物との間の親和性は、１０^{− 6}Ｍ未満、１０^{− 7}Ｍ未満、１０^{− 8}Ｍ未満、１０^{− 9}Ｍ未満、１０⁻¹⁰Ｍ未満、１０⁻¹¹Ｍ未満、１０⁻¹²Ｍ未満、１０⁻¹³Ｍ未満、１０⁻¹⁴Ｍ未満、または１０⁻¹⁵Ｍ未満のＫ_D（解離定数）によって特徴付けられる。

様々な異なる種類の特異的結合剤が、捕捉プローブとして用いられてもよい。対象となる特異的結合剤は、抗体結合剤、タンパク質、ペプチド、ハプテン、核酸等を含む。本明細書において使用される「抗体結合剤」という用語は、対象となる分析物に結合するのに十分なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体または断片を含む。抗体断片は、例えば、単量体Ｆａｂ断片、単量体Ｆａｂ’断片、または二量体Ｆ（ａｂ）’ ₂断片であり得る。また、「抗体結合剤」という用語の範囲内には、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）等の抗体工学によって生成される分子、あるいは、キメラ抗体を生成するための重鎖および軽鎖の定常領域の置換、またはヒト化抗体を生成するための定常領域および可変領域のフレームワーク部分の両方の置換によってモノクローナル抗体から生成される、ヒト化もしくはキメラ抗体が含まれる。

所与の検出領域は、単一の捕捉プローブ領域または２つ以上の異なる捕捉プローブ領域を含んでもよく、２つ以上の異なる捕捉プローブ領域の各々は捕捉プローブを含み、各領域内の捕捉プローブは、（後により詳細に記載されるような定量的アッセイデバイスに見られるように）同じであってもよいか、または（後により詳細に記載されるような多重アッセイデバイス内に存在し得るように）異なっていてもよい。検出領域が２つ以上の捕捉プローブ領域を含む場合、必要に応じて、領域は、互いと別個であってもよいか、または重複していてもよい。

場合によっては、吸湿性メンバーは、例えば、試料受容領域内、または試料受容領域と検出領域との間の位置のいずれかの検出領域から上流に位置する、レポータ結合メンバーを含んでもよい。レポータ結合メンバーと検出領域との間の距離は、場合によっては、０．３〜１５ｃｍ、例えば、５〜１０ｃｍを含む１〜５ｃｍの範囲で異なってもよい。存在する場合、レポータ結合メンバーは、吸湿性メンバーと不安定に会合する。「不安定に会合する」とは、試料を塗布する前は、レポータ結合メンバーは、吸湿性メンバーに対して静止していられるが、試料を塗布し、試料が吸湿性結合メンバーを通ってウィッキングすると、レポータ結合メンバーが、試料中に存在する分析物と自由に反応し、毛細管作用により吸湿性メンバーを通って試料と共に移動することを意味する。そのため、レポータ結合メンバーは、バルク流量下で吸湿性メンバーを通って横方向に移動する。

対象となるレポータ結合メンバーは、特異的な結合メンバーおよび信号生成システムメンバーを含む。レポータ結合メンバーにおいて、特異的な結合メンバーおよび信号生成システムメンバーは、例えば、共有結合により、互いに安定に会合する。

特異的な結合メンバーは、アッセイが競合形式またはサンドイッチ形式を有するかどうかに応じて異なってもよい。競合形式の場合、結合メンバーは、検出領域内の捕捉プローブとの結合について対象となる分析物と競合する部分である。結合メンバーは、分析物またはその断片であり得る。サンドイッチ形式の場合、結合メンバーは、捕捉プローブが結合する位置とは異なる位置で分析物に特異的に結合する。そのため、結合メンバーと捕捉プローブとが、対象となる分析物に同時に結合する可能性がある。これらのサンドイッチ形式において、分析物特異的結合部分は、対象となる分析物に特異的に結合する任意の部分であり得る。対象となる特異的結合メンバーは、抗体結合メンバー、タンパク質、ペプチド、ヘプタン、核酸等を含む。本明細書で使用される「抗体結合メンバー」という用語は、対象となる分析物に結合するのに十分なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体または断片を含む。抗体断片は、例えば、単量体Ｆａｂ断片、単量体Ｆａｂ’断片、または二量体Ｆ（ａｂ）’ ₂断片であり得る。また、「抗体結合剤」という用語の範囲内には、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）等の抗体工学によって生成される分子、あるいは、キメラ抗体を生成するための重鎖および軽鎖の定常領域の置換、またはヒト化抗体を生成するための定常領域および可変領域のフレームワーク部分の両方の置換によってモノクローナル抗体から生成される、ヒト化もしくはキメラ抗体が含まれる。

結合メンバーに加えて、レポータ結合メンバーは、信号生成システムのメンバーをさらに含む。信号生成システムのメンバーは、ラテラルフローアッセイのある性質に応じて大きく異なってもよく、任意の直接的または間接的に検出可能な標識であってもよい。上記方法において使用するための好適な検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的、または他の手段による検出可能な任意の部分を含む。例えば、好適な標識として、標識化ストレプトアビジンコンジュゲートによる染色のためのビオチン、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射標識（例えば、 ³Ｈ、 ¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、または³²Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される他の酵素）、ならびにコロイド金または色ガラスもしくはプラスチック等の比色標識（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスビーズ）が挙げられる。そのような標識の使用について記載する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、および第４，３６６，２４１号を含む。また、蛍光プローブおよび化学研究のハンドブック（第６版、モレキュラープローブ社、ユージーンオレゴン州）（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ Ｏｒｅｇ．））も参照のこと。放射標識は、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、放射光を検出するための光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質上の酵素の作用によって生成された反応性生物を検出することによって検出され、比色標識は、単純に、着色された標識を可視化することによって検出される。

場合によっては、ラテラルフローアッセイデバイスは、対照領域をさらに含んでもよい。対照領域は、試料受容領域から下流に位置し、必要に応じて、検出領域から上流または下流に位置してもよい。対照領域は、固定化された対照物質を含有する。固定化された対照物質は、移動性の対照結合剤に特異的に結合し、例えば米国特許第６，１３６，６１０号に記載されるような対照結合対を形成する。対象となる対照結合対は、内部標準、すなわち、個々の試験ストリップ上でそれに対する分析物の測定結果を比較することができる標準物質としての役割を果たす。一般的に、本明細書において任意の従来の標準物質を使用することができるが、場合によっては、試料中に存在しないか、または試料中に存在する化合物と免疫学的に交差反応しない対照化合物が用いられる。対象となる好適な対照結合対の例として、限定されないが、マウスＩｇＧ／抗マウスＩｇＧ、ニワトリＩｇＹ／抗ニワトリＩｇＹ等が挙げられる。これらの対のうちのいずれのメンバーが固定化された対照物質であってもよく、他方が対照結合剤であってもよい。所与のラテラルフローアッセイデバイスは、単一の対照領域または２つ以上の異なる対照領域を有してもよく、各領域の固定化された対象物質は、同じであってもよいか、または異なっていてもよい。対照結合剤は、任意選択的に、対照領域から上流の位置、例えば、レポータ結合剤と同じかまたは異なる位置で、吸湿性メンバーと不安定に会合してもよい。

任意選択的に、ラテラルフローアッセイデバイスは、検出領域および任意の対照領域から下流に、例えば、試料受容領域から遠位の端部に吸収パッドを含んでもよく、吸収パッドは、吸湿性メンバーを通って流れた流体およびその中に存在する試薬を吸収するように構成される。

所望される場合、ラテラルフローアッセイデバイスの構成部品が、好適な筐体の中に存在してもよい。筐体は、吸湿性メンバーおよび他のアッセイ構成要素を取り囲むように構成されてもよい。筐体は、任意の好適な材料から製造されてもよく、材料は、その中に収容される吸湿性メンバーおよび他の構成要素の完全性を維持するのに十分に剛性であると同時に、使用中に筐体に接触する種々の流体および試薬に対して不活性な材料であってもよい。対象となる筐体の材料は、プラスチックを含む。筐体は、試料塗布領域への試料の塗布を可能にするように構成されるポートまたは類似構造と、検出領域の視認を可能にするように構成される窓とを含んでもよい。筐体は、印、例えば、検出領域および対照領域の印（例えば、「Ｔ」および「Ｃ」）等をさらに含んでもよい。

本発明の一実施形態によるラテラルフローアッセイデバイスを図１に示す。図１において、ラテラルフローアッセイデバイス１０は、吸湿性メンバーを取り囲む筐体１２を含む。試料は、試料ポート１６を介して試料受容領域１４に塗布される。また、検出領域２０の可視化を可能にする視認窓１８も示されている。

本発明の方法を実践する際に、対象となる非診断用試料が、ラテラルフローアッセイデバイスの試料受容領域に塗布される。場合によっては、非診断用試料は、例えば、これらの構成要素のうちのいずれかまたは両方が既にデバイス中に存在しない場合、ある量のレポータ結合剤および／または対照結合剤と組み合わせられる。試料がこれらのアッセイ構成要素のうちのいずれかまたは両方と組み合わせられる場合、その組み合わせは、任意の従来のプロトコルを用いて達成することができる。試料と組み合わせられる場合、これらの薬剤の量は、例えば、当該技術分野で既知の標準的な方法によって容易に決定される所望の量に伴って異なってもよい。所望の横方向の流れおよびアッセイの実施可能性を提供するのに十分である限り、試料受容領域に塗布される試料の量は異なってもよい。試料は、任意の従来のプロトコルを用いて、例えば、スポイト、ピペット、注射器等を介して、試料受容領域に塗布されてもよい。そのため、本発明の方法における第１のステップは、試験ラテラルフローアッセイデバイスの試料受容領域に非診断用試料を塗布することである。試料を塗布することに加えて、本方法は、吸湿性メンバーを通る適切な流量を提供するために、ある量の好適な液体、例えば緩衝液を塗布することをさらに含んでもよい。限定されないが、緩衝液、細胞培養培地（例えば、ＤＮＥＭ）等を含む任意の好適な液体が用いられてもよい。対象となる緩衝液は、限定されないが、トリス、トリシン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＢＳ、ＴＢＳ等を含む。所望される場合、界面活性剤、例えば、ＮＰ−４０またはＴＷＥＥＮ（商標）界面活性剤が、液体中に存在してもよい。

試料の塗布後、試料は、吸湿性メンバーおよび検出領域を通って横方向に流れることができ、次いで、非診断用試料中に非診断用分析物が存在するか否かを決定するために検出領域が読み取られる。検出領域は、試料塗布後の所定期間の後に読み取られてもよく、この期間は、１０秒〜１時間、例えば、３０秒〜３０分、例えば３０秒〜１分の範囲であってもよい。検出領域は、信号生成システムの検出可能な生成物の性質に応じたプロトコルを用いて読み取られる。放射標識は、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、放射光を検出するための光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質上の酵素の作用によって生成される反応性生物を検出することによって検出され、比色標識は、単純に、着色された標識を可視化することによって検出される。したがって、信号生成システムの検出可能な生成物が着色された標識であるこれらの場合において、本方法は、例えば、デバイスの筐体の視認窓を通して、検出領域を目視することを含んでもよい。そのため、本発明の方法における次のステップは、試験ラテラルフローアッセイデバイスの検出領域を読み取って、非診断用試料中に非診断用分析物が存在するか否かを決定することを含む。

図２Ａおよび２Ｂは、陰性の結果が得られた（図２Ａ）および陽性の結果が得られた（図２Ｂ）図１に示すデバイスの図を提供する。図２Ａでは、唯一のストライプが可視であり、したがって、デバイス１０の検出領域２０内で検出されたのは内部標準ストライプ２２である。対照ストライプ２２の存在、および「Ｔ」領域２４内にいずれの試験ストライプも存在しないことが、検査した試料中に分析物は存在しなかったが、内部標準ストライプ２２の存在によって実証されるように、アッセイが正しく機能していたことを示唆している。図２Ｂでは、内部標準ストライプ２２および試験ストリップ２４の両方が可視であり、したがって、デバイス１０の検出領域２０内で検出された。対照ストライプ２２および「Ｔ」領域内の試験ストライプ２４の存在は、検査した試料中に分析物が存在したこと、そして内部標準ストライプ２２の存在によって実証されるように、アッセイが正しく機能していたことを示唆している。

所望される場合、本方法は、対照ラテラルフローアッセイデバイスの試料受容領域に対照試料を塗布することと、対照ラテラルフローアッセイデバイスの検出領域を読み取って結果を得ることとをさらに含んでもよい。これらの実施形態において、対照ラテラルフローアッセイデバイスは、試験ラテラルフローアッセイデバイスと同一（例えば、試験ラテラルフロー用デバイスと同じ生産ロットからの第２のラテラルフロー用デバイス）である。対照試料は、既知の量の対象となる非診断用分析物を含む流体試料である。そのため、これらの実施形態は、試験ラテラルフローアッセイデバイスと同じラテラルフローアッセイデバイスを使用して完全な対照アッセイを実行することを採択する。

本発明の方法は、定性的または定量的な結果を提供し得る。定性的な結果は、検査される試料中に分析物が存在するかどうかという単純な「有」または「無」の決定を提供する結果を含む。また、定性的な結果は、試料中の分析物の量が所定の閾値を超えた場合に陽性となる結果も含む。

ラテラルフローアッセイデバイスが定性的結果を提供するように構成されるいくつかの実施形態において、例えば、分析物が後続手順において用いられる特定の最低濃度である必要がある場合、アッセイデバイスは、任意の濃度で分析物の存在を検出するように構成される同等のラテラルフローアッセイデバイスよりも低い感受性を有するように構成されてもよい。そのため、所定の閾値を超える量で単純に存在する分析物の形式での定性的結果が所望される特定の場合において、アッセイデバイスは、閾値未満での検出を提供するのに十分ではない感受性を有するように構成されてもよい。アッセイデバイスの感受性が高過ぎる場合、有用であるには濃度が低過ぎる分析物であるにもかかわらず陽性の結果をもたらすという、偽陽性の結果のリスクが存在する。この感受性は、非診断用試料中の分析物の任意の最低量に設定することができる。さらに、ある実施形態において、各々が同じ抗体および分析物を有するが、分析物の有用性のために必要な閾値に応じて異なる感受性を有する（例えば、試験ストリップの形態の）重複アッセイデバイスが（例えば、後により詳細に考察されるキットの形態で）供給されてもよい。これらの種類の定性的実施形態は、所与の試料中の全てのレベルの分析物に対して感受性を示すように構成される診断用アッセイと区別される。所望の感受性は、任意の従来のプロトコルを用いて、例えば、検出領域内に適切な量の捕捉剤を提供すること等によって、所与のデバイスに提供されてもよい。

対照的に、定量的結果は、検査される試料中にどれくらいの分析物が存在するかのある程度の尺度を提供する。したがって、定量的結果は、検査される試料中に存在する対象となる分析物の量の少なくとも近似値を提供する。定量的結果を提供するために、検出領域は、同じかまたは異なる量の同じ捕捉プローブを含む、２つ以上の別個の捕捉プローブ領域を含んでもよい。そのため、試料中の分析物の量が、第１の捕捉領域内で捕捉することができる分析物の量を超えると、残りの自由な分析物が第２の捕捉領域に移動する。両方の領域から得られた陽性の結果は、試料中の分析物の量に関する定量的尺度を提供する。各々が異なる（徐々に少なくなる等）量の捕捉プローブを有する２つ以上の捕捉領域の勾配であってもよい一連の領域を有することにより、試料中の分析物の定量的尺度が得られてもよい。代替として、定量的尺度は、濃度測定によって得ることができる。この場合、１つの捕捉領域のみが必要となる。

場合によっては、本方法は、定性的または定量的のいずれかにおいて、試料中の２つ以上の別個の（すなわち異なる）非診断用分析物（例えば、分子式によって互いと異なる）の存在が決定される重複アッセイである。所与の重複アッセイにおいて検出され得る別個の分析物の数は、場合によっては、１〜１２、例えば、２〜４を含む１〜２の範囲で異なってもよい。重複分析を提供するために、ラテラルフローアッセイデバイスの構成は異なってもよい。例えば、ラテラルフローアッセイデバイスは、単一の試料受容領域と、２つ以上の非診断用分析物の各々のための捕捉プローブを含む検出領域を含んでもよく、例えば、各分析物のために用いられる標識が互いと識別可能であるかどうかに応じて、同じ捕捉領域または異なる捕捉領域内に異なる捕捉プローブが存在してもよい。したがって、これらの場合、ラテラルフローアッセイデバイスは、試料受容領域を検出領域に関連付ける単一のフローレーンを含んでもよい。別の対象となる重複構成は、２つ以上の対象となる非診断用分析物の各々のために別々の試料受容領域および検出領域を含む。したがって、所与の対象となるラテラルフローアッセイデバイスは、各々がその独自の試料受容領域および検出領域を有する、２つ以上の別個のフローレーンを有してもよい。また、単一の試料受容領域から複数の検出領域へと延在する複数のフローレーンを有する構成であって、それぞれの対象となる分析物に対して別々の検出領域が提供される構成を含む他の構成も可能である。重複構成に関するさらなる詳細は、米国特許第６，０３７，１２７号に提供され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

上述のように、場合によっては、分析物検出アッセイは、複数ステップの研究プロトコルにおける１つのステップとして用いられ、プロトコルは、少なくとも、本発明の分析物検出のステップの前または後のいずれかにさらなるステップを含む。したがって、本発明の態様は、第１のステップ、分析物検出ステップ、および後続ステップを含む研究プロトコルを含む。例えば、場合によっては、本発明の方法は、非診断用試料を調製するステップ、対象となる非診断用分析物について非診断用試料を試験するステップ、および、研究手順において非診断用試料をさらに使用するステップ、例えば、実験室において行われるさらなる方法を含む。

例えば、一実施形態において、検出されるべき分析物は、ウイルスベクターのパッケージングによる上清中に存在するウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）であり得る。この場合、レンチウイルス発現システム、バキュロウイルス発現システム、アデノウイルス発現システム、レトロウイルス発現システム等に使用されるもの等の、ウイルス発現プロトコルにおける使用のために作製されるウイルスベクターの上清の作製が、分析物検出ステップに先行してもよい。これらの種類のプロトコルを行う際、研究者は、最初に、対象となる遺伝子をｐＬＶＸおよびその誘導体、ｐＢａｃＰＡＫ８およびその誘導体、ｐＳｈｕｔｔｌｅ２およびその誘導体、ｐＲｅｔｒｏ−Ｌｉｂ、ＭＭＬＶ由来のプラスミド（ｐＬＸＲＮ、ｐＬＮＨＸ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＮＣＸ２等）等のベクターにクローン化してもよい。このクローン化ステップの後、研究者は、次いで、例えば、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ、ＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡ、エンベロープベクター（例えば、ｐＶＳＶ−Ｇ、ｐＥｃｏ、ｐＡｍｐｈｏ、ｐ１０Ａ１等）等の任意のプロトコル特異的パッケージング試薬とともに、ＨＥＫ２９３細胞、Ｓｆ２１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の宿主細胞に生成物をコトランスフェクトしてもよい。トランスフェクション後、ある時間の間、例えば、２４〜７２時間、パッケージング細胞を増殖させてもよい。この期間中、感染細胞中で対象となる遺伝子を含有する成熟ウイルス粒子が形成し、場合によっては、増殖培地中に見られるか、または細胞自体の中に充填される可能性もある。増殖後、研究者は、増殖培地を遠心分離もしくは濾過して上清画分を得るか、または、細胞内に生成されたウイルスの場合、研究者は、当該技術分野において既知である任意の適切な手順を用いて細胞を溶解してもよい。

この段階で、その後に続く形質導入ステップの前に、採取された上清中にウイルスが存在することを確認するために分析物検出ステップが用いられてもよい。例えば、後に実験のセクションでより詳細に記載されるような、例えば、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）ＧｏＳｔｉｘ（商標）ラテラルフローアッセイ用ストリップが、少量、例えば２０μＬの上清をストリップの試料受容領域に塗布し、次いで、吸湿性メンバーを通って検出領域へと上清を通過させることによって、採取された上清中のレンチウイルスｐ２４を検出するために使用されてもよい。上清が、標的細胞の形質導入を支持するのに十分な濃度、例えば、１ｍｌ当たりの感染単位（ＩＦＵ／ｍＬ）＞５×１０⁵ である量の成熟レンチウイルスを含有する場合、捕捉プローブ領域は、十分な量でレポータ結合メンバーに付着したレンチウイルスｐ２４を補足し、可視信号を生成してレンチウイルスの存在を示唆する。次いで、研究者は、上清を使用して標的細胞に確実に形質導入することができる。類似した方法でバキュロウイルス、レトロウイルス等の上清中の種々の他のウイルスの存在について試験するために、他のラテラルフローアッセイが用いられてもよい。試料中に存在するウイルスの量の定量的評価は、複数の捕捉プローブ領域を備えるストリップを使用して、または上記の通り濃度測定によって得ることができる。

場合によっては、検出されるべき分析物は、発現されたタンパク質に付着したエピトープタグ、例えば、６ｘＨＮ、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ等であり得る。検出ステップの前に、研究者は、大腸菌、出芽酵母、ウイルス発現系等の様々な系のうちの１つにおいてエピトープタグ化タンパク質を発現させてもよい。次いで、研究者は、クロマトグラフィー（例えば、アフィニティー、イオン交換、サイズ排除等）、選択的な沈殿、濾過等の方法を使用してタンパク質を精製することを選択してもよい。次いで、捕捉プローブ、例えば、タグ特異的モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体等と、レポータ結合剤、例えば、各々がエピトープタグに特異的に結合する、金コロイドまたはラテックスコロイド等にコンジュゲートされたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とを含むラテラルフローアッセイの試料受容領域に試料の画分を塗布することによって、検出ステップが行われてもよい。そのようなラテラルフローアッセイに十分な量のエピトープタグ化タンパク質が塗布されると、次いで、可視信号がエピトープタグの存在を示唆する。試料中に存在する発現されたタンパク質の量の定量的評価は、複数の捕捉プローブ領域を備えるストリップを使用して、または上記の通り濃度測定によって得ることができる。

さらに別の実施形態において、検出されるべき分析物は、実験汚染物質、例えば、マイコプラズマ等であり得る。この場合、分析物検出ステップは、汚染物質の存在について試験するための複数ステップの研究プロトコルの間のいずれの時点で用いられてもよい。検出ステップでそのような汚染物質の存在または不在が示唆されることにより、そのような物質に感受性を示す任意の後続実験、例えば、組織培養を継続することができるか、または中止するべきかが決定される。試料中に存在する発現されたタンパク質の量の定量的評価は、複数の捕捉プローブ領域を備えるストリップを使用して、または上記の通り濃度測定によって得ることができる。

さらに別の実施形態において、検出されるべき分析物は、レポータタンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質等）、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ等であり得る。例えば、研究者は、実験的転写因子によって誘導される上に列挙したようなレポータ遺伝子を含有する発現コンストラクトを作製し、次いで、種々のストレス条件下（飢餓、加熱または冷却処理、栄養もしくは塩分の過剰または欠乏等）で細胞を培養し、続いて細胞の上清を採取してもよい。分析物検出ステップは、発現されたレポータタンパク質の存在、不在、または量を決定するために使用することができるため、研究者は、ストレス条件下で転写因子が活性であったかどうか、プロトコルの後続ステップを続行すべきかどうか等を決定することができる。代替として、本方法は、トランスフェクションを確認するために用いられてもよい。例えば、分泌型ルシフェラーゼ等の分泌されたタンパク質が、例えば、良好にトランスフェクトされた細胞の上清中の分泌型ルシフェラーゼの存在を検出することによって、良好なトランスフェクションを確認するために検査されてもよい。次いで、細胞がさらなる実験における使用に好適であるという示唆として、トランスフェクションの確認が用いられる。所望される場合、試料中に存在する発現されたタンパク質の量の定量的評価は、複数の捕捉プローブ領域を備えるストリップを使用して、または上記の通り濃度測定によって得ることができる。

さらに別の実施形態において、検出されるべき分析物は、試料汚染物質、例えば、菌体内毒素、培養汚染物質、例えば、マイコプラズマ等であり得る。この場合、研究者は、細菌（または他の適切な、例えば細胞培養）源由来のＤＮＡ、タンパク質、または別の分子の試料を調製し、その調製物を後続実験に使用する前に汚染物質について確認することを希望してもよい。研究者は、対象となる組成物に関与するさらなる実験の前に、調製物に汚染物質、例えば、内毒素、マイコプラズマ等が入っていないことを確認するために分析物検出ステップを用いてもよい。

キット
本発明のさらなる態様は、例えば、非診断用試料中の１つ以上の非診断用分析物の存在を決定する等の本発明の方法を実践する際に使用されるキットを含む。キットは、少なくとも２つの同一のラテラルフローアッセイデバイスと、対象となる非診断用分析物のための標準物質とを含んでもよく、これらの構成要素の各々については上でより詳細に記載している。キットは、試薬（例えば、レポータ結合メンバー、対照結合剤等）、緩衝液、試料塗布器等の１つ以上の追加のアッセイ構成要素をさらに含んでもよい。キットの種々の試薬構成要素は、別々の容器内に存在してもよいか、またはそれらのうちのいくつかもしくは全てが試薬混合物中に予め組み合わせられてもよい。

上記構成要素に加えて、主題のキットは、（ある実施形態において）主題の方法を実践するための指示をさらに含んでもよい。これらの指示は、主題のキット内に様々な形態で存在してもよく、指示のうちの１つ以上がキット内に存在してもよい。これらの指示が存在し得る１つの形態は、好適な媒体または基板上に印刷された情報として、例えば、情報が印刷された一枚または数枚の紙として、添付文書等において、キットの包装内に存在してもよい。これらの指示のさらに別の形態は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）等である。存在し得るこれらの指示のさらに別の形態は、遠隔地で情報にアクセスするためにインターネットを介して使用され得るウェブサイトのアドレスである。

実験
以下の実施例は、本発明をどのように作製および使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために記述するのであって、発明者が彼らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験が、実施した全てのまたは唯一の実験であることを提示することを意図するものではない。用いた数値（例えば、量、温度等）に関して正確性を確保するように努力がなされてはいるが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮に入れるべきである。別途そうではないと指示されない限り、分は重量分であり、分子量は重量平均の分子量であり、温度は摂氏の度数であり、圧力は大気圧であるかまたはほぼ大気圧である。標準的な省略形が用いられてもよい：例えば、ｂｐ：塩基対（複数可）、ｋｂ：キロベース（複数可）、ｐｌ：ピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃ：秒（複数可）、ｍｉｎ：分（複数可）、ｈまたはｈｒ：時間（複数可）、ａａ：アミノ酸（複数可）、ｋｂ：キロベース（複数可）、ｎｔ：ヌクレオチド（複数可）等。

Ａ．レンチウイルスベクターのパッケージングによる上清の作製
当業者に既知の標準的な分子生物学的技術を用いて、対象となる遺伝子をプラスミドベクターｐＬＶＸ−Ｐｕｒｏ中にクローン化する。次いで、得られたコンストラクトを大腸菌に形質転換することによって増幅し、標準的プロトコルを用いて回収および精製する。第１の試験管内で、１μｇ／μｌの濃度のこのベクターＤＮＡ７μｌと、５５７μｌのＸｆｅｃｔ反応緩衝液（Ｘｆｅｃｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）および３６μｌのＬｅｎｔｉ−Ｘ（商標）ＨＴＸパッケージングミックス（どちらもＬｅｎｔｉ−Ｘ（商標）ＨＴＸパッケージングシステムの一部としてクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社から入手可能（カタログ番号６３１２４７））とを組み合わせる。第２の試験管内で、５９２．５μｌのＸｆｅｃｔ反応緩衝液と、７．５μｌの十分にボルテックスしたＸｆｅｃｔポリマー（どちらもＬｅｎｔｉ−Ｘ（商標）ＨＴＸパッケージングシステムの一部としてクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社から入手可能（カタログ番号６３１２４７））とを組み合わせる。各試験管を別々にボルテックスし、次いで、試験管の内容物を組み合わせて１０秒間ボルテックスする。得られた混合物を室温で１０分間インキュベートする。次いで、１０ｍｌの増殖培地（４．５ｇ／ｌグルコース、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、３．７ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウム、および１０％テトラサイクリンを含まないウシ胎仔血清を含む９０％ダルベッコ変法イーグル培地、使用前に１ｍＭビルビン酸ナトリウムに加える）中、４〜５×１０⁶ 細胞／１００ｍｍプレートで予め播種しておいたＬｅｎｔｉ−Ｘ（商標）２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のカタログ番号６３２１８０）に、全体で１２００μｌの混合物を滴下で加え、３７°Ｃおよび５％ＣＯ₂ で一晩増殖させる。得られた細胞混合物を３７°Ｃで少なくとも４時間から一晩インキュベートし、次いで、培地を１０ｍｌの新しい増殖培地と交換する。この新しい培地中で細胞を３７°Ｃで２４〜４８時間増殖させる。このインキュベーション期間の後、増殖培地を５００×ｇで１０分間遠心分離し、細胞ペレットから上清を除去することによって上清を採取する。

Ｂ．ラテラルフローアッセイによる上清中のレンチウイルスの検出
次いで、２０μｌの上清を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）ＧｏＳｔｉｘ（商標）ラテラルフローアッセイ用スティック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のカタログ番号６３１２４３）の試料受容領域に塗布する。次いで、４滴の追跡緩衝液（ｃｈａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）を試料受容エリアに加える。室温で２〜１０分後、試験領域および対照領域が可視化される。試料受容エリアに十分な液体が塗布された場合、対照線に赤色バンドが現れる。試料中にｐ２４タンパク質が存在する場合、赤色バンドは試験線に観察される。赤色の試験バンドは、ｐ２４タンパク質および抗ｐ２４抗体（検出抗体）上に被覆された金粒子の免疫複合体の貯留によるものである。陽性対照として、平行して第２のアッセイを実行することができる。この場合、４滴の追跡緩衝液は、凍結乾燥した組換えｐ２４タンパク質を収容するｐ２４対照試験管に加えられる。可溶化したｐ２４タンパク質を含む追跡緩衝液を試料受容エリアに移す。室温で２〜１０分後、試験領域および対照領域が可視化される。対照領域および試験検出領域の両方の赤色バンドが、アッセイが正しく機能していることを裏付ける。

米国特許法３５ＵＳＣ１１９（ｅ）に基づいて、本出願は、２０１０年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／３７３，１１０号および２０１０年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／４１５，２１８号の出願日に対する優先権を主張するものであり、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (15)

1. 非診断用試料中に非診断用分析物が存在するか否かを決定する方法であって、
   試験ラテラルフローアッセイデバイスの試料受容領域に前記非診断用試料を塗布する過程、および
   前記試験ラテラルフローアッセイデバイスの検出領域を読み取り、前記非診断用試料中に前記非診断用分析物が存在するか否かを決定する過程
   を有し、
   前記非診断用分析物に特異的に結合する捕捉結合メンバーが前記検出領域に存在することを特徴とする方法。
2. 前記非診断用試料は、インビトロ源から得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 対照ラテラルフローアッセイデバイスの試料受容領域に対照試料を塗布する過程、および
   前記対照ラテラルフローアッセイデバイスの検出領域を読み取る過程
   をさらに有し、
   前記対照ラテラルフローアッセイデバイスは、前記試験ラテラルフローアッセイデバイスと同一であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 前記非診断用試料中に前記非診断用分析物が存在するか否かを定性的に決定することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記非診断用試料中に前記非診断用分析物が存在するか否かを定量的に決定することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記検出領域は、２つ以上の互いに区別される捕捉プローブ領域を有することを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記非診断用試料中に２つ以上の非診断用分析物が存在するか否かを決定する方法であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記試験ラテラルフローアッセイデバイスは、単一の試料受容領域と、前記２つ以上の非診断用分析物の各々のための捕捉プローブを含む検出領域とを有することを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 前記試験ラテラルフローアッセイデバイスは、各々が個々の試料受容領域および検出領域を有する２つ以上のレーンを備えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 前記試験ラテラルフローアッセイデバイスは、前記試料受容領域と前記検出領域との間に位置するレポータ結合メンバーを備え、
    前記レポータ結合メンバーは、前記非診断用分析物に特異的に結合することを特徴とする請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記非診断用分析は、非診断用ウイルス分析物であることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
12. ウイルスベクターのパッケージングによる上清を生成する過程、および
    前記ウイルスベクターのパッケージングによる上清中に細胞を感染させるのに十分なウイルス粒子の力価が存在するか否かを決定する過程
    をさらに有することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 各々が、試料受容領域と、該試料受容領域から下流側に位置する検出領域とを有する第１および第２の同一のラテラルフローアッセイデバイスであって、非診断用分析物に特異的に結合する捕捉結合メンバーが前記検出領域に存在するデバイス、及び
    前記非診断用分析物のための標準物質
    を備えることを特徴とするキット。
14. ラテラルフローアッセイデバイスは、前記検出領域から下流側に位置する内部標準領域をさらに有することを特徴とする請求項１３に記載のキット。
15. 前記ラテラルフローアッセイデバイスは、前記試料受容領域と前記内部標準領域との間に位置する内部標準、または、前記ラテラルフローアッセイデバイスから隔離されたある量の内部標準を備えることを特徴とする請求項１４に記載のキット。

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