WO2007138964A1

WO2007138964A1 - 免疫測定用ラテックス組成物

Info

Publication number: WO2007138964A1
Application number: PCT/JP2007/060569
Authority: WO
Inventors: Shosaku Motoda
Original assignee: Denka Seiken Co., Ltd.
Priority date: 2006-05-25
Filing date: 2007-05-24
Publication date: 2007-12-06
Also published as: WO2007138964A9; JP4486059B2; JP2007315883A

Abstract

抗体を結合したラテックス粒子の自然凝集が防止され、高感度な免疫測定を可能にする免疫測定用ラテックス組成物並びにこのラテックス組成物を用いた免疫測定方法並びにイムノクロマトグラフィー装置及びフロースルー免疫測定装置が開示されている。免疫測定用ラテックス組成物は、抗体又はその抗原結合性断片を結合させたラテックス粒子と、該ラテックス粒子を浮遊させる媒体と、糖類及び多価アルコールから成る群より選ばれる少なくとも１種の凝集防止剤と、タンパク質と、緩衝剤とを含み、そのｐＨが9.0～9.8である。

Description

明細書

免疫測定用ラテックス組成物

技術分野

[0001] 本発明は、ィムノクロマトグラフィーやフロースルー免疫測定に用いられる標識抗体や、免疫凝集法用の測定試薬として有用な、免疫測定用ラテックス組成物に関する。背景技術

[0002] 近年、ウィルスや細菌等の病原体感染の有無、妊娠の有無などの様々な検査を短時間のうちに行う簡易検査試薬やキットが開発されている。病原体構成成分、ヒト絨毛性ゴナドトロピン等が検出あるいは定量の対象である。簡易検査試薬の多くは、特別な設備を必要とせず操作も簡単で安価であるという特徴を有しており、例えば、妊娠診断のための簡易検査試薬は一般薬局で販売されている。また、病原体の感染を検査する簡易検査試薬は、他の検査試薬と異なり、大病院ゃ医療検査センター以外にも一般の病院や診療所で広く使用されている。これらの施設は患者が最初に訪れる医療機関である場合が多ぐ患者力採取した検体についてその場で感染の有無が判明すれば、早い段階で治療措置を施すことができるため、簡易検査試薬の医療における重要性は益々高まってきて、る。

[0003] 現在、簡易検査方法として、抗原抗体反応を利用した免疫測定、特に、ニトロセルロース等のメンブランを用いた測定法が一般に知られており、フロースルー式とラテラルフロー式 (ィムノクロマトグラフィーとも云う）に大別される。前者は、被検出物を含む溶液をメンブランに対して垂直方向に通過させるものであり、後者は水平方向に展開させるものである。いずれの場合も被検出物に特異的に結合する捕捉物質、および被検出物に特異的に結合する標識体の複合体を固相上に形成させて、標識を検出あるいは定量することで、被検出物の検出あるいは定量を行うという点で共通している。ラテラルフロー式は、フロースルー式に比べ測定装置が簡単で、またコストの点でも優れて、るため多種多様の抗原の検出に広く用いられつつある。

[0004] 従来は、被検出物に特異的に結合する抗体を金粒子に結合したものが標識体として広く用いられていたが、着色ラテックス粒子を用いた測定系が確立され測定対象もより拡大されつつある。特にィムノクロマトグラフィーによる免疫測定は、抗体を調製すれば対象病原微生物抗原が測定可能であるがゆえに大いに期待されている。

[0005] しかし、抗体を結合させたラテックス粒子は、自然凝集が起こり易ぐこのような自然凝集は、例えば、ィムノクロマトグラフィーの場合、ラテックス粒子カ^ンブラン上に非特異的に結合したり、メンブランに目詰まりしてバックグラウンドを高めるため検出感度の低下をきたし、又捕捉物質と非特異的に結合したりして偽陽性を示すこととなり大きな問題であった。

[0006] すなわち、自然凝集は、検出感度に大きく影響し、測定に必要な S (シグナル) ZN

(ノイズ)比を低下させていた。試薬を評価する際、 SZN比が大きいことが常に必要とされ、又試薬ィ匕の技術もいかに SZN比を大きくし、し力も一定にするかが課題とされている。自然凝集には、物理的撹拌で分散する程度の凝集から、物理的撹拌では元のように分散できない強固なものまで認められる。特に後者の場合は、使用の際に撹拌する程度では元にもどらないため、反応に影響を与え、検出感度、特異性に著しヽ影響を与える結果となる。

[0007] 従来、自然凝集を防ぐ目的で添加される、 1分子内にアミノ基を 2個以上有するアミノ酸 (特許文献 1)が知られているが、比重や粘度が高くなり検出感度に著しい影響を与えるという欠点がある。また、添加剤として N, N—ジアルキルアミドゃ低級アルキルスルホキシド等 (特許文献 2参照）が、特許文献 3には、グァ-ジン、グァ-ジン塩酸塩、グァ -ジ-ゥムチオシアン酸塩、尿素等のカオトロピック試薬と共に塩化リチウム、臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、ヨウ化リチウムのようなハロゲンィ匕アルカリ金属や、塩ィ匕カルシウムのようなハロゲンィ匕金属が記載されている。また、グリシン、塩化コリン等を添加する方法も知られているが、いずれも物理的撹拌で分散する程度の安定ィ匕には効果が認められるものの強固な自然凝集には効果がない。

[0008] 特許文献 1 :特公平 6— 17911号公報

特許文献 2：特開昭 55 - 160853号公報

特許文献 3：特開昭 56 - 158947号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題 [0009] 従って、本発明の目的は、抗体を結合したラテックス粒子の自然凝集が防止され、高感度な免疫測定を可能にする免疫測定用ラテックス組成物を提供することである。さらにまた、本発明の目的は、上記本発明のラテックス組成物を用いた免疫測定方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、上記本発明の組成物を用いたィムノクロマトグラフィー装置及びフロースルー免疫測定装置を提供することである。課題を解決するための手段

[0010] 本願発明者は、鋭意研究の結果、特定の凝集防止剤と、タンパク質を添加すると共に、塩基性の緩衝剤を用いて組成物の pHを、従来のラテックス組成物では用いられていない特定範囲の高 pHとすることにより、ラテックス粒子の自然凝集が効果的に防止されると共に、高 pHにも関わらず抗体の抗原抗体反応性が低下せず、公知のラテックス組成物を用いた場合よりも高感度な免疫測定が可能になることを見出し、本発明を完成した。

[0011] すなわち、本発明は、抗体又はその抗原結合性断片を結合させたラテックス粒子と、該ラテックス粒子を浮遊させる媒体と、糖類及び多価アルコールカゝら成る群より選ばれる少なくとも 1種の凝集防止剤と、タンパク質と、緩衝剤とを含み、その pHが 9.0 〜9.8である免疫測定用ラテックス組成物を提供する。

[0012] また、本発明は、 (1) 固相に固定化された、被検出物と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片と、前記被検出物とを抗原抗体反応させて被検出物を前記固相に固定ィ匕する工程と、

(2) 次いで、該固相に固定化された被検出物と抗原抗体反応する、標識された抗体又はその抗原結合性断片を該被検出物と抗原抗体反応させて標識を前記固相に固定化する工程と、 (3) 該固相に固定化された標識を検出又は定量する工程とを含む免疫測定方法にぉ、て、

前記 (2)の工程において用いられる標識された抗体又はその抗原結合性断片が、上記本発明の組成物に含まれる、前記抗体及び Z又はその抗原結合性断片を結合させた前記ラテックス粒子であり、前記工程 (2)は、前記固相に、上記本発明の組成物を施すことにより行なわれることを特徴とする、免疫測定方法を提供する。

[0013] さらに、本発明は、多孔性基体と、該基体上に設けられ、被検出物と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が固定化された検出部と、前記基体上に設けられ、前記検出部に固定化された被検出物と抗原抗体反応する、標識された抗体又はその抗原結合性断片を保持する標識体部とを具備するィムノクロマトグラフィー装置において、前記標識体部が、上記本発明のラテックス組成物を前記基体に塗布し、乾燥したものであることを特徴とするィムノクロマトグラフィー装置を提供する。

[0014] さらに、本発明は、第 1の多孔性基体と、該第 1の多孔性基体上に設けられ、被検出物と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が固定化された検出部と、該第 1の基体上に配置された第 2の多孔性基体と、該第 2の多孔性基体上に設けられ、前記検出部に固定化された被検出物と抗原抗体反応する、標識された抗体又はその抗原結合性断片を保持する標識体部とを具備するフロースルー免疫測定装置において、前記標識体部が、上記本発明のラテックス組成物を前記第 2の多孔性基体に塗布し、乾燥したものであることを特徴とするフロースルー免疫測定装置を提供する。

[0015] さらに本発明は、上記本発明の組成物の、免疫測定用ラテックス組成物の製造のための使用を提供する。

発明の効果

[0016] 本発明により、抗体を結合したラテックス粒子の自然凝集が防止され、高感度な免疫測定を可能にする新規な免疫測定用ラテックス組成物並びにそれを用いた免疫測定方法並びにィムノクロマトグラフィー装置及びフロースルー装置が提供された。本発明の組成物によれば、従来、比重、粘度や浸透圧が上昇するため低下していた検出感度を上げることができるため、特に医療現場で行うィムノクロマトグラフィー等の簡易測定法により検体中の被検出物を高感度に精度よく測定することができる。図面の簡単な説明

[0017] [図 1]本発明の一実施態様であるィムノクロマトグラフィー装置の上面図及び切断断面図である。

発明を実施するための最良の形態

[0018] 本発明の組成物中に含まれるラテックス粒子は、従来から免疫測定に広く用いられているラテックス粒子と同じであってよぐポリスチレン、スチレン一ブタジエン共重合体、スチレンスチレンスルホン酸塩共重合体などを用いることができ、種々のものが市販されて、る。ィムノクロマトグラフィーやフロースルー免疫測定に標識抗体として用いる場合には、着色されたラテックス粒子が好ましい。また、後述する抗体又はその抗原結合性断片は、ラテックス粒子に物理吸着させてもよいが、より安定に又は大量に結合させるためには共有結合でラテックス粒子に結合させることが好ましい。このような目的のためには、ラテックス粒子上にカルボキシル基等の官能基を有するものを好ましく用いることができる。着色ラテックス粒子や、カルボキシル基等の官能基を有するラテックス粒子も市販されており、市販品を好ましく用いることができる。なお

、ラテックス粒子の直径は、特に限定されないが、通常、 0.1 μ πι〜0.8 /ζ m程度、好ましくは、 0.2 μ m〜0.6 μ m程度である。

[0019] ラテックス粒子上には抗体又はその抗原結合性断片が結合される。抗体は、免疫測定しょうとする被検出物と抗原抗体反応する抗体であり、ポリクローナル抗体であつてもモノクローナル抗体であってもよい。ここで、被検出物としては、何ら限定されるものではなぐ各種病原体、各種臨床マーカー等、抗体と抗原抗体反応することが可能ないかなる物質であってもよい。具体例として、インフルエンザウイルス、アデノウィルス、 RSウィルス、 HAV、 HBs、 HIV,ノーウォーク様ウィルス等のウィルス抗原、 M RSA、 A群溶連菌、 B群溶連菌、レジオネラ属菌等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ、クラミジァ 'トラコマティス、ヒト絨毛性ゴナドトロピン等のホルモン、 C反応性タンパク質、ミオグロビン、心筋トロポニン、各種腫瘍マーカー、農薬、環境ホルモン等を例示することができるがもちろんこれらに限定されるものではない。

[0020] 抗体に代え、又は抗体と共に、該抗体の抗原結合性断片をラテックス粒子に結合させてもよい。抗原結合性断片は、例えば、抗体の Fabや F(ab')断片等のように、対応

2

抗原と抗原抗体反応可能な断片である。これらの抗原結合性断片は、周知の通り、抗体をパパインやペプシンのようなタンパク質分解酵素で処理することにより得られる

。また、遺伝子工学的に生産した抗体やその抗原結合性断片を用いることもできる。

[0021] 抗体又はその抗原結合性断片のラテックス粒子への結合は、周知の方法により行うことができ、物理吸着によっても共有結合によっても結合することができる。上記の通り、例えばカルボキシル基を表面に有するラテックス粒子が巿販されているので、このカルボキシル基を抗体又はその抗原結合性断片のァミノ基と結合させることにより、抗体又はその抗原結合性断片を共有結合によりラテックス粒子に結合することができる。ラテックス粒子に結合する抗体又はその抗原結合性断片の量は、特に限定されず、従来と同様でよぐ粒子の径によって異なる力通常、粒子 lmg当たり 10〜： LOO g程度でよい。

[0022] 抗体又はその抗原結合性断片を結合したラテックス粒子の組成物中の含量は、特に限定されないが、通常、 0.005w/v%〜0.2w/v%程度、好ましくは、 0.01w/v%〜0.1w/v

%程度である。

[0023] ラテックス粒子を浮遊させる媒体としては、通常、水（水溶液を包含する）が用いられる。

[0024] 本発明のラテックス組成物は、糖類及び多価アルコール力も成る群より選ばれる少なくとも 1種の凝集防止剤を含有する。下記実施例に具体的に記載されるように、この凝集防止剤を含有することにより、ラテックス粒子の自然凝集が、これを含まない場合に比べて抑制される。

[0025] 糖類としては、単糖及びオリゴ糖 (単糖数が 2〜6)並びにそれらの糖アルコールが好ましぐ特に、単糖及び二糖類並びにそれらの糖アルコールが好ましい。好ましい具体例として、サッカロース、トレハロース、マルトース、ラタトース、ソルビトール及び D マン-トール等を挙げることができるがこれらに限定されるものではな、。多価ァルコールは、 1分子中に複数のアルコール性水酸基を有する化合物であり、炭素数 2 〜10程度、特に炭素数 2〜4のもの、特に直鎖状又は分枝状の鎖状多価アルコールが好ましい。特に、三価のアルコールであるグリセリン、及び水溶性多価アルコールであるポリビュルアルコールが好ましぐ特に、グリセリンは抗体タンパク質の安定性を高める効果が容易に得られるので特に好ま、。

[0026] なお、ィムノクロマトグラフィーの場合は、ラテックス粒子を抗体に標識した標識体（抗体結合ラテックス粒子)をパッドに塗布して乾燥させた状態で用いることが多、。グリセリンは常温では乾燥し難い。一方で前記の糖類は、乾燥時にラテックス組成物の安定剤としての効果を有する。従ってこのような場合は、グリセリンよりも糖類を用いるのが好ましい。 [0027] この凝集防止剤の該ラテックス組成物中の濃度 (凝集防止剤が複数種類含まれる場合にはその合計濃度）は、被検出物の種類、必要とする検出感度、用いる測定系等を勘案して適宜選択すれば良いが、一般的には 3〜20w/v%であることが好ましい。 3w/v%未満では効果が低ぐ 20w/v%を超える濃度では自然凝集の防御効果は高くなるが、逆に免疫測定の検出感度が低下する恐れがある。

[0028] さらに本発明のラテックス組成物はタンパク質を含有する。本発明でいうタンパク質は、従来から一般的な免疫測定用試薬中に安定剤、非特異的反応防止剤、ブロッキング剤等として添加されているものであって、被検出物と結合しないタンパク質であれば特に限定されるものではないが、アルブミン（ゥシ血清アルブミン、卵由来アルブミン等）、カゼイン、ゼラチン、正常免疫グロブリン等が好ましく使用できる。これらのタンパク質は、単独でも 2種以上を組み合わせても用いることができる。そしてラテックス組成物中のこれらのタンパク質の濃度 (複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、 0.02〜0.1w/v%であることが好ましぐより好ましくは 0.04〜0.08w/v%である。 0.02w/v%未満では濃度が下がるにつれて自然凝集が強くなることがあり、又 O.lw /v%を超えると濃度が上がるにつれて自然凝集が強くなる恐れがある。

[0029] 本発明のラテックス組成物の pHは 9.0〜9.8であり、好ましくは 9.2〜9.6である。下記実施例に具体的に示されるように、組成物の pHはラテックス粒子の自然凝集防止に重要な役割を果たす。すなわち、 pHが 9.0未満では自然凝集が強くなり、一方、 9.8 を超えると次第に抗体が変質するため自然凝集が起こる。従来の免疫測定用ラテツタス組成物の pHは、一般的に中性から弱塩基性の pH7.0〜8.0程度であり、本発明の組成物の pHは従来のラテックス組成物の pHよりも高い。驚くべきことに、この高い特定範囲の pHを採用することにより、ラテックスの自然凝集がより効果的に抑制される。これは高い _PHによりラテックス粒子の分散安定性が向上したものと考えられる。なお、このような高い pHを採用すると、ラテックス粒子に結合している抗体又はその抗原結合性断片が変性してその抗原抗体反応性が低下すると考えられるが、驚くべきことに、上記凝集防止剤及びタンパク質の存在下では抗体又はその抗原結合性断片の抗原抗体反応性が実質的に低下せず、下記実施例に具体的に記載されるように高感度な免疫測定が可能である。 [0030] 前記のような高、_PHのラテックス組成物を得るために、緩衝剤としてはアルカリ性の緩衝剤が好ましぐ特にトリス塩基、グリシンアミド及びアルギニン力選択したィ匕合物であることが好ましぐ更にその濃度が 2〜8mMであることが好ましぐより好ましくは 4〜6mMである。 2mM未満では濃度が下がるにつれて自然凝集が強くなる場合があり、 8mMを超えると濃度が上がるにつれて自然凝集が強くなる場合がある。なお、ここで、「緩衝剤」とは水に溶解すると緩衝液を与える化合物を意味し、緩衝液には緩衝剤が含まれる。また、「アルカリ性の緩衝剤」とは、水に溶かすとアルカリ性の緩衝液を与える緩衝剤を意味する。本発明のラテックス組成物の pHを、設定値に調整するには、水酸化ナトリウム、又は塩酸で行うのが好ましいが、これに限定されるものではない。

[0031] 本発明のラテックス組成物は、自然凝集を防御する効果を有するものである力その使用の目的に合わせて従来カゝら用いられている、界面活性剤、防腐剤等を添加して用いることができる。その添カ卩量として界面活性剤は 0.01〜2w/v%の範囲であることが好ましい。前記の界面活性剤としては、たとえば以下のようなものを用いることができる。ポリエチレングリコールモノー ρ—イソォクチルフエニルエーテル、ポリオキシェチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノォレエート、ノ-デット P— 40 (商品名）、 n—テトラデシル— N, N—ジメチル— 3—アンモ-ォ—1—プ口パンスルホネート等あるいはこれら 2種類以上混合したものを用いることができるが、これらに限定されない。

[0032] 前記の防腐剤としては、例えばアジィ匕ナトリウム、パラォキシ安息香酸エステル、ィソチアゾリノン類のケーソン CG (商品名）等が挙げられる力これらに限定されない。組成物中の防腐剤の濃度 (複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、通常、 0. 02〜0. 2w/v%程度である。

[0033] この発明のラテックス糸且成物の使用方法は、従来のラテックス糸且成物の使用方法と全く同じである。すなわち、凝集法による免疫測定の場合には、検体を検体浮遊 Z 抽出用緩衝液に浮遊 Z抽出させた検体試料とラテックス組成物とを混合し、反応させ、それによつて生じるラテックス粒子の凝集の程度を、肉眼的に観察して測定、あるいは専用の分析機器を用いて測光することによって測定するのである。より具体的な測定法としては平板を用いて行うスライド法、マイクロプレートを用いて行うプレート法、専用分析機器を用いて行う自動分析法が例として挙げられる。また、本発明のラテックス組成物中のラテックス粒子は、フロースルー免疫測定、ィムノクロマトグラフィ一等に標識抗体として用いることができ、特にィムノクロマトグラフィーにおいては、極めて好適に用いることができる。標識抗体として用いる場合には、上記の通り、ラテツタス粒子は着色されたものが好ましい。標識抗体として用いる場合も、使用方法は従来のラテックス標識抗体と全く同じである。

[0034] すなわち、本発明のラテックス組成物は、

(1) 固相に固定化された、被検出物と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片と、前記被検出物とを抗原抗体反応させて被検出物を前記固相に固定ィ匕する工程と、

(2) 次いで、該固相に固定化された被検出物と抗原抗体反応する、標識された抗体又はその抗原結合性断片を該被検出物と抗原抗体反応させて標識を前記固相に固定化する工程と、 (3) 該固相に固定化された標識を検出又は定量する工程とを含む周知の免疫測定方法において用いることができる。本発明の免疫測定方法では、前記 (2)の工程において用いられる標識された抗体又はその抗原結合性断片が、上記本発明のラテックス組成物に含まれる、前記抗体及び Z又はその抗原結合性断片を結合させた前記ラテックス粒子であり、前記工程 (2)は、前記固相に、上記本発明の組成物を施すことにより行なわれる。

[0035] この免疫測定方法は、上記の通り、ィムノクロマトグラフィー又はフロースルー免疫測定により好適に実施することができる。後で詳しく説明する通り、ィムノクロマトダラフィー装置やフロースルー免疫測定装置の標識体部を、多孔性基体 (固相）に上記本発明のラテックス組成物を施し、乾燥させて形成した装置を用いることにより、上記本発明の免疫測定方法を行なうことができる。なお、この場合、上記工程 (2)において、固相に施されるものは、被検出物を含む被検試料液によって標識体部から溶出、展開された組成物であるが、該組成物は、上記本発明のラテックス組成物に他ならない。

[0036] 本発明はまた、ィムノクロマトグラフィー装置及びフロースルー免疫測定装置をも提供する。本発明のィムノクロマトグラフィー装置及びフロースルー免疫測定装置は、

、て、標識体部を、多孔性基体に上記本発明のラテックス組成物を塗布、乾燥したもので構成したものであり、標識体部以外の構成は、公知のいずれのィムノクロマトグラフィー装置及びフロースルー免疫測定装置と同じであってもよい。

[0037] すなわち、本発明のィムノクロマトグラフィー装置は、多孔性基体（固相）と、該基体上に設けられ、被検出物と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が固定化された検出部と、前記基体上に設けられ、前記検出部に固定化された被検出物と抗原抗体反応する、標識された抗体又はその抗原結合性断片を保持する標識体部とを具備するィムノクロマトグラフィー装置において、前記標識体部が、上記本発明のラテックス組成物を前記基体に塗布し、乾燥したものであることを特徴とするものである。なお、以下の説明から明らかな通り、ここで、「多孔性基体」は、単一の多孔性基体力成ってて、てもよ、が、複数の多孔性基体の端部がそれぞれ重なるように配置され、被検試料液が、各多孔性基体を連続的に流通し得るものであってもよい。後者の場合でも、全体として 1つの多孔性基体と考えることができる。

[0038] より具体的に説明すると、例えば、着色ラテックスを用いたィムノクロマトグラフィーの場合は、メンブランストリップ (多孔性基体)上に被検出物に特異的に結合する抗体を固相した検出部、および被検出物に特異的に結合する標識体を含む標識体部を備えたアツセィ装置に被検出物を含む検体試料を展開して被検出物標識体の複合体を形成させながら展開して検出部でこの複合体を捕捉することで標識を検出あるいは定量する。着色ラテックス粒子を標識に用いるィムノクロマトグラフィーの装置の具体例の模式図を図 1に示す。図 1の上が上面図、下が切断断面図である。検体を検体浮遊 Z抽出用緩衝液に浮遊 Z抽出させた検体試料を調製する。プラスチック板 (へ)上に積層されたメンブラン (ィ)上に、被検出物と特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片を着色ラテックス粒子で標識した標識体を乾燥状態に含む標識体部 (口）を備え、更に被検出物に特異的に結合して被検出物を捕捉する捕捉抗体がライン状に結合した検出部 (ハ)を備えたアツセィ装置の検体試料滴下部 (二）に前記検体試料を滴下する。被検出物を含む検体試料は、メンブラン上を水平方向に移動しながら標識体を展開するので、被検出物が存在すれば、被検出物標識体の複合体を形成し、更に検出部 (ハ）に到達するとそのライン上に、捕捉抗体被検出物標識体の複合体が形成され、この複合体中の着色ラテックス粒子により、複合体の存在を検出することで検体中の被検出物の有無を判定する。なお、検出部 (ハ）は、被検出物と抗原抗体反応し、かつ、ラテックス粒子上の抗体又はその抗原結合性断片と同時に被検出物に結合することが可能な、抗体又はその抗原結合性断片をライン状に固相化した領域である。反応に関与しな力つた他の成分等は、吸収パッド部

(ホ）に吸収される。なお、図 1に示す例では、検出部 (ハ）が 2個存在するが、これは、例えば下記実施例に記載するように、 A型インフルエンザウイルスと B型インフルェンザウィルスのような 2種類の被検出物をそれぞれ捕捉するためのものである。このような検出部 (ハ)を複数設けることにより、複数種類の被検出物を同時に免疫測定することが可能である。着色ラテックス粒子に抗体又はその抗原結合性断片を結合したラテックス粒子を含む本発明のラテックス組成物を組み込んだ上記のようなィムノクロマトグラフィー装置を用いることにより簡便、迅速、高感度に被検出物を測定できる。

[0039] また、本発明のフロースルー免疫測定装置は、第 1の多孔性基体（固相）と、該第 1 の多孔性基体上に設けられ、被検出物と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が固定化された検出部と、該第 1の基体上に配置された第 2の多孔性基体（固相）と、該第 2の多孔性基体上に設けられ、前記検出部に固定化された被検出物と抗原抗体反応する、標識された抗体又はその抗原結合性断片を保持する標識体部とを具備するフロースルー免疫測定装置において、前記標識体部が、上記本発明のラテックス組成物を前記第 2の多孔性基体に塗布し、乾燥したものであることを特徴とするものである。フロースルー免疫測定装置は、上記したィムノクロマトグラフィー装置の検出部の上に標識体部が配置されたものに相当し、標識体部を鉛直方向に通過し、標識体を伴った被検試料液が検出部に到達し、被検試料中に被検出物が含まれる場合には、ィムノクロマトグラフィーの場合と同様に、標識であるラテックス粒子が検出部に固定される。

実施例

[0040] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

[0041] 実施例 1

ィムノクロマトグラフィーによるインフルエンザウイルス抗原の検出

1.抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の作製

(1)抗 A型インフルエンザウイルス NP抗体

A型インフルエンザウイルス抗原を BALBZcマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al.， Nature, vol, 256, p495- 497(19 75))によりマウスミエローマ細胞 (P3 X 63)と融合した。得られた融合細胞 (ハイブリド一マ）を、 37°Cインキュベータ一中で維持し、 A型インフルエンザウイルス NP抗原を固相したプレートを用いた ELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純ィ匕 (単クローン化）を行った。取得した該細胞 2株をそれぞれプリスタン処理した BALB Zcマウスに腹腔投与し、約 2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からプロテイン Aカラムを用いたァフィユティークロマトグラフィーにより、それぞれ IgGを精製し、 2種類の精製抗 A型インフルエンザウイルス NP抗体を得た。

[0042] (2)抗 B型インフルエンザウイルス NP抗体

B型インフルエンザウイルス抗原を用い、（1)と同様の方法で、 2種類の精製抗 B型インフノレエンザゥイノレス NP抗体を得た。

[0043] 2.標識体パッドの作製

精製抗 A型インフルエンザウイルス NP抗体及び精製抗 B型インフルエンザウイルス NP抗体のうち夫々 1種類ずつを使用した。粒径 0.394 mの青色ラテックス粒子 (CM /BL セラダイン製)に抗 A型インフルエンザウイルス抗体を共有結合させ、トリス塩基 5mM、ゥシ血清アルブミン 0.04w/v%、トレハロース 10w/v%及び Triton X-100 (商品名） 0.2w/v%を含む pH8.8から 9.8の溶液を調製し、これらの溶液にラテックス粒子の濃度力 S0.018w/v%になるように懸濁し、ソ-ケーシヨンを行って充分に分散浮遊させた抗 A 型ラテックス浮遊液を調製した。また、同様に抗 B型インフルエンザウイルス抗体を共有結合させた抗 B型ラテックス浮遊液を調製した。それぞれの pHの抗 A型ラテックス浮遊液と抗 B型ラテックス浮遊液とを混合し、大きさが 20cm X 1cmのガラス繊維 (33GL ASS NO.10539766 Schleicher & Schuell製)に 1平方センチメートルあたり 50 μ Lになる量を塗布し、減圧下で良く乾燥させて標識体 (パッド)を作製した。なお、ラテックス粒子への抗インフルエンザウイルス抗体の共有結合は、セラダイン社発行の Particle Te chnology RECOMMENDED ADSORPTION and COVALENT COUPLING PROCED URES 5/13/96に記載されて!、る水溶性カルボジイミド（EDAC)を用いる 1—ステツプ法により行った。

[0044] 3.インフルエンザウイルス検出用アツセィ (ィムノクロマトグラフィー）装置の作製

インフルエンザウイルス検出用アツセィ装置は、図 1に示すものと同様の構成のものを用いた。ニトロセルロースメンブラン（Hiflow Plus HF120 ミリポア製）を 3cm X 20cm の大きさに裁断し接着剤がついたプラスチック板でバッキングした、下端から 1.0cmと 1.5cmの位置に約 lmm幅になる量の抗 A型インフルエンザウイルス抗体（上記と別の抗体)液、並びに抗 B型インフルエンザウイルス抗体（上記と別の抗体)液を各々 20c m塗布し、減圧下で良く乾燥させて抗体を固相化した (検出部)。次に、 3cm X 20cm の大きさの濾紙 (WF1.5ワットマン製）を-トロセルロースメンブランの上端に 8mm重ねて吸収パッド部を設けた。更に、標識体パッドを-トロセルロースメンブランの下端に 2 mm重ねて標識体部を設け、更に、大きさが 2.0cm X 20cmのガラス繊維 (F075-14、ヮットマン製)を標識体パッドの上端から 3mm離れた位置に合わせて重ね、検体試料滴下部を設けた。次いで、カッターで幅 5mmの短冊に裁断して一体ィ匕されたアツセィ装置を作製した。

[0045] 4.試験

検体として、ふ化鶏卵内で培養した A型インフルエンザウイルス A/Panama/2007/9 9(H3N2)、 B型インフルエンザウイルス B/Shangdong/7/97を用いた。検体は、検体浮遊 Z抽出用緩衝液 (50mMトリス緩衝液、 pH8.0に Triton X- 100 (商品名 ) l(w/v)%、ゥシ血清アルブミン l(w/v)%、正常免疫グロブリン（マウス） 0.1(w/v)%、アジ化ナトリウム 0.09(w/v)%にカロ）を用いて以下のような希釈系列を調製し検体試料とした。

1 : 1 X 10³

1 : 2 X 10³

1 : 4 X 10³

1 : 6 X 10³ 1 : 8 X 10³

[0046] また、検体浮遊 Z抽出用緩衝液を陰性対照試料 (ウィルス陰性)とした。次に、アツセィ装置を水平に置き、検体試料並びに陰性対照試料を検体試料滴下部に 100 L 滴下し、標識体を展開させた。判定は、 15分間後に検出部 (A型インフルエンザウイルス検出部並びに B型インフルエンザウイルス検出部）の着色ラインの有無を目視により観察して行った。

着色ライン有：陽性 (+ )

着色ライン無：陰性（一）

[0047] 5.結果

得られた結果を表 1 (表 1-1並びに表 1-2)に示す。検体試料 A/Panamaは、表 1-1 に示すように、 pH9.0〜9.8では 1:4 X 10³希釈まで A型検出部が陽性を示し、 B型検出部は陰性であり、陰性対照試料は、 A型検出部並びに B型検出部共に陰性で特異的に A型インフルエンザウイルスを検出している。しかしながら、 pH8.8においては、 1:2 10³〜6 10³希釈まで八型検出部並びに型検出部共陽性、陰性対照試料も A型検出部並びに B型検出部共陽性で非特異反応がみられた。

[0048] 検体試料 B/Shangdongは、表 1—2に示すように、 pH9.0〜9.8では 1:2 X 10³希釈まで B型検出部が陽性を示し、 A型検出部は陰性であり、陰性対照試料は、 A型検出部並びに B型検出部共に陰性で特異的に B型インフルエンザウイルスを検出している。しかしながら、 pH8.8においては、 1:1 10³〜4 10³希釈まで八型検出部並びに型検出部共陽性、陰性対照試料も A型検出部並びに B型検出部共陽性で非特異反応がみられた。 A型 ZB型インフルエンザウイルス希釈試料並びに陰性対照試料を用いた PH8.8における A型検出部並びに B型検出部共すベて陽性となる現象は、ラテックス粒子の自然凝集による検出ラインへの非特異結合によるものと考えられる。以上の成績から、ラテックス組成物は、 pHが 9.0以上、 9.8以下の範囲が適していることがわカゝる。

[0049] [表 1-1] 表 1― 1

A型： A型インフルエンザウイルス検出部

B型： B型インフルエンザウイルス検出部

¾¾ε I一

Α型： Α型インフルエンザウイルス検出部

B型： B型インフルエンザウイルス検出部

[0051] 実施例 2

実施例 1で使用した PH9.4の標識体パッドを備えたアツセィ装置を用いて、検体を増やして本発明法と比較例との検出感度を試験した。

[0052] 試験

検体として、ふ化鶏卵内で培養した、

A型インフルエンザウイルス 3株

A/New Caledonia/20/99(H1N1)

A/Panama/2007/99(H3N2)

A/Beijing/32/92(H3N2)

B型インフルエンザウイルス 3株、

B/Shangdong/7/97

B/ Johannesburg/ 5/ 99

B/Shanhai/361/2002 を用いた。

[0053] 検体は、実施例 1と同様に希釈して検体試料を調製した。検体試料を検体試料滴下部に 100 L滴下し、標識体を展開させた。

[0054] 判定は、 15分間後に検出部の着色ラインの有無を目視により観察して行った。陽性と判定された終末希釈倍数を検出感度として表示した。

着色ライン有：陽性 (+ )

着色ライン無：陰性（一）

[0055] 比較例 1

比較例 1として体外診断用医薬品、インフルエンザウイルスキット「クイック S—インフル Α·Β「生研」」（デン力生研製)を用い検出感度を試験した。なお、「クイック S—インフル Α·Β「生研」」（デン力生研製）は、金コロイド標識抗インフルエンザウイルス抗体を標識体として用いたフロースルー式のアツセィ装置である。

[0056] 結果

得られた結果を表 2に示す。本発明法の成績は、 Α型並びに Β型ウィルスとも比較例 1よりも少な、ウィルス量を検出して、る。本発明のラテックス組成物は非特異がなぐ A型/ B型インフルエンザウイルスを高感度に検出並びに鑑別できることがわかる

[0057] [表 2]

検体試料本発明法比較例 1

A型 B型 A型 B型

A/New Caledonia

1 ： 1 X 1 0³ + +

1 ： 2 X 1 0³ 十 ―

1 ； 4 X 1 0³ +

1 ： 6 X 1 0³ ―

A/Panama

1 1 X 1 0³ + + ―

1 2 X 1 0 ³ + ―

1 4 X 1 0 + ― ―

1 6 X 1 0³ ― ― ― ―

A/Be ij ing

1 2 X 1 0³ + +

1 4 X 1 0³ + 一 ―

1 6 X 1 0³ 十 ― ― ―

1 8 X 1 0³ ― ― ― ―

B/Shangdong

1 1 X 1 0³ ― + ― 十

1 2 X 1 0³ + ―

1 4 X 1 0³ ― ―

1 6 X 1 0 ³ ―

B/Jo anriesburg

1 1 X 1 0 ³ 十 +

1 2 X 1 0³ + ―

1 4 X 1 0³ + ―

1 6 X 1 0 ^a ― ―

B/Shanhai

丄 , 1 丄 0³ +

X ■ '、丄 0³ +

1 : 4 X 1 0 ³

1 : 6 X 1 0³

A型： A型ィ出部

B型： B型ィ

実施例 3

実施例 2で作製したと同じアツセィ装置を用いて以下のような試験をした。 [0059] 試験

病院で採取された鼻腔拭、検体の中から、 PCR法で A型インフルエンザウイルス陽性と判定された検体 1〜10、 B型インフルエンザウイルス陽性と判定された検体 11 〜20を用いた。検体を検体浮遊 Z抽出用緩衝液 (実施例 1と同組成) 0.3mLに浮遊したものを検体試料とし、その 100 Lを検体試料滴下部に滴下した。判定は、実施例 1と同様に行った。

[0060] 結果

得られた結果を表 3に示す。本発明法の成績は全て PCR法の成績と一致した。表 3に示すように本発明による方法は、インフルエンザウイルスを特異的に高感度で検出並びに A型 ZB型の判定が同時にできることがわかる。

[0061] [表 3]

[0062] 実施例 4

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA)のペニシリン結合蛋白 2' (PBP2')に対するモノクローナル抗体 2種類 (デン力生研製)を酵素処理して F(ab')精製画分 (抗 PBP2'精

2

製画分)を得た。

[0063] 抗 PBP2'精製画分の 1種類を、実施例 1と同様にして粒径 0.394 /z mの青色ラテックス粒子（CM/BL セラダイン製）に共有結合させ、ミルクカゼイン 0.05w/v%、 D-マン- トール 10w/v%並びにトリス塩基 5mM、 Triton X- 100 (商品名） 0.2w/v%を含む溶液、 p H9.2を調製し、ラテックス粒子の濃度が 0.018w/v%になるように懸濁し、ソ-ケーションを行って充分に分散浮遊させた抗 PBP2'ラテックス浮遊液を調製した。

[0064] 実施例 1と同様の方法で標識抗体パッドを作製した。抗 PBP2'精製画分のもう 1種類の方を実施例 1の A型に相当する位置の-トロセルロースメンブランに実施例 1と同様の方法で塗布し、さらに実施例 1と同様の方法により標識抗体パッドを装着した PBP2'検出用の一体ィ匕アツセィ装置を作製した。

[0065] 試験

黄色ブドウ球菌の PBP2'産生菌 (菌株 1〜5) 5株を培養して、スライドラテックス凝集反応による PBP2'検出用キット「MRSA-LA「生研」」（デン力生研製)の添付文書に記載されているアルカリ抽出法によりスライドラテックス凝集反応用試料を調製した。

[0066] 検体浮遊 Z抽出用緩衝液 (実施例 1と同組成)を用いて凝集反応用試料の 2倍系列希釈を行い検体試料を調製し、その 100 Lを PBP2'検出用アツセィ装置の検体試料滴下部に滴下した。

[0067] 判定は、 15分間後に検出部の着色ラインの有無を目視により観察して行った。陽性と判定された終末希釈倍数を検出感度として表示した。

[0068] 比較例 2

比較例 2として、従来カゝら行われている MRSA-LA「生研」（デン力生研製)を用いたスライドラテックス凝集反応により検出感度を試験した。なお、 MRSA-LA「生研」（デン力生研製）に用いられて、るラテックス組成物の組成は、

抗 PBP2'抗体結合ポリスチレン粒子 0.1(w/v)%、

リン酸緩衝生理食塩液 75mM、 pH7.0、

ゥシ血清アルブミン 0.5(w/v)%

アジ化ナトリウム 0.08(w/v)%、であり、ラテックス粒子上には抗 PBP2'モノクローナル抗体が結合されている。

[0069] 結果

得られた結果を表 4に示す。表 4に示すように本発明による方法は、比較例 2と比べ MRSAの PBP2'抗原を特異的に高感度で検出できることがわかる。

[0070] [表 4] 実施例 4 比較例 2

菌株 1 1 2⁹ 1 2³

菌株 2 1 2⁸ 1 2⁴

菌株 3 1 2 ' ¹ 1 2⁶

菌株 4 1 V 1 2²

菌株 5 1 2⁹ 1 2⁵

[0071] 実施例 5

タンパク質及び凝集防止剤の効果を確かめるために以下のような実験を行った。

[0072] 正常ゥサギ免疫グロブリンを粒径 0.191 μ mの白色ラテックス粒子 (積水化学製）に吸着結合させ、下記の組成の溶液をそれぞれ調製し、ラテックス粒子の濃度が O.lw/ v%になるようにそれぞれの溶液に懸濁し、ソ-ケーシヨンを行って充分に分散浮遊させた正常ゥサギ免疫グロブリン結合ラテックス浮遊液を調製した。

[0073] 溶液の組成：

a溶液：トリス塩基 5mM、アジ化ナトリウム 0.09w/v%、 pH9.4

b溶液：トリス塩基 5mM、ゥシ血清アルブミン 0.05w/v%、アジ化ナトリウム 0.09w/v%、 p H9.4

c溶液：トリス塩基 5mM、ゥシ血清アルブミン 0.05w/v%、サッカロース 15w/v%、アジ化ナトリウム 0.09(w/v)%、 pH9.4

d溶液：トリス塩基 5mM、ゥシ血清アルブミン 0.05w/v%、グリセリン 15w/v%、アジ化ナトリウム 0.09(w/v)%、 pH9.4

[0074] 正常ゥサギ免疫グロブリン結合ラテックス浮遊液を 4〜10°Cに保存して自然凝集の発生の有無を目視により観察した。

[0075] 結果

得られた結果を表 5に示す。タンパク質並びにサッカロースを含む c溶液、タンパク質並びにグリセリンを含む d溶液

は 540日間保存しても自然凝集が起こらなかった力サッカロース、グリセリンを含まないタンパク質だけの b溶液は 360日間の保存で自然凝集が起こり、更に、タンパク質、サッカロース、グリセリンを含まないトリス塩基だけの _a溶液は 1日間で自然凝集が起こった。以上の結果から、タンパク質及び凝集を防止する物質の効果は明らかである。

[表 5] 保存曰数

1 曰 9 0曰 1 8 0曰 3 6 0 曰 5 4 0曰

a溶液 + + + + +

b溶液 ― ― 一 + +

c溶液

d溶液 ― ― ― ―

一；自然凝集なし + ; 自然凝集あり

Claims

請求の範囲

[I] 抗体及び Z又はその抗原結合性断片を結合させたラテックス粒子と、該ラテックス粒子を浮遊させる媒体と、糖類及び多価アルコール力成る群より選ばれる少なくとも 1種の凝集防止剤と、タンパク質と、緩衝剤とを含み、その pHが 9.0〜9.8である免疫測定用ラテックス組成物。

[2] 前記糖類が、単糖及びオリゴ糖並びにそれらの糖アルコールカゝら成る群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 1記載の組成物。

[3] 前記糖類が、サッカロース、トレハロース、マルトース、ラタトース、ソルビトール及び

D—マン-トールカ成る群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 2記載の組成物

[4] 前記多価アルコール力炭素数 2〜10の多価アルコール力も成る群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 1ないし 3のいずれか 1項に記載の組成物。

[5] 前記多価アルコールがグリセリンである請求項 4記載の組成物。

[6] 前記凝集防止剤の前記組成物中の濃度が 3〜20w/v%である請求項 1な、し 5 、ずれカ 1項に記載の組成物。

[7] 前記緩衝剤がアルカリ性の緩衝剤であり、前記組成物中の濃度が 2〜8mMである請求項 1な!、し 6 、ずれか 1項に記載の組成物。

[8] 前記アルカリ性の緩衝剤力トリス塩基、グリシンアミド及びアルギニン力成る群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 7記載の組成物。

[9] 前記タンパク質がアルブミン、カゼイン、ゼラチン及び免疫グロブリン力も成る群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 1ないし 8のいずれ力 1項に記載の組成物。

[10] 前記タンパク質の前記組成物中の濃度が、 0.02〜0.1w/v%である請求項 1ないし 9 の!、ずれか 1項に記載の組成物。

[II] 前記ラテックス粒子が着色ラテックス粒子であり、前記免疫測定がィムノクロマトダラフィ一又はフロースルー免疫測定である請求項 1な!、し 10の、ずれか 1項の記載の組成物。

[12] ィムノクロマトグラフィー又はフロースルー免疫測定用装置に、標識体として含まれた形態にある請求項 11記載の組成物。

[13] (1) 固相に固定化された、被検出物と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片と、前記被検出物とを抗原抗体反応させて被検出物を前記固相に固定ィ匕する工程と、

前記 (2)の工程において用いられる標識された抗体又はその抗原結合性断片が、請求項 1ないし 10のいずれ力 1項に記載の組成物に含まれる、前記抗体及び Z又はその抗原結合性断片を結合させた前記ラテックス粒子であり、前記工程 (2)は、前記固相に、請求項 1ないし 10のいずれか 1項に記載の組成物を施すことにより行なわれることを特徴とする、免疫測定方法。

[14] ィムノクロマトグラフィー又はフロースルー免疫測定により行なわれる請求項 13記載の方法。

[15] 多孔性基体と、該基体上に設けられ、被検出物と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が固定化された検出部と、前記基体上に設けられ、前記検出部に固定化された被検出物と抗原抗体反応する、標識された抗体又はその抗原結合性断片を保持する標識体部とを具備するィムノクロマトグラフィー装置において、前記標識体部が、請求項 1な、し 10の、ずれか 1項に記載の組成物を前記基体に塗布し、乾燥したものであることを特徴とするィムノクロマトグラフィー装置。

[16] 第 1の多孔性基体と、該第 1の多孔性基体上に設けられ、被検出物と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が固定化された検出部と、該第 1の基体上に配置された第 2の多孔性基体と、該第 2の多孔性基体上に設けられ、前記検出部に固定化された被検出物と抗原抗体反応する、標識された抗体又はその抗原結合性断片を保持する標識体部とを具備するフロースルー免疫測定装置におヽて、前記標識体部力請求項 1ないし 10のいずれか 1項に記載の組成物を前記第 2の多孔性基体に塗布し、乾燥したものであることを特徴とするフロースルー免疫測定装置。

[17] 請求項 1ないし 10のいずれか 1項に記載の組成物の、免疫測定用ラテックス組成物の製造のための使用。