JPH0552846A - 免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高分子量の蛋白質のような測定対象抗原であ
っても、交差反応の影響を回避して高精度に測定し得る
免疫測定方法を得る。 【構成】 測定対象抗原に対する抗体に対して交差反応
し、かつ試料中に測定対象抗原と共に混在することが予
測される交差反応性物質に対する抗体を、予め試料と反
応させて交差反応性物質を捕捉し、しかる後試料と、測
定対象抗原に対する抗体が不溶性担体に担持されたもの
との免疫反応により凝集の程度を検出する、免疫測定方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原と抗体との免疫凝
集反応を利用した免疫測定方法に関し、特に、交差反応
性物質による交差反応の影響を回避し得る免疫測定方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、抗原と、該抗原に対応する抗体と
の免疫反応により生じた凝集の程度を、肉眼により、あ
るいは光学的検出手段により検出する免疫測定方法が広
く用いられている。この種の免疫測定方法では、抗原と
抗体との特異反応を利用するものであるため、測定対象
抗原に対応する抗体に対して交差反応する、交差反応性
物質が試料中に混在する場合、測定対象抗原を正確に検
出することができない。

【０００３】そこで、交差反応性物質の影響を抑制し得
る測定方法が、特開昭６３−２６６３５６号で提案され
ている。この先行技術に記載の測定方法では、試料中に
混在することが予測される交差反応性物質または該交差
反応性物質の交差反応性抗原決定基を有する物質を添加
して免疫反応を行わせ、それによって交差反応の影響が
抑制されている。すなわち、この先行技術に記載の方法
では、交差反応率が、交差反応性物質の濃度が低い程大
きく、該交差反応性物質の濃度が高い場合には比較的小
さいことに着目し、上記のように反応系に交差反応性物
質を添加することにより、交差反応の影響を抑制してい
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記先
行技術に記載の方法は、測定対象が低分子量物質である
場合には一応の効果を発揮するが、高分子量の蛋白質を
測定する場合には、この測定対象物が低濃度の場合、吸
光度変化を大きくとることが難しいため、実際に使用す
ることが難しい。

【０００５】また、上記先行技術に記載の方法は、競合
反応によって交差反応を抑制するものであるため、測定
時間等の条件によっては、交差反応を完全に抑えられな
い可能性があった。本発明の目的は、低分子量物質から
蛋白質等の高分子量物質に至る広い範囲の測定対象物質
を、交差反応の影響を回避しつつ正確に測定し得る免疫
測定方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の抗原
の測定に際し、該抗原と該抗原に対応する抗体との免疫
反応により生じた凝集の程度を検出することにより、前
記抗原を検出または定量する免疫測定方法において、下
記の工程を備えることを特徴とする。すなわち、本発明
の免疫測定方法では、測定対象抗原に対応する抗体に対
して測定対象抗原と交差し、かつ試料中に測定対象抗原
と混在することが予測される交差反応性物質に対する抗
体と、試料とがまず反応させられる。次に、上記反応後
の試料と、不溶性担体に担持されており、かつ測定対象
抗原に対応する抗体とが反応させられる。

【０００７】すなわち、本発明の免疫測定方法では、測
定対象抗原と該抗原に対応する抗体とを反応させるに先
立ち、試料が交差反応性物質に対する抗体と反応させら
れ、試料中の交差反応性物質が捕捉される。従って、試
料中の交差反応性物質による交差反応の影響が防止さ
れ、それによって測定対象抗原が正確に測定され得る。
本発明によって測定される測定対象抗原としては、ヒト
絨毛性ゴナドトロピン（以下ＨＣＧ）、ヒトアルブミン
（以下ＨＳＡ）、ウシアルブミン（ＢＳＡ）等の高分子
量の蛋白質や、その他薬物やペプチド等の低分子量の抗
原性物質が挙げられる。この種の測定対象抗原に対して
交差反応性を示す交差反応性物質としては、例えば、測
定対象がＨＣＧでは黄体形成ホルモンが挙げられ、ＨＳ
Ａに対してはＢＳＡが、ＢＳＡに対してはＨＳＡが挙げ
られる。また、低分子量の測定対象抗原であるテオフィ
リンに対しては、交差反応性物質として、カフェインが
挙げられる。

【０００８】上記のような測定対象抗原を含有する試料
を免疫凝集反応を利用した免疫測定法で測定する場合、
試料中に上記のような交差反応性物質が存在している
と、該交差反応性物質と、測定対象抗原に対応する抗体
との交差反応の影響を受け、測定対象抗原を正確に測定
することが困難となる場合がある。そこで、本発明で
は、予め、試料と、交差反応性物質に対する抗体とが反
応されて、試料中の交差反応性物質が捕捉される。交差
反応性物質に対する抗体と、試料との上記反応は、通
常、交差反応性物質に対する抗体を含む緩衝液溶液を試
料と混合し、反応させることにより行われ、それによっ
て試料の希釈と同時に、上記反応が行われる。反応の際
のｐＨは、５〜１０、特に６〜８の範囲であることが好
ましい。また、上記緩衝液としては、リン酸緩衝液、ト
リス緩衝液、グリシン緩衝液、アンモニア緩衝液等が適
宜使用される。反応温度は４〜５０℃、特に２０〜４０
℃が好ましい。

【０００９】次に、上記反応後の試料と、測定対象抗原
に対応する抗体とが反応される。この測定対象抗原に対
応する抗体は、不溶性担体に担持された状態で用意され
る。具体的には、例えば、上記反応終了後の試料と、測
定対象抗原に対応する抗体を不溶性担体に担持させたも
のを含有する緩衝液とを混合することにより行われる。
この免疫反応の際のｐＨは、５〜１０、特に６〜８の範
囲であることが好ましい。また、測定対象抗原に対する
抗体が担持された不溶性担体を含有する緩衝液として
は、前述したような適宜の緩衝液が用いられる。反応温
度は、４〜５０℃、特に２０〜４０℃が好ましい。

【００１０】本発明の測定系において上記測定対象抗原
に対する抗体を担持するための不溶性担体としては、無
機物質粉末、合成高分子を含む有機物質粉末、微生物、
血球または細胞膜片等が挙げられる。無機物質粉末とし
ては、シリカもしくはアルミナまたは金、チタン、鉄も
しくはニッケル等の金属片が挙げられる。有機物質粉末
としては、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキ
ストラン等が挙げられる。また、合成高分子としては、
ラテックスが好ましく、通常ラテックス懸濁液の状態で
用いられる。使用し得るラテックスとしては、ポリスチ
レン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、（メ
タ）アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン
共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、
酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられ
る。用いるラテックスの平均粒径は、測定対象物質の検
出濃度域または測定機器によって適宜選択されるが、通
常、０．０５〜１．０μｍ程度とされる。

【００１１】上記のように、測定対象抗原に対する抗体
が担持された不溶性担体と試料との反応により、測定対
象抗原と該測定対象抗原に対する抗体との免疫反応によ
って凝集が進行する。この凝集の程度を測定することに
より、測定対象抗原の検出を行うことができる。本発明
では、上記不溶性担体に担持された測定対象抗原に対す
る抗体と、試料との反応によって生じた凝集状態を検出
する方法については特に限定されず、肉眼によって凝集
の有無を判定する方法、及び光学的な測定方法を用いて
行う方法の何れをも採用することができる。肉眼で判定
する方法は、一般に、不溶性担体に担持された抗体と、
試料中の抗原の凝集状態を肉眼で判定し、抗原の有無の
判定あるいは抗原の半定量法として用いられているもの
である。他方、光学的測定方法は、試料中の抗原の定量
に用いられている方法であり、反応液に光を照射して散
乱光または透過光を測定するものである。本発明では、
上記不溶性担体に担持された測定対象抗原に対する抗体
と、試料との反応によって生じた凝集状態を検出する方
法については特に限定されない。

【００１２】不溶性担体の凝集の程度を光学的に検出す
る方法では、測定対象抗原に対する抗体が担持された不
溶性担体含有緩衝液中に、ポリエチレングリコールやデ
キストラン等の増感剤を添加することも有効である。ま
た、光学的測定は、散乱光強度、吸光度または粒子数の
いずれを測定することによって行ってもよい。測定波長
は、一般に、３００〜２４００ｎｍを使用することがで
きる。測光方法については、公知の方法に従って、用い
る不溶性担体の粒子の大きさもしくは濃度または反応時
間の選択等によって、散乱光強度または吸光度の増加も
しくは減少を測定することができる。また、より短時間
で測定したい場合には、凝集反応速度や吸光度の絶対値
を検出することによっても、測定対象抗原を定量するこ
とができる。なお、光学的検出法を用いる場合、反応時
間についても、適宜選択することができる。

【００１３】測定対象抗原に対応する抗体が担持された
不溶性担体の凝集の程度を肉眼で判定する試薬に本発明
を用いる場合を説明する。上記と同様に、交差反応性物
質に対する抗体と反応された後の試料と、測定対象抗原
に対する抗体を吸着させた不溶性担体を含む緩衝液と
を、判定板上で混合し、１〜５分間揺り動かした後、凝
集の有無を肉眼で判定する。なお、緩衝液中にポリエチ
レングリコールやデキストラン等の増感剤を含有させて
もよく、それによって凝集反応を促進し、微量の測定対
象抗原を正確に検出または半定量することができる。

【００１４】

【作用】本発明によれば、測定対象抗原を含有する試
料、例えば血液や尿に、測定対象抗原と交差反応性を有
する物質に対する抗体を予め反応させることにより、試
料中の交差反応性物質が、上記交差反応性物質に対する
抗体により捕捉される。そして、上記交差反応性物質に
対する抗体と試料との反応によって交差反応性物質が捕
捉された後に、試料が測定対象抗原に対する抗体と反応
される。この場合、交差反応性物質が、上記のように予
め該交差反応性物質に対する抗体によって捕捉されてい
るため、測定対象抗原に対する抗体と測定対象抗原との
凝集反応に関与することがない。従って、交差反応の影
響が確実に回避されるので、測定対象抗原が正確に検出
される。

【００１５】

【実施例】以下、本発明の非限定的な実施例及び比較例
を説明することにより、本発明を明らかにする。実施例１ ヒト絨毛性ゴナドトロピン（コスモバイオ社製、以下、
ＨＣＧと略す）を常法に従ってウサギに免疫した。得ら
れた抗血清を硫安塩析により精製し、γ−グロブリン分
画を得た。このγ−グロブリン分画を濃度１ｍｇ／ｍｌ
となるように、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）
で希釈し、抗ＨＣＧ抗体溶液を得た。

【００１６】上記抗ＨＣＧ抗体溶液１０ｍｌに、平均粒
径が０．２６μｍのポリスチレンラテックス（積水化学
社製、固形分１０重量％）１ｍｌを加え、３７℃で６０
分間攪拌し、次に４℃で遠心分離（１８，０００ｒｐｍ
×６０分）行った。遠心後、上澄みを捨てた沈澱物に、
１．２重量％のウシ血清アルブミンを含む０．２Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）１０ｍｌを加えてラテックス
を懸濁させ、ラテックス試薬を作成した。

【００１７】正常ヒト尿、及び正常ヒト尿に、５、１
０、３０、５０及び１００ＩＵ／ｍｌとなるように、そ
れぞれ、ヒトＨＣＧを添加したものを試料とした。ま
た、交差性の判定用に、ＨＣＧの類似物質試料として、
黄体形成ホルモン（コスモバイオ社製、以下、ＬＨと略
す）を１００ｍＩＵ／ｍｌに希釈したものを用意した。
各試料を、抗ＬＨ抗体を５ｍｇ／ｍｌ含有し、ウシ血清
アルブミンを１重量％含有する５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ＝７．２）で、ガラス試験管を用いて１０倍に希
釈し、５分間静置した。静置後、希釈試料５０μｌと、
上記ラテックス試薬５０μｌとを混合し、３分間揺り動
かした後、凝集の有無を肉眼で判定した。結果を下記の
表１に示す。

【００１８】なお、上記で使用した抗ＬＨ抗体は、ＬＨ
（コスモバイオ社製）をウサギに免疫し、得られた抗血
清を硫安塩析により精製したγ−グロブリン分画であ
る。比較例１ ラテックス試薬については、実施例１と同様にして作成
した。また、実施例１で用意したのと同一の各試料を、
ウシ血清アルブミンを１重量％含有する５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ＝７．２）で、ガラス試験管を用いて１０
倍に希釈した。希釈検体５０μｌと、上記ラテックス試
薬５０μｌとを混合し、３分間揺り動かした後の凝集の
有無を肉眼で判定した。結果を表１に併せて示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】なお、表１おいて、−の記号は、ラテック
スが凝集しない状態を示し、＋の記号はラテックスが凝
集した状態を示す。表１から明らかなように、ＢＳＡの
みによって希釈した比較例１では、交差反応の影響を除
くことができず、従ってＬＨとも反応しており、特異性
が十分でないことがわかる。これに対して、実施例１の
免疫測定方法では、試料を希釈する際に抗ＬＨ抗体を含
有したリン酸緩衝液で希釈することにより、予め交差反
応性物質が捕捉されているため、ＬＨとの反応が認めら
れず、従って特異性に優れていることがわかる。

【００２１】実施例２ ヒトアルブミン（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ社製、以下、ＨＳＡと略す）を、常法に従ってウサギ
に免疫した。得られた抗血清を、硫安塩析により精製
し、γ−グロブリン分画を得た。このγ−グロブリン分
画を、濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍグリシン
緩衝液（ｐＨ＝９．０）により希釈し、抗ＨＳＡ抗体溶
液を得た。

【００２２】上記のようにして得た抗ＨＳＡ抗体溶液１
０ｍｌに、平均粒径が０．１３μｍのポリスチレンラテ
ックス（積水化学社製、固形分１０重量％）１ｍｌを加
え、３７℃で６０分間攪拌し、次に４℃で遠心分離（１
８，０００ｒｐｍ×６０分）をおこなった。遠心後、上
澄みを捨てた沈澱物に、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ
＝９．０）８０ｍｌを加えてラテックスを懸濁させ、ラ
テックス試薬を作成した。

【００２３】正常ヒト尿、及び正常ヒト尿に、それぞ
れ、５、１０、５０μｇ／ｍｌの濃度となるようにＨＳ
Ａを添加したもの並びにＢＳＡを正常ヒト尿で５０μｇ
／ｍｌに希釈したものを試料とした。各試料を、５ｍｇ
／ｍｌの割合で抗ウシアルブミン抗体（コスモバイオ社
製）を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）
で、ガラス試験管を用いて１０倍に希釈し、３７℃で５
分間静置した。静置後、希釈試料１０μｌと、上記ラテ
ックス試薬１２００μｌとを混合し、光路長５ｍｍのガ
ラスセルを用いて５７０ｎｍの波長で５分間の吸光度変
化を求めた。結果を下記の表２に示す。

【００２４】比較例２ ラテックス試薬及び各試料については実施例２と同様に
作成した。各試料は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝
７．２）でガラス試験管を用いて１０倍に希釈した。希
釈試料１０μｌと、上記ラテックス試薬１２００μｌと
を混合し、実施例２と同様にして吸光度変化を測定し
た。結果を下記の表２に示す。

【００２５】

【表２】

【００２６】表２から明らかなように、比較例２では、
試料を５０ｍＭリン酸緩衝液で希釈しただけであるた
め、交差反応による影響によって、試料中のヒトアルブ
ミン濃度が０の場合でも凝集が生じた。これに対して、
実施例では、抗ヒトアルブミン抗体を含有するリン酸緩
衝液で希釈したためか、試料が損なわれたり、交差反応
を起こしたりすることなく、正確に測定を行い得ること
がわかる。

【００２７】このことは、比較例２においては、抗ヒト
アルブミンポリクローナル抗体が、ウシ血清アルブミン
と交差反応を起こしていることを意味する。これに対し
て、実施例２では、予め抗ウシ血清アルブミン抗体によ
り、交差反応性物質であるウシ血清アルブミンが捕捉さ
れ、担体に固定化された抗ヒトアルブミン抗体との反応
においては凝集を起こさなくなったものと考えられる。

【００２８】

【発明の効果】以上のように、本発明によれば、測定対
象抗原含有試料が、予め測定対象抗原に対して交差性を
有する交差反応性物質に対する抗体と反応されて、交差
反応性物質が捕捉されるため、試料と測定対象抗原に対
する抗体との反応に際し、交差反応の影響を確実に回避
することができる。よって、低分子量の測定対象抗原だ
けでなく、高分子量の蛋白質等についても正確に免疫学
的測定法により検出することができる。

【００２９】また、本発明の免疫測定法は、競合反応を
利用するものでないため、測定時間等の条件を厳格にコ
ントロールする必要がない。従って、比較的簡便に測定
対象抗原を正確に検出することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の抗原の測定に際し、前記抗原
   と、該抗原に対応する抗体との免疫反応により生じた凝
   集の程度を検出することにより、前記抗原を検出または
   定量する免疫測定方法において、 測定対象抗原に対する抗体に対して測定対象抗原と交差
   し、かつ試料中に測定対象抗原と混在することが予測さ
   れる交差反応性物質に対する抗体と、試料とを反応さ
   せ、 次に、前記反応後の試料と、不溶性担体に担持されてお
   りかつ測定対象抗原に対応する抗体とを反応させること
   を特徴とする、免疫測定方法。