JPH0989894A - 免疫学的測定法 - Google Patents
免疫学的測定法Info
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- JPH0989894A JPH0989894A JP26647695A JP26647695A JPH0989894A JP H0989894 A JPH0989894 A JP H0989894A JP 26647695 A JP26647695 A JP 26647695A JP 26647695 A JP26647695 A JP 26647695A JP H0989894 A JPH0989894 A JP H0989894A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 免疫学的測定法おいて、高濃度の被測定物質
を正確に測定し、測定物質を希釈することなしで測定す
ること。 【解決手段】 被測定物質および被測定物質と特異的に
結合する物質を免疫反応させる免疫学的測定法におい
て、免疫反応の際の液中の塩化ナトリウム濃度を２０〜
２５０ｇ／Ｌとする。
を正確に測定し、測定物質を希釈することなしで測定す
ること。 【解決手段】 被測定物質および被測定物質と特異的に
結合する物質を免疫反応させる免疫学的測定法におい
て、免疫反応の際の液中の塩化ナトリウム濃度を２０〜
２５０ｇ／Ｌとする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫学的測定法に
関する。さらに詳しくは、被測定物質（Ａ）を正確に測
定し、被測定物質（Ａ）を希釈することなしに測定する
ことができる免疫学的測定法に関する。
関する。さらに詳しくは、被測定物質（Ａ）を正確に測
定し、被測定物質（Ａ）を希釈することなしに測定する
ことができる免疫学的測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来の免疫学的測定法では、被測定物質
および被測定物質と特異的に結合する物質を反応させる
際に、反応液中の塩化ナトリウム濃度を８．５ｇ／Ｌ前
後として、免疫反応させていた［例えば、「生化学実験
法１５」、東京化学同人、ｐ．３５９（１９９３）］。
および被測定物質と特異的に結合する物質を反応させる
際に、反応液中の塩化ナトリウム濃度を８．５ｇ／Ｌ前
後として、免疫反応させていた［例えば、「生化学実験
法１５」、東京化学同人、ｐ．３５９（１９９３）］。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
免疫学的測定法で測定するには、被測定物質（Ａ）の濃
度が高すぎるため正確な測定値が得られないものがあ
り、例えば、「臨床検査、ｖｏｌ．３２、ｎｏ．８、
ｐ．８５７〜８６２」に記載の被測定物質がβ２マイク
ログロブリンの場合には、被測定物質を希釈してから測
定することが必要で、測定操作が繁雑であるなどの問題
点があった。
免疫学的測定法で測定するには、被測定物質（Ａ）の濃
度が高すぎるため正確な測定値が得られないものがあ
り、例えば、「臨床検査、ｖｏｌ．３２、ｎｏ．８、
ｐ．８５７〜８６２」に記載の被測定物質がβ２マイク
ログロブリンの場合には、被測定物質を希釈してから測
定することが必要で、測定操作が繁雑であるなどの問題
点があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題を
解決するため鋭意検討した結果、高濃度の被測定物質で
も正確な測定値が得られ、被測定物質を希釈することな
しで測定することができる免疫学的測定法を見出し、本
発明に到達した。すなわち本発明は、被測定物質（Ａ）
および被測定物質と特異的に結合する物質（Ｂ）を免疫
反応させる免疫学的測定法において、免疫反応の際の液
中の塩化ナトリウム濃度を２０〜２５０ｇ／Ｌとするこ
とを特徴とする免疫学的測定法である。
解決するため鋭意検討した結果、高濃度の被測定物質で
も正確な測定値が得られ、被測定物質を希釈することな
しで測定することができる免疫学的測定法を見出し、本
発明に到達した。すなわち本発明は、被測定物質（Ａ）
および被測定物質と特異的に結合する物質（Ｂ）を免疫
反応させる免疫学的測定法において、免疫反応の際の液
中の塩化ナトリウム濃度を２０〜２５０ｇ／Ｌとするこ
とを特徴とする免疫学的測定法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明の方法では、（Ａ）および
（Ｂ）を免疫反応させる際の反応液中の塩化ナトリウム
濃度を通常２０〜２５０ｇ／Ｌ、好ましくは４０〜２５
０ｇ／Ｌとする。
（Ｂ）を免疫反応させる際の反応液中の塩化ナトリウム
濃度を通常２０〜２５０ｇ／Ｌ、好ましくは４０〜２５
０ｇ／Ｌとする。
【０００６】本発明の方法は、非競合アッセイ法、サン
ドイッチ法などの免疫学的測定法に使用することができ
る。
ドイッチ法などの免疫学的測定法に使用することができ
る。
【０００７】非競合アッセイ法とは、少なくとも二つの
エピトープを有する被測定物質（Ａ）を測定する免疫学
的測定法であり、被測定物質（Ａ）の増加とともに、プ
ロゾーン現象などが生じない限り、散乱光、透過光、放
射能、発光、蛍光などの測定信号値も増加する方法であ
る。
エピトープを有する被測定物質（Ａ）を測定する免疫学
的測定法であり、被測定物質（Ａ）の増加とともに、プ
ロゾーン現象などが生じない限り、散乱光、透過光、放
射能、発光、蛍光などの測定信号値も増加する方法であ
る。
【０００８】サンドイッチ法は、例えば、被測定物質
（Ａ）と、（Ｂ）を不溶化担体に結合させた物質と、
（Ｂ）を標識物に結合させた物質とを反応させて得られ
る複合体における標識物量を測定することにより、被測
定物質（Ａ）を測定する。この複合体の形成反応は一段
反応で行っても二段反応で行ってもよい。二段反応の場
合は、例えば、（Ａ）と（Ｂ）を不溶化担体に結合させ
た物質とを先ず反応させ、次いで（Ｂ）を標識物に結合
させた物質とを反応させて、複合体とする。この二段反
応の場合は一段目の免疫反応における塩化ナトリウム濃
度を２０〜２５０ｇ／Ｌとする。また、二段目の免疫反
応における塩化ナトリウム濃度も同様とした方がより好
ましい。
（Ａ）と、（Ｂ）を不溶化担体に結合させた物質と、
（Ｂ）を標識物に結合させた物質とを反応させて得られ
る複合体における標識物量を測定することにより、被測
定物質（Ａ）を測定する。この複合体の形成反応は一段
反応で行っても二段反応で行ってもよい。二段反応の場
合は、例えば、（Ａ）と（Ｂ）を不溶化担体に結合させ
た物質とを先ず反応させ、次いで（Ｂ）を標識物に結合
させた物質とを反応させて、複合体とする。この二段反
応の場合は一段目の免疫反応における塩化ナトリウム濃
度を２０〜２５０ｇ／Ｌとする。また、二段目の免疫反
応における塩化ナトリウム濃度も同様とした方がより好
ましい。
【０００９】本発明の方法において、使用することがで
きる被測定物質（Ａ）としては、血清タンパク質（ＡＦ
Ｐ，ＣＥＡ，ＣＡ１９−９，ＩｇＥ，β２−マイクログ
ロブリン（以下β２ｍとする），ＴＢＧ，フェリチン，
ＩＡＰ，Ｃ３，Ｃ４，Ｃ５，ＣＲＰ，α２−ＭＧ，Ｉｇ
Ａ，ＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＤ，ＨＰＬ,トラン
スフェリン，糖タンパク，アルブミンなど）、ホルモン
（インシュリン，ＨＣＧ-β，成長ホルモン，ＴＳＨ，
ＬＨ，ＦＳＨ，プロラクチン，ソマトスタチンなど）、
または数々の細菌，ウイルス，原虫（真菌，連鎖球菌，
肝炎ウイルス，ヘルペスウイルス，トキソプラズマ原
虫，マラリア原虫，赤痢アメ−バ−など）などがあげら
れる。これらのうち、好ましくは、特に希釈を必要とす
る血清タンパク質（β２ｍ，ＴＢＧ，ＩＡＰ，Ｃ3，Ｃ
4，Ｃ5，ＣＲＰ，α2−ＭＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，Ｉｇ
Ｇ，ＩｇＥ，ＩｇＤ，ＨＰＬ，トランスフェリン，アル
ブミン）などである。
きる被測定物質（Ａ）としては、血清タンパク質（ＡＦ
Ｐ，ＣＥＡ，ＣＡ１９−９，ＩｇＥ，β２−マイクログ
ロブリン（以下β２ｍとする），ＴＢＧ，フェリチン，
ＩＡＰ，Ｃ３，Ｃ４，Ｃ５，ＣＲＰ，α２−ＭＧ，Ｉｇ
Ａ，ＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＤ，ＨＰＬ,トラン
スフェリン，糖タンパク，アルブミンなど）、ホルモン
（インシュリン，ＨＣＧ-β，成長ホルモン，ＴＳＨ，
ＬＨ，ＦＳＨ，プロラクチン，ソマトスタチンなど）、
または数々の細菌，ウイルス，原虫（真菌，連鎖球菌，
肝炎ウイルス，ヘルペスウイルス，トキソプラズマ原
虫，マラリア原虫，赤痢アメ−バ−など）などがあげら
れる。これらのうち、好ましくは、特に希釈を必要とす
る血清タンパク質（β２ｍ，ＴＢＧ，ＩＡＰ，Ｃ3，Ｃ
4，Ｃ5，ＣＲＰ，α2−ＭＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，Ｉｇ
Ｇ，ＩｇＥ，ＩｇＤ，ＨＰＬ，トランスフェリン，アル
ブミン）などである。
【００１０】被測定物質と特異的に結合する物質（Ｂ）
としては、（Ａ）と特異的に反応する抗体、抗原などを
用いることができる。例えば、（Ａ）がＡＦＰ抗原な
ら、（Ｂ）としては抗ＡＦＰ抗体，（Ａ）が抗ＨＢｓ抗
体なら、（Ｂ）としてはＨＢｓ抗原などである。また、
不溶化担体に結合させる場合の物質（Ｂ）および標識物
に結合させる場合の物質（Ｂ）の両物質は、被測定物質
と特異的に結合する物質でありさえすれば、両物質が全
く同一でなくても使用できる。例えば、モノクローナル
抗体とポリクローナル抗体の組合せや、ウサギ由来の抗
体とヤギ由来の抗体の組合せ等である。
としては、（Ａ）と特異的に反応する抗体、抗原などを
用いることができる。例えば、（Ａ）がＡＦＰ抗原な
ら、（Ｂ）としては抗ＡＦＰ抗体，（Ａ）が抗ＨＢｓ抗
体なら、（Ｂ）としてはＨＢｓ抗原などである。また、
不溶化担体に結合させる場合の物質（Ｂ）および標識物
に結合させる場合の物質（Ｂ）の両物質は、被測定物質
と特異的に結合する物質でありさえすれば、両物質が全
く同一でなくても使用できる。例えば、モノクローナル
抗体とポリクローナル抗体の組合せや、ウサギ由来の抗
体とヤギ由来の抗体の組合せ等である。
【００１１】不溶化担体としては、ケイ酸質無機担体
［ガラス（ポ−ラス、ツヤ消しガラスなど）、シリカゲ
ル、ベンナイトなど］、磁性体（磁性微粒子など）、お
よび有機担体（プラスチック、デキストラン、ロ紙な
ど）などいずれも公知の物質が使用される。また、これ
らの不溶化担体は微粒子にされ懸濁の状態で使用される
場合もある。
［ガラス（ポ−ラス、ツヤ消しガラスなど）、シリカゲ
ル、ベンナイトなど］、磁性体（磁性微粒子など）、お
よび有機担体（プラスチック、デキストラン、ロ紙な
ど）などいずれも公知の物質が使用される。また、これ
らの不溶化担体は微粒子にされ懸濁の状態で使用される
場合もある。
【００１２】（Ｂ）を不溶化担体に結合させる方法とし
ては、（Ｂ）をガラスに化学的に結合させる方法（例え
ば、米国特許第４２８０９９２号明細書及び同第３６５
２７６１号明細書）や、（Ｂ）をプラスチックに物理吸
着させる方法（例えば、イ−・エングバル等；バイオシ
ム・バイオフィズ・アクタ、２５１巻、４２７貢、１９
７１年）等がある。さらに、（Ｂ）にビオチンを結合さ
せ不溶化担体にはストレプトアビジンを結合させること
により（Ｂ）を不溶化担体に結合させる方法や、（Ｂ）
に対する抗体をあらかじめ不溶化担体に結合させておく
ことにより（Ｂ）を不溶化担体に結合させる方法（例え
ば、特願平０４−１７４９１１号明細書）等、間接的に
（Ｂ）を不溶化担体に結合させる方法がある。
ては、（Ｂ）をガラスに化学的に結合させる方法（例え
ば、米国特許第４２８０９９２号明細書及び同第３６５
２７６１号明細書）や、（Ｂ）をプラスチックに物理吸
着させる方法（例えば、イ−・エングバル等；バイオシ
ム・バイオフィズ・アクタ、２５１巻、４２７貢、１９
７１年）等がある。さらに、（Ｂ）にビオチンを結合さ
せ不溶化担体にはストレプトアビジンを結合させること
により（Ｂ）を不溶化担体に結合させる方法や、（Ｂ）
に対する抗体をあらかじめ不溶化担体に結合させておく
ことにより（Ｂ）を不溶化担体に結合させる方法（例え
ば、特願平０４−１７４９１１号明細書）等、間接的に
（Ｂ）を不溶化担体に結合させる方法がある。
【００１３】標識物としては、アイソト−プ［Ｉ１２５
など］、酵素［ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファ
ターゼ、βガラクトシダーゼなど］、蛍光物質［ユーロ
ピウム誘導体など］、発光物質［アクリジウム誘導体な
ど］等いずれも公知の物質が使用される。
など］、酵素［ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファ
ターゼ、βガラクトシダーゼなど］、蛍光物質［ユーロ
ピウム誘導体など］、発光物質［アクリジウム誘導体な
ど］等いずれも公知の物質が使用される。
【００１４】（Ｂ）を標識物に結合させる方法として
は、（Ｂ）を標識物に結合させる方法［例えば、生化学
実験法１５、東京化学同人、ｐ３０８〜３３０（１９９
３）］がある。さらに、（Ｂ）にストレプトアビジンを
結合させ標識物にビオチンを結合させることにより
（Ｂ）を標識物に結合させる方法や、（Ｂ）に対する抗
体をあらかじめ標識物に結合させておくことにより
（Ｂ）を標識物に結合させる方法（例えば、特願昭６３
−２６２４７９号明細書）等、間接的に（Ｂ）を標識物
に結合させる方法がある。
は、（Ｂ）を標識物に結合させる方法［例えば、生化学
実験法１５、東京化学同人、ｐ３０８〜３３０（１９９
３）］がある。さらに、（Ｂ）にストレプトアビジンを
結合させ標識物にビオチンを結合させることにより
（Ｂ）を標識物に結合させる方法や、（Ｂ）に対する抗
体をあらかじめ標識物に結合させておくことにより
（Ｂ）を標識物に結合させる方法（例えば、特願昭６３
−２６２４７９号明細書）等、間接的に（Ｂ）を標識物
に結合させる方法がある。
【００１５】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。
が、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１６】塩化ナトリウム含有の免疫反応用緩衝液の
調製；０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に、牛
血清アルブミンを１０ｇ／Ｌおよび塩化ナトリウムを
８．５ｇ／Ｌの濃度になるように添加し、免疫反応用緩
衝液（ａ）を調製した。さらに、（ａ）の塩化ナトリウ
ム濃度が２０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、１６０
ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌになる免疫反応用緩衝液（ｂ
１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｂ４）、（ｂ５）を調製
した。
調製；０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に、牛
血清アルブミンを１０ｇ／Ｌおよび塩化ナトリウムを
８．５ｇ／Ｌの濃度になるように添加し、免疫反応用緩
衝液（ａ）を調製した。さらに、（ａ）の塩化ナトリウ
ム濃度が２０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、１６０
ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌになる免疫反応用緩衝液（ｂ
１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｂ４）、（ｂ５）を調製
した。
【００１７】比較例１及び実施例１〜５ β２ｍ免疫学
的測定法（サンドイッチ二段法） 第一反応として、（ａ）、（ｂ１）〜（ｂ５）各々の
０．９ｍＬと、標準β２ｍ液またはβ２ｍ含有検体の
０．００５ｍＬと、抗β２ｍ抗体結合ガラスビーズ（以
下Ｇ１とする）１個とを試験管に分注し、試験管中で３
７℃，１５分間免疫反応させ、Ｇ１＋β２ｍ複合体を形
成した。反応後、試験管中の液をアスピレーターで除
き、Ｇ１＋β２ｍ複合体を生食水３ｍＬで３回洗浄し
た。
的測定法（サンドイッチ二段法） 第一反応として、（ａ）、（ｂ１）〜（ｂ５）各々の
０．９ｍＬと、標準β２ｍ液またはβ２ｍ含有検体の
０．００５ｍＬと、抗β２ｍ抗体結合ガラスビーズ（以
下Ｇ１とする）１個とを試験管に分注し、試験管中で３
７℃，１５分間免疫反応させ、Ｇ１＋β２ｍ複合体を形
成した。反応後、試験管中の液をアスピレーターで除
き、Ｇ１＋β２ｍ複合体を生食水３ｍＬで３回洗浄し
た。
【００１８】第二反応として、試験管中のＧ１＋β２ｍ
複合体１個に、ペルオキシダーゼ標識抗β２ｍ抗体（以
下Ｐ１とする）を０．２ｍｇ／Ｌおよび牛血清アルブミ
ンを１０ｇ／Ｌおよび塩化ナトリウムを８．５ｇ／Ｌ含
有する０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を０．
３ｍＬ添加し、試験管中で３７℃，１５分間免疫反応さ
せ、Ｇ１＋β２ｍ＋Ｐ１複合体を形成した。反応後、試
験管中の液をアスピレーターで除き、Ｇ１＋β２ｍ＋Ｐ
１複合体を生食水３ｍＬで３回洗浄した。
複合体１個に、ペルオキシダーゼ標識抗β２ｍ抗体（以
下Ｐ１とする）を０．２ｍｇ／Ｌおよび牛血清アルブミ
ンを１０ｇ／Ｌおよび塩化ナトリウムを８．５ｇ／Ｌ含
有する０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を０．
３ｍＬ添加し、試験管中で３７℃，１５分間免疫反応さ
せ、Ｇ１＋β２ｍ＋Ｐ１複合体を形成した。反応後、試
験管中の液をアスピレーターで除き、Ｇ１＋β２ｍ＋Ｐ
１複合体を生食水３ｍＬで３回洗浄した。
【００１９】第三反応として、試験管中のＧ１＋β２ｍ
＋Ｐ１複合体１個に、過酸化水素を０．２ｇ／Ｌおよび
オルト−フェニレンジアミン３ｇ／Ｌを含有するクエン
酸−リン酸緩衝液０．３ｍＬを加え３７℃，１５分間発
色反応させ、反応後、１．５規定の硫酸３ｍｌを加えて
酵素反応を停止させ溶液の吸収を分光光度計を用い４９
２ｎｍで測光した。
＋Ｐ１複合体１個に、過酸化水素を０．２ｇ／Ｌおよび
オルト−フェニレンジアミン３ｇ／Ｌを含有するクエン
酸−リン酸緩衝液０．３ｍＬを加え３７℃，１５分間発
色反応させ、反応後、１．５規定の硫酸３ｍｌを加えて
酵素反応を停止させ溶液の吸収を分光光度計を用い４９
２ｎｍで測光した。
【００２０】最後に、各標準β２ｍ液の濃度値と測光値
をグラフ用紙にプロットし検量線を作製しその検量線か
ら、β２ｍ含有検体の測光値に対する濃度値を算出し
た。この濃度値をβ２ｍ測定値とした。
をグラフ用紙にプロットし検量線を作製しその検量線か
ら、β２ｍ含有検体の測光値に対する濃度値を算出し
た。この濃度値をβ２ｍ測定値とした。
【００２１】比較例２および実施例６〜１０ β２ｍ免
疫学的測定法（サンドイッチ一段法） 第一反応として、（ａ）、（ｂ１）〜（ｂ５）各々の
０．９ｍＬと、標準β２ｍ液またはβ２ｍ含有検体の
０．００５ｍＬと、Ｇ１の１個と、Ｐ１の０．１μｇと
を試験管に分注し、試験管中で３７℃，１５分間免疫反
応させ、Ｇ１＋β２ｍ＋Ｐ１複合体を形成した。反応
後、試験管中の液をアスピレーターで除き、Ｇ１＋β２
ｍ＋Ｐ１複合体を生食水３ｍＬで３回洗浄した。
疫学的測定法（サンドイッチ一段法） 第一反応として、（ａ）、（ｂ１）〜（ｂ５）各々の
０．９ｍＬと、標準β２ｍ液またはβ２ｍ含有検体の
０．００５ｍＬと、Ｇ１の１個と、Ｐ１の０．１μｇと
を試験管に分注し、試験管中で３７℃，１５分間免疫反
応させ、Ｇ１＋β２ｍ＋Ｐ１複合体を形成した。反応
後、試験管中の液をアスピレーターで除き、Ｇ１＋β２
ｍ＋Ｐ１複合体を生食水３ｍＬで３回洗浄した。
【００２２】第二反応として、試験管中のＧ１＋β２ｍ
＋Ｐ１複合体１個に、過酸化水素を０．２ｇ／Ｌおよび
オルト−フェニレンジアミン３ｇ／Ｌを含有するクエン
酸−リン酸緩衝液０．３ｍＬを加え３７℃，１５分間発
色反応させ、反応後、１．５規定の硫酸３ｍｌを加えて
酵素反応を停止させ溶液の吸収を分光光度計を用い４９
２ｎｍで測光した。
＋Ｐ１複合体１個に、過酸化水素を０．２ｇ／Ｌおよび
オルト−フェニレンジアミン３ｇ／Ｌを含有するクエン
酸−リン酸緩衝液０．３ｍＬを加え３７℃，１５分間発
色反応させ、反応後、１．５規定の硫酸３ｍｌを加えて
酵素反応を停止させ溶液の吸収を分光光度計を用い４９
２ｎｍで測光した。
【００２３】最後に、各標準β２ｍ液の濃度値と測光値
をグラフ用紙にプロットし検量線を作製しその検量線か
ら、β２ｍ含有検体の測光値に対する濃度値を算出し
た。この濃度値をβ２ｍ測定値とした。
をグラフ用紙にプロットし検量線を作製しその検量線か
ら、β２ｍ含有検体の測光値に対する濃度値を算出し
た。この濃度値をβ２ｍ測定値とした。
【００２４】比較例３、実施例１１〜１５ ＴＢＧ免疫
学的測定法（サンドイッチ二段法） 第一反応として、（ａ）、（ｂ１）〜（ｂ５）各々の
０．９ｍＬと、標準ＴＢＧ液またはＴＢＧ含有検体の
０．００５ｍＬと、抗ＴＢＧ抗体結合ガラスビーズ（以
下Ｇ２とする）１個とを試験管に分注し、試験管中で３
７℃，１５分間免疫反応させ、Ｇ２＋ＴＢＧ複合体を形
成した。反応後、試験管中の液をアスピレーターで除
き、Ｇ２＋ＴＢＧ複合体を生食水３ｍＬで３回洗浄し
た。
学的測定法（サンドイッチ二段法） 第一反応として、（ａ）、（ｂ１）〜（ｂ５）各々の
０．９ｍＬと、標準ＴＢＧ液またはＴＢＧ含有検体の
０．００５ｍＬと、抗ＴＢＧ抗体結合ガラスビーズ（以
下Ｇ２とする）１個とを試験管に分注し、試験管中で３
７℃，１５分間免疫反応させ、Ｇ２＋ＴＢＧ複合体を形
成した。反応後、試験管中の液をアスピレーターで除
き、Ｇ２＋ＴＢＧ複合体を生食水３ｍＬで３回洗浄し
た。
【００２５】第二反応として、試験管中のＧ２＋ＴＢＧ
複合体１個に、ペルオキシダーゼ標識抗ＴＢＧ抗体（以
下Ｐ２とする）を０．４ｍｇ／Ｌおよび牛血清アルブミ
ンを１０ｇ／Ｌおよび塩化ナトリウムを８．５ｇ／Ｌ含
有する０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を０．
３ｍＬ添加し、試験管中で３７℃，１５分間免疫反応さ
せ、Ｇ２＋ＴＢＧ＋Ｐ２複合体を形成した。反応後、試
験管中の液をアスピレーターで除き、Ｇ２＋ＴＢＧ＋Ｐ
２複合体を生食水３ｍＬで３回洗浄した。
複合体１個に、ペルオキシダーゼ標識抗ＴＢＧ抗体（以
下Ｐ２とする）を０．４ｍｇ／Ｌおよび牛血清アルブミ
ンを１０ｇ／Ｌおよび塩化ナトリウムを８．５ｇ／Ｌ含
有する０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を０．
３ｍＬ添加し、試験管中で３７℃，１５分間免疫反応さ
せ、Ｇ２＋ＴＢＧ＋Ｐ２複合体を形成した。反応後、試
験管中の液をアスピレーターで除き、Ｇ２＋ＴＢＧ＋Ｐ
２複合体を生食水３ｍＬで３回洗浄した。
【００２６】第三反応として、試験管中のＧ２＋ＴＢＧ
＋Ｐ２複合体１個に、過酸化水素を０．２ｇ／Ｌおよび
オルト−フェニレンジアミン３ｇ／Ｌを含有するクエン
酸−リン酸緩衝液０．３ｍＬを加え３７℃，１５分間発
色反応させ、反応後、１．５規定の硫酸３ｍｌを加えて
酵素反応を停止させ溶液の吸収を分光光度計を用い４９
２ｎｍで測光した。
＋Ｐ２複合体１個に、過酸化水素を０．２ｇ／Ｌおよび
オルト−フェニレンジアミン３ｇ／Ｌを含有するクエン
酸−リン酸緩衝液０．３ｍＬを加え３７℃，１５分間発
色反応させ、反応後、１．５規定の硫酸３ｍｌを加えて
酵素反応を停止させ溶液の吸収を分光光度計を用い４９
２ｎｍで測光した。
【００２７】最後に、各標準ＴＢＧ液の濃度値と測光値
をグラフ用紙にプロットし検量線を作製しその検量線か
ら、ＴＢＧ含有検体の測光値に対する濃度値を算出し
た。この濃度値をＴＢＧ測定値とした。
をグラフ用紙にプロットし検量線を作製しその検量線か
ら、ＴＢＧ含有検体の測光値に対する濃度値を算出し
た。この濃度値をＴＢＧ測定値とした。
【００２８】比較例４及び実施例１６〜２０ ＴＢＧ免
疫学的測定法（サンドイッチ一段法） 第一反応として、（ａ）、（ｂ１）〜（ｂ５）各々の
０．９ｍＬと、標準ＴＢＧ液またはＴＢＧ含有検体の
０．００５ｍＬと、Ｇ２の１個と、Ｐ２の０．３μｇと
を試験管に分注し、試験管中で３７℃，１５分間免疫反
応させ、Ｇ２＋ＴＢＧ＋Ｐ２複合体を形成した。反応
後、試験管中の液をアスピレーターで除き、Ｇ２＋ＴＢ
Ｇ＋Ｐ２複合体を生食水３ｍＬで３回洗浄した。
疫学的測定法（サンドイッチ一段法） 第一反応として、（ａ）、（ｂ１）〜（ｂ５）各々の
０．９ｍＬと、標準ＴＢＧ液またはＴＢＧ含有検体の
０．００５ｍＬと、Ｇ２の１個と、Ｐ２の０．３μｇと
を試験管に分注し、試験管中で３７℃，１５分間免疫反
応させ、Ｇ２＋ＴＢＧ＋Ｐ２複合体を形成した。反応
後、試験管中の液をアスピレーターで除き、Ｇ２＋ＴＢ
Ｇ＋Ｐ２複合体を生食水３ｍＬで３回洗浄した。
【００２９】第二反応として、試験管中のＧ２＋ＴＢＧ
＋Ｐ２複合体１個に、過酸化水素を０．２ｇ／Ｌおよび
オルト−フェニレンジアミン３ｇ／Ｌを含有するクエン
酸−リン酸緩衝液０．３ｍＬを加え３７℃，１５分間発
色反応させ、反応後、１．５規定の硫酸３ｍｌを加えて
酵素反応を停止させ溶液の吸収を分光光度計を用い４９
２ｎｍで測光した。
＋Ｐ２複合体１個に、過酸化水素を０．２ｇ／Ｌおよび
オルト−フェニレンジアミン３ｇ／Ｌを含有するクエン
酸−リン酸緩衝液０．３ｍＬを加え３７℃，１５分間発
色反応させ、反応後、１．５規定の硫酸３ｍｌを加えて
酵素反応を停止させ溶液の吸収を分光光度計を用い４９
２ｎｍで測光した。
【００３０】最後に、各標準ＴＢＧ液の濃度値と測光値
をグラフ用紙にプロットし検量線を作製しその検量線か
ら、ＴＢＧ含有検体の測光値に対する濃度値を算出し
た。この濃度値をＴＢＧ測定値とした。
をグラフ用紙にプロットし検量線を作製しその検量線か
ら、ＴＢＧ含有検体の測光値に対する濃度値を算出し
た。この濃度値をＴＢＧ測定値とした。
【００３１】比較例１〜４及び実施例１〜２０の評価 高濃度の被測定物質を正確に測定することができる免
疫学的測定法であることを確かめるため、比較例１，２
および実施例１〜１０のβ２ｍ免疫学的測定法で、低
（０．２ｍｇ／Ｌ）、中（２．０ｍｇ／Ｌ）、高濃度
（２０ｍｇ／Ｌ）のβ２ｍ含有検体をそれぞれｎ＝３０
で測定し、同時再現性［測定値の標準偏差値／平均値×
１００（％）］を求めた。その結果を表１に示す。
疫学的測定法であることを確かめるため、比較例１，２
および実施例１〜１０のβ２ｍ免疫学的測定法で、低
（０．２ｍｇ／Ｌ）、中（２．０ｍｇ／Ｌ）、高濃度
（２０ｍｇ／Ｌ）のβ２ｍ含有検体をそれぞれｎ＝３０
で測定し、同時再現性［測定値の標準偏差値／平均値×
１００（％）］を求めた。その結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】さらに、比較例３，４および実施例１１
〜２０のＴＢＧ免疫学的測定法で、低（０．５ｍｇ／
Ｌ）、中（５．０ｍｇ／Ｌ）、高濃度（５０ｍｇ／Ｌ）
のＴＢＧ含有検体をそれぞれｎ＝３０で測定し、同時再
現性［測定値の標準偏差値／平均値×１００（％）］を
求めた。その結果を表２に示す。
〜２０のＴＢＧ免疫学的測定法で、低（０．５ｍｇ／
Ｌ）、中（５．０ｍｇ／Ｌ）、高濃度（５０ｍｇ／Ｌ）
のＴＢＧ含有検体をそれぞれｎ＝３０で測定し、同時再
現性［測定値の標準偏差値／平均値×１００（％）］を
求めた。その結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
【発明の効果】従来は、高濃度の被測定物質の測定値が
正確に得られなかったが、本発明によって、高濃度の被
測定物質の測定値が正確に得られるようになる。例え
ば、本比較例での高濃度の被測定物質の同時再現性は全
て３５％以上であるが、本実施例での高濃度の被測定物
質の同時再現性は全て２０％以下となり測定値が正確に
得られるようになっている。
正確に得られなかったが、本発明によって、高濃度の被
測定物質の測定値が正確に得られるようになる。例え
ば、本比較例での高濃度の被測定物質の同時再現性は全
て３５％以上であるが、本実施例での高濃度の被測定物
質の同時再現性は全て２０％以下となり測定値が正確に
得られるようになっている。
【００３６】さらに、従来は高濃度の被測定物質の測定
値が正確に得られなかったため、高濃度の被測定物質を
希釈して測定する必要性があったが、本発明によって、
高濃度の被測定物質の測定値が正確に得られるため、高
濃度の被測定物質を希釈せずとも測定できるようにな
り、免疫学的測定法の測定操作上の簡便性が飛躍的に向
上する。
値が正確に得られなかったため、高濃度の被測定物質を
希釈して測定する必要性があったが、本発明によって、
高濃度の被測定物質の測定値が正確に得られるため、高
濃度の被測定物質を希釈せずとも測定できるようにな
り、免疫学的測定法の測定操作上の簡便性が飛躍的に向
上する。
Claims (3)
- 【請求項１】 被測定物質（Ａ）および被測定物質と特
異的に結合する物質（Ｂ）を免疫反応させる免疫学的測
定法において、免疫反応の際の液中の塩化ナトリウム濃
度を２０〜２５０ｇ／Ｌとすることを特徴とする免疫学
的測定法。 - 【請求項２】 非競合アッセイ法である請求項１記載の
免疫学的測定法。 - 【請求項３】 該測定法がサンドイッチ法であり、免疫
反応が一段又は二段反応で行われ、少なくとも一段目の
免疫反応の際の液中の塩化ナトリウム濃度を２０〜２５
０ｇ／Ｌとする請求項１記載の免疫学的測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26647695A JPH0989894A (ja) | 1995-09-19 | 1995-09-19 | 免疫学的測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26647695A JPH0989894A (ja) | 1995-09-19 | 1995-09-19 | 免疫学的測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0989894A true JPH0989894A (ja) | 1997-04-04 |
Family
ID=17431465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26647695A Pending JPH0989894A (ja) | 1995-09-19 | 1995-09-19 | 免疫学的測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0989894A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7202041B2 (en) | 2002-12-10 | 2007-04-10 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Immunoreaction measurement method |
| CN109575133A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-04-05 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 抗人β2-MG抗体及其应用 |
| CN109666072A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-04-23 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 抗人β2-微球蛋白抗体及其应用 |
-
1995
- 1995-09-19 JP JP26647695A patent/JPH0989894A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7202041B2 (en) | 2002-12-10 | 2007-04-10 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Immunoreaction measurement method |
| CN109575133A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-04-05 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 抗人β2-MG抗体及其应用 |
| CN109666072A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-04-23 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 抗人β2-微球蛋白抗体及其应用 |
| CN109666072B (zh) * | 2018-12-28 | 2022-04-05 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 抗人β2-微球蛋白抗体及其应用 |
| CN109575133B (zh) * | 2018-12-28 | 2022-04-05 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 抗人β2-MG抗体及其应用 |
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