JP5177677B2 - 抗原およびその抗原に対する抗体を測定する方法、並びにそれに用いる測定用試薬 - Google Patents
抗原およびその抗原に対する抗体を測定する方法、並びにそれに用いる測定用試薬 Download PDFInfo
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Description
久保信彦ら、日本臨床、第57巻、1999年増刊号、10−12頁 右田孝子ら、日本輸血学会雑誌、第50巻、第3号、419−424頁(2004)
(1)試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
(i)測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、該抗原および該抗体のいずれか一方が微細粒子に担持されており、
(ii)試料と、その測定用試薬とを混合し、
(iii)抗原抗体反応による凝集の上昇または下降の度合いから、試料中の抗原または抗体を測定する
ことを含む上記方法。
(2)試料として、抗原を含みその抗原に対する抗体を含まない試料、抗原を含まずその抗原に対する抗体を含む試料、または抗原とその抗原に対する抗体のいずれをも含まない試料を測定対象とする上記(1)の方法。
(3)試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
(i)測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、試薬中の抗原が微細粒子に担持されており、
(ii)試料と、その測定用試薬とを混合し、
(iii)試料中に抗原が含まれる場合には、測定用試薬としての抗体と、試料中の抗原および測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原との間で、抗原抗体反応を競合させて、抗原抗体反応による凝集の下降の度合いから、試料中の抗原を測定し、
(iv)試料中に抗体が含まれる場合には、測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原と、試料中の抗体および測定試薬としての抗体とを抗原抗体反応させて抗原抗体反応による凝集の上昇の度合いから、試料中の抗体を測定する、
上記(1)または(2)記載の測定方法。
(4)試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
(i)測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、試薬中の抗体が微細粒子に担持されており、
(ii)試料と、その測定用試薬とを混合し、
(iii)試料中に抗原が含まれる場合には、測定用試薬としての微細粒子が担持された抗体と、試料中の抗原および測定用試薬としての抗原とを、抗原抗体反応させて、抗原抗体反応による凝集の上昇の度合いから、試料中の抗原を測定し、
(iv)試料中に抗体が含まれる場合には、測定試薬の抗原と、試料中の抗体および測定用試薬として微細粒子に担持された抗体との間で、抗原抗体反応を競合させて、抗原抗体反応による凝集の下降の度合いから、試料中の抗体を測定する、
上記(1)または(2)記載の上記方法。
(5)抗原が、通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原である、上記(1)から(4)のいずれかの方法。
(6)試料中の抗原がIgAで、試料中の抗体が抗IgA抗体である請求項1から5のいずれかの方法。
(7)測定用試薬として抗体と微細粒子に担持された抗原とを用いて、プロゾーン現象を回避して、試料を希釈することなく実施する上記(1)から(3)および(5)から(6)のいずれかの方法。
(8)試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも測定するための測定用試薬であって、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原を含み、かつ、該抗原および該抗体のいずれか一方が微細粒子に担持されている、測定用試薬。
(9)試料として、抗原を含みその抗原に対する抗体を含まない試料、抗原を含まずその抗原に対する抗体を含む試料、または抗原とその抗原に対する抗体のいずれをも含まない試料を測定対象とする上記(8)の測定用試薬。
(10)抗原が、通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原である、上記(8)または(9)の測定用試薬。
(11)試料中の抗原がIgAで、試料中の抗体が抗IgA抗体である上記(8)から(10)のいずれかの測定用試薬。
また、IgAなどの通常の生体試料中では高濃度で存在する抗原を測定する場合には、測定用試薬として、その抗原に対する抗体と、微細粒子に担持させた抗原とを用いることにより、プロゾーン現象を回避して、試料を希釈することなく、試料中の抗原を測定することができる。
従って、本発明の測定方法および測定用試薬は、輸血の際のショック反応をなくすために、輸血をする側および受ける側の両方の血液に対し、抗IgA抗体が含まれているかどうかを検査するために用いることができる。また、慢性炎症、慢性肝炎、肝硬変、IgA腎症、リウマチなどの膠原病、IgA型骨髄腫などをIgAレベルに基き診断する臨床検査の分野でも用いることができる。
本発明の測定方法および測定用試薬に好適な試料中の抗原としては、「通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原」である。そのような抗原として、免疫グロブリンA(IgA)、ハプトグロブリン、α2−マクログロブリン、補体C9、補体C4等を例示できる。
本発明の測定方法および測定用試薬に好適な試料中の抗体は、上記した試料中の抗原に対する抗体であり、例えば、それぞれ、抗IgA抗体、抗ハプトグロブリン抗体、抗α2−マクログロブリン抗体、抗補体C9抗体、抗補体C4抗体等を例示できる。
本発明の測定方法および測定用試薬に用いる試薬中の抗原としては、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原であれば特に限定しない。試薬の抗体として抗IgA抗体、抗ハプトグロブリン抗体、抗α2−マクログロブリン抗体、抗補体C9抗体、抗補体C4抗体を用いるときは、測定用試薬の抗原として、それぞれIgA、ハプトグロブリン、α2−マクログロブリン、補体C9、補体C4を例示できる。また、試薬中の抗原は、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原であれば、その由来、製造法などはいずれでもよく、例えば、ヒトの試料中のIgAまたは抗IgA抗体を測定する場合には、ヤギ由来IgA、ウサギ由来IgA、ラット由来IgA等を例示でき、また、組換えIgAなどが挙げられる。また、試薬中の抗原は、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原であれば、これらの抗原の断片であってもよい。
本発明の測定方法および測定用試薬に用いる微細粒子は、免疫凝集反応に通常使用される微細粒子をそのまま使用することができる。最も一般的な微細粒子は、ラテックス粒子である。微細粒子は、通常0.01〜0.5ミクロンのものが使用される。本発明において、抗原または抗体を微細粒子に担持させるには、担持の方法は、疎水性相互作用による物理的吸着法や共有結合法等の通常の担持する方法を用いることができる。
まず、反応物として混合する対象は、試料中に抗原が存在する場合には、(i−1)試料由来の抗原、試料中に抗体が存在する場合には、(i−2)試料由来の抗体、(ii)測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原、および(iii)測定用試薬としての抗体であり、これら(i)から(iii)の反応物は、すべて水に可溶あるいは均一分散可能である。
まず、反応物として混合する対象は、試料中に抗原が存在する場合には、(i−1)試料由来の抗原、試料中に抗体が存在する場合には、(i−2)試料由来の抗体、(ii)測定用試薬としての抗原、および(iii)測定用試薬としての微細粒子に担持された抗体であり、これら(i)から(iii)の反応物は、すべて水に可溶あるいは均一分散可能である。
測定用試薬として、抗体および微細粒子に担持された抗原を用いた場合には、まず、測定用試薬として、抗体(例えば、抗IgA抗体)を緩衝液(例えば、リン酸緩衝液)に均一分散した液(第一試薬)および測定すべき抗原(例えば、IgA)と同じ抗原(例えば、IgA)を担持した微細粒子(例えば、ラテックス粒子)を緩衝液(例えば、リン酸緩衝液)に均一分散した液(第二試薬)を調製する。次いで、自動分析装置(例えば、日立7180型自動分析装置)を用いて、測定すべき抗原または抗体を含む試料に、第一試薬、次いで第二試薬を加えて抗原抗体反応をさせ、生じる凝集割合を特定波長(例えば、340nmから800nm)にて2ポイントエンド法により吸光度変化量として測定し、得られた測定値から、あらかじめ抗原または抗体濃度が既知の標準試料を用いて作成した検量線に基づいて、目的とする試料中の抗原または抗体を定量することができる。
試料を1.5〜35μl、好ましくは5〜25μlを用いたとき、第一試薬に含まれる抗IgA抗体濃度は、最終濃度(試料と第一試薬と第二試薬とを混合したときの濃度)として0.5〜50μg/ml(ベッカータイターとして)、好ましくは1.5〜15μg/mlに、第二試薬に含まれるIgA感作ラテックス濃度は、0.005〜0.5%、好ましくは0.015〜0.15%に、ラテックスに感作したIgA濃度(IgA重量換算)は、0.005〜0.5mg/ml、好ましくは0.015〜0.15mg/mlになるように設定すると良い。なお、このとき、第一試薬と第二試薬の量は、おのおの30〜250μl、好ましくは50〜150μlの範囲で、かつ、サンプルと第一試薬と第二試薬とを併せた量は120〜300μl、好ましくは150〜250μlになるように設定すると良い。
試料を1.5〜35μl、好ましくは5〜25μlを用いたとき、第一試薬に含まれる抗体濃度は、最終濃度(試料と第一試薬と第二試薬とを混合したときの濃度)として0.5〜50μg/ml(ベッカータイターとして)、好ましくは1.5〜15μg/mlに、第二試薬に含まれる抗体感作ラテックス濃度は、0.005〜0.5%、好ましくは0.015〜0.15%に、ラテックスに感作した抗体濃度は、0.05〜10mg/ml、好ましくは0.5〜5mg/mlになるように設定すると良い。なお、このとき、第一試薬と第二試薬の量は、おのおの30〜250μl、好ましくは50〜150μlの範囲で、かつ、サンプルと第一試薬と第二試薬とを併せた量は120〜300μl、好ましくは150〜250μlになるように設定すると良い。
実施例1
ヒト免疫グロブリンA(IgA)の測定
実施例1〜3は測定用試薬として、抗体と微細粒子に担持された抗原とを用い、抗原(IgA)と抗体(抗IgA抗体)のいずれをも測定する方法を示した例である。
1)IgA感作ラテックス粒子(微細粒子に担持された抗原)の調製
ラテックス粒子へのIgAの吸着は以下のように行った。
1%濃度とした粒径98nm のポリスチレン製ラテックス粒子溶液4 mLに、ヒト血清IgAをりん酸緩衝液に0.5mg/mLとなるように溶解した溶液4 mLを混合し、室温にて1 時間攪拌した。そして、20,000 rpmで45分間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にコート緩衝液4 mLを加え、沈殿物を懸濁し超音波処理を行い、ラテックス粒子を完全に分散させた。このラテックス濃度1 %のヒトIgA感作ラテックス粒子懸濁液は、冷蔵にて保存した。
IgAを吸着させたラテックス粒子および抗ヒトIgA抗体を用いて、以下のように第一試薬および第二試薬を調製した。
第一試薬は、ヤギ抗ヒトIgA抗血清(ベッカータイター8.8mg/mL)を0.2%含む希釈緩衝液を用いた。
第二試薬は、1)記載のラテックス濃度1 %のヒトIgA感作ラテックス粒子懸濁液を希釈緩衝液により10倍に希釈して用いた。
各試薬の組成は以下の通りである。
りん酸二水素ナトリウム二水和物 20 mM pH 7.50
EDTA・2Na 1 mM
コート緩衝液組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 20 mM pH 7.50
EDTA・2Na 1 mM
ウシ血清アルブミン(BSA) 1 %
ブロッキング試薬 5 %
希釈緩衝液組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 20 mM pH 7.50
EDTA・2Na 1 mM
BSA 1 %
ブロッキング試薬 5 %
第一試薬
りん酸二水素ナトリウム二水和物 20 mM pH 7.50
EDTA・2Na 1 mM
BSA 1 %
ブロッキング試薬 5 %
ヤギ抗ヒトIgA抗血清 0.2 %(v/v)
第二試薬組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 20 mM pH 7.50
EDTA・2Na 1 mM
BSA 1 %
ブロッキング試薬 5 %
ヒトIgA感作ラテックス粒子 0.1 %(v/v)
標準試料は、IgA濃度既知の血清を希釈緩衝液で希釈して使用した。IgA濃度は、蛋白標準血清CRM470から伝達されたものである。
測定は日立7170S型自動分析装置を用い、試料として血清15 μLに対し第一試薬100 μL、第二試薬100 μLを反応させ、主波長505 nm、副波長800 nmにて19〜26測光ポイント間(R2添加直後から2.5分後に相当)において、2ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した。
4)測定結果
上記に示した試薬を用いて、標準試料を測定した際の吸光度変化量を表1に、またそれをグラフ化したもの(検量線)を図1に示した。
本発明の測定方法とTIA法との相関
1)IgA測定試薬の調製および測定条件
実施例1と同様の試薬および測定条件を用いた。
2)自動分析装置の検量
実施例1記載の標準試料を用い日立7170S型自動分析装置の多点検量線作成機能により行った。
3)血清試料の測定
試料は、血清を希釈緩衝液で適宜希釈したものを使用した。市販TIA法の「N−アッセイ TIA IgA−SH」(日東紡績)を対照試薬として相関性の確認を行った。TIA法は同様に日立7170S型自動分析装置を使用し、指定パラメーターにしたがって行った。
4)測定結果
本発明の測定方法とTIA法との相関性の結果を図2に示した。図2に示すように、TIA法をX、本発明法をYとして、相関性を確認したところ、Y=1.02X+0.7、相関係数 0.998(N=30)と良好な結果が得られた。これにより、本発明法は血清IgA濃度を正確に測定し得ることが示される。
IgAおよび抗IgA抗体の測定
1)測定試薬の調製および測定条件
実施例1と同様の試薬および測定条件を用いた。
2)測定試料
試料は、IgAまたは抗IgA抗体を含む検体を希釈緩衝液で適宜連続希釈して使用した。
3)自動分析装置の検量
実施例1記載の標準試料のうち、0および1mg/dLを用い日立7170S型自動分析装置の2点検量線作成機能により行った。
3)測定結果
試料中のIgAおよび抗IgA抗体の測定結果を表2および図3に示した。
ヒトCRPと抗ヒトCRP抗体の測定
測定用試薬として、抗原と微細粒子に担持された抗体とを用い、抗原と抗体のいずれをも測定できることを確認した。
具体的には、測定用試薬として、抗ヒトCRP抗体感作ラテックス(微細粒子に担持された抗体)とヒトCRP(抗原)を用い、検体中のヒトCRP(抗原)または抗ヒトCRP抗体(抗体)の濃度を測定した。なお、検体が抗ヒトCRP抗体を含む場合は、モデルサンプルとしてヤギ由来抗ヒトCRP抗体を含む検体を使用した。
1)抗ヒトCRP抗体感作ラテックス粒子の調製
ラテックス粒子への抗ヒトCRP抗体の吸着は以下のように行った。
1%濃度とした粒径120 nmのポリスチレン製ラテックス粒子溶液100mLに、抗ヒトCRP抗体をTris緩衝液に3.0mg/mLとなるように溶解した溶液100mLを混合し、室温にて1時間撹拌した。そして、20,000rpmで45分間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にコート緩衝液100mLを加え、沈殿物を懸濁し超音波処理を行い、ラテックス粒子を完全に分散させた後、室温にて1時間撹拌した。次いで遠心分離を行い得られた沈殿物にTris緩衝液100mL加えて懸濁し、超音波処理を行い完全に分散させ1%濃度抗ヒトCRP抗体感作ラテックス粒子懸濁液を得た。
抗ヒトCRP抗体感作ラテックス粒子及びヒトCRPを用いて、以下のように第一試薬及び第二試薬を調製した。
第一試薬は、ヒトCRPを0.10 mg/dL含むTris緩衝液を用いた。
第二試薬は、上記1)記載の1%濃度抗ヒトCRP抗体感作ラテックス粒子懸濁液をTris緩衝液により5倍に希釈して用いた。
各試薬の組成は以下の通りである。
Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン)
50mM pH7.5
塩化ナトリウム 150mM
コート緩衝液組成
Tris 50mM pH7.5
塩化ナトリウム 150mM
BSA(ウシ血清アルブミン) 1.0%
第一試薬
Tris緩衝液
ヒトCRP 0.10 mg/dL
第二試薬
Tris緩衝液
抗ヒトCRP抗体感作ラテックス粒子 0.2%(v/v)
測定は日立7180型自動分析装置を用い、試料2.4 μLに対し第一試薬120 μL、第二試薬120 μLを反応させ、主波長570 nm、副波長800 nmにて18〜28測光ポイント間(R2添加直後から2.9分後に相当)において、2ポイントエンド法により吸光度変化量を測定した。
試料は、ヒトCRP及び抗ヒトCRP抗体を含む検体を生理食塩水で適宜希釈して使用した。
4)測定結果
上記に示した試薬を用いて、試料中のヒトCRP及び抗ヒトCRP抗体の測定結果を表3及び図4に示した。
Claims (11)
- 試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
(i)測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、該抗原および該抗体のいずれか一方が微細粒子に担持されており、
(ii)試料と、その測定用試薬とを混合し、
(iii)抗原抗体反応による凝集の上昇または下降の度合いから、試料中の抗原または抗体を測定する
ことを含む上記方法。 - 試料として、抗原を含みその抗原に対する抗体を含まない試料、抗原を含まずその抗原に対する抗体を含む試料、または抗原とその抗原に対する抗体のいずれをも含まない試料を測定対象とする請求項1の方法。
- 試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
(i)測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、試薬中の抗原が微細粒子に担持されており、
(ii)試料と、その測定用試薬とを混合し、
(iii)試料中に抗原が含まれる場合には、測定用試薬としての抗体と、試料中の抗原および測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原との間で、抗原抗体反応を競合させて、抗原抗体反応による凝集の下降の度合いから、試料中の抗原を測定し、
(iv)試料中に抗体が含まれる場合には、測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原と、試料中の抗体および測定試薬としての抗体とを抗原抗体反応させて抗原抗体反応による凝集の上昇の度合いから、試料中の抗体を測定する、
請求項1または2記載の測定方法。 - 試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
(i)測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、試薬中の抗体が微細粒子に担持されており、
(ii)試料と、その測定用試薬とを混合し、
(iii)試料中に抗原が含まれる場合には、測定用試薬としての微細粒子が担持された抗体と、試料中の抗原および測定用試薬としての抗原とを、抗原抗体反応させて、抗原抗体反応による凝集の上昇の度合いから、試料中の抗原を測定し、
(iv)試料中に抗体が含まれる場合には、測定試薬の抗原と、試料中の抗体および測定用試薬として微細粒子に担持された抗体との間で、抗原抗体反応を競合させて、抗原抗体反応による凝集の下降の度合いから、試料中の抗体を測定する、
請求項1または2記載の上記方法。 - 抗原が、通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原である、請求項1から4のいずれかの方法。
- 試料中の抗原がIgAで、試料中の抗体が抗IgA抗体である請求項1から5のいずれかの方法。
- 測定用試薬として抗体と微細粒子に担持された抗原とを用いて、プロゾーン現象を回避して、試料を希釈することなく実施する請求項1から3および5から6のいずれかの方法。
- 試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも測定するための測定用試薬であって、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原を含み、かつ、該抗原および該抗体のいずれか一方が微細粒子に担持されている、測定用試薬。
- 試料として、抗原を含みその抗原に対する抗体を含まない試料、抗原を含まずその抗原に対する抗体を含む試料、または抗原とその抗原に対する抗体のいずれをも含まない試料を測定対象とする請求項8の測定用試薬。
- 抗原が、通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原である、請求項8または9の測定用試薬。
- 試料中抗原がIgAで、試料中抗体が抗IgA抗体である請求項8から10のいずれかの測定用試薬。
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