KR101433974B1 - 응집 저해 측정법 및 응집 저해 측정용 시약 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시료 중의 리간드를 저농도 영역부터 고농도 영역까지 고감도이면서 광범위하게 측정할 수 있는 동시에, 양호한 측정 재현 성능을 갖는 응집 저해 측정법 및 응집 저해 측정용 시약의 제공을 과제로 한다. 리간드를 담지한 불용성 담체 입자와 유리상의 특이적 수용체에 더하여, 리간드 상의 결합 부위가 상기 유리상 수용체와는 다른 특이적 수용체를 담지시킨 불용성 담체 입자를 이용하는 응집 저해 측정법 및 응집 저해 측정용 시약을 제공한다.
응집 저해 측정법, 리간드, 수용체, 불용성 담체 입자, 인간 알부민, 모노클로날 항체
Description
본 발명은 시료 중의 측정 대상이 되는 리간드를, (담체) 입자의 응집 저지 반응을 이용하여 측정하는 방법 및 여기에 이용하는 시약에 관한 것이다. 특히, 미리 리간드를 담지한 불용성 담체 입자, 리간드 특이적인 유리상의 수용체, 및 리간드 특이적인 수용체를 담지한 불용성 담체 입자에 의한 응집의 형성이 샘플 중의 리간드에 의해 저해되는 응집 저해 측정법 및 응집 저해 측정용 시약에 관한 것이다.
불용성 담체 입자를 이용하여 입자의 응집 또는 응집 저해를 일으켜 리간드를 정성, 정량하는 측정법은 간편하면서 고감도이기 때문에, 항원 항체간의 면역 반응이나 상보성 염기쇄간의 결합 반응 등의 리간드-수용체 반응 원리를 이용한 각종 측정 시약이 개발되어 있다.
응집법은 수용체를 감작한 담체 입자가 측정 대상 리간드를 통한 가교 반응에서 응집되는 정도를 측정하는 방법으로서, 미량 물질의 고감도 측정의 필요성을 배경으로 하여 많은 측정 항목에 대하여 실용화되고 있다.
한편, 응집 저해법은 미리 리간드 또는 리간드 유사 물질을 감작한 담체 입 자와 수용체에 의한 응집이 측정 대상인 리간드에 의해 저지되는 비율을 측정하는 방법으로서, 응집법에서는 특수한 리간드를 제외하고 2종 이상의 특이적 수용체가 필수인 데 반하여, 응집 저해법은 1종의 특이적 수용체가 있으면 측정계를 구축할 수 있는 것이 큰 특징이다.
또한, 면역 반응에 관해서 말하자면, 응집 저해법에는 지대 현상(항원 과잉에 의한 외관 상의 반응 저하 현상)이 발생하지 않는다는 이점이 있지만, 현재까지의 적용은 햅텐과 같은 저분자 리간드, 즉 2종 이상의 수용체를 이용할 수 없는 리간드를 측정 대상으로 하고 있는 경우가 대부분이다.
응집 저해법의 적용이 한정되어 있는 이유로서, 응집법과 비교하여 측정 농도 범위의 조정이 어렵다는 점을 들 수 있다. 응집법에 있어서는 리간드량에 비례하여 응집이 진행되기 때문에, 예를 들면 라텍스 면역 응집법에 관한 하기 특허 문헌 1에 개시된 바와 같이, 고농도 영역의 감도 상승을 증강시키는 것만으로 용이하게 측정 범위를 확대시킬 수 있다.
한편, 리간드량에 비례하여 응집 저지 반응이 진행되는 응집 저해법의 측정 범위에 관해서는 리간드 고농도 영역의 측정 상한치는 기본적으로는 초기 응집(리간드량 제로일 때의 응집)의 크기에 의존하고, 리간드 저농도 영역의 측정 하한치는 응집 저지 반응의 감수성에 의존하기 때문에, 두 요인을 복합적으로 고려할 필요가 있다.
응집 저해법의 초기 응집을 증강시키는 방법으로서, 예를 들면 하기 특허 문헌 2에 기재된 방법에서는 햅텐의 측정에 있어서 비특이적인 응집 촉진 물질을 이 용하는 방법이 제시되어 있다. 본 방법에 의해 고농도 영역까지 리간드의 측정이 가능해져 측정 상한치를 확장시킬 수 있지만, 리간드와 수용체간의 특이 반응에 관계가 없는 응집 증강이기 때문에 응집 저지 반응에 대한 감수성이 저하되어, 결과적으로 저농도 영역의 검출능은 현저히 악화된다.
또한, 하기 특허 문헌 3에는 단일의 모노클로날 항체 감작 담체와 항원 감작 담체를 이용하는 응집 저해법이 개시되어 있다. 본 방법에서는 리간드와 수용체를 각각 담지한 담체 입자를 이용하여, 광학적으로 감도의 변화량을 증강시킴으로써, 응집 저지 반응에 대한 감수성을 손상시키지 않고 저농도 영역의 검출능을 향상시키고 있다. 그러나, 상기 방법은 항원과 항체간의 반응 자체가 증강되는 것은 아니기 때문에, 측정 범위를 확장시키는 것과 같은 효과는 보이지 않는다. 마찬가지로 하기 특허 문헌 4에 제안된 항원 감작 라텍스, 항체 및 항체에 특이적인 수용체를 이용하는 응집 저해법은 항원과 항체, 항체와 수용체의 특이 반응만으로 응집을 증강시키고 있기 때문에, 종래법과 비교하면 측정 범위의 확장이 달성된다. 그러나, 실시예에서 수용체로서 개시되어 있는 프로테인 A는 항체(IgG) 전반에 반응성을 갖기 때문에, IgG를 함유하는 혈청이나 혈장과 같은 시료의 측정에는 부적합하고, 항마우스 IgG 래트 모노클로날 항체에 관해서도, 일반적으로 이용되는 소재는 아니기 때문에 입수가 곤란한 경우도 생각할 수 있다. 또한, 측정 원리 자체가 항원-항체, 항체-수용체라는 이상성(二相性)의 반응을 통하고 있기 때문에, 측정 기기, 방법에 따라서는 성능이 불량이 될 가능성도 생각할 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 초기 응집은 강하고, 동시에 응집 저지 반응에 대 한 감수성도 높다는 상반된 특성을 겸비한 응집 저해 측정법 및 응집 저해 측정용 시약은 아직 확립되지 않았고, 지금까지의 측정법으로는 통상의 리간드, 예를 들면 2개소 이상의 수용체 결합 부위를 갖는 것과 같은 리간드를 고감도이면서 광범위하게 재현성 좋게 측정하는 것은 곤란한 상황에 있었다.
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 제2004-191332호 공보
특허 문헌 2: 일본 특허 공고 (평)05-000665호 공보
특허 문헌 3: 일본 특허 공개 (소)59-173760호 공보
특허 문헌 4: 일본 특허 공개 제2001-337092호 공보
<발명의 개시>
<발명이 해결하고자 하는 과제>
본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 시료 중의 리간드를 저농도 영역부터 고농도 영역까지 고감도이면서 광범위하게 측정할 수 있는 동시에, 양호한 측정 재현 성능을 갖는 응집 저해 측정법 및 응집 저해 측정용 시약의 제공을 과제로 한다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
본 발명자들은 응집 저해 측정법에 대하여 예의 검토를 행한 결과, 리간드를 담지한 불용성 담체 입자와 유리상의 특이적 수용체에 더하여, 리간드 상의 결합 부위가 상기 유리상 수용체와는 다른 특이적 수용체를 담지시킨 불용성 담체 입자를 이용함으로써, 응집 저지 반응에 대한 감수성을 유지한 채로 초기 응집을 증강시킬 수 있고, 리간드 저농도 영역부터 고농도 영역까지 예상 외로 고감도이면서 광범위하게 측정할 수 있고, 양호한 측정 재현 성능을 가짐을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 구성을 갖는다.
(1) 2개소 이상의 수용체 결합 부위를 갖는 측정 대상 리간드를 포함하는 시료와, 하기 (A) 내지 (C)를 혼합하여, 시료 중의 측정 대상 리간드량에 따른 입자의 응집 저지 반응을 측정하는 것을 특징으로 하는 응집 저해 측정법:
(A) 미리 리간드 또는 리간드 유사 물질을 담지한 불용성 담체 입자
(B) 상기 리간드에 특이적으로 반응하는 유리상 수용체
(C) 상기 리간드에 특이적으로 반응하고, 리간드 상의 결합 부위가 상기 유리상 수용체와는 다른 수용체를 담지한 불용성 담체 입자.
(2) 불용성 담체 입자가 라텍스 입자인 상기 (1)에 기재된 응집 저해 측정법.
(3) 수용체가 항체 또는 이들의 기능성 부위를 포함하는 단편이고, 리간드가 항원이고, 수용체와 리간드와의 면역 반응에 기초하여 입자의 응집 저지 반응을 측정하는 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 응집 저해 측정법.
(4) 유리상 수용체 및 불용성 담체 입자에 담지된 수용체가 모두 모노클로날 항체인 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 응집 저해 측정법.
(5) 측정 대상 리간드가 인간 알부민이고, 수용체가 항 인간 알부민 모노클로날 항체인 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 응집 저해 측정법.
(6) 수용체를 담지하는 불용성 담체 입자의 평균 입경이, 리간드 또는 리간드 유사 물질을 담지하는 불용성 담체 입자의 평균 입경의 1/2 내지 1/10인 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 응집 저해 측정법.
(7) 하기 (A) 내지 (C)를 포함하고, 시료 중의 측정 대상 리간드량에 따른 입자의 응집 저지 반응을 측정하는 것을 특징으로 하는 응집 저해 측정용 시약:
(A) 미리 리간드 또는 리간드 유사 물질을 담지한 불용성 담체 입자
(B) 상기 리간드에 특이적으로 반응하는 유리상 수용체
(C) 상기 리간드에 특이적으로 반응하고, 리간드 상의 결합 부위가 상기 유리상 수용체와는 다른 수용체를 담지한 불용성 담체 입자.
(8) 불용성 담체 입자가 라텍스 입자인 상기 (7)에 기재된 응집 저해 측정용 시약.
(9) 수용체가 항체 또는 이들의 기능성 부위를 포함하는 단편이고, 리간드가 항원이고, 수용체와 리간드와의 면역 반응에 기초하여 입자의 응집 저지 반응을 측정하기 위한 상기 (7) 또는 (8)에 기재된 응집 저해 측정용 시약.
(10) 유리상 수용체 및 리간드 상의 결합 부위가 상기 유리상 수용체와는 다른 수용체가 모두 모노클로날 항체인 상기 (7) 내지 (9) 중 어느 한 항에 기재된 응집 저해 측정용 시약.
(11) 수용체를 담지하는 불용성 담체 입자의 평균 입경이, 리간드 또는 리간드 유사 물질을 담지하는 불용성 담체 입자의 평균 입경의 1/2 내지 1/10인 상기 (7) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 응집 저해 측정용 시약.
(12) 측정 대상 리간드가 인간 알부민이고, 수용체가 항 인간 알부민 모노클로날 항체인 상기 (7) 내지 (11) 중 어느 한 항에 기재된 응집 저해 측정용 시약.
<발명의 효과>
본 발명의 응집 저해 측정법 및 응집 저해 측정용 시약은 측정 대상 리간드를 저농도 영역부터 고농도 영역까지 고감도이면서 광범위하게 측정할 수 있는 동시에, 양호한 측정 재현 성능을 갖는다. 특히, 면역 반응을 이용하는 경우, 지대 현상을 발생하지 않는다는 특징으로부터 이상 고가를 나타낼 가능성이 있는 리간드 측정시에는 입자 응집법보다 측정 신뢰성이 높다. 또한, 본 발명의 수용체에 모노클로날 항체를 이용한 경우에는 리간드가 전장(full-length)이 아니더라도 에피토프가 잔존해 있으면 응집 저지 반응이 일어나기 때문에, 단편화한 리간드도 전장의 리간드와 마찬가지로 측정할 수 있을 가능성이 있다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
(측정 대상 시료)
본 발명의 측정 대상이 되는 리간드를 포함하는 시료로서는, 예를 들면 인간 또는 동물의 혈액, 혈청, 혈장, 배양 상청, 뇨, 수액, 타액, 땀, 복수, 또는 세포 또는 조직의 추출액 등을 들 수 있다.
(리간드)
본 발명의 측정 대상이 되는 리간드로서는 2개소 이상의 수용체 결합 부위를 갖는 물질이면 모두 대상으로 할 수 있다. 구체적으로는, C 반응성 단백질(CRP), FDP, D-이량체, 전립선 특이 항원(PSA), 헤모글로빈 A1c, 알부민, 펩시노겐 I(PGI), 펩시노겐 II(PGII), 매트릭스 메탈로프로테이나아제(MMP), 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 카텝신 등의 단백질, 그 밖에 펩티드, 당류, 핵산, 지질, 고분자 약제 등을 들 수 있다. 이론적으로는 2개소 이상의 수용체 결합 부위를 갖는 리간드(리간드가 항원이면 2개소 이상의 에피토프(항원 결정기)를 갖는 리간드, 예를 들면 2종 이상의 모노클로날 항체를 이용한 샌드위치 측정으로 검출 가능한 리간드)는 모두 측정 대상 물질로서 적용 가능하다.
리간드 유사 물질이란, 수용체와의 관계에 있어서 상기 리간드와 동등, 동질의 반응성(리간드가 항원이면 항원성)을 갖는 것을 말한다. 예를 들면, 리간드(항원 등)를 분해하여 얻어지는 단편, 유전자 조작으로 얻어진 재조합 리간드, 리간드 구조가 유사한 물질(리간드 유연 물질) 등을 들 수 있다.
(수용체)
본 발명에서 사용하는 수용체로서는 측정 대상인 리간드에 특이적으로 결합하는 물질을 이용한다. 일반적으로는 토끼, 양, 염소 등에, 측정 대상 리간드를 면역하여 얻어지는 항 리간드 폴리클로날 항체나 항 리간드 모노클로날 항체를 사용할 수 있다. 그 중에서도 특이성 면에서는 모노클로날 항체의 사용이 특히 바람직하다. 사용하는 항체는 통상법에 따라 제조한 항체의 단편일 수 있다. 그 밖에, 리간드의 종류에 따라서는 렉틴, 핵산 염기 등도 항체와 병용하여 또는 단독으로 수용체로서 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 수용체의 종류는 2종 이상이면 특별히 제한은 없고, 유리상 수용체와 담체에 고정화되는 수용체와는 다른 것을 이용할 것을 요한다. 즉, 유리상 수용체와 담체 고정화 수용체란, 리간드 상의 결합 부위가 다른 수용체일 것을 요한다. 즉, 각 수용체가 리간드와의 결합을 서로 간섭하지 않는 관계에 있는 수용체이면 좋다. 또한, 유리상 수용체 및 담체 고정화 수용체는 모두 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 본 발명에서는 유리상 수용체와 고정화 담체 수용체의 양자를 조합하여 사용함으로써, 초기 응집을 촉진하면서 고농도 영역에서의 감도 변화도 증대시킬 수 있어, 측정 가능한 범위를 확장시킬 수 있다. 수용체의 종류나 함량, 존재 양식(유리 상태 또는 담체 담지 상태)은 리간드의 수용체 결합 부위의 수나 분석에 필요한 입자의 응집 정도, 목적으로 하는 측정 범위 등을 고려하여 적절하게 선택할 수 있다.
수용체로서 모노클로날 항체를 이용하는 경우, 이들의 선정은 예를 들면 다음과 같은 절차로 행해진다.
우선, 측정 대상 리간드를 면역원으로서 제조한 모노클로날 항체와 리간드와의 반응성을 웨스턴 블롯법이나 ELISA법 등으로 확인하고, 반응성이 강한 항체를 2종 이상 선택한다. 또한, 선택된 이들 항체를 조합하였을 때의 반응성을 샌드위치 ELISA법으로 확인한다. 이 때, 반응성이 강하면 그만큼 감도가 높아 측정 범위를 확장시킬 수 있을 가능성이 높기 때문에, 모노클로날 항체의 조합은 측정 대상, 요구 성능에 따라 적절히 선택하는 것이 바람직하다. 이와 같이 하여 얻어진 모노클로날 항체의 조합을, 한쪽을 담체에 고정화시킨 상태로, 다른 한쪽을 담체에 고정화시키지 않은 유리 상태로 실제의 측정계에 제공하고, 초기 응집, 측정 감도, 측정 범위, 리간드와 유사한 구조를 갖는 측정 대상 외의 물질과의 교차 반응성 등을 고려하여 어느 조합이 적당한지 최종적인 판단을 행한다.
(담체 입자)
본 발명에서 사용하는 리간드 또는 수용체를 담지시키는 불용성 담체 입자는 특별히 한정되지 않지만 평균 입경 50 내지 1000 ㎚의 라텍스가 바람직하다. 라텍스의 재질로서는, 리간드 또는 수용체의 담지에 적합한 것이면 좋고, 일반적으로 이용되는 폴리스티렌을 주성분으로 하는 라텍스 외에도, 스티렌-부타디엔 공중합체, (메트)아크릴산 에스테르류 중합체 등을 들 수 있다. 또한, 금속 콜로이드, 젤라틴, 리포솜, 마이크로 캡슐, 실리카, 알루미나, 카본 블랙, 금속 화합물, 금속, 세라믹 또는 자성체 등의 재질로 이루어지는 입자를 사용할 수도 있다. 담체 입자에 상기 리간드 또는 리간드 유사 물질 및 수용체를 담지하는 방법으로서는 일반적으로 사용되고 있는 물리 흡착법 외에 화학 결합법도 채용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 이용하는 리간드 및 수용체를 각각 담지하는 담체 입자는 그의 재질이 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 각각의 담체 입자의 입경은 분석 방법이나 목적에 적합한 입경을 선택할 수 있지만, 본 발명의 효과를 충분히 발휘하기 위해서는 수용체를 담지하는 담체 입자의 평균 입경은 리간드를 담지하는 담체 입자의 평균 입경의 1/2 내지 1/10인 것이 바람직하다.
(완충액)
본 발명에서의 응집 반응은 완충액 중에서 행해지고, 그 완충액은 응집 반응이 최적으로 행해지는 종류, 농도, pH가 선택되고, 인산 완충액, 트리스 염산 완충액, 탄산 완충액, 글리신 완충액, 굿 완충액(Good's buffer) 등을 이용할 수 있다. 그 완충액의 완충제 농도는 5 mM 내지 500 mM 정도로 이용되고, pH는 중성 영역부터 염기성 영역에서 이용되는 경우가 많고, 통상 7.0 내지 9.5의 범위로 이용된다.
(응집 시그널의 측정 방법)
응집 시그널의 측정은 통상 응집 저지 반응 측정에 이용되는 방법이면 어느 것이든 좋고, 흡광도비에 의한 평가, 입자수 측정, 입자 크기 측정(응집되면 크기는 커짐), 산란광 측정이나 흡수 스펙트럼의 측정(응집되면 증대 또는 이동함) 등 당업자가 이용할 수 있는 수단을 들 수 있다. 또한, 광학적인 검출을 가능한 범위에서 전기 화학적인 검출에 의해 치환하는 것도 가능하다.
응집 시그널의 측정은 상기와 같이 다양한 방법이 있지만, 라텍스 입자와 범용 생화학 분석 장치를 이용하는 방법이 편리하다. 예를 들면, 측정 대상인 리간드를 포함하는 시료에, 유리상의 수용체와 별종의 수용체를 담지한 라텍스, 리간드를 담지한 라텍스 등의 불용성 담체 입자를 포함하는 시약을 가하여 일정 온도에서 일정 시간 가온하고, 그동안의 흡광도를 측정하여 흡광도의 변화량을 검출하고, 미리 농도가 알려진 표준액을 시료로 한 경우의 검량선으로부터 피검 시료 중의 리간드의 농도를 산출할 수 있다. 라텍스 응집 저해법에서는 통상 500 내지 900 ㎚ 파장의 흡광도가 이용되고, 반응시의 흡광도의 변화량을 정량으로 이용하는 것이 일반적이다. 본 발명을 이용한 측정 범위는 측정 대상으로 하는 리간드의 종류, 수용체의 결합력(avidity), 각 수용체의 양비 등을 고려하여 적절히 원하는 측정 범위로 설정할 수 있다. 예를 들면, 측정 대상이 뇨 중 알부민인 경우, 임상 검사에서의 사용을 고려하면 1 μg/mL 내지 1 mg/mL의 범위가 바람직하고, 후술하는 실시예와 같이 본 발명에 의해 정확하게 측정할 수 있다.
본 발명의 응집 저해 측정용 시약은 (A) 미리 리간드 또는 리간드 유사 물질을 담지한 불용성 담체 입자, (B) 상기 리간드에 특이적으로 반응하는 유리상 수용체, (C) 상기 리간드에 특이적으로 반응하고, 리간드 상의 결합 부위가 상기 유리상 수용체와는 다른 수용체를 담지한 불용성 담체 입자를 포함하고, (B), (C)를 포함하는 제1 시약과 (A)를 포함하는 제2 시약으로 나누는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.
응집 저해 측정법에 의한 미량 알부민의 측정
(1) 수용체(항 알부민 모노클로날 항체)의 제조
정제 인간 알부민(시그마사 제조) 100 μg을 1회의 면역에 사용하였다. 첫회 면역은 알부민과 프로인드 완전 보조제를 등량 혼합하여 제조한 에멀젼 200 μL를 이용하여 이것을 BALB/c 마우스의 복강에 주사하여 행하였다. 추가 면역은 프로인드 불완전 보조제를 사용하여 상기와 동일하게 제조한 에멀젼 200 μL를 이용하여 2시간 간격으로 3회, 복강 주사를 반복하였다.
마우스 안저 정맥으로부터 채혈한 혈액 내의 항체가를, 정제 인간 알부민을 고상화한 ELISA법으로 측정하고, 항체가가 높은 마우스를 선택하여 세포 융합에 제 공하였다(또한, 항체가의 확인 방법은 후술하는 배양 상청 중의 항 알부민 항체의 존재 확인 방법과 동일함). 4회째의 면역으로부터 2주일 후에, 알부민 100 μg을 생리 식염액 200 μL에 용해시킨 것을 마우스 복강에 주사하고, 3일 후에 비장을 적출하였다. 상기 적출한 비장을 RPMI 1640 배지 중에서 푼 후, 1500 rpm으로 원심 분리하여 비장 세포를 회수하였다. 이것을 소 태아 혈청을 포함하지 않는 RPMI 1640 배지에서 3회 이상 원심·침전에 의한 세정 후, 침전부에 대하여 15％ 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지 2 mL를 가하여 현탁시켜 비장 세포 현탁액으로 하였다. 비장 세포와 미엘로마 세포 SP2/O-AG14를 세포수로 6대 1의 비율로 혼합한 후, 50％ 폴리에틸렌글리콜 존재하에서 세포 융합시켰다. 1500 rpm의 원심 분리로 침전부를 모으고, GKN액(글루코오스 2 g, 염화칼륨 0.4 g, 염화나트륨 8 g, 인산수소이나트륨 1.41 g 및 인산이수소나트륨 이수화물 0.78 g을 정제수에 녹여 1리터로 한 것)에 현탁·원심 분리에 의해 세정한 후, 침전부를 회수하였다. 상기 침전부를 15％ 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지 30 mL에 현탁한 것을 1웰당 100 μL 분주하고, 동일한 웰에, 피더 세포로서 BALB/c 마우스의 흉선 세포를 2.5×106개/mL 포함하는 HAT 배지를 1웰당 200 μL 분주하였다. 96 구멍 마이크로플레이트 3장에 분주하고, 37℃에서 5％ 탄산가스 배양기 내에서 배양하였다.
배양 상청 중의 항 알부민 항체의 존재는 정제 인간 알부민을 고상화한 ELISA법으로 확인하였다. 배양 10일 후에 모든 웰에서 융합 세포의 증식을 확인하였다. 항 알부민 항체의 존재 확인 방법의 상세는 이하와 같다.
우선, 10 μg/mL의 알부민 및 150 mM 염화나트륨을 포함하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.2; 이하, PBS라 약칭함) 100 μL를 96 구멍 마이크로 플레이트에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 다음으로 이것을 0.05％ Tween 20 및 1％ 소혈청 알부민을 포함하는 PBS 300 μL로 3회 세정한 후, 배양을 행한 3장의 96 구멍 마이크로 플레이트 각 웰의 배양 상청을 50 μL/웰 가하여 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 0.05％ Tween 20을 포함하는 PBS로 3회 세정한 후, 퍼옥시다아제 표지 항 마우스 항체(다이이찌 가가꾸 야꾸힌사 제조)를 50 μL/웰 가하고, 실온에서 1시간 방치하였다. 이것을 0.5％ Tween 20을 포함하는 PBS로 3회 세정한 후, 0.2％ 오르토페닐렌디아민 및 0.02％ 과산화수소를 포함하는 시트르산 완충액(pH 5) 50 μL/웰을 가하고, 실온에서 15분간 방치한 후, 4.5N 황산 50 μL/웰을 가하여 반응을 정지시키고, 파장 492 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 측정 결과, 흡광도가 높은 웰을 항 알부민 항체가 존재하는(즉, 항 알부민 항체 생산 융합 세포가 존재하는) 웰(양성 웰)로서 선택하였다.
단클론화는 한계 희석법으로 행하였다. 즉 피더 세포로서 BALB/c 마우스의 흉선 세포를 1웰당 106개씩 분주한 96 구멍 마이크로 플레이트에, 양성 웰 중의 융합 세포를 10 개/mL가 되도록 희석한 것을 0.1 mL씩 분주하였다. 배지는 첫회는 HT 배지를, 2회째 이후에는 15％ 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지를 이용하여, 37℃에서 5％ 탄산 가스 배양기 내에서 10일간 배양하였다. 상기한, 정제 인간 알부민을 고상화한 ELISA법에 의한 양성 웰의 선택 및 한계 희석법에 의한 단 클론화 조작을 각 3회 반복하여 30종의 항 알부민 모노클로날 항체 생산 세포를 얻었다. 각 세포의 약 105개를 프리스탄으로 전처리한 마우스 복강에 투여하고, 생성된 복수를 각각 채취하였다. 채취한 각 복수로부터 원심 분리에 의해 불용물을 제거하고, 등량의 포화황산암모늄액을 가하고, 교반하면서 하룻밤 방치한 후, 원심 분리로 침전을 회수하였다. 회수한 침전을 20 mM 트리스 완충액(pH 8)에 용해시키고, 동 완충액으로 투석하였다. 투석 내용물 각각을 동 완충액으로 평형화한 DEAE-세파로오스 컬럼에 별개로 흡착시킨 후, 각각 동 완충액 중의 염화나트륨 0 내지 300 mM의 농도 구배로 용출시켜 얻은 IgG 분획을 50 mM 글리신 완충액으로 투석하여 얻어진 30종의 정제 항체 중, 샌드위치법으로 가장 고감도가 얻어지는 2종의 항체의 조합(항체 1-8과 항체 3-8)을 선택하였다.
(2) 알부민 측정용 라텍스 시약의 제조
선택한 2종의 항 알부민 모노클로날 항체 중, 항체 3-8을 2.8 mg/mL 포함하는 20 mM 트리스 완충액(pH 8.5) 3 mL에, 평균 입경 50 ㎚의 4％ 라텍스(세키스이 가가꾸 고교사 제조) 현탁액 3 mL를 가하고, 4℃에서 2시간 교반하였다. 여기에 0.4％ 소혈청 알부민을 포함하는 20 mM 트리스 완충액(pH 8.5) 6 mL를 가하고, 4℃에서 1시간 교반하였다. 원심 분리 후, 침전을 5 mM MOPS 완충액(pH 7.0)으로 파장 600 ㎚에서의 흡광도가 40 mOD가 되도록 재현탁하여 항 알부민 항체 3-8 감작 라텍스를 제조하였다. 유리 상태의 항체 1-8과 항체 3-8 감작 라텍스를 혼합하여 제1 시약을 제조하였다.
다음으로, 인간 혈청 알부민 0.5 mg/mL를 포함하는 10 mM CHES 완충액(pH 5.5) 3 mL를 이용하여, 평균 입경 300 ㎚의 0.5％ 라텍스(세키스이 가가꾸 고교사 제조) 현탁액 3 mL를 가하고, 4℃에서 1시간 교반하였다. 원심 분리 후, 상청을 제거하고, 침전을 5 mM MOPS 완충액(pH 7.0)으로 파장 600 ㎚에서의 흡광도가 2.15OD가 되도록 재현탁하여, 알부민 감작 라텍스 용액으로서 제2 시약을 제조하였다.
(3) 알부민의 측정
범용형의 히타치 7170형 자동 분석 장치를 이용하여 각 농도의 알부민 시료를 측정하고, 측정 감도를 확인하였다. 구체적으로는, 제1 시약 100 μL에 각 농도의 알부민을 함유하는 시료액 3 μL를 각각 가하여 교반한 후, 37℃에서 5분간 가온하고, 추가로 제2 시약 100 μL를 첨가하여 37℃, 5분간의 주 파장 570 ㎚/부 파장 800 ㎚에서의 흡광도 변화량을 측정하였다. 우선, 알부민 농도 0 μg/mL일 때의 초기 응집을 표 1에 나타내었다. 또한, 5, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800 μg/mL의 알부민을 함유하는 각 시료 측정시의 초기 응집으로부터의 흡광도 변화량을 측정하고, 알부민 농도 대 －(마이너스) 흡광도(이하 동일)의 반응 곡선으로서 도 1에 실선으로 나타내었다. 이 반응 곡선의 형상에 기초하여 0, 5, 25, 100, 400, 800 μg/mL의 6 포인트로부터의 검량선을 제조하고, 각 농도의 알부민 시료의 흡광도 변화량을 알부민 농도로 환산한 측정치를 표 2에 나타내었다.
(4) 비교예
비교예로서 실시예와 최종 항체 농도가 동일해지도록 하기 (A) 내지 (E)의 5 종의 제1 시약을 제조하였다.
(A) 유리 상태의 항체 1-8을 단독으로 함유하는 제1 시약
(B) 항체 1-8 감작 라텍스를 단독으로 함유하는 제1 시약
(C) 유리 상태의 항체 1-8과 항체 1-8 감작 라텍스의 양쪽을 함유하는 제1 시약
(D) 유리 상태의 항체 1-8과 유리 상태의 항체 3-8의 양쪽을 함유하는 제1 시약
(E) 항체 1-8 감작 라텍스와 항체 3-8 감작 라텍스의 양쪽을 함유하는 제1 시약
상기 (A) 내지 (E)의 각 제1 시약과, (2)에서 제조한 제2 시약을 조합하여 (3)의 방법에 따라 측정을 행하였다. 실시예과 동일하게 초기 응집의 결과를 표 1에, 알부민 농도 대 － 흡광도의 반응 곡선을 도 1에, 각 비교예의 반응 곡선의 형상에 기초하여 0 내지 800 μg/mL의 범위에서 선택한 최적의 농도 포인트로부터 검량선을 작성하고, 각 농도의 알부민 시료의 흡광도 변화량을 알부민 농도로 환산한 측정치를 표 2에 나타내었다.
(5) 결과
표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예의 초기 응집(흡광도)에 대하여 비교예 A, B, C는 약 반, 비교예 D는 2/3 정도의 초기 응집밖에 얻어지지 않아, 응집 저해법에서의 기본적인 측정 성능이 떨어졌음이 용이하게 추찰되었다. 한편, 비교예 E에서는 실시예보다 큰 초기 응집이 얻어졌다.
도 1의 알부민 농도 대 －(마이너스) 흡광도의 반응 곡선으로부터, 실시예(-●-)에서는 응집 저지 반응의 감수성이 높고, 알부민 저농도 영역(5-50 μg/mL)에서 큰 감도(- 흡광도) 변화를 나타냄과 동시에 알부민 고농도 영역(100-800 μg/mL)에서도 명료한 감도 변화를 나타내는 점에서, 저농도 영역부터 고농도 영역까지 광범위하게 정밀도 좋게 알부민을 측정할 수 있음이 확인되었다. 한편, 비교예 A(-□-), 동 C(-△-)에서는 알부민 저농도 영역에서 거의 감도 변화가 보이지 않기 때문에, 저농도 영역을 정확하게 측정할 수 없다. 또한, 비교예 D(-x-)는 알부민 농도 대 － 흡광도의 반응 곡선의 형상이 실시예와 근사하지만, 초기 응집이나 감도 변화 자체가 실시예에 비하여 작아, 측정 정밀도에 문제가 있다. 비교예 B(-○-), 동 E(-－-)에서는 알부민 저농도 영역에서 큰 감도 변화를 나타내지만, 고농도 영역에서는 감도 변화가 없기 때문에, 저농도 영역부터 고농도 영역까지를 광범위하게 측정할 수 없다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예에서는 저농도부터 고농도까지 거의 이론치대로의 측정치가 얻어졌다. 비교예 A, C에서는 알부민 0 μg/mL를 포함하는 저농도 영역을 정확하게 측정할 수 없었다. 또한, 비교예 B, E에서는 고농도 영역을 정확하게 측정할 수 없었다. 비교예 D에서는 어느 농도에서든 이론치와의 괴리가 커, 측정치 전반의 정확성에 문제가 보였다.
상기 실시예 및 비교예에 대하여 동일한 조건으로 동시 재현성 시험을 행하였다(n=5). 결과를 표 3에 나타내었다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예에서는 저농도부터 고농도까지 재현성 좋게 변동 계수 6％ 이하의 값이 얻어졌고, 측정 평균치도 알부민 농도 레벨과 동등한 측정치가 얻어졌다. 비교예 A, C, D에서는 재현성이 나쁘고, 특히 저농도의 변동 계수가 20％를 상회하는 경우가 있었다. 비교예 B, E에서는 재현성 좋게 측정할 수 있긴 하지만, 고농도 영역에서의 측정 평균치는 알부민 농도 레벨과 괴리되어 정확성이 낮았다.
본 발명에 따르면, 측정 대상 리간드를 저농도 영역부터 고농도 영역까지 고감도이면서 광범위하게 측정할 수 있는 동시에, 양호한 측정 재현 성능을 갖는 응집 저해 측정법 및 응집 저해 측정용 시약을 제공할 수 있다. 특히, 면역 반응을 이용하는 경우, 지대 현상을 발생하지 않는다는 특징으로부터 측정치의 신뢰성이 높고, 또한 이상 고가를 나타낼 가능성이 있는 리간드를 측정하는 경우에는 입자 응집법보다 정확한 측정 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 및 비교예에서의 알부민 농도 대 － 흡광도의 반응 곡선을 나타낸다.
Claims (12)
- 2개소 이상의 수용체 결합 부위를 갖는 측정 대상 리간드를 포함하는 시료와, 하기 (A) 내지 (C)를 혼합하여, 시료 중의 측정 대상 리간드량에 따른 입자의 응집 저지 반응을 측정하는 것을 특징으로 하는 응집 저해 측정법이며:(A) 미리 상기 리간드, 또는 수용체와의 관계에 있어서 상기 리간드와 동등, 동질의 반응성을 갖는 리간드 유사 물질을 담지한 제1 불용성 담체 입자(B) 상기 리간드 또는 리간드 유사 물질에 특이적으로 반응하는 유리상 수용체(C) 상기 리간드 또는 리간드 유사 물질에 특이적으로 반응하고, 리간드 또는 리간드 유사 물질 상의 결합 부위가 상기 유리상 수용체와는 다른 수용체를 담지한 제2 불용성 담체 입자,여기서, 상기 제1 불용성 담체 입자와 제2 불용성 담체 입자는 그의 재질이 동일하거나 또는 상이하고, 수용체가 항체 또는 이들의 기능성 부위를 포함하는 단편이고, 측정 대상 리간드가 항원이고, 수용체와 리간드와의 면역 반응에 기초하여 입자의 응집 저지 반응을 측정하는 응집 저해 측정법.
- 제1항에 있어서, 제1 불용성 담체 입자 또는 제2 불용성 담체 입자, 또는 상기 양자가 라텍스 입자인 응집 저해 측정법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 유리상 수용체 및 제2 불용성 담체 입자에 담지된 수용체가 모두 모노클로날 항체인 응집 저해 측정법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 측정 대상 리간드가 인간 알부민이고, 수용체가 항 인간 알부민 모노클로날 항체인 응집 저해 측정법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 수용체를 담지하는 제2 불용성 담체 입자의 평균 입경이, 리간드 또는 리간드 유사 물질을 담지하는 제1 불용성 담체 입자의 평균 입경의 1/2 내지 1/10인 응집 저해 측정법.
- 하기 (A) 내지 (C)를 포함하고, 시료 중의 측정 대상 리간드량에 따른 입자의 응집 저지 반응을 측정하는 것을 특징으로 하는 응집 저해 측정용 시약이며:(A) 미리 상기 리간드, 또는 수용체와의 관계에 있어서 상기 리간드와 동등, 동질의 반응성을 갖는 리간드 유사 물질을 담지한 제1 불용성 담체 입자(B) 상기 리간드 또는 리간드 유사 물질에 특이적으로 반응하는 유리상 수용체(C) 상기 리간드 또는 리간드 유사 물질에 특이적으로 반응하고, 리간드 또는 리간드 유사 물질 상의 결합 부위가 상기 유리상 수용체와는 다른 수용체를 담지한 제2 불용성 담체 입자,여기서, 상기 제1 불용성 담체 입자와 제2 불용성 담체 입자는 그의 재질이 동일하거나 또는 상이하고, 수용체가 항체 또는 이들의 기능성 부위를 포함하는 단편이고, 측정 대상 리간드가 항원이고, 수용체와 리간드와의 면역 반응에 기초하여 입자의 응집 저지 반응을 측정하는 응집 저해 측정용 시약.
- 제6항에 있어서, 제1 불용성 담체 입자 또는 제2 불용성 담체 입자, 또는 상기 양자가 라텍스 입자인 응집 저해 측정용 시약.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 유리상 수용체 및 리간드 상의 결합 부위가 상기 유리상 수용체와는 다른 수용체가 모두 모노클로날 항체인 응집 저해 측정용 시약.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 수용체를 담지하는 제2 불용성 담체 입자의 평균 입경이, 리간드 또는 리간드 유사 물질을 담지하는 제1 불용성 담체 입자의 평균 입경의 1/2 내지 1/10인 응집 저해 측정용 시약.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 측정 대상 리간드가 인간 알부민이고, 수용체가 항 인간 알부민 모노클로날 항체인 응집 저해 측정용 시약.
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