JPS59173760A - 免疫化学的測定方法及びその試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明１１、繁全抗原の新しいタイプの免疫イヒ学的測
足方法及びその方法を利用するのｒζ適した新しいタイ
プの測定試薬に則する。

と〈ｔこ、本発明は例えば血液、尿その他の体液や体液
成分などの如き被、検体中の微量な抗原を免りクテヒ学
的に測定する■（１１定方法及びその試薬しこ関し、浸
れた確実・１王、信頼１辻、精度、敏感性及び高い特売
性をもって、偽反応生起のトラプ〃を伴うことなしに、
再現性良く安定且つ容易な操作で、短時間ＶＣ被・検体
中のＳ量な抗原を免疫化学的に測定でさるｆ「シいタイ
プの測定方法及びその方法に利用するに適した新しいタ
イプの測定試薬に関する。

史ＶＣ詳しくは、本発明は、 （１４）完全抗原感作担体及び （句　上記抗原ＶＣ対する単一種のモノクロナル抗体感
作担体 を用い、被検体中の該抗原−による上記（４）及び（ロ
）両試薬成分の凝集阻止反応を測定することを特徴とす
る上記抗原の免疫化学的測定方法に１諧する。本発明ｔ
：ｉまた、 （，４）完全抗原感作担体及び （旬　上記抗原に対する単−棹のモノクロナル抗体感作
担体 から成ることを！１キ徴とする上記抗原の免疫イと学的
測定試薬ＶＣも関する。

従来、（’Ａｌえば血液、尿その他の体液や１本液成分
などの如き検体中に存在する生を勿学凶活性を儒する微
量物質を、免疫化学的手段で測定する方法は占くから知
られている。かかる免疫化学的側定法として、例えば赤
血球を担体として用ｕ）、これを反応を生屑させて、該
ａ＋　ＳＡ動物質測定する方法も既しく知られている。

また、担体として赤血球の代りに、非生物学的粒子とし
て例えば合成樹脂ラテックス、ベントナイト、コロゾオ
ン、コレステロール結晶、水晶等を免疫化学反応におけ
乞固体和体として用いることも知られている（以上例え
ば特開＋ｉｄ　５０−８２２３０号公開公報）。

このような抗原抗体反応を利用した免疫化学的手法しこ
よって被検体中の抗原の存在（定性）もしくはその濃度
（定量）を測定検出するのに従来もつとも普通に利用さ
れてきた抗体感作担体は、ポリクロナル抗体感作担体で
あった。

１９７５年Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎらが−ｒ　ｒ７　ス（
Ｄミエローマ細胞と肺臓中の抗体産生細胞とを細胞融合
し、該細胞からモノクロナル抗体の産生に成功して以来
、細胞融合技術分野における著るしい技術の進歩に伴っ
て、モノクロナル抗体産生細胞株の形成、それを利用し
たモノクロナル抗体の産生が容易と７？す、このような
モノクロナル抗体を利用した抗原の免疫化学的測定方法
に関する提案がなされるよう？こなった。

このような提案として、特開昭５７−８６０５１号の提
案が知られている。この提案ｔＣ於ては、２　イＩｉａ
又はそれ以上の異種類のモノクロナル抗体が同一の抗原
ｒ（対応して用いられることを特徴とし、少くとも２個
の杭木分子に抗原を結合させる免疫化学的反応を利用し
た抗爪定：瀘法が３７を案されている。セして、この保
案ｐ（ｉ”、ｉ：　、従来の抗体すなわちポリクロナル
抗体か対心抗京と反応して沈ｊ咬すを生ずる公知現象と
は全く）６なって、モノクロナル抗ｔ−トは対応抗原と
結合して沈ＩＣ々吻を生成することがなく、モノクロナ
ル抗体で被曖された１クリえは赤血球、ラテックス球、
金Ｌ６粒子などの如き担体１）２子が対応抗原の存在下
で凝集しないことが記載されている。

この十是案ＶＣ於ては、イ１ρ来公知の知吃とは昇って
、モノクロナル抗体は対応抗原と、詰合して沈殿吻を生
成しないという事実があるｒこも拘わらず、複数（・毬
の異種モノクロナル抗体を使用すると抗原と結合して沈
、唆物を生成できるという新しい知見が得られたことを
記載し、それゆえに、この提案においては、上述のとお
り、少なくとも二Ａ（の異種モノクロナル抗体の１更用
を必須とする抗原定量法に特定さ第１でいる。

懸に、この提案ＶＣ（は、このような複数種の異オＩＲ
モノクロナル抗体の使用ＶこよってもなＲ１ａｌｌ定の
８問と特異性Ｋ　ＫＩ　して放ずしも好結果が得られる
わけではなく、全く効、果的ではないことさえあり彷る
ため、可能な限りの結合の仕方を試みた上で検討選択し
なけＪｌはならないことを記述している。

このような複数種の異種モノクロナル抗体の使用を必須
とする類似の提案として、特開昭５７−１１８１５９号
の提案も知られている。

そして、これらモノクロナル抗体を利用する抗原の免役
化学的測定方法に関する従来提案に於ては、従来のポリ
クロナル抗体の揚台とは異なって、単−睡のモノクロナ
ル抗体は対応抗体抗原と結合して沈殿物を生成せず、複
数４４１０異（・；」モノクロナル抗体の使用ＶＣよっ
てはじめて沈殿勿を主成でさるという事実から当然のこ
とながら、’ｊ′ｎ数卜ｑの異種モノクロナル抗体の便
用が必須でのるという点で共辿している。

しかしながら、前者の提４ｆ′ＶＬ　ｒｆ己載さ才して
いるように、モノクロナル抗体と対応抗原との凝集を生
じさせるために複数１にの異９ｉ　’Ｂノクロナル抗体
を相体に感作し、その感作相体を使用しても々ｋ、測定
のｔＱ躊にと特るυ性ＩＩ（関して必ずしも好結果が達
ｒｉＶ、できるとはかき゛らない欠陥があり、−ｊｖｔ
ｌは、利用し得るようなに、（←さえ生ぜす、全く効果
的でないことさえあるという寅犬な技術的欠点があった
。

そして、／Ｉｋｉｔ足すべき凝集性を与えるためＶＣｌ
例えばより多種の異種モノクロナル抗体を使用すればす
るほど、当然のことながら、モノクロナル抗体の利用に
よる高い特売性の利点はより多く失われていく不都合を
伴うことが回遵できないという両立し難い技術的線順が
生じていた。

すなわち、モノクロナル抗体に抗原分子中の一１’Ｃｇ
ｎ’ｓする結果となり、モノクロナル抗体の利用ｔこよ
る高い％＝Ｑ性の利点がより多く失われていくという両
立し咋い技術的課項を悼う。￥ＶＣ又、抗原分子の多数
の部位を認１ｉｒｉｉ！できる従来のポリクロ　、ナル
抗体利用の場合とは異なって、上述したようＶＣ、モノ
クロナル抗体は一つの特定部位しか認識しないので、ポ
リクロナル抗於利用の場合に比して、凝集反応における
凝集性は著るしく弱いことが予期され、事実、上述した
ようＩＩ（、モノクロナル抗体利用の従来提巣において
は単一種のモノクロナル抗体の利用では対応抗原と結合
して沈殿物を生成しないので複数種の異種モノクロナル
抗体の利用が必須でるることを教え、更に、前述した前
者の提案においては、複数種の異種モノクロナル抗体を
利用してもなお、凝集を生じない場合がある・という技
術的欠陥のあることを開示している。・本発明者等は、
モノクロナル抗体を免役化学的な抗原測定法に利用する
際の上述の如き両立し難い技術的課題ないし技術的欠陥
を解決できる方法を開発すべく研究を行ってきた。

その結果、モノクロナル抗体利用に２ける前記従来知見
とは全く異なって、完全抗原を相体に感作させた完全抗
原感作担体の場合には、該抗原に対する単一種のモノク
ロナル抗体を担体ｖＣ感作させた単一種のモノクロナル
抗体感作担体との間に、満足すべき凝集反応が生起し、
斯くて、モノクロナル抗体利用における従来知見に必須
であった複数種の異種モノクロナル抗体を利用する必要
が全くないという予想外の新しい知見を得た。

このモノクロナル抗体利用における全く新しい知見に基
いて更に研究を進めた結果、（４）完全抗原感作担体及
び（旬上記抗原に対する単一種のモノクロナル抗体感作
担体の組み合わせから成る新しいタイプの試薬を用い、
被検体中の該抗原Ｖこよる上記（功及び０両試薬成分の
凝集反応に対する凝集阻止反応を測定するという新しい
タイプの免疫化学的な完全抗原測定方法が提供でき、顕
著に優れた確実性、信頼度、精度、感度及び顕著に高い
抗原特異性をもって、偽反応生起のトラブルを伴うこと
なしに、優れた再現性、安定性１つ容易な操作で、短時
間に被検体中の微量な抗原を免疫化学的に測定できるこ
とを見い出した。

更に又、上記の顕著に優れた作用効果は、対照完全抗原
に対するモノクロナル抗体の種類に実質的な影響を受け
ない利点を有し、斯くて広汎な任意の抗原の免疫化学的
測定方法に適用可能であることがわかった。

従って、本発明の目的はモノクロナル抗体を利用した完
全抗原の新しいタイプの免疫化学的測定方法及びその方
法すこ利用するのに適した新し、いタイプの測定試薬を
提供するりこめる。

本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記載から一層明らかとなるでるろう。

本発明に於いて完全抗原とは、生体内に於てそれ自体で
抗体産生能を有する抗原を意味し、生体内に於てそれ自
体では抗体産生能を有し、ない−・ブテン（不完全抗原
）を除外する意味である。換言すると、それ自体で抗原
性を有する抗原を指す。

このような完全抗原として任意の抗原が利用でき、例え
ば、以下の如き抗原を例示することができる。

（１）　　ペプチドホルモンとしては、例えば（１）成
長ホルモン（ＧＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ
）、メラミン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、グロラクチ
ン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン
（ＬＨ）、卵胞刺Ｗｋホルモン（ＦＳＨ）、オキシトシ
ン等の下垂体ホルモン、 （４）　カルシトニン、副甲状腺ホルモン等のカルシウ
ム代謝調節ホルモン、 （ｉｉｌ）　　インシュリン、プロインシュリン、膵グ
ルカゴン等の膵ホルモン、 （ｉｖ）　　ガストリン、セクレチン等の消化管ホルモ
ン、 （Ｖ）　　アンデオテンシン、プラジキニン等の血管に
作用するホルモン、 （ｖｌ）ヒトｄｉ　＆性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、
ヒト胎盤催乳ホルモン（ｈＰＬ）等の胎盤ホルモン、 等をあげることかでＬ　−１だ、 （１１）　　ホルモン以外の物質としては、例えば（１
）前立腺性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、アルカリ
；・上フォスファターゼ、トランスアミナーゼ、乳酸脱
水素酵素、トランスアミナーゼ、トリプシン、ペグシノ
ーダン等の酵素（Ｉｉ　　α−フェトプロティン（ＡＦ
Ｐ）、ガン胎児住抗ノボ（ＣＥＡ）等のガン特異物質（
ＩｉＤ　　免疫グロブリンＧ（ＩｃｌＧ）、フイプリン
ーフイブリノケ゛／分解産物（ＦＤ　Ｐ　）　、抗トロ
ンビンＩＩＩ　（，４７”１ｌｌｌ　）、トランスフェ
リン等の、血３負タンパク成分、 （１功　その他として、リュマチ因子、セロトニン、ウ
ロキナーゼ、フェリチン、サブスタンスＰ等の物質 等々の生体内に存在する成分及び代謝産物の如く多くの
完全抗原類をあげることができる。

本発明の完全抗原類は、しかし、上記例示の完全抗原類
に限定されるものではない。

本発明で利用する上記例示の如き完全抗原に対するモノ
クロナル抗体は、細胞融合技術分野においてそれ自体公
知の手法を適宜に選択組み合わせてモノクロナル抗体産
生融合細胞株を形成し、該細胞株を利用して産生、椴得
することができる。

その−態様によれば、上記例示の如き完全抗原を用いて
、これを適当な動物たとえばマウス、ラット、ウサギ、
ヒツギ、ウマ、ウシなどの如き動物ＶＣ１投与たとえば
アジュバントと共に皮下注射の如き手法で投与して、該
動物を免疫したのち、この免疫動物たとえば免疫マウス
の該抗原に対する抗体産生細胞たとえば肝細胞、胸腺細
胞、リンパ節細胞および／または末梢血細胞の如き細胞
を採取し、該細胞と自己増殖性を有するが抗体産生能を
笑質的に有しない適当な株化細胞たとえばマウス骨髄腫
株化細胞とを、それ自体公知の手法により細胞融合処理
する。

単クローン性抗体を得るためのミエローマ細胞と抗体産
生細胞との組合せは、各細胞が融合して増殖しつつ抗体
を産生ずることが可能であれば、それぞれの細胞の由来
する動物の種類は限定されず、任意の組合せでよい。

使用されるミエローマ細胞は特に限定はなく、多くのマ
クス、ラット、ウサギ、ヒトなどの動物の細胞株を使用
することができる。好ましい株イヒＭＢ胞Ｆｉ系剤抵抗
性のものであシ、かつ未融合のミエローマ細胞が選択培
地で生存せず、一方融合細胞のみが生存するようなもの
が良い。最も普通に用いられるものは８−アザグアニソ
ン抵抗性の株化細胞で、これはヒポキサンチン・グアニ
ン・ホスホリボシル・トランス７エラーゼヲ欠損シ、ヒ
ポキサンチン・アミノプテリイ・チミジン（ＨＡＴ）培
地に育生できない性質を有している。

さらに使用する株化細胞は「非分泌型」のものであるこ
とが好゛チしい。例えばマウスミエローマＭＯＰＣ−２
を株由来のＰａ／Ｘ　６３−Ａｇ８Ｕ１（ＰｓＵＩ）、
Ｐ、／Ｘ　６３−　Ａｇ　’８・６・５・３．７’　ｓ
　／　Ｎ　Ｓ　Ｉ　−１−Ａ　ｇ　４−１、Ｓｐ２１０
−Ａｇ１４、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇ
１・２・３などが好適に用いられる。

該細胞融合処理は、例えば、通常イーグル最少基本培地
（ＨＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０などの培地中で上記免
疫マウスの牌細胞１〜５Ｘ１０’個と上記マウス骨髄腫
株化細胞１〜５Ｘ１０’個とを、混合して行なうことが
できる。融合促進剤としては、平均分子量１，０００−
ａｏｏｏのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が好まし
く、他の融合促進剤、例えば、ポリビニルアルコール、
ウィルスなどを１史用することができる。ＰＥＧの使用
濃度は約３０〜５０％で用いることができる。

上述のようνこして得ることのできる融合細胞含有系か
ら融合細胞を、それ自体公知の手法を利用して、選別処
理、抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処ノ
ーして、免疫マウスの形成に用いた完全抗原に対するモ
ノクロナル抗１７Ｉ辺産生能を／ 有し且つ自己増殖能を持つ融合細胞株を取得することか
でさる。

上記程合細胞のｆ別処理は、例えば、２０％ウシ胎児血
清含有ＲＰＭＩ−ｘ６４ｏ培地などで細胞融合を終えた
細胞を適当に希釈し、９６穴マイタログレートに１０Ｉ
′〜１０６／ウ工ル程度に分注し、各ウェルＩｔＣ選択
培地（たとえばｆｌＡＴ培地）を加え、以後選択培地交
換を行いながら、５％で死滅し、また抗体産生細胞は正
常細胞なのでｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養では長期間生育でき
ない。したがって培養後１０〜１４日ぐらいから生育し
てくる細胞は全て融合細胞である。

上述のようにして得ることのでき、る融合細胞株の抗体
活性スクリーニング処理及びクローニンク処理は、常法
Ｖこより行うことができるが例えば、以下のようＶＣシ
て行うことができる。

融合細胞の生育したウェルの培養上清の一部を採取し、
一定量の標識抗原とインキュベーションし、標識抗原と
の結合能を測定することにより、目的とする抗体を分泌
しているウェルを検索することができる。即ち　ＩＮ＠
、１．１３１７などのラジオアイソトープあるいは酵素
などで標識した抗原と培養上清を反応させた後、各反応
液について抗原−抗体結合物を分離し、標識量を測定す
ることにより、目的とする抗体の存在および結合能を倶
索することができる。

目的とする抗体活性の認められる各ウェル中には２種以
上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希
Ｒ法や軟寒天ＶＣよるコロニー形成法によりクローニン
グを行い、モノクロナル抗体・ル抗体産生細胞株を用い
て、前記免疫動物の形成に用いた完全抗原に対するモノ
クロナル抗体を取得するＶＣは、該モノクロナル抗俸鮒
生細胞株を、例えば適当な培地に培養し、培地からモノ
クロナル抗体を採取する方法、ミエローマ細胞由来動物
と同系の劾吻Ｖこ核、１１ＩＩ　Ｉ＠株を移植し腹水中
のモノクロナル抗体を採取する方法など、それ自体公知
の手法を利用して取得することができる。

上記前者の態様によれば、例えば、モノクロナル抗体産
生融合細胞株をｌＯ％ウシ胎児血清含有ＲＰＭ１１６４
０培地などの培養液で培養し、その培養上精液を硫安分
画、抗原を結合させたセファロース４Ｂなどのアフィニ
ティークロマトグラフィーなどに工って精製することに
より目的とするモノクロナル抗体を採取することができ
る。

父、上記後者の態様によれば、例えば、同系動物にプリ
スタン（２，６，１０，，１４−テトラメチルペンタデ
カン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、融合細胞を腹
腔内投与することＶＣより１ｎｖｉｖｏで融合細胞を大
量に増殖させる。その結果、形成される腹水には高濃度
のモノクロナル抗体が含まれている。この腹水から硫安
分画及び必要に応じて前記アフィニティークロマトグラ
フィーなどにより、目的とするモノクロナル抗体を取得
することができる。

上述のようにして取得できるようなモノクロナル抗体は
市販品として入手することも可能で６Ｄ、利用でき、る
。

本発明によれば、前記例示の如き完全抗原を適当な担体
Ｖζ感作きせた（４完全抗原感作担体と、上述のように
して取得できる上記抗原に対するモノクロナル抗体の単
−棟を適当な担体に感作させた（句上記抗原に対する単
一種のモノクロナル抗体感作担体との組み合わせから成
ることを特徴とする上記抗原の免疫化学的測定試薬が提
供できる。

このような感作担体の調製ＶＣ利用する相体としては、
従来より免疫化学的凝集反応寂よび凝集阻止反応に２い
て一般的に用いられる微粒子の担体を使用することがで
き、例えばヒト、羊、ウサギなどの赤血球、細陥の細胞
などの生物学的粒子、高分子ラテックス、ベントナイト
、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン
などの非生物学的粒子などの如き担体を挙げることがで
きる。

このような担体の中で、高分子ラテックス担体の例とし
ては、ポリスチレンラテックス、スチレン−ブタツエン
コポリマーラテックス、ポリビニルトルエンラテックス
、ビニルトルエン・ｔ−ブ′チルスチレンコポリマーラ
テックス、スチレン−メタアクリレートコポリマーラテ
ックスなどおよび官能基としてカルボキシル基、第１級
アミノ基又はカルがアミド基（−〇〇ＮＨ２）を有し、
且つ基体が前記ラテックスから成る反応性高分子ラテッ
クスなどを挙げることができる。

上記例示の如き高分子ラテックス担体の粒子サイズは適
宜に選択できるが、例えば、平均粒径が約０．０１〜約
２ミクロンのものが使用でき、特に平均粒径が約０．０
５〜約１．５ミクロンのものが好ましい。又、他の非生
物学的担体についても上記高分子ラテックス担体と同様
に平径粒径約０．Ｏ１〜約２ミクロンのものが使用でき
る。

上記例示の如き担体に、完全抗原もしくは該抗原に対す
るモノクロナル抗体を感作させる手法は屁ｆ々知られて
おり、本発明において適宜に選択利用できる。このよう
な感作手法としては、担体にこれらを吸着させる手法及
び化学的に結合させる手法のいずれの手法も利用するこ
とができ、本発明に於て、完全抗原感作担体もしくけモ
ノクロナル抗体感作担体と称するのは、これらの任意の
手法を適宜に選択利用して担体に完全抗原もしくにモノ
クロナル抗体を相持させたすべての感作担体を意味する
。

以下、その数態様ｅζついて更に詳しく説明する。

完全抗原及びモノクロナル抗体感作担体の調製態様ニー 完全抗原捷たはモノクロナル抗体を吸着により担体に感
作するには、完全抗原またはモノクロナル抗体？溶液と
担体の懸濁液を混合することＶＣより、容易に完全抗原
感作担体めるいはモノクロナル抗体感作担体を得ること
ができる。

完全抗原及び抗体は多くの場合カルボキシル基と第１級
アミン基の双方を有する。抗原またはモノクロナル抗体
を化学的Ｖこ担体に結合させるには、例えば前記官能基
を有する反応性高分子ラテックスと完全抗原又はモノク
ロナル抗体をカルがジイミド法、カルボニルソイミダゾ
ール法、混合酸無水吻法、活性エステル法などの一つを
適宜選択して用い、結合することＶＣより完全抗原感作
担体あるいはモノクロナル抗体感作担体を得ることがで
きる。

また赤血球を担体として用い、完全抗原又はモノクロナ
ル抗体を感作するには、例えば赤血球をホルマリン、グ
ルタルアルデヒド又はピルビンアルデヒド等の適切なも
ので固定化した固定赤血球を用い、必要に応じタンニン
酸あるいはビスジアゾベンヅノン（ＢＤＢ）やグルタル
アルデヒド等の縮合剤を用いて感作させ、完全抗原感作
血球あるいはモノクワナル抗体感作血球を得ることがで
きる。

たとえば上述のようにして調製できる（（資）完全抗原
感作担体と（ハ）上記抗原に対する単一種のモノクロナ
ル抗体感作担体の組み合わせから成る本発明の免疫化学
的」り定試薬としては、下記の如き測定試薬を例１示す
ることができる。

ｌ）Ａ：前立腺性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）感作
ラテツクスと Ｂ：抗ＣＡモノクロナル抗体感作ラテックス よりなる免疫化学的測定試薬、 ２）Ａ：α−フェトプロティン（Ａ　Ｆ　Ｐ）　＠作う
テックスと Ｂ：抗ＡＦＰモノクロナル抗体感作ラテックスよりなる
免疫化学的測定試薬、 ３）Ａ：ヒト胎盤催乳ホルモン（ｈＰＬ）感作ラテツク
スと Ｂ：抗ｈＰＬモノクロナル抗体感作ラテックスよりなる
免疫化学的測定試薬、 ４）Ａ：ヒト胎螢性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）感作ラ
テツクスと Ｂ：抗ＣＥモノクロナル抗体感作ラテックスよりなる免
疫化学的測定試薬、 ５）Ａ：ヒト生長ホルモン（ｈＧＨ）感作ラテツクスと Ｂ：抗ｈＧＨモノクロナル抗体感作ラテックスよりなる
免疫化学的測定試薬、 ６）Ａ：ガン胎児性抗ＪＪＮ　（ＣＥ　Ａ　）感作ラテ
ツクスと Ｂ：抗ＣＥＡモノクロナル抗体感作ラテックスよりなる
免疫化学的測定試薬、 ７）Ａ：フィブリン・フイブリノグン分解産物（ＦＤＰ
）感作ラテツクスと、 Ｂ：抗Ｆ’　Ｄ　Ｐモノクロナル抗体感作ラテックスよ
りなる免疫化学的測定試薬、 ８）Ａ：抗トロンビン■（Ａ’ｒＩ［ｌ）感作ラテツク
スと Ｂ：抗ＡＴＩモノクロナル抗体感作ラテックスよりなる
免疫化学的測定試薬、 ９）Ａ：ＰＡＰ感作赤血球と Ｂ：抗ＰＡＰモノクロナル抗体感作赤血球よりなる免疫
１ヒ学的測定試薬、 ｌＯ）／ｊ：ＡＦＰ感作赤血球と Ｂ：抗ＡＦＰモノクロナル抗体感作赤血球よりなる免疫
化学的測定試薬、 １１）ＡｓｈＣＧ感作赤血球と Ｂ：抗り、ＣＧモノクロナル抗体感作赤血球よりなる免
疫化学的測定試薬、 １２）Ａ：　ＡＦＰ感作血球と よりなる免疫化学的測定試薬 等々を挙げることができるが、本発明の試薬は上記に掲
げる具体例の例示に限定されるものではない。

本発明によれば、上述の如き新しいタイプの測定試薬を
利用した完全抗原の新しい夕、イブの免疫化学的測定方
法が提供できる。この測定方法によれば、（４）完全抗
原感作担体及び（Ｂ）上記抗原に対する単一種のモノク
ロナル抗体感作担体の組み合わせを用い、被検体中の該
抗原による上記（４）及び（７１？１両試薬成分の凝集
を阻止する凝集阻止反応を測定することにより、上記抗
原を免疫化学的に測定することができる。測定は、被検
体中の抗原の存在を測定検出する定性的な測定及び被検
陣中の抗原の濃度を測定検出する定量的な測定のいずれ
の態様ＶＣよっても行なうことができる。被検体の例と
しては、尿、血清、血漿、羊水などの如き体液もしくは
体液成分を例示することかでさる。以下、本発明の免疫
化学的測定方法ｔ（ついてｋに詳しく説明する。

血液、尿その他の本液中に存在する微紋＊質は前記試薬
を用いて＃Ｉ！集阻止反応に、Ｊニジ定量することがで
きる。具体的な測定法は実施製として示したが、一般的
な測定法は次に述べる通りでるる。

ｇ理的Ｖ（は完全抗原感作担体とモノクロナル抗体感作
担体の凝集反応系を用いた凝集１ｓＵ止反応でりる。す
なわち、（１）例えば、清浄なスジイド板上ＩＩ（１を
所の試験検体（適宜希釈）を置き、その上に１滴の前記
モノクロナル抗体感作ラテックスを滴下し、次いで完全
抗原感作ラテツクス１滴を滴下した後、三者を混合し、
２分間揺動することにより、試験の結果が城祭さオＬ１
凝集像を陰性、凝集阻止像（非凝集１象）を陽性と’ｔ
’ｌＪ足する。

（２）清浄な丸底試験管に検体（適宜希釈）の一定量を
入れ、これにモノクロナル抗体感作血球懸濁液の一定量
を加えて振盪混ヤ後、抗原感作血球懸濁液の一定量を加
えて振盪混セし、ミラー付スタンドに静置し、２時間後
に管底像を観察する。この場合、凝集阻止像（陽性像）
は沈降リングを形成し、凝集像（陰性像）はマット状を
、呈する。

検体中の抗原濃度は、検体を適宜希釈して試験を行い、
陽性像を呈する最高希釈倍数に測定感層を乗することに
より求めることができる。

本発明の（，４）完全抗原感作担体及び（的上記抗原に
対する単一種のモノクロナル抗体感作担体の組み合わせ
からなる該抗原の免疫化学的測定試薬及びこれを用いた
該抗原の免疫化学的測定方法によれば、モノクロナル抗
体利用の従来技術においては、単一種のモノクロナル抗
体の利用によっては対応抗原と結合して沈殿物を生成し
ないので二以上複数種の異種モノクロナル抗体の使用が
必須であったにも拘わらず、全く意外なことに、上記（
Ａ）及び０両試薬の間ＶＣは満足すべき凝集反応が生ず
る。

斯くて、本発明に−よれば、抗原分子中の一つの特定部
位を特異的に認識する能力を１するモノクロナル抗体の
単一種と抗原との組与合わせｐｃよる凝集反応であるた
め、顕著に高い特異性が達成できる特色がある。四に、
上記（／１）及び＠両試薬の間の凝集反応で形成される
凝集像は、予想外なことにも、従来のポリクロナル抗体
を用いたものよりも強い凝集性を示す鮮明な凝集像とな
る特色がある。

又釘に、モノクロナル抗体利用の従来技術においては、
二以上の’１４種モノクロナル抗体を使用してもなお、
全く効果的でないことさえあるというトラブルがめった
にも拘わらず、本発明によればそのようなトラブルから
解放され、広汎な任ムの抗原の免疫学的測定方法に適用
可能となる特色を有する。

本発明によれば、上述の如き特色を持ったモノクロナル
抗体利用の新しいタイプの免疫化学的測定試薬及び測定
方法が提供でき、顕著に優れた確実性、信頼度、精度、
感度及び顕著に高い特異性をもって、偽反応生起のトラ
ブルを伴うことなしに、優れた再現性、安定性で且つ容
易な操作で、短時間に被検体中の微量の抗原を免疫化学
的に測定することができる。

実施例１　前立腺性酸性フォスファターゼ（７’、４７
’）の測定（１） （α）ＰＡＰ感作ラテックスの製造 ＰＡＰｓ　ｏμ２を５ｒｎｌのグリシン緩衝化食塩液（
ｐＨ８，２）に溶解し、これに１０％ポリスチレンラテ
ックス１ｒｎｌを加えて混合し、室温で２時間処理した
。次いで遠心分離し、得られた沈殿をグリシン緩衝化食
塩液にて遠心洗浄し、沈殿を０．０５％ＶｃＢＳＡ（ウ
シ血清アルブミン）を含むグリシン緩衝化食塩液１０ｍ
１にｊｌ―濁し、ＰＡＰ感作ポリスチレンラテックスを
製造した。

（６）　　抗ＰＡＰモノクロナル抗体感作ラテックスの
製造 抗ＰＡＰモノクロナル抗体０．２■を５−のグリシン緩
衝化食塩液（ｐＨ８，２）に溶ＩＩ＋”＃　Ｌ、これに
ｌθ％ポリスチレンラテックスｌ−を加えて混合し、５
６℃で３０分間処理した。次いで遠心分離して得た沈殿
をグリノン緩衝化食塩液にて一雄心洗浄し、沈殿を０．
０５％１′（ＢＳＡを含むグリシン緩衝住良塩液２０屑
ｅにて懸濁≧せ、抗ＰＡＰモノクロナル抗体感作、７１
Ｊスチレンラテツクスを製造した。

（ｃ）ＰＡＰの測定 前立腺癌患者血清５検体および吟常人血清３検体につい
て原血清及びグリシン緩衝化食塩液（ｐＨ＆２）で５．
１０．２０．４０及び８０倍に希釈し、各希釈検体の１
滴（０，０３ｄ）を反応スライド板上に滴下し、これし
こ（ので製造した抗ＰＡＰモノクロナル抗体感作ラテッ
クスを各１滴ずつ滴下し、次いで（Ｃ）で製造したＰＡ
Ｐ感作ラテックスを各１滴ずつ滴下する。この三者を均
一に混合し、２分間揺動後、肉眼で凝集像、凝集阻止像
を観察した。尚、本賽施例においてはその試薬の感度を
ＬＯ？１１／ｒｎ１．に調整しであるので各検体のＰＡ
Ｐ濃度は第１表に示す値であった。

第１表 実施例２　　ＰＡＰの測定（ＩＩ） （ａ）ＰＡＰ感作血球の製造 ホルマリン固定羊血球の４％懸濁液（リン酸緩衝１ヒ食
塩液、ｐＨ６，４）に等量の０．０１％タンニン酸溶液
を加えて５６℃３０分反応させた後、リン酸緩衝化食塩
液にて血球を洗飴し、８％懸濁液とした。次いでＰＡＰ
ｏ、００５％溶液を等量加え、３７℃１時間反応させた
。反応終了後、リン酸緩衝化食塩液にて血球を遠心洗浄
し、０．２％にＮＲ８（正常ウサギ血清）、５％に乳抛
を含むリン酸緩衝化食塩液にて０．７５％血球＃度に希
釈し、０．１ｍｌずつ分注した後、凍結乾燥してＰＡＰ
感作血球を製造した。

（ｂ）　　抗ＰＡＰモノクロナル抗体感作血球の製造ホ
ルマリン固定羊血球の４％懸濁液（リン酸緩衝化食塩液
、ｐＨ６，４）に等量の０．０１％タンニン酸溶液を加
えて、５６℃３０分反応させた後、リン酸緩衝化食塩液
ＶＣて血球を洗浄して８％懸濁液とした。次、いで抗Ｐ
ＡＰモノクロナル抗体の０、００１％溶液を等量加え５
６℃で２時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝化食
塩液にて血球を遠心洗浄し、０，２％にＮＲ８，５％に
乳糖を含むリン酸緩衝化食塩液にて０．７５％血球濃度
に希釈し、０．１縁ずつ分注し、次いで凍結乾燥して抗
ＰＡＰモノクロナル抗体感作血球を製造した。

（ｃ）ＰＡＰの測定 前立腺癌患者血清及び健常人血清について、それぞれを
リン酸緩衝化食塩液で５．２５．５０．１００．２００
．４００倍に希釈し、各希釈検体を丸底小試験管に０．
１ｙ＋／！すつ分注し、次いで、上記（ｂ）で製造しに
１抗ＰＡＰモノクロナル抗体感作血球１アンブルをリン
酸緩衝化食塩液Ｑ、　２　ｍｅで旧′濁させた全量を、
それぞれｌ／（添加し、混合した後、前記（α）で５々
造したＰＡＰ感作血球１アングルをリン酸緩衝化食塩ｉ
　０．２　ｍで懸濁させた全量をそれぞれに添加してよ
く攪拌し、ミラー付スタンドに静置し、２時間後の管底
像により判定した。本実施例では測定感ＩＦを２ｎａ／
ｍｅｖｃ調整しであるので、各検体のＰＡＰ濃度は第２
表ＶＣ示す値であった。

判定基準　−二明瞭な凝集像（マット状）十二完全な凝
集阻止像（リング形成） 実施例３　ヒト絨毛性ゴナドトロピン（−ｈＣＧ）の測
定 （ａ）　　抗ｈＣＧモノクロナル抗体感作ラテックスの
製造 抗ｈＣＧモノクロナル抗体を用い、実施例１−（６）と
同様ＶＣして、抗ｈＣＧモノクロナル抗体感作ラテック
スを製造した。

（６）　　ｈＣＧ感作ラテックスの製造ｈＣＧ　（比活
性９６ｏ　ｏ　ＩＵ／ｐＫＩ）　１　ｏＯμ２゛を５−
の梢製氷に溶解した。該溶液にカルボキシモディファイ
ドラテックスのｌＯ％＋’＋Ｙｒ　Ｍ液１　ｍｌを加え
て混合し、次いで１０■の１−エチル−３（３−ヅメチ
ルアミノグロビル）カルボソイミド・ハイドロクロライ
ドを／ＪＯえ、桔拌下に一夜反応を行った。反応終了後
、遠心分離して得た沈殿をグリシン緩衝化食塩液で洗浄
し、沈殿を０゜１％にＢＳＡを含むグリシン緩衝化食塩
液１０−で懸γ蜀させ、５６℃で３０分間反応させた。

反応後、遠心分離して得た沈殿をグリシン緩衝化食塩液
で洗浄し、同緩衝液１０ｍｇ１’こ懸濁させてｈＣＧ感
作ラテックスを製造した。

（ｃ）ｈＣＧの測定 妊婦尿５検体及び正常婦人尿３検体＆ｊついて、前記（
α）で製造した抗ｈＣＧモノクロナル抗体感作ラテック
スと上６己（ｂ）で？ｐＵ　ｉ告したｈ　ＣＧ　ノ永作
うテツ。

クスとを用いて実が６例１−（ｃ）と同様な操作により
、ｈＣＧを測定した。

尚、この実施例で用いた試薬の感度をｏ、　ｓ　Ｉ　Ｕ
／−に叫整して）るので、各検体のｈＣＧ濃度は第３表
に示す値であった。

第・３表 判定基準　−二明瞭な凝集像 ＋：完全な凝集阻止像 実施例４　ヒト胎盤性ラクトケ゛ン（ｈＰＬ）の測定 （（１）　　抗ｈＰＬモノクロナル抗体感作ラテックス
の製造 抗ｈＰＬモノクロナル抗体を用い、実施例１−（ｂ）と
同様な方法で抗ｈＰＬモノクロナル抗体感作ラテックス
を製造した。

（ｂ）ｈＰＬ感作ラテックスの製造 実施例１−（ａ）と同様な方法で、ｈ、ＰＬ感作ラテッ
クスを製造した。

（ｃ）ｈＰＬの測定 妊婦血清５検体及び対照として正常婦人血清３検体につ
いて、前記（ａ）で製造した抗ｈＰＬモノクロナル抗体
感作ラテックスと上記（ｂ）で製造したｈＰＬ感作ラテ
ックスとを用いて、実施ｙＨ−（ｃ）と同様な操作によ
り、検体中のｈＰＬを測定した。

尚、本実施例においては試薬の感度を０．１μｔ／　ｄ
　Ｖ（調整しであるので、各検体の、ｈＰＬ濃度は第４
表に示す値であった。

第　　　４　　　表 判定基準　−二明瞭な凝集像 ＋：完全な凝集阻１ヒ像 参考例 上記実施例で用いるモノクロナル抗体は例えば次の様な
操作により製造することができる。

（（１）　　精製ＰＡＰの製造 ヒト精漿２００−から硫酸アンモニウムによる塩析（４
０％上清、７５％沈殿）によりＰＡＰ粗抽出物６．７５
　ｇを得た。これをｐ−セルロースクロマトグラフィー
（λ７ｘ１９ｃｍ）に付し、次いで未吸着分画を濃縮し
、０．１　Ｍ酢酸緩衝液（１？ＦＬＭＣａＣ１，、ＭＱ
Ｃｌ、、ＭｎＣｌ２．０．ｔＭ　ＮａＣ１゜ｐＨｓ、ｏ
）で透析後、上記緩衝液で平、衡化したコンカナバリン
Ａ−セファロースカラム（２Ｘ４５ｃ１ｎ）に付した後
、４℃で一晩インキユベートした。

次いで上記緩衝液で蛋白質の流出がなくなる棟で洗浄し
、α−メチル−Ｄ−マンノシドのグラノユエントクロマ
トグラフイ−（０，１Ｍ→ｏ、　ｓ　Ｍ　）　ヲ行い、
酵素活性を有する分画を集め濃縮した。次いで゛同画分
を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化した
ＤＥＡＥ−セルロースカラム（３×４０　ｔ：ｍ　）に
付し、同緩衝液で蛋白質の流出がなくなるまで洗浄後、
０．０２．Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）及び０．５Ｍ
ＮａＣ１含有０．０２　Ｍす７＃緩衝液（ｐＨ６，０）
を用いてグラソユエントクロマトグラフイーを行い、酵
素活性分画を集め濃縮した。

次いで、ｏ、ｏ２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，ｏ）で平
衡化したセファクリルＳ−２ｏ　ｏ・ｌ　２．６Ｘ８４
ｃｒｎ）及びセファデックスＧ−１００（Ｚ６Ｘ８’８
ｃｒｎ）によるグルｐ過で￥Ｗ製して、精製ＰＡＰ１２
８Ｉｖを得た。

（ｂ）　　抗ＰＡＰモノクロナル抗体の製造上記（α）
で製造した精製ＰＡＰ５ｏμｍを完全フロインドアソ上
バンドと共にＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウス（６〜８週令）
　ｐｃ　ａ週間おきに皮下投与し、最後に８０μりを静
注した。

最終免疫から３日後にマクスの肝臓を摘出して、帥砒胞
を採取し、デルベコのモディファイド最少基本培地（以
下Ｄ’ＭＥＭと称す）で３回洗浄した後、細胞数を算定
して、その２Ｘ１０Ｂ個をマウスミエローマ細胞Ｐ３−
ＮＳ−１／１−ＡＵ　４・１（以下ＮＳ〜１と称す）Ｉ
ＸＩＯ７個と混合して遠心し細胞を集めた。このペレッ
トに３７℃に温めて？いたポクエチレングリコール溶液
（ＰＥＧ−ｌ　ＯＯ：　４．２５％、ＤＭＳＯ：１．５
％含育ＤりＭＥＭ）を１　ｍｅ加え、１分間遠心管をゆ
っくり回転させて細胞融合を行った。３７″ＣのＤ／Ｍ
ＥＭを３０秒ごとに２　ｍｅずつ１０回加えたのち遠心
分離し、ペレットを２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−
１６４０培地でＭＳ−１として５Ｘ１０’個１０．２ｄ
となるように）胡濁し、９６ウエルマイクロプレート［
０，２−ずつ分注し、５％ＣＯ２培養器で培養した。２
４時間後各ウェルの上清の半量をすて、ＨＡＴ培地（ヒ
ボキサンチン・アミノグチリン・チミジン、１０％ウシ
胎児血清含有ＲＰＭ７−４６４０培地）を０．１−加え
、その後３〜４日ごとに半量をＨＡＴ培地交換を行いな
がら２週間培養したのち、増殖したウェル中の培養上清
の抗体活性を測定した。

活性の認められたウェルの細胞をＢＡＬＢ／Ｃマウス胸
腺細胞を含む１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ　−１６
４０培地で希釈し、限界希釈法によりクローニングを行
って１２株の抗モノクロナル抗体産生融合細胞を得た。

これを大量培養し、その培養上清からＰＡＰを結合させ
たセファロース４Ｂを用いたアフィニティークロマトグ
ラフィーに付し、モノクロナル抗体を得た。筐た２Ｘ１
０’個以上の細胞をプリスタン０．５　ｄを予め投与し
たＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスに腹腔内投与し、腹水腫瘍
を作せて腹水を得たのち、この１敗水をＰＡＰを結合さ
せたセファロース４Ｂを用いたアフィニティークロマト
グラフィーによりモノクロナル抗体を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（４完全抗原感作担体及び （匂　上記抗原ＶＣ対する単一種のモノクロナル抗ｉ４
   −感作祖体 を用い、被埃体中の該抗原による上記（，４）及び（句
   両試薬成分の凝集ｌ５１４止反応をｄｌす定することを
   特徴とする上記抗原の免疫イし学的測定方法。 ２　（４完全抗原感作担体及び （偽　上記抗原しζ対する単−押のモノクロナル抗体感
   作担体 から成ることを４〒徴とする上記抗原の免疫化学的測定
   試薬。