KR101669918B1

KR101669918B1 - 사람 체액 중의 시스타틴 ｃ의 측정방법

Info

Publication number: KR101669918B1
Application number: KR1020117012540A
Authority: KR
Inventors: 신야 나카야마; 히로시 다카하시; 야스시 나카무라; 토모 시미즈
Original assignee: 세키스이 메디칼 가부시키가이샤
Priority date: 2008-12-04
Filing date: 2009-12-03
Publication date: 2016-10-27
Also published as: EP2357475A1; CN102227639B; EP2357475B1; CN102227639A; WO2010064435A1; WO2010064435A8; US8802446B2; US20110236996A1; EP2357475A4; CA2745610A1; CA2745610C; JPWO2010064435A1; KR20110111370A; JP5554247B2

Abstract

특이성이 낮은 폴리클로날 항체나, 특이성은 높고 응집성이 약한 모노클로날 항체가 대량으로 이용되고 있던 종래의 측정방법에 대해서, 특이성이 높고, 저비용으로 자동화가 용이한 사람 체액 중의 시스타틴 C의 입자 증강 면역 측정방법을 제공한다.
고친화성 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체와, 그것과 인식 부위가 다르고, 상대적으로 친화력이 약한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체를, 불용성 담체 입자에 각각 독립적으로 결합시킨 항체 감작 입자를 조합한 입자 증강 면역 측정방법이며, 각각의 항체 감작 입자 중량에 대한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체의 결합량이, 5중량% 미만인 사람 체액 중의 시스타틴 C 특이적 측정방법.

Description

사람 체액 중의 시스타틴 Ｃ의 측정방법{METHOD FOR MEASURING CYSTATIN C IN HUMAN BODY FLUID}

본 발명은 사람 체액 중의 시스타틴 C의 입자 증강 면역 측정방법 및 입자 증강 면역 측정 시약에 관한 것이다.

시스타틴 C는 분자량 13kDa의 염기성 저분자 단백질(등전점 pH 9.3)로, 전신의 유핵세포에서 끊임없이 산생되며, 환경변화의 영향을 받지 않고, 일정량이 세포 밖으로 분비된다. 이 때문에, 혈중농도가 일정하게 되어 다른 질환에 의한 염증 등의 영향이나 연령, 성별, 운동, 식사 등의 영향을 받지 않는다. 또한, 시스타틴 C는 다른 혈장 단백질과 복합체를 형성하지 않고, 신장 사구체에서 여과되어 근위요세관(近位尿細管)에서 재흡수되기 때문에, 사구체 여과율(GFR)이 저하하면, 혈중농도가 상승하는 것이 알려져 있고, 크레아티닌 대신에 GFR을 나타내는 지표로서 주목받고 있다. 또한, 신장기능검사에 있어서, 조기 신부전의 진단 지표로 되기 때문에, 외래나 건강진단 등의 영역에서도 널리 유용하다.

시스타틴 C의 측정방법으로서는 자동화된 사람 시스타틴 C의 입자 증강 면역 측정방법이 보고되어 있다(비특허문헌 1~3, 특허문헌 1). 예를 들면, 비특허문헌 1 기재의 방법에서는 응집력이 강한 항시스타틴 C 폴리클로날 항체를 담체 입자에 5%의 중량비로 결합시켜 이용하고 있지만, 비특허문헌 4에 나타난 바와 같이, 시스타틴 C에는 구조가 유사한 시스타틴 패밀리군이 존재하고, 각종 사람 체액에 의하여 다르게 국재(局在)하기 때문에, 특이성이 낮은 폴리클로날 항체에서는 사람 체액의 종류(예를 들면, 타액이나 눈물)에 의하여는 정확한 시스타틴 C의 측정값을 얻을 수 없을 가능성이 매우 높다. 한편, 특허문헌 1에 있어서는, 일반적으로는 폴리클로날 항체를 이용한 쪽이 면역 응집체를 형성하기 쉽다는 취지가 기재되어 있다(20페이지 21－27행). 또한, 특이성이 높은 항시스타틴 C 모노클로날 항체의 이용이 시사되고 있지만, 시스타틴 C와 같은 단량체로 저분자량의 단백질을 측정 대상으로 하는 경우는 많은 다른 모노클로날 항체의 칵테일을 이용하여 좋은 결과가 얻어진다는 취지가 기재되어 있고(21페이지 5－10행째), 실질적으로는 폴리클로날 항체가 이용되고 있는 것에 동일하다. 게다가 성능을 향상시키기 위해서는 항체 감작(感作) 입자의 총중량에 대한 항체의 결합량이 5중량%초과~35중량%로 현저하게 대량의 항체를 결합시킬 필요가 있었다.

특허문헌 1: 국제특허 공개 제2007/102054호 팸플릿

비특허문헌 1: CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 40, No. 10, (1994), 1921-1926 비특허문헌 2: KIDNEY INTERNATIONAL, Vol. 47, (1995), 312-318 비특허문헌 3: CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 43, No. 6, (1997), 1016-1022 비특허문헌 4: METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 244, (1994), 685-700

사람 시스타틴 C의 입자 증강 면역 측정방법에서 범용되는 폴리클로날 항체는 특이성이 낮고, 시료의 종류에 의해 시스타틴 C 특이적인 측정을 할 수 없다고 하는 과제가 존재하고 있었다. 그 대책으로서 모노클로날 항체의 이용이 고안되었지만, 응집력이 약하기 때문에, 불용성 담체 입자에 여러 종류의 모노클로날 항체로 이루어진 칵테일을 대량으로 결합시킬 필요가 있어, 방대한 수고와 코스트를 요하는 새로운 과제가 발생하고 있었다. 그러므로, 지금까지 모노클로날 항체만으로 이루어진 사람 체액 중의 시스타틴 C의 입자 증강 면역 측정방법은 실용화되어 있지 않았다. 게다가 종래의 사람 시스타틴 C의 입자 증강 면역 측정방법에서는 실용적인 성능을 얻기 위해서는 항체 감작 입자의 총중량에 대한 결합량이 5중량%초과~35중량%라고 하는 대량의 항체가 필요했다.

따라서, 본 발명은 특이성이 높고, 저비용으로 자동화가 용이한 사람 체액 중의 시스타틴 C의 입자 증강 면역 측정방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여, 예의 연구한 결과, 종래, 시스타틴 C의 측정에는 부적합하다고 생각되고 있던 모노클로날 항체에 있어서도, 고친화성 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체와, 그것과는 인식 부위가 다르고, 상대적으로 친화력이 약한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체를, 항체 감작 입자의 총중량에 대하여 5중량% 미만의 결합량 비율로, 각각 독립적으로 결합시킨 항체 감작 입자를 조합하면, 시스타틴 C 특이적인 입자 증강 면역 측정이 가능한 것을 발견하고, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 고친화성 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체와 인식 부위가 다르고, 상대적으로 친화력이 약한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체를, 불용성 담체 입자에 각각 독립적으로 결합시킨 항체 감작 입자를 조합한 입자 증강 면역 측정방법으로, 각각의 항체 감작 입자의 총중량에 대한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체의 결합량이 5중량% 미만인 사람 체액 중의 시스타틴 C 측정방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 고친화성 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체와, 인식 부위가 다르고, 상대적으로 친화력이 약한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체를, 불용성 담체 입자에 각각 독립적으로 결합시킨 항체 감작 입자의 조합으로, 각각의 항체 감작 입자의 총중량에 대한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체의 결합량이 5중량% 미만인 항체 감작 입자를 함유하는 사람 체액 중의 시스타틴 C 특이적인 입자 증강 면역 측정 시약을 제공하는 것이다.

본 발명에 의해, 종래보다 특이성이 높고, 저비용으로 자동분석장치로의 적응이 용이한 사람 체액 중의 시스타틴 C의 입자 증강 면역 측정방법 및 시약을 제공하는 것이 가능해졌다.

도 1은 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 a, b, d를 각각 입자지름 0.13㎛, 0.30㎛의 라텍스 입자에 결합한 항체 감작 라텍스 입자를, a－b, a－d, b－d와 동일 입자지름끼리를 조합하고, 시스타틴 C를 측정했을 때의 입자 증강 면역 응집에 수반하는 감도를 나타낸 시스타틴 C 농도-감도 곡선이다.
도 2는 ELISA법으로 확인한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 및 대조로 한 항사람 시스타틴 C 폴리클로날 항체의 특이성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명 시약과 대조시약의 시스타틴 C 측정 상관도(샘플 수 N=50)이다.
도 4는 본 발명 시약과 대조시약의 검출한계농도를 나타낸 그래프이다.

본 발명에서 사용하는 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체는 2종 이상이며, 사람 시스타틴 C와 특이적으로 반응하고, 고친화성의 모노클로날 항체 및 인식 부위가 다르며, 상대적으로 친화력이 약한 모노클로날 항체, 각 1종 이상을 포함한다. 또, 상기 항체에는 기능 부위를 포함하는 항체 단편(즉, 사람 시스타틴 C 인식부위인 Fab를 포함하는 항체 단편)이나, 재조합형 항체(즉, Fab 이외의 구조를 재조합한 항체)도 포함한다.

상기 고친화성 모노클로날 항체를 획득하는 방법은 특히 한정되지 않지만, 면역부위나 융합세포의 선택, 면역하는 사람 시스타틴 C의 증량, 면역 기간의 연장 등이 고친화성 항체를 얻는데 효과적이다. 여기서 사람 시스타틴 C와 특이적으로 반응한다는 것은 사람 시스타틴 C와는 항원항체 반응을 일으키지만, 그 외의 시스타틴 패밀리(예를 들면 사람 시스타틴 A, 시스타틴 B, 시스타틴 D, 시스타틴 E/M, 시스타틴 F, 시스타틴 S, 시스타틴 SA, 키니노겐 등)와는 실질적으로 항원 항체 반응을 일으키지 않는 것을 말한다.

본 발명에서 사용하는 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 가운데, 고친화성 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체는 예를 들면, 「상품명: 비아코어(BIAcore(등록상표)) GE헬스케어사제」 장치에서의 역가 측정에 의한 산출에서 해리정수(kd값)가 1nM 미만, 바람직하게는 0.5nM 이하이다. 또, 비아코어 장치에 의한 해석에서는 일반적인 친화력의 모노클로날 항체의 해리정수는 1nM 이상이다. 해리정수의 확인 방법으로서는 당해 분야에서 공지의 통상 사용되는 방법이면 특히 한정되지 않지만, 측정 원리나 측정조건에 의해 약간, 해리정수가 변동할 가능성이 있다.

이러한 고친화성 모노클로날 항체의 예로서는 후기 실시예에 나타내는 하이브리도머 75202(FERM　BP－11186)가 산생하는 모노클로날 항체를 들 수 있다.

본 발명에 있어서는 상기 고친화성 모노클로날 항체를 적어도 1종 사용하면, 다른 상대적으로 친화력이 약한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체는 일반적인 친화력이어도 좋다. 그러한 조합 중에서도, 상대적으로 친화력이 약한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체의 해리정수를 고친화성 모노클로날 항체의 해리정수로 나눈 비가 2 이상의 것이 바람직하다. 이러한 모노클로날 항체는 통상의 방법에 따라서 제조할 수가 있다. 또한, 친화력(해리정수의 상대비)에 2배 이상의 차이가 있으면, 해리정수가 1nM 미만의 고친화성 모노클로날 항체끼리 조합하여 사용할 수도 있다.

또, 본 발명에서 사용하는 2종 이상의 모노클로날 항체는 각각의 모노클로날 항체가 사람 시스타틴 C가 다른 부위를 인식하는 모노클로날 항체의 조합이다. 당해 인식 부위가 다른 것은 예를 들면, 샌드위치 ELISA법 등에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 입자 증강 면역 측정방법 및 시약에 있어서, 불용성 담체 입자로서 이용되는 소재는 검사 시약의 성분으로서 이용 가능한 물질이면 특히 제한은 없지만, 구체적으로는 라텍스, 금속 콜로이드, 실리카, 카본 등을 들 수 있다. 불용성 담체 입자의 사이즈는 본 발명의 입자 증강 면역 측정방법 및 시약의 검출원리에 따라 0.05~0.5㎛까지 적당히 선택할 수 있지만, 자동분석장치에 있어서의 광학적 측정에 있어서는 평균 입자지름 0.1~0.4㎛가 범용되고 있고, 바람직하게는 0.1~0.2㎛이다. 불용성 담체 입자의 평균 입자지름은 입도 분포합계나 전자현미경상 등으로 확인할 수가 있다.

본 발명의 모노클로날 항체의 조합에 의해, 각각의 항체 감작 입자의 총중량에 대한 항체의 결합량이 5중량% 미만이어도 사람 시스타틴 C의 측정이 가능하고, 항체량은 1중량% 이상 4중량% 미만이 바람직하다.

불용성 담체 입자로의 모노클로날 항체의 결합(감작)은 예를 들면 물리 흡착법이나 화학 결합법의 통상의 방법에 의해 수행할 수가 있다.

본 발명의 입자 증강 면역 측정방법과 시약 및 키트에 있어서의 측정대상 시료는 각종 사람 체액에 있어서 사람 시스타틴 C를 함유하는 시료이면 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 혈청, 혈장, 활액(滑液), 젖, 타액, 뇌척수액, 정장(精漿), 양수(羊水), 뇨, 눈물 등의 사람 체액이다.

본 발명의 입자 증강 면역 측정방법과 시약 및 키트는 히타치사제를 비롯하여 토시바사제, 니뽄덴시사제, 올림푸스사제, 세키스이메디컬사제의 범용 자동분석장치나 근적외를 측정파장으로 한 전용 자동분석장치 LPIA(등록상표)(Mitsubishi Gagaku Iatron, Inc.)에 있어서의 탁도법, 산란광 강도를 측정하는 장치(DADE　BEHRING사제)에 있어서의 네페로메트리법으로의 적용이 가능하기 때문에, 자동화가 용이하다.

본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정 시약은 주성분 외에, 시료의 이온 강도나 침투압 등을 완충하는 성분으로서 예를 들면, 아세트산, 시트르산, 인산, 트리스, 글리신, 붕산, 탄산 및 굿 완충액이나, 그들의 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등을 포함해도 좋다. 또, 면역학적 응집을 증강시키는 성분으로서 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 인지질 폴리머 등의 고분자를 포함해도 좋다. 또, 면역학적 응집의 형성을 컨트롤하는 성분으로서 단백질, 아미노산, 당류, 금속염류, 계면활성제류, 환원성 물질이나 캐이오트로픽(chaotropic) 물질 등 입자 증강 면역 응집 측정에서 범용되는 성분을 1종류, 또는 복수의 성분을 조합하여 포함해도 좋다. 게다가 이들 성분을 조합한 키트로 해도 좋다.

본 발명의 사람 시스타틴 C의 입자 증강 면역 측정방법 및 입자 증강 면역 측정 시약 및 키트는 시료 중의 사람 시스타틴 C를 고정밀도이고도 특이적으로 측정하는 용도이면 어느 것에도 적용할 수 있다.

[실시예]

이하, 제작예, 평가예 및 실시예를 들어 본 발명의 일부를 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

[제작예]

고친화성 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체의 제작

정제된 사람 시스타틴 C(SCIPAC사) 100㎍을 1회 면역으로 사용했다. 첫회 면역은 사람 시스타틴 C와 프로인트 완전 어주번트를 등량 혼합하여 조제한 에멀젼 200㎕를 이용하고, 이것을 BALB/c마우스의 복강에 주사했다. 추가 면역에는 프로인트 불완전 어주번트를 사용하여 동일하게 조제한 에멀젼 200㎕를 이용하고, 고친화성 항체를 획득하기 위해 2주간 간격으로 6회 추가 면역을 반복하는 장기 면역을 행했다. 마우스 안저 정맥으로부터 채혈한 혈액 중의 항체가를 ELISA법으로 측정하여, 항체가가 높은 마우스를 선택하여 세포 융합에 제공했다. 7번째의 면역으로부터 2주간 후에, 사람 시스타틴 C 100㎍을 생리 식염액 200㎕에 용해한 것을 마우스 복강에 주사하고, 3일 후에 비장을 적출했다. 비장을 rpmI1640 배지 중에 용해한 후, 1500rpm에서 원심분리하여 비장 세포를 회수했다. 이것을 소 태아 혈청이 없는 rpmI1640 배지에서 3회 이상 세정한 후, 15% 소 태아 혈청을 포함한 rpmI1640 배지 2㎖를 첨가하여 현탁하고, 이를 비장세포 현탁액으로 했다. 비장세포와 미에로마세포 SP2/0－AG14를 6대 1의 비율로 혼합한 후, 50% 폴리에틸렌글리콜 존재하에서 세포 융합시켜, 하이브리도머(융합세포)를 얻었다. 1500rpm의 원심분리에서 침전부를 모아 GKN액(글루코오스 2g, 염화칼륨 0.4g, 염화나트륨 8g, 인산 수소2나트륨 1.41g 및 인산2수소나트륨2수화물 0.78g을 정제수에 용해하여 1리터로 한 것)에 현탁, 원심분리하여 세정한 후, 침전부를 회수했다. 이것을 15% 소태아 혈청을 포함한 rpmI1640 배지 30㎖에 현탁한 것을 1웰당 100㎕ 및 피더 세포로서 BALB/c마우스의 흉선 세포를 2.5×10⁶개/㎖ 포함한 HAT 배지를 1웰당 200㎕씩 96웰 마이크로플레이트 3매에 각각 분주하고, 37℃에서 5% 탄산가스 배양기 중에서 하이브리도머를 배양했다.

배양상청 중의 항사람 시스타틴 C항체의 존재를, 사람 시스타틴 C를 고상화한 ELISA법으로 확인하고, 10일 후에 모든 웰에서 하이브리도머의 증식을 확인했다. 상세하게는 10㎍/㎖의 사람 시스타틴 C 및 150mM 염화나트륨을 포함한 10mM 인산 완충액(pH 7.2; 이하, PBS라고 약칭한다) 100㎕를 상기 하이브리도머의 증식이 확인된 96웰 마이크로플레이트에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 방치했다. 이어서, 96웰 마이크로플레이트를 0.05% Tween20 및 1% 소혈청알부민(이하, BSA)을 포함한 PBS 300㎕로 3회 세정한 후, 각 웰의 배양 상청을 50㎕/웰 첨가하여, 실온에서 1시간 방치했다. 그 후, 이 플레이트를 0.05% Tween20을 포함한 PBS로 3회 세정한 후, 페록시다아제 표지 항마우스 항체(세키스이메디컬주식회사제)를 50㎕/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 방치했다. 그 후, 이 플레이트를 0.05% Tween20을 포함한 PBS로 3회 세정 후, 0.2% 오르토페닐렌디아민 및 0.02% 과산화수소를 포함한 시트르산 완충액(pH 5) 50㎕/웰을 첨가하고, 실온에서 15분간 방치한 후, 4.5N 황산 50㎕/웰을 첨가하여 반응을 정지시키고, 각 웰의 파장 492nm에 있어서의 흡광도를 측정하여, 흡광도가 높은 웰을 양성 웰로서 선택했다.

단클론화는 한계 희석법으로 행하였다. 즉, 피더세포로서 BALB/c마우스의 흉선세포를 1웰당 10⁶개씩 분주한 96웰 마이크로플레이트에, 상기 양성 웰 중의 하이브리도머를 10개/㎖가 되도록 희석한 것을 0.1㎖씩 분주했다. 배지는, 첫회는 HT배지를, 2번째 이후는 15% 소태아 혈청을 포함한 RPMI1640 배지를 이용하고, 37℃에서 5% 탄산가스 배양기 중에서 10일간 배양했다. ELISA법에 의한 양성 웰의 선택 및 한계 희석법에 의한 단클론화 조작을 각 3회 반복하여, 반응성이 높은 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 산생 하이브리도머를 얻었다. 각 하이브리도머의 약 10⁵개를 프리스탄 전처리한 마우스 복강에 투여하여, 생성된 복수를 각각 채취했다. 채취한 각 복수로부터 원심분리에 의해 불용물을 제거하고, 등량의 포화 황산암모늄액을 첨가하고, 교반하면서 하룻밤 방치한 후, 원심분리하여 침전을 회수했다. 회수한 침전을 20mM 트리스 완충액(pH 8)에 용해하고, 동일 완충액으로 투석했다. 투석 내용물 각각을 동일 완충액으로 평형화한 DEAE－세파로오스 컬럼에 별개로 흡착시킨 후, 각각 동일 완충액 중의 염화나트륨 0~300mM의 농도 구배로 용출시켜, 각종 정제 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체를 얻었다.

[평가예 1]

인식 부위가 다른 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체의 선택

샌드위치 ELISA법에 있어서의 반응성을 지표로서 제작한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 간에 인식 부위가 다른 조합의 탐색을 행했다. 구체적으로는 각 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체를 각 1㎍/㎖를 함유하는 PBS 50㎕/웰 가하고, 실온에서 2시간 정치하여 플레이트에 고상화한 후, 0.05% Tween20를 포함한 PBS 300㎕로 3회 세정하고, 0.05% Tween20 및 1% BSA를 함유하는 PBS 300㎕/웰 가하고, 실온에서 1시간 정치했다. 그런 다음, 0.05% Tween20를 함유하는 PBS로 3회 세정한 후, 10ng/㎖ 사람 시스타틴 C를 함유하는 PBS 50㎕/웰 가하고, 실온에서 1시간 정치하여 반응시켜, 0.05% Tween20를 함유하는 PBS로 3회 세정한 후, 검출용으로 비오틴화한 각 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 1㎍/㎖를 함유하는 PBS 50㎕/웰 가하고, 실온에서 1시간 정치했다. 0.05% Tween20를 포함한 PBS로 3회 세정 후, 5000배에 희석한 페록시다아제 표지 스트렙티아비딘(ZYMED사)을 50㎕/웰 가하고, 실온에서 1시간 정치하고, 당해 플레이트를 0.05% Tween20를 함유하는 PBS로 3회 세정한 후, 0.2% 오르토페닐렌디아민 및 0.02% 과산화수소를 함유하는 시트르산 완충액(pH 5) 50㎕/웰을 가하고, 실온에서 15분간 반응 후, 4.5N 황산 50㎕/웰을 가하여 반응을 정지시키고, 각 웰의 파장 492nm에 있어서의 흡광도를 측정하고, 반응성이 인정된 조합을 인식 부위가 다른 모노클로날 항체로 했다. 그 결과, 4종류의 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 a~d에 있어서 표 1에 나타낸 바와 같은 조합이 가능한 것을 확인했다.

[표 1]

항체 a에 관해서는 b~d 어느 항체와도 조합이 가능한 것을 확인했다. 또 항체 c에 관해서는 고상화한 상태에서는 조합하는 항체에 관련되지 않고 반응성을 나타내지 않게 되는 것으로부터 불용성 담체로의 결합, 즉 고상화가 필요한 입자 증강 면역 측정방법에서의 이용은 불가능한 것으로 생각되었다.

[평가예 2]

인식부위가 다른 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 조합에 있어서의 입자 증강 면역 응집의 확인

항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 a, b, d를 각각 독립하여 소량 결합시킨 항체 감작 라텍스 입자를 조제하고, 인식부위가 다른 조합으로 사람 시스타틴 C 농도 의존적인 입자 증강 면역 응집의 형성을 확인했다.

(항체 감작 라텍스 입자의 조제)

평균 입경 0.13㎛ 또는 0.3㎛(세키스이메디컬사제)의 0.5% 라텍스 용액(30mM　Tris－HCl,　pH 8.5~9.0)에, 0.2mg/㎖의 각 시스타틴 C 모노클로날 항체 용액(30mM　Tris－HCl,　pH 8.5~9.0)을 등량 첨가하고, 4℃에서 1시간 교반한 후, 등량의 1% BSA용액(30mM　Tris－HCl,　pH 8.5~9.0)을 가하고, 4℃에서 30분간 교반하고, 원심하여 상청을 제거한 후, 침전을 정제수로 재현탁하여 항체 감작 라텍스 입자 용액으로 했다. 이때, 항체 감작 입자의 총중량에 대한 항체의 결합량은 약 3.8중량%으로 된다.

(제1 시약의 조제)

750mM의 염화칼륨, 1% BSA를 함유하는 30mM CHES 완충액(pH 8.75)을 조제하여 제1 시약으로 했다.

(제２ 시약의 조제)

2종류의 항체 감작 라텍스 입자 용액을 등량 혼합하여, 5mM MOPS 완충액(pH 7.0)으로 최종 흡광도 2.0 OD가 되도록 희석하여 제２ 시약으로 했다. 시약은 평가예 1의 결과로 강한 반응성이 인정된 a－b, a－d, b－d의 각 항체 감작 라텍스 입자를, 동일한 입자지름끼리로 조합하여 조제했다.

(측정방법)

제1 시약과 제２ 시약을 조합하여 히타치 7170형 자동분석장치를 이용하여 사람 시스타틴 C 농도 의존적인 입자 증강 면역 응집의 형성을 확인했다. 구체적으로는 농도 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0mg/L의 사람 시스타틴 C용액 2.5㎕에 제1 시약 100㎕를 가하고, 37℃에서 5분간 가온 후, 제２ 시약 100㎕를 가하고, 교반했다. 그런 다음, 5분간의 응집 형성에 수반하는 흡광도 변화를, 주파장 570nm, 부파장 800nm에서의 감도로서 측정했다.

(결과)

항체 a감작 라텍스 입자와 항체 b감작 라텍스 입자를 조합한 시약으로 각 농도의 시스타틴 C용액을 측정한 바, 도 1 기재의 시스타틴 C 농도-감도 곡선에 나타난 바와 같이, 어느 입자에서도 시스타틴 C 농도 의존적으로 감도가 상승하여 측정이 가능한 것이 확인되었다. 0.13㎛입자(검은색 네모)에서는 저농도역의 감도가 약간 낮기는 하지만 고농도역의 감도 신장이 양호하고, 0.3㎛입자(흰색 네모)에서는 저농도역은 고감도이지만, 고농도역의 감도 신장이 불량이었다. 또, 항체 a감작 라텍스 입자와 항체 d감작 라텍스 입자를 조합한 시약에서는 0.13㎛입자(검은색 동그라미)와 0.3㎛입자(흰색 동그라미)에 있어서의 저농도역의 감도가 동등하고, 0.13㎛ 입자에서는 고농도역까지 감도가 상승하는데 반해, 0.3㎛ 입자에서는 거의 감도 신장이 인정되지 않았다. 따라서, 조합에 따라서는 이용할 수 없는 입자가 있지만, 양쪽 조합과도 면역 응집 측정방법으로의 적용이 가능한 것으로 사료된다. 한편, 파선으로 나타낸 항체 b감작 라텍스 입자와 항체 d감작 라텍스 입자를 조합한 시약에서는 0.13㎛ 입자(검정색 삼각), 0.3㎛ 입자(흰색 삼각)의 어느 것에서도, 시스타틴 C 농도 의존적인 감도 상승은 거의 보이지 않고, 입자 증강 면역 측정방법에서의 이용은 곤란한 것으로 생각되었다.

[평가예 3]

비아코어에 의한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체의 해리정수 확인

비아코어장치(GE헬스케어사)를 이용하여, 통상의 방법에 준하여 정제 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 a, b, 및 d의 해리정수를 산출했다. 구체적으로는 Mouse Antibody　Capture　Kit(GE헬스케어사)를 이용하여, 센서 칩에 각각 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체를 고정화하고, 농도 0㎍/㎖ 및 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0㎍/㎖ 가지의 사람 시스타틴 C(R＆D Systems사)와의 반응성으로부터 해리정수를 산출했다(표 2). 평가예 2에서 입자 증강 면역 측정으로의 적용이 가능한 것으로 생각된 조합 a－b, a－d는 고친화성 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 a(해리정수: 0.29nM)와, 통상의 친화력의 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 b(해리정수: 1.32nM) 또는 d(해리정수: 2.30nM)의 조합으로 되어 있어 해리정수의 비는 각각, b/a(1.32/0.29)가 약 4.6, d/a(2.30/0.29)가 약 7.9로 조합한 항체 사이에 명확한 친화성의 차이가 보였다. 한편, 입자 증강 면역 응집으로의 적용이 불가능한 것으로 생각된 b－d는 일반적인 친화력의 항체끼리의 조합이고, 또 해리정수의 비 d/b(2.30/1.32)는 약 1.7로 명확한 친화력의 차이가 보이지 않았다. 이 중, 고친화성 또한 가장 범용성이 높다고 생각되는 모노클로날 항체 a를 산생하는 하이브리도머 75202를 선택했다. 이 하이브리도머는 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소특허생물기탁센터((우)305－8566　일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1－1－1　중앙 제 6)에 2008년 11월 20일에 수령번호(FERM　BP－11186)로서 기탁했다.

[표 2]

[평가예 4]

ELISA법에 의한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 특이성의 확인

ELISA법으로, 이번 제작한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 a, b, d의 특이성 평가를 행했다. 상세하게는 1㎍/㎖의 사람 시스타틴 C 및 시스타틴 패밀리에 속하는 사람 시스타틴 A, 시스타틴 B, 시스타틴 D, 시스타틴 E/M, 시스타틴 F, 시스타틴 S, 시스타틴 SA, 키니노겐(모두 R＆D Systems사)을 포함한 PBS 50㎕를 96웰 마이크로플레이트에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 플레이트에 고상화했다. 이어서, 이 96웰 마이크로플레이트를, 0.05% Tween20를 함유하는 PBS 300㎕로 3회 세정한 후, 0.05% Tween20 및 1% BSA를 함유하는 PBS 300㎕/웰 가하고, 실온에서 1시간 정치했다. 그런 다음, 제작한 각 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 1㎍/㎖ 를 함유하는 PBS 50㎕/웰 가하고, 실온에서 1시간 정치하고, 0.05% Tween20를 함유하는 PBS로 3회 세정한 후, PBS로 5000배에 희석한 페록시다아제 표지 항마우스 항체(Biosource사)를 50㎕/웰 가하고, 실온에서 1시간 정치했다. 그 후, 당해 플레이트를 0.05% Tween20 함유하는 PBS로 3회 세정하고, 0.2% 오르토페닐렌디아민 및 0.02% 과산화수소를 함유하는 시트르산 완충액(pH 5) 50㎕/웰을 가하고, 실온에서 15분간 반응시킨 후, 4.5N 황산 50㎕/웰을 가하여 반응을 정지시키고, 각 웰의 파장 492nm에 있어서의 흡광도를 측정했다.

대조로서 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 대신에 항사람 시스타틴 C 토끼 폴리클로날 항체(BioVendor사), 페록시다아제 표지 항마우스 항체 대신에 페록시다아제 표지 항토끼 항체(CAPPEL사)를 사용하여 특이성을 비교했다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 모노클로날 항체 a, b, d 어느 모노클로날 항체도 사람 시스타틴 C만과 특이적으로 반응하는 것이 확인되었기 때문에, 이들의 항체를 이용함으로써, 사람 체액 중의 시스타틴 C를 특이적으로 측정할 수 있는 것으로 생각된다. 한편, 대조로 한 폴리클로날 항체는 시스타틴 C에 첨가하여 시스타틴 B, 시스타틴 D, 시스타틴 E/M, 시스타틴 S, 시스타틴 SA, 시스타틴 SN에 대하여 동일한 정도의 강한 반응성을, 또 시스타틴 A, 시스타틴 F, 키니노겐에 대해서도 약한 반응성을 나타내기 때문에, 항시스타틴 C 폴리클로날 항체를 이용한 측정에 있어서는 이들 시스타틴 패밀리 분자가 공존하는 시료에서는 시스타틴 C의 정확한 측정은 불가능한 것으로 예상되었다.

평가예 1－4를 반복한 결과, 한층 더 입자 증강 면역 측정으로의 적용이 가능하다고 생각되는 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 e, f, g를 이용한 조합 1, 및 2를 발견하였다. 모두 해리정수 1nM 미만의 고친화성 항체를 적어도 1종류 함유하는 조합으로, 조합 1은 고친화성 항체끼리의 조합으로, 해리정수의 비는 약 2.1, 조합 2는 고친화성 항체와 일반적인 친화력의 항체의 조합으로, 해리정수의 비는 약 15.4였다(표 3).

[표 3]

[실시예]

항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 a 및 b를 사용하여, 라텍스 입자지름 및 그 외 모든 조건을 히타치 7170형 자동분석장치의 측정에 최적화한 본 발명의 시스타틴 C측정 시약을 조제하고, 항시스타틴 C 폴리클로날 항체를 사용하고 있는 기존의 시스타틴 C 측정 시약(DADE　BEHRING사　N-라텍스　시스타틴 C 키트)과 성능 비교를 실시했다. 또한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체를 사용한 범용 자동분석장치용의 측정 시약은 입수할 수가 없었다.

(항체 감작 라텍스 입자의 조제)

평균 입경 0.15㎛의 0.5% 라텍스 용액(30mM　Tris－HCl,　pH 8.5)에, 등량의 0.15mg/㎖ 항체 a 또는 b용액(30mM　Tris－HCl, pH 8.5)를 가하고, 4℃에서 1시간 교반한 후, 등량의 1% BSA 용액(30mM　Tris－HCl,　pH 8.5)을 가하고, 4℃에서 30분간 교반하고, 원심하여 상청을 제거한 후, 침전을 정제수로 재현탁하여 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체 a 및 b감작 라텍스 입자 용액으로 했다. 이때, 항체 감작 입자의 총중량에 대한 항체의 결합량은 약 2.9중량%로 된다.

(제1 시약의 조제)

750mM의 염화칼륨, 1% BSA를 포함한 pH 8.0의 30mM Tris－HCl를 조제하여 제1 시약으로 했다.

(제２ 시약의 조제)

항체 a감작 라텍스 입자 용액과 항체 b감작 라텍스 입자 용액을 등량 혼합하고, 5mM MOPS 완충액(pH 7.0)으로 최종 흡광도 1.5OD가 되도록 희석하여 제２ 시약으로 했다.

(측정 시료)

사람 혈청 검체

(측정 조건)

히타치 7170형 자동분석장치: 파라미터 조건

·검체-제1 시약-제２ 시약; 2.4㎕－120㎕－120㎕

·분석법; 2포인트 엔드법(측정 포인트 18－34)

·측정 파장; 주파장 570nm/부파장 800nm

·칼리브레이션(calibration); 스프라인

(측정방법)

농도 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 10.0mg/L의 사람 시스타틴 C 용액의 측정 감도로부터 검량선을 작성하고, 그 검량선을 기초로 각 시료 중의 시스타틴 C 농도를 측정하여, 대조시약과 상관성(샘플수 N=50), 동시 재현성(연속 측정 회수 n=10), 검출한계농도(시스타틴 C 농도 제로 시료의 측정 평균 감도 ＋2SD와 시스타틴 C 농도 기존 시료의 측정 평균 감도 -2SD의 에러 바가 겹치지 않는 농도를 검출한계농도로 한다)를 비교했다.

(대조시약 및 분석장치)

대조시약: N－라텍스　시스타틴 C 키트

분석장치: BN　Prospec

이상　DADE　BEHRING사제

(결과)

본 발명의 시약과 대조시약의 검체 측정값의 상관성은 양호했다(도 3). 또 재현성에 관해서는 본 발명 시약의 변동계수는 기존 시약의 1/5 이하로 적고, 재현성이 뛰어나다(표 4). 더욱이 검출한계농도에 관해서도, 대조시약이 시스타틴 C 농도 0.2mg/L인 것에 대해, 본 발명의 시약은 0.05mg/L로 1/4 이하의 저농도까지 검출 가능한 것을 확인했다(도 4).

고친화성 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체와 그것과는 인식 부위가 다르고, 상대적으로 친화력이 약한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체를, 불용성 담체 입자에 각각 독립적으로 결합시킨 항체 감작 입자를 이용한 본 발명의 입자 증강 면역 측정방법에 의해, 항체 감작 입자의 총중량에 대한 항체의 결합량이, 종래의 시약에 있어서 이용되어 온 5중량% 초과~35중량 %보다도 소량으로, 저비용일 뿐만 아니라, 고성능 또한 특이성이 높은 사람 체액 중 시스타틴 C의 측정방법이 달성되었다.

[표 4]

[산업상의 이용가능성]

본 발명의 입자 증강 면역 측정방법과 시약 및 키트에 의해, 고성능, 저가인 동시에 간편한 사람 체액 중의 사람 시스타틴 C의 검출·측정방법을 제공한다.

독립행정법인산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터

FERMBP11186

20081120

Claims

고친화성 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체와, 그것과는 인식 부위가 다르고, 상대적으로 친화력이 약한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체를 불용성 담체 입자에 각각 독립적으로 결합시킨 항체 감작 입자를 이용한 입자 증강 면역 측정방법으로, 각각의 항체 감작 입자의 총중량에 대한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체의 결합량이 1중량% 이상, 4중량% 미만인 사람 체액 중의 시스타틴 C 측정방법.
제1항에 있어서,
불용성 담체 입자의 평균 입자지름이 0.1~0.4㎛인 사람 체액 중의 시스타틴 C 측정방법.
제1항에 있어서,
항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체가 기능 부위를 포함한 항체 단편 또는 재조합형 항체인 사람 체액 중의 시스타틴 C 측정방법.
제1항에 있어서,
고친화성 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체의 해리정수(kd값)가 1nM 미만이고, 이 해리정수로 상대적으로 친화력이 약한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체의 해리정수를 제외한 비가 2 이상인 사람 체액 중의 시스타틴 C 측정방법.
제1항 내지 제4항의 어느 한항에 있어서,
사람 체액이 혈청, 혈장, 활액, 젖, 타액, 뇌척수액, 정장(精漿), 양수(羊水), 뇨 또는 눈물인 사람 체액 중의 시스타틴 C 측정방법.
고친화성의 사람 시스타틴 C 모노클로날 항체와, 그것과는 인식 부위가 다르고, 상대적으로 친화력이 약한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체를 불용성 담체 입자에 각각 독립적으로 결합시킨 항체 감작 입자이며, 각각의 항체 감작 입자의 총중량에 대한 항사람 시스타틴 C 모노클로날 항체의 결합량이 5중량% 미만인 항체 감작 입자를 함유하는 사람 체액 중의 시스타틴 C의 입자 증강 면역 측정 시약.
제6항에 있어서,
불용성 담체 입자의 평균 입자지름이 0.1~0.4㎛인 측정 시약.