JP5914333B2

JP5914333B2 - 抗体の作製方法及び抗体

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Publication number: JP5914333B2
Application number: JP2012524613A
Authority: JP
Inventors: 厳建部; 真澄秋山; 登紀雄 ▲高▼木; 平松　光夫; 光夫平松
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2031-07-15
Also published as: WO2012008584A1; JPWO2012008584A1

Description

本発明は、抗体の作製方法、特に難溶性抗原の立体構造を認識できる抗体の作製方法に関する。本発明はまた、上記抗体の作製方法によって得られる抗体に関する。

抗体は、抗原のアミノ酸配列を認識するものと、抗原の立体構造を認識するものとに大別する。一般に、抗体を作製する際、変性した抗原を使用するとアミノ酸を認識する抗体がより多く作製され、変性していない天然型（ｎａｔｉｖｅｆｏｒｍ）の抗原を使用すると立体構造を認識するものがより多く作製される。

従来、水に溶けにくい（難溶性）タンパク質やペプチドを抗原として抗体を作製する場合、尿素などの変性剤で可溶化する必要があった。この際、抗原は変性し天然型の立体構造を保てないため、得られた抗体は抗原の立体構造を認識できない可能性が高い。立体構造を認識できない抗体は、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法やＥＬＩＳＡ法などの試験法には使用できるものの、免疫沈降や組織染色などの試験法には使用できず、使途が限られる。したがって、難溶性抗原の立体構造を保った状態で抗体を作製することが望ましい。

特許文献１には、抗原を生分解性ポリマーの微粒子に吸着または封入することによって、より大きい免疫応答を惹起できることが記載されている。しかし、この方法では抗体作製効率に主眼を置いており、抗原の立体構造を認識する抗体の作製について何ら記載されていない。

一方、特許文献２には、難溶性薬物（主に低分子の有機化合物）を光照射によって微粒子化する微粒子分散液製造方法が記載されている。しかし、この方法は低分子の有機化合物である難溶性薬物の分散安定性向上に主眼が置かれており、タンパク質の分散について何ら記載されていない。

特表２００９−５１８３０６号公報国際公開２００７−１１６６３２号

本発明は、抗原を立体構造を保ったまま安定に分散することによる抗体の作製方法、及び該抗体の作製方法によって得られる抗体を提供すること目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究の結果、難溶性抗原であるシスタチンＣ、さらに分散安定化剤であるポリビニルピロリドン、及び界面活性剤であるポリオキシル２０セチルエーテルを揮発性有機溶媒に溶解し、ついで有機溶媒を蒸発乾固させ得られた残存物に水を添加して、高出力パルスレーザーを照射して残存物から微粒子を分散化し、安定なシスタチンＣ微粒子分散液を得て、この分散液を用いて天然型の難溶性抗原に特異性の高い抗体を作製できることを見出し、本発明の完成に至った。

すなわち、本発明は、難溶性抗原と、分散安定化剤及び界面活性剤のいずれか一方又は両方とを揮発性有機溶媒に溶解させる溶解工程と、得られた溶液から有機溶媒を除去し、抗原と、分散安定化剤及び界面活性剤のいずれか一方又は両方とを含む残存物を容器の内壁に固定する固定工程と、容器に水を加え、残存物に光を照射し、抗原と、分散安定化剤及び界面活性剤のいずれか一方又は両方とを含む微粒子が水に分散された分散液を得る照射工程と、分散液を用いて動物を免疫し、抗体を得る免疫工程とを含む、抗体の作製方法を提供する。本発明の抗体の作製方法によれば、難溶性抗原を変性させることなく分散できるため、天然型の難溶性抗原の立体構造を認識でき、特異性の高い抗体を作製できる。

本発明において、分散安定化剤は、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリアクリル酸ナトリウム、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ酢酸ビニル、ポロキサマー、乳酸グリコール酸共重合体、ポリ乳酸、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリブテン、ポリプロピレングリコール、デンプン、アミロペクチン、デキストラン、ゼラチン、シクロデキストリン、キトサン、プルラン、タンニン、リグニン、テルペン、ヒアルロン酸ナトリウム、マンニトール、メグルミン、アラビアゴム、シスポリイソプレンゴム、及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１つの高分子ポリマーであり、界面活性剤は、ポリオキシル２０セチルエーテル、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、ロート油、ショ糖脂肪酸エステル、スクワラン、ステアリルアルコール、ポリオキシエチレン４０モノステアレート、セチルアルコール、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルアミン、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルセバシン酸ジエチル、ソルビタン脂肪酸エステル、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ソルビタントリオレエート、オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリルジメチルアミンオキシド、ラウリルサルコシンナトリウム、リン酸ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、及びステロイドサポニンからなる群より選択される少なくとも１つの界面活性剤であることが好ましい。

本発明はまた、上記抗体の作製方法によって得られる抗体を提供する。本発明の抗体は、天然型の難溶性抗原の立体構造を認識でき、特異性の高い抗体であるため、免疫沈降や組織染色などの試験法に使用され得る。

本発明の抗体の作製方法によれば、従来の方法に比べて変性剤を使用しないことで、難溶性抗原の立体構造を認識できる抗体を高い割合で作製することができる。このような抗体は免疫沈降や組織染色などに試験法に好適に使用される。

シスタチンＣ微粒子分散液に含まれる粒子を、走査型電子顕微鏡を用いて観察した結果を示す図である（実施例１）。

本発明の抗体の作製方法は、難溶性抗原と、分散安定化剤及び界面活性剤のいずれか一方又は両方とを揮発性有機溶媒に溶解させる溶解工程と、得られた溶液から有機溶媒を除去し、抗原と、分散安定化剤及び界面活性剤のいずれか一方又は両方とを含む残存物を容器の内壁に固定する固定工程と、容器に水を加え、残存物に光を照射し、抗原と、分散安定化剤及び界面活性剤のいずれか一方又は両方とを含む微粒子が水に分散された分散液を得る照射工程と、分散液を用いて動物を免疫し、抗体を得る免疫工程とを含む。

溶解工程では、難溶性抗原、並びに分散安定化剤及び／又は界面活性剤は揮発性有機溶媒に溶解される。本明細書において、難溶性抗原は、水にほとんど溶けない又は溶けにくい、タンパク質抗原又はペプチド抗原であり、これらはインクルージョンボディの形態であってもよい。その水における溶解度は、室温（２５℃）では例えば０．１ｍｇ／ｍＬ以下、０．０１ｍｇ／ｍＬ以下、又は０．００１ｍｇ／ｍＬ以下である。難溶性抗原の具体例として、シスタチンＣ、アンジオテンシノーゲンが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において、分散安定化剤は、難溶性抗原分子同士が密接に存在しないように分散化するときに、該分散状態を安定に維持できる物質である。分散安定化剤は、抗体作製の妨げにならなければ特に限定されないが、水溶性が高く、種々の有機溶媒に溶け易い物質であることが好ましく、特にポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリアクリル酸ナトリウム、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ酢酸ビニル、ポロキサマー、乳酸グリコール酸共重合体、ポリ乳酸、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリブテン、ポリプロピレングリコール、デンプン、アミロペクチン、デキストラン、ゼラチン、シクロデキストリン、キトサン、プルラン、タンニン、リグニン、テルペン、ヒアルロン酸ナトリウム、マンニトール、メグルミン、アラビアゴム、シスポリイソプレンゴム、及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１つの高分子ポリマーであることが好ましい。

本明細書において、界面活性剤は、難溶性抗原分子同士が密接に存在しないように分散化するための界面活性剤である。界面活性剤は、抗体作製の妨げにならなければ特に限定されないが、安全性の観点、及び難溶性抗原や高分子ポリマーとの相互作用による分散安定性の観点からポリオキシル２０セチルエーテル、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、ロート油、ショ糖脂肪酸エステル、スクワラン、ステアリルアルコール、ポリオキシエチレン４０モノステアレート、セチルアルコール、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルアミン、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルセバシン酸ジエチル、ソルビタン脂肪酸エステル、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ソルビタントリオレエート、オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリルジメチルアミンオキシド、ラウリルサルコシンナトリウム、リン酸ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、及びステロイドサポニンなど低毒性であるものからなる群より選択される少なくとも１つの界面活性剤であることが好ましい。

本明細書において、揮発性有機溶媒は最終的に取り除かれるため、特に限定されないが、難溶性抗原、高分子ポリマー及び界面活性剤を均質に完全に溶解させる観点から、例えばジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）や、テトラハイドロフラン（ＴＨＦ）、クロロホルム、メタノール等が使用される。

溶解工程において、難溶性抗原、並びに分散安定化剤及び／又は界面活性剤の添加順番は特に限定されない。また、添加量については、難溶性抗原の分散安定性を保つ観点から、例えば重量比で難溶性抗原１に対し０．１〜１００の混合比で添加することができる。

次に、固定工程では、得られた溶液から有機溶媒を除去し、抗原と、分散安定化剤及び界面活性剤のいずれか一方又は両方とを含む残存物を容器の内壁に固定する。有機溶媒の除去は、抗原の熱変性を避けるべき観点から、減圧蒸留法による除去が好ましい。ペレット状の残存物を容器へ固定するため、有機溶媒を除去するとき、激しい振とうを避けることが好ましい。容器は特に限定されないが、光照射の効率を考慮すれば、例えばガラス容器が使用され得る。

次に、照射工程では、容器に水を加え、残存物に光を照射することで、抗原と、分散安定化剤及び界面活性剤のいずれか一方又は両方とを含む微粒子が水に分散された分散液が得られる。光照射は高効率かつ短時間に微粒子分散液を作製できる観点から、レーザー光が好ましく使用される。照射条件は、例えば照射波長１０６４ｎｍ、１パルス当たり照射強度０．１２Ｊ、パルス幅５ｎｓｅｃ、繰り返し１０Ｈｚが挙げられる。照射装置としては、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザーが挙げられる。光照射により、残存物が微粒子に粉砕され、容器を軽く振とうすることで微粒子の分散液を得ることができる。分散液中の微粒子は、好ましく１００ｎｍ〜１０μｍの粒径を有する。この分散液をそのまま免疫工程に適用してもよく、長期保存する場合は、微粒子分散液を凍結乾燥して凍結乾燥微粒子とすることもできる。

最後に、免疫工程では、分散液を用いて動物を免疫することで抗体が得られる。免疫方法は、一般的な手法であればよく、例えば、ウサギの背皮内複数箇所へ抗原を投与することによって免疫する方法が挙げられる。また、分散液をそのまま動物に投与してもよいが、免疫反応を増強するため、免疫アジュバントなどの補助成分を添加してもよい。

本発明の抗体の作製方法によって得られる抗体は、天然型の難溶性抗原の立体構造を特異的に認識できるものであることが確認されている。その理由は、必ずしも明確ではない。なぜならば、特許文献２の記載からは、タンパク質を微粒子化することで分散液中の安定性が向上する可能性があるとしても、微粒子化されたタンパク質を用いて立体特異性の高い抗体を得られる理由を容易に推察し得ないからである。

本発明者らは、以下のように推察している。一般に、難溶性抗原分子同士が水中に高度に凝縮しているため天然型の立体構造が維持されにくい。しかし、本発明の方法によれば、高分子ポリマー及び界面活性剤の存在下では、難溶性抗原同士の分子が密接に存在せず、適度に分散化された状態に存在するため、天然型の立体構造が維持されていると考えられる。また、一般にタンパク質の可逆的な変性体であれば、時間の進行とともに元の立体構造に戻ることは公知の事実であるが、分散処理されない難溶性抗原は生体内に取り込まれた後、立体構造を回復する可能性があるものの、長い時間を要すると考えられる。一方、微粒子化され分散された難溶性抗原は、生体内で微粒子から徐々に溶出するため、凝集度合いが低いため、早い時間で立体構造を回復・維持するものと考えられる。免疫担当細胞に取り込まれ抗原提示を受ける際に、立体構造の回復が速い微粒子化され分散された難溶性抗原では、未処理の抗原をより多く抗原提示でき立体構造を認識する抗体がより多く産生されると考えられる。

（実施例１ウサギ抗シスタチンＣ抗体の作製）
難溶性抗原である大腸菌で発現させたリコンビナントシスタチンＣ（（株）免疫生物研究所）１０ｍｇと、分散安定化剤としてのポリビニルピロリドン５０ｍｇ、界面活性剤としてのポリオキシル２０セチルエーテル１００ｍｇとを試験管にとり、ジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）２ｍＬに溶解した。減圧条件下でＤＭＳＯ溶液を乾固し、抗原と分散安定化剤が均一に分子分散した残存物（以下、「ペレット」という）を得た。得られたペレットに水１．０ｍLを添加し、密閉した。

試験管内のペレットに対して、試験管側方よりＮｄ：ＹＡＧパルスレーザー照射を行った。照射条件は、波長１０６４ｎｍ、照射光強度０．６１Ｊ／ｃｍ^２／ｐｕｌｓｅ、パルス幅５〜７ｎｓ、繰り返し周波数１０Ｈｚ、エネルギー０．１２J／ｐｕｌｓｅであった。１０分間照射を行った後、軽く振とうすると白色の分散液を得た。得られた分散液に含まれる粒子について、走査型電子顕微鏡Ｓ４２００（（株）日立ハイテクノロジーズ）を用いて観察した結果、粒子径１μｍ程度の球形粒子が多数認められた（図１）。

調製したシスタチンＣ微粒子分散液と、未処理シスタチンＣ溶液について、各々ウサギ３匹に投与し、ポリクロ−ナル抗体を作製した。

（実施例２抗体の力価の評価）
シスタチンＣ微粒子分散液を用いて得られたウサギ抗血清（Ｎｏ．４〜６）、及び、未処理のシスタチンＣを用いて得られたウサギ抗血清（Ｎｏ．１〜３）、及び、変性剤を添加したシスタチンＣ溶液を用いて作製された市販のウサギ抗シスタチンＣ抗血清（ダコ・ジャンパン株式会社）（Ｎｏ．７）について、ＥＬＩＳＡ法による力価の測定を行った。

具体的には、尿由来ヒトシスタチンＣを５０ｎｇ／ウェルでタイタープレートに添加し、３７℃で３０分反応させて抗原を固相化した。次に１００〜２０４８００倍まで２倍連続希釈した抗血清をウェルに添加し、３７℃で３０分反応させた。ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を添加し、オルソフェニレンジアミン発色による４９０ｎｍの吸光度を測定した。ウサギを４回免疫後の抗血清の吸光度の結果は表１、ウサギを６回免疫後の抗血清の吸光度の結果を表２に示した。

表１から、４回免疫後の抗血清は、力価が強い順に変性体（Ｎｏ．７）＞未処理（Ｎｏ．１〜３）＞本発明の分散化体（Ｎｏ．４〜６）であり、分散化体の抗原を用いて得られた抗血清は、抗体産生量が低いか、または抗体の結合定数が低いと考えられた。６回免疫後の結果も同様であった（表２）。

（実施例３抗体の特異性の評価）
実施例２と同じ抗体を用いて、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ法により抗原特異性の評価を行った。尿由来ヒトシスタチンＣを４０００〜７．８ｎｇ／ｍＬまで２倍連続希釈した抗原液、及び抗原の含まれていない溶液を、先の力価測定の結果から力価を揃えた各抗血清と等量混合して、３７℃で６０分静置した（一次反応）。次いで一次反応した溶液を、尿由来ヒトシスタチンＣを５０ｎｇ／ウェルでコートしたタイタープレートに添加し、３７℃で６０分反応させた。その後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を添加し、オルソフェニレンジアミン発色による４９０ｎｍの吸光度を測定した。抗原が含まれていない溶液で測定した吸光度を１００％として、各抗原濃度での割合を算出した。ウサギを４回免疫後の抗血清の吸光度の結果は表３、ウサギを６回免疫後の抗血清の吸光度の結果を表４に示した。

４回免疫後の結果から、未変性抗原を認識する抗体の割合が高い順に、分散化体＞未処理物＞変性体であり、分散化体抗原で調製した抗体が最も特異性が高かった。６回免疫後の結果も同様であった。

Claims

難溶性抗原と、分散安定化剤及び界面活性剤のいずれか一方又は両方とを揮発性有機溶媒に溶解させる溶解工程と、
得られた溶液から前記有機溶媒を除去し、前記抗原と、前記分散安定化剤及び前記界面活性剤のいずれか一方又は両方とを含む残存物を容器の内壁に固定する固定工程と、
前記容器に水を加え、前記残存物にレーザー光を照射し、前記抗原と、前記分散安定化剤及び前記界面活性剤のいずれか一方又は両方とを含む微粒子が水に分散された分散液を得る照射工程と、
前記分散液を用いて動物（ヒトを除く）を免疫し、ポリクローナル抗体を得る免疫工程と
を含む、抗体の作製方法。
前記分散安定化剤は、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリアクリル酸ナトリウム、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ酢酸ビニル、ポロキサマー、乳酸グリコール酸共重合体、ポリ乳酸、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリブテン、ポリプロピレングリコール、デンプン、アミロペクチン、デキストラン、ゼラチン、シクロデキストリン、キトサン、プルラン、タンニン、リグニン、テルペン、ヒアルロン酸ナトリウム、マンニトール、メグルミン、アラビアゴム、シスポリイソプレンゴム、及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１つの高分子ポリマーであり、前記界面活性剤は、ポリオキシル２０セチルエーテル、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、ロート油、ショ糖脂肪酸エステル、スクワラン、ステアリルアルコール、ポリオキシエチレン４０モノステアレート、セチルアルコール、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルアミン、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルセバシン酸ジエチル、ソルビタン脂肪酸エステル、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ソルビタントリオレエート、オクチルフェノールポリ、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリルジメチルアミンオキシド、ラウリルサルコシンナトリウム、リン酸ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、及びステロイドサポニンからなる群より選択される少なくとも１つの界面活性剤である、請求項１に記載の方法。