WO2010064435A1 - ヒト体液中のシスタチンｃ測定方法 - Google Patents

ヒト体液中のシスタチンｃ測定方法 Download PDF

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    • G01N2333/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin

Definitions

  • the present invention also provides an antibody sensitization in which a high-affinity anti-human cystatin C monoclonal antibody and an anti-human cystatin C monoclonal antibody having a different recognition site and relatively low affinity are independently bound to insoluble carrier particles.
  • a particle-enhanced immunoassay reagent is provided.
  • anti-human cystatin C monoclonal antibodies used in the present invention, which react specifically with human cystatin C, and each has a high affinity monoclonal antibody, a monoclonal antibody having a different recognition site and a relatively weak affinity, Contains one or more.
  • the antibody also includes an antibody fragment containing a functional site (ie, an antibody fragment containing Fab that is a human cystatin C recognition site) and a recombinant antibody (ie, an antibody having a structure other than Fab).
  • the particle-enhanced immunoagglutination measurement reagent of the present invention is a component that buffers the ionic strength, osmotic pressure, etc. of the sample, such as acetic acid, citric acid, phosphoric acid, tris, glycine, boric acid, carbonic acid, And Good's buffer solution, sodium salt, potassium salt, calcium salt thereof and the like.
  • a polymer such as polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, or phospholipid polymer may be included.
  • Antibody titers in blood collected from the fundus vein of mice were measured by ELISA, and mice with high antibody titers were selected for cell fusion.
  • 100 ⁇ g of human cystatin C dissolved in 200 ⁇ L of physiological saline was injected into the abdominal cavity of the mouse, and the spleen was removed 3 days later.
  • the spleen was loosened in RPMI 1640 medium and then centrifuged at 1500 rpm to collect splenocytes. This was washed 3 times or more with fetal bovine serum-free RPMI 1640 medium, and then suspended by adding 2 mL of RPMI 1640 medium containing 15% fetal bovine serum to obtain a spleen cell suspension.
  • Each of the dialysis contents was adsorbed separately on a DEAE-Sepharose column equilibrated with the same buffer solution, and then eluted with a concentration gradient of 0 to 300 mM sodium chloride in the same buffer solution.
  • Various purified anti-human cystatin C monoclonal antibodies Got.
  • the precipitate was resuspended with purified water to obtain an antibody-sensitized latex particle solution.
  • the binding amount of the antibody with respect to the total weight of the antibody-sensitized particles is about 3.8% by weight.
  • the combinations ab and ad considered to be applicable to the particle-enhanced immunoassay in Evaluation Example 2 are a high-affinity anti-human cystatin C monoclonal antibody a (dissociation constant: 0.29 nM), It is a combination of affinity anti-human cystatin C monoclonal antibody b (dissociation constant: 1.32 nM) or d (dissociation constant: 2.30 nM), and the ratio of the dissociation constants is b / a (1.32 / 0). .29) was about 4.6, and d / a (2.30 / 0.29) was about 7.9, indicating a clear difference in affinity between the combined antibodies.

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Abstract

　特異性の低いポリクローナル抗体や、特異性は高いものの凝集性の弱いモノクローナル抗体が大量に用いられていた従来の測定方法に対して、特異性が高く、低コストで自動化が容易なヒト体液中のシスタチンＣの粒子増強免疫測定方法を提供する。 　高親和性の抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体と、それと認識部位が異なり相対的に親和力の弱い抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体を、不溶性担体粒子にそれぞれ独立して結合させた抗体感作粒子を組合わせた粒子増強免疫測定方法であって、それぞれの抗体感作粒子重量に対する抗ヒトシスタチンＣモノクローナルの結合量が、５重量％未満であるヒト体液中のシスタチンＣ特異的測定方法。

Description

ヒト体液中のシスタチンＣ測定方法
　本発明は、ヒト体液中のシスタチンＣの粒子増強免疫測定方法及び粒子増強免疫測定試薬に関する。
　シスタチンＣは、分子量１３ｋＤａの塩基性低分子タンパク質（等電点ｐＨ９．３）で、全身の有核細胞で絶えず産生され、環境変化の影響を受けずに一定量が細胞外に分泌される。このため、血中濃度が一定となり他の疾患による炎症などの影響や年齢、性別、運動、食事などの影響を受けない。また、シスタチンＣは、他の血漿タンパク質と複合体を形成せず、腎糸球体で濾過されて近位尿細管で再吸収されるため、糸球体濾過率（ＧＦＲ）が低下すると、血中濃度が上昇することが知られており、クレアチニンに代わるＧＦＲを表す指標として注目されている。また、腎機能検査において、早期腎症の診断指標となるため、外来や健康診断などの領域でも広く有用である。
　シスタチンＣの測定方法としては、自動化されたヒトシスタチンＣの粒子増強免疫測定方法が報告されている（非特許文献１～３、特許文献１）。例えば、非特許文献１記載の方法では、凝集力が強い抗シスタチンＣポリクローナル抗体を担体粒子に５％の重量比で結合させて利用しているが、非特許文献４に示されるように、シスタチンＣには構造が類似したシスタチンファミリー群が存在し、各種のヒト体液によって局在が異なるため、特異性の低いポリクローナル抗体では、ヒト体液の種類（例えば、唾液や涙液）によっては正確なシスタチンＣの測定値が得られない可能性が極めて高い。一方、特許文献１においては、一般的にはポリクローナル抗体を用いた方が免疫凝集体を形成しやすい旨記載されている（２０頁２１－２７行目）。また、特異性が高い抗シスタチンＣモノクローナル抗体の利用が示唆されているものの、シスタチンＣのような単量体で低分子量の蛋白質を測定対象とする場合は、多くの異なるモノクローナル抗体のカクテルを利用することで良い結果が得られる旨記載されており（２１頁５－１０行目）、実質的にはポリクローナル抗体が利用されているに等しい。さらに、性能を向上させるためには抗体感作粒子の総重量に対する抗体の結合量が５重量％超～３５重量％と著しく大量の抗体を結合させる必要があった。
国際公開第2007/102054号パンフレット
CLINICAL CHEMISTRY,Vol.40,No.10,(1994),1921-1926 KIDNEY INTERNATIONAL,Vol.47,(1995),312-318 CLINICAL CHEMISTRY,Vol.43,No.6,(1997),1016-1022 METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.224, (1994),685-700
　ヒトシスタチンＣの粒子増強免疫測定方法で汎用されるポリクローナル抗体は、特異性が低く、試料の種類によってシスタチンＣ特異的な測定ができないという課題が存在していた。その対策としてモノクローナル抗体の利用が考案されたが、凝集力が弱いため、不溶性担体粒子に多種類のモノクローナル抗体からなるカクテルを大量に結合させる必要があり、膨大な手間とコストを要するといった新たな課題が発生していた。それ故、これまでモノクローナル抗体のみからなるヒト体液中のシスタチンＣの粒子増強免疫測定方法は実用化されていなかった。さらに、従来のヒトシスタチンＣの粒子増強免疫測定方法では、実用的な性能を得るためには抗体感作粒子の総重量に対する結合量が５重量％超～３５重量％という大量の抗体が必要であった。
　従って、本発明は、特異性が高く、低コストで自動化が容易なヒト体液中のシスタチンＣの粒子増強免疫測定方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、従来、シスタチンＣの測定には不向きと考えられていたモノクローナル抗体においても、高親和性の抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体と、それとは認識部位が異なり相対的に親和力の弱い抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体を、抗体感作粒子の総重量に対して５重量％未満の結合量割合で、それぞれ独立して結合させた抗体感作粒子を組合わせれば、シスタチンＣ特異的な粒子増強免疫測定が可能であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、高親和性の抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体と、認識部位が異なり相対的に親和力の弱い抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体を、不溶性担体粒子にそれぞれ独立して結合させた抗体感作粒子を組合わせた粒子増強免疫測定方法であって、それぞれの抗体感作粒子の総重量に対する抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体の結合量が５重量％未満であるヒト体液中のシスタチンＣ測定方法を提供するものである。
　また、本発明は、高親和性の抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体と、認識部位が異なり相対的に親和力の弱い抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体を、不溶性担体粒子にそれぞれ独立して結合させた抗体感作粒子の組合せであって、それぞれの抗体感作粒子の総重量に対する抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体の結合量が５重量％未満である抗体感作粒子を含有する、ヒト体液中のシスタチンＣ特異的な粒子増強免疫測定試薬を提供するものである。
　本発明により、従来よりも特異性が高く、低コストで自動分析装置への適応が容易なヒト体液中のシスタチンＣの粒子増強免疫測定方法及び試薬を提供することが可能となった。
抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体ａ、ｂ、ｄをそれぞれ粒子径０．１３μｍ、０．３０μｍのラテックス粒子に結合した抗体感作ラテックス粒子を、ａ－ｂ、ａ－ｄ、ｂ－ｄと同一粒子径同士を組合わせ、シスタチンＣを測定した際の粒子増強免疫凝集に伴う感度を示したシスタチンＣ濃度－感度曲線である。 ＥＬＩＳＡ法で確認した抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体及び、対照とした抗ヒトシスタチンＣポリクローナル抗体の特異性を示すグラフである。 本発明試薬と対照試薬のシスタチンＣ測定相関図（サンプル数Ｎ＝５０）である。 本発明試薬と対照試薬の検出限界濃度を示したグラフである。
　本発明で使用する抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体は２種以上であり、ヒトシスタチンＣと特異的に反応し、高親和性のモノクローナル抗体及び、認識部位が異なり相対的に親和力の弱いモノクローナル抗体、各1種以上を含む。尚、前記抗体には、機能部位を含む抗体断片（すなわち、ヒトシスタチンＣ認識部位であるＦａｂを含む抗体断片）や、組換え型抗体（すなわち、Ｆａｂ以外の構造を組換えた抗体）も含む。
　前記の高親和性のモノクローナル抗体を獲得する方法は、特に限定されないが、免疫部位や融合細胞の選択、免疫するヒトシスタチンＣの増量、免疫期間の延長などが高親和性の抗体を得るのに効果的である。ここでヒトシスタチンＣと特異的に反応するとは、ヒトシスタチンＣとは抗原抗体反応を起こすが、その他のシスタチンファミリー（例えばヒトシスタチンＡ、シスタチンＢ、シスタチンＤ、シスタチンＥ/Ｍ、シスタチンＦ、シスタチンＳ、シスタチンＳＡ、キニノーゲンなど）とは実質的に抗原抗体反応を起こさないことをいう。
　本発明で使用する抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体のうち、高親和性の抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体は、例えば「商品名：ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））ＧＥヘルスケア社製」装置における力価測定による算出で解離定数（ｋｄ値）が１ｎＭ未満、好ましくは０．５ｎＭ以下である。尚、ビアコア装置による解析では、一般的な親和力のモノクローナル抗体の解離定数は１ｎＭ以上である。解離定数の確認方法としては、当該分野で公知の通常使用される方法であれば特に限定されないが、測定原理や測定条件によって若干、解離定数が変動する可能性がある。
　このような高親和性モノクローナル抗体の例としては、後記実施例に示す、ハイブリドーマ７５２０２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１８６）が産生するモノクローナル抗体が挙げられる。
　本発明においては、前記の高親和性モノクローナル抗体を少なくとも１種使用すれば、他の相対的に親和力の弱い抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体は、一般的な親和力であってもよい。そのような組合せの中でも、高親和性モノクローナル抗体の解離定数で、他の相対的に親和力の弱い抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体の解離定数を除した比が２以上のものが好ましい。このようなモノクローナル抗体は常法に従って製造することができる。なお、親和力（解離定数の相対比）に２倍以上の差があれば、解離定数が１ｎＭ未満の高親和性モノクローナル抗体同士を組合わせて使用することもできる。
　また、本発明で使用する２種以上のモノクローナル抗体は、それぞれのモノクローナル抗体がヒトシスタチンＣの異なる部位を認識するモノクローナル抗体の組合せである。当該認識部位が異なることは、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などによって確認できる。
　本発明の粒子増強免疫測定方法及び試薬において、不溶性担体粒子として用いられる素材は、検査試薬の成分として利用可能な物質であれば特に制限はないが、具体的にはラテックス、金属コロイド、シリカ、カーボンなどが挙げられる。不溶性担体粒子のサイズは、本発明の粒子増強免疫測定方法及び試薬の検出原理に応じて０．０５～０．５μｍまで適宜選択できるが、自動分析装置における光学的測定においては平均粒子径０．１～０．４μｍが汎用されており、好ましくは０．１～０．２μｍである。不溶性担体粒子の平均粒子径は粒度分布計や電子顕微鏡像などで確認することができる。
　本発明のモノクローナル抗体の組合せにより、それぞれの抗体感作粒子の総重量に対する抗体の結合量が５重量％未満であってもヒトシスタチンＣの測定が可能であり、抗体量は１重量％以上４重量％未満が好ましい。
　不溶性担体粒子へのモノクローナル抗体の結合（感作）は、例えば物理吸着法や化学結合法といった常法により行うことができる。
　本発明の粒子増強免疫測定方法ならびに試薬及びキットにおいての測定対象試料は、種々のヒト体液であってヒトシスタチンＣを含有する試料であれば特に限定されないが、例えば血清、血漿、滑液、乳、唾液、脳脊髄液、精漿、羊水、尿、涙液などのヒト体液である。
　本発明の粒子増強免疫測定方法ならびに試薬及びキットは、日立社製を始めとして東芝社製、 日本電子社製、オリンパス社製、積水メディカル社製の汎用自動分析装置や近赤外を測定波長とした専用自動分析装置ＬＰＩＡ（登録商標）（三菱化学ヤトロン社製）における濁度法、散乱光強度を測定する装置（ＤＡＤＥ　ＢＥＨＲＩＮＧ社製）におけるネフェロメトリー法への適用が可能であるため、自動化が容易である。
　本発明の粒子増強免疫凝集測定試薬は、主成分の他に、試料のイオン強度や浸透圧などを緩衝する成分として、例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸、及びグッドの緩衝液や、それらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などを含んでも良い。また、免疫学的凝集を増強する成分としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子を含んでも良い。また、免疫学的凝集の形成をコントロールする成分として、タンパク質、アミノ酸、糖類、金属塩類、界面活性剤類、還元性物質やカオトロピック物質など粒子増強免疫凝集測定で汎用される成分を１種類、又は複数の成分を組合わせて含んでも良い。さらに、これらの成分を組合わせたキットとしてもよい。
　本発明のヒトシスタチンＣの粒子増強免疫測定方法ならびに粒子増強免疫測定試薬及びキットは、試料中のヒトシスタチンＣを高精度かつ特異的に測定するという用途であればいずれにも適用することができる。
　以下、作製例、評価例ならびに実施例を挙げて本発明の一部を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔作製例〕
高親和性抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体の作製
　精製ヒトシスタチンＣ（ＳＣＩＰＡＣ社）１００μｇを１回の免疫に使用した。初回免疫は、ヒトシスタチンＣとフロインドの完全アジュバンドを等量混合して調製したエマルジョン２００μＬを用い、これをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に注射した。追加免疫にはフロインドの不完全アジュバンドを使用して同様に調製したエマルジョン２００μＬを用い、高親和性の抗体を獲得するために２週間間隔で６回の追加免疫を繰り返す長期免疫を行なった。マウス眼底静脈より採血した血液中の抗体価をＥＬＩＳＡ法にて測定し、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合に供した。７回目の免疫から２週間後に、ヒトシスタチンＣ１００μｇを生理食塩液２００μＬに溶解したものをマウス腹腔に注射し、３日後に脾臓を摘出した。脾臓をＲＰＭＩ１６４０培地中でほぐした後、１５００ｒｐｍで遠心分離して脾細胞を回収した。これを牛胎児血清フリーのＲＰＭＩ１６４０培地で３回以上洗浄後、１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地２ｍＬを加えて懸濁し、脾細胞懸濁液とした。脾細胞とミエローマ細胞ＳＰ２／０－ＡＧ１４を６対１の割合で混合した後、５０％ポリエチレングリコール存在下で細胞融合させ、ハイブリドーマ（融合細胞）を得た。１５００ｒｐｍの遠心分離で沈殿部を集め、ＧＫＮ液（グルコース２ｇ、塩化カリウム０．４ｇ、塩化ナトリウム８ｇ、リン酸水素二ナトリウム１．４１ｇ及びリン酸二水素ナトリウム二水和物０．７８ｇを精製水に溶かして１リットルとしたもの）に懸濁、遠心分離により洗浄後、沈殿部を回収した。これを１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地３０ｍＬに懸濁したものを１ウェルあたり１００μＬ、及びフィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞を２．５×１０6個／ｍＬ含むＨＡＴ培地を１ウェルあたり２００μＬずつ９６穴マイクロプレート３枚にそれぞれ分注し、３７℃にて５％炭酸ガス培養器中でハイブリドーマを培養した。
　培養上清中の抗ヒトシスタチンＣ抗体の存在を、ヒトシスタチンＣを固相化したＥＬＩＳＡ法で確認し、１０日後に全てのウェルでハイブリドーマの増殖を確認した。詳細には、１０μｇ／ｍＬのヒトシスタチンＣ及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳと略す）１００μＬを前記ハイブリドーマの増殖が確認された９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一晩放置した。次に、この９６穴マイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡ）を含むＰＢＳ３００μＬで３回洗浄した後、各ウェルの培養上清を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間放置した。その後、当該プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（積水メディカル株式会社製）を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間放置した。その後、当該プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５）５０μＬ／ウェルを加え、室温で１５分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬ／ウェルを加えて反応を停止させ、各ウェルの波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の高いウェルを陽性ウェルとして選択した。
　単クローン化は限界希釈法で行った。すなわちフィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞を１ウェルあたり１０6個ずつ分注した９６穴マイクロプレートに、前記陽性ウェル中のハイブリドーマを１０個／ｍＬとなるように希釈したものを０．１ｍＬずつ分注した。培地は、初回はＨＴ培地を、２回目以降は１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い、３７℃にて５％炭酸ガス培養器中で１０日間培養した。ＥＬＩＳＡ法による陽性ウェルの選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各３回繰り返して、反応性の高い抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。各ハイブリドーマの約１０5個をプリスタン前処理したマウス腹腔に投与し、生成した腹水をそれぞれ採取した。採取した各腹水から遠心分離により不溶物を除去し、等量の飽和硫安液を加え、撹拌しながら一晩放置後、遠心分離で沈殿を回収した。回収した沈殿を２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、同緩衝液で透析した。透析内容物それぞれを同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ－セファロースカラムに別個に吸着させた後、それぞれ同緩衝液中の塩化ナトリウム０～３００ｍＭの濃度勾配で溶出させ、各種精製抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体を得た。
〔評価例１〕
認識部位が異なる抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体の選択
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法における反応性を指標として、作製した抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体間で認識部位が異なる組合せの探索をおこなった。具体的には、各抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体を各１μｇ／ｍＬを含むＰＢＳ５０μＬ／ウェル加え、室温２時間静置してプレートに固相化した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ３００μＬで３回洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％ＢＳＡを含むＰＢＳ３００μＬ／ウェル加え、室温１時間静置した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄の後、１０ｎｇ/ｍＬヒトシスタチンＣを含むＰＢＳ５０μＬ／ウェル加え、室温１時間静置して反応させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄の後、検出用にビオチン化した各抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体１μｇ／ｍＬを含むＰＢＳ５０μＬ／ウェル加え、室温１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄の後、５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ社）を５０μＬ／ウェル加えて室温で１時間静置し、当該プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５）５０μＬ／ウェルを加え、室温で１５分間反応後、４．５Ｎ硫酸５０μＬ／ウェルを加えて反応を停止させ、各ウェルの波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定し、反応性が認められた組合せを認識部位が異なるモノクローナル抗体とした。その結果、４種類の抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体ａ～ｄにおいて表１に示したような組合せが可能であることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　抗体ａに関してはｂ～ｄいずれの抗体とも組合せが可能であることを確認した。また抗体ｃに関しては、固相化した状態では、組合わせる抗体に関わらず反応性を示さなくなることから、不溶性担体への結合、すなわち固相化が必要な粒子増強免疫測定方法での利用は不可能と考えられた。
〔評価例２〕
認識部位が異なる抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体組合せにおける粒子増強免疫凝集の確認
　抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体ａ、ｂ、ｄをそれぞれ独立して少量結合させた抗体感作ラテックス粒子を調製し、認識部位が異なる組合わせでヒトシスタチンＣ濃度依存的な粒子増強免疫凝集の形成を確認した。
（抗体感作ラテックス粒子の調製）
　平均粒径０．１３μｍ又は０．３μｍ（積水メディカル社製）の０．５％ラテックス溶液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．５～９．０）に、０．２ｍｇ/ｍＬの各シスタチンＣモノクローナル抗体溶液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．５～９．０）を等量添加して４℃１時間攪拌後、等量の１％ＢＳＡ溶液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．５～９．０）を添加して４℃３０分間攪拌し、遠心して上清を除去後、沈殿を精製水で再懸濁し抗体感作ラテックス粒子溶液とした。このとき、抗体感作粒子の総重量に対する抗体の結合量は約３．８重量％となる。
（第一試薬の調製）
　７５０ｍＭの塩化カリウム、１％ＢＳＡを含む３０ｍＭ ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ８．７５）を調製し第一試薬とした。
（第二試薬の調製）
　２種類の抗体感作ラテックス粒子溶液を等量混合し、５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で最終吸光度２．０ＯＤとなるように希釈して第二試薬とした。試薬は評価例１の結果で強い反応性が認められたａ－ｂ、ａ－ｄ、ｂ－ｄの各抗体感作ラテックス粒子を、同一の粒子径同士で組合わせて調製した。
（測定方法）
　第一試薬と第二試薬を組合わせ、日立７１７０形自動分析装置を用いてヒトシスタチンＣ濃度依存的な粒子増強免疫凝集の形成を確認した。具体的には、濃度０、０．５、１．０、２．０、４．０、８．０ｍｇ/ＬのヒトシスタチンＣ溶液２．５μＬに第一試薬１００μＬを加えて３７℃で５分間加温後、第二試薬１００μＬを加えて攪拌した。その後５分間の凝集形成に伴う吸光度変化を、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにおける感度として測定した。
（結果）
　抗体ａ感作ラテックス粒子と抗体ｂ感作ラテックス粒子を組合わせた試薬で各濃度のシスタチンＣ溶液を測定したところ、図１記載のシスタチンＣ濃度－感度曲線に示したように、いずれの粒子でもシスタチンＣ濃度依存的に感度が上昇し測定が可能であることが確認された。０．１３μｍ粒子（黒四角）では低濃度域の感度がやや低いものの高濃度域の感度伸長が良好で、０．３μｍ粒子（白四角）では低濃度域は高感度であるが、高濃度域の感度伸長が不良であった。また、抗体ａ感作ラテックス粒子と抗体ｄ感作ラテックス粒子を組合わせた試薬では、０．１３μｍ粒子（黒丸）と０．３μｍ粒子（白丸）における低濃度域の感度が同等で、０．１３μｍ粒子では高濃度域まで感度が上昇するのに対し、０．３μｍ粒子ではほとんど感度伸長が認められなかった。したがって、組合せによっては利用できない粒子があるものの、両組合せとも免疫凝集測定方法への適用が可能と考えられた。一方、破線で示した抗体ｂ感作ラテックス粒子と抗体ｄ感作ラテックス粒子を組合わせた試薬では、０．１３μｍ粒子（黒三角）、０．３μｍ粒子（白三角）いずれにおいても、シスタチンＣ濃度依存的な感度上昇はほとんど認められず、粒子増強免疫測定方法での利用は困難と考えられた。
〔評価例３〕
ビアコアによる抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体の解離定数確認
　ビアコア装置（ＧＥヘルスケア社）を利用し、常法に則り精製抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体ａ、ｂ、およびｄの解離定数を算出した。具体的には、Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）を用いて、センサーチップにそれぞれ抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体を固定化し、濃度０μｇ／ｍＬ及び０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、１．０μｇ／ｍＬまでのヒトシスタチンＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）との反応性から解離定数を算出した（表２）。評価例２で粒子増強免疫測定への適用が可能と考えられた組合せａ－ｂ、ａ－ｄは、高親和性の抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体ａ（解離定数：０．２９ｎＭ）と、通常の親和力の抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体ｂ（解離定数：１．３２ｎＭ）もしくはｄ（解離定数：２．３０ｎＭ）の組合せとなっており、解離定数の比はそれぞれ、ｂ／ａ（１．３２／０．２９）が約４．６、ｄ／ａ（２．３０／０．２９）が約７．９と、組合わせた抗体間で明確な親和性の差が認められた。その一方で、粒子増強免疫凝集への適用が不可能と考えられたｂ－ｄは、一般的な親和力の抗体同士の組合せであり、また解離定数の比ｄ／ｂ（２．３０／１．３２）は約１．７と明確な親和力の差が認められなかった。このうち高親和性かつ最も汎用性が高いと考えられるモノクローナル抗体ａを産生するハイブリドーマ７５２０２を選択した。このハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６　日本国茨城県つくば市東１－１－１　中央第６）に２００８年１１月２０日に受領番号（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１８６）として寄託した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
〔評価例４〕
ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体特異性の確認
　ＥＬＩＳＡ法にて、今回作製した抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体ａ、ｂ、ｄの特異性評価を行った。詳細には１μｇ／ｍＬのヒトシスタチンＣ及びシスタチンファミリーに属するヒトシスタチンＡ、シスタチンＢ、シスタチンＤ、シスタチンＥ／Ｍ、シスタチンＦ、シスタチンＳ、シスタチンＳＡ、キニノーゲン（いずれもＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を含むＰＢＳ５０μＬを９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一晩静置してプレートに固相化した。次にこの９６穴マイクロプレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ３００μＬで３回洗浄した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％ＢＳＡを含むＰＢＳ３００μＬ／ウェル加え、室温１時間静置した。その後、作製した各抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体１μｇ／ｍＬを含むＰＢＳ５０μＬ／ウェル加え室温１時間静置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄の後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社）を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置した。その後、当該プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含むＰＢＳで３回洗浄し、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５）５０μＬ／ウェルを加え、室温で１５分間反応後、４．５Ｎ硫酸５０μＬ／ウェルを加えて反応を停止させ、各ウェルの波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
　対照として、抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体の代わりに抗ヒトシスタチンＣウサギポリクローナル抗体（ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ社）、ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体の代わりにペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社）を使用し特異性を比較した。
　図２に示したように、モノクローナル抗体ａ、ｂ、ｄいずれのモノクローナル抗体もヒトシスタチンＣのみと特異的に反応することが確認されたことから、これらの抗体を利用することによって、ヒト体液中のシスタチンＣを特異的に測定できると考えられる。一方、対照としたポリクローナル抗体は、シスタチンＣに加えてシスタチンＢ、シスタチンＤ、シスタチンＥ／Ｍ、シスタチンＳ、シスタチンＳＡ、シスタチンＳＮに対して同程度の強い反応性を、またシスタチンＡ、シスタチンＦ、キニノーゲンに対しても弱い反応性を示すことから、抗シスタチンＣポリクローナル抗体を利用した測定においては、これらシスタチンファミリー分子が共存する試料ではシスタチンＣの正確な測定は不可能であるものと予想された。
　評価例１－４を繰り返した結果、さらに粒子増強免疫測定への適用が可能と考えられる抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体ｅ、ｆ、ｇを用いた組合せ１、および２を見出した。いずれも解離定数１ｎＭ未満の高親和性抗体を少なくとも１種類含む組合せで、組合せ１は高親和性抗体同士の組合せで、解離定数の比は約２．１、組合せ２は高親和性抗体と一般的な親和力の抗体の組合せで、解離定数の比は約１５．４であった（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔実施例〕
　抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体ａ及びｂを使用し、ラテックス粒子径及び、その他諸条件を日立７１７０形自動分析装置の測定に最適化した本発明のシスタチンＣ測定試薬を調製し、抗シスタチンＣポリクローナル抗体を使用している既存のシスタチンＣ測定試薬（ＤＡＤＥ　ＢＥＨＲＩＮＧ社　Ｎ-ラテックス　シスタチンＣキット）と性能比較を実施した。なお抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体を使用した汎用自動分析装置用の測定試薬は、入手することができなかった。
（抗体感作ラテックス粒子の調製）
　平均粒径０．１５μｍの０．５％ラテックス溶液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．５）に、等量の０．１５ｍｇ／ｍＬ抗体ａ又はｂ溶液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．５）を添加して４℃１時間攪拌後、等量の１％ＢＳＡ溶液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．５）を添加して４℃３０分間攪拌し、遠心して上清を除去後、沈殿を精製水で再懸濁し抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体ａ及びｂ感作ラテックス粒子溶液とした。このとき、抗体感作粒子の総重量に対する抗体の結合量は約２．９重量％となる。
（第一試薬の調製）
　７５０ｍＭの塩化カリウム、１％ＢＳＡを含むｐＨ８．０の３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを調製し第一試薬とした。
（第二試薬の調製）
　抗体ａ感作ラテックス粒子溶液と抗体ｂ感作ラテックス粒子溶液を等量混合し、５ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で最終吸光度１．５ＯＤとなるように希釈して第二試薬とした。
（測定試料）
ヒト血清検体
（測定条件）
日立７１７０形自動分析装置： パラメータ条件
・検体－第一試薬－第二試薬；２．４μＬ－１２０μＬ－１２０μＬ
・分析法；２ポイントエンド法（測定ポイント１８－３４）
・測定波長；主波長５７０ｎｍ／副波長８００ｎｍ
・キャリブレーション；スプライン
（測定方法）
　濃度０、０．５、１．０、２．０、４．０、１０．０ｍｇ／ＬのヒトシスタチンＣ溶液の測定感度から検量線を作成し、その検量線をもとに各試料中のシスタチンＣ濃度を測定し、対照試薬と相関性（サンプル数Ｎ＝５０）、同時再現性（連続測定回数ｎ＝１０）、検出限界濃度（シスタチンＣ濃度ゼロ試料の測定平均感度＋２ＳＤと、シスタチンＣ濃度既知試料の測定平均感度－２ＳＤのエラーバーが重ならない濃度を検出限界濃度とする）を比較した。
（対照試薬及び分析装置）
　対照試薬：Ｎ－ラテックス　シスタチンＣキット
　分析装置：ＢＮ　Ｐｒｏｓｐｅｃ
　以上　ＤＡＤＥ　ＢＥＨＲＩＮＧ社製
（結果）
　本発明の試薬と対照試薬の検体測定値の相関性は良好であった（図３）。また再現性に関しては、本発明の試薬の変動係数は既存試薬の１／５以下と小さく再現性に優れていた（表４）。さらに検出限界濃度に関しても、対照試薬がシスタチンＣ濃度０．２ｍｇ／Ｌであるのに対し、本発明の試薬は０．０５ｍｇ／Ｌと１／４以下の低濃度まで検出可能であることを確認した（図４）。
　高親和性の抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体と、それとは認識部位が異なり、相対的に親和力の弱い抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体を、不溶性担体粒子にそれぞれ独立して結合させた抗体感作粒子を利用した本発明の粒子増強免疫測定方法により、抗体感作粒子の総重量に対する抗体の結合量が、従来の試薬において利用されてきた５重量％超～３５重量％よりも少量で、低コストであるのみならず、高性能かつ特異性の高いヒト体液中のシスタチンＣの測定方法が達成された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明の粒子増強免疫測定方法ならびに試薬及びキットにより、高性能、安価かつ簡便なヒト体液中のヒトシスタチンＣの検出・測定方法を提供する。

Claims (7)

  1. 　高親和性の抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体と、それとは認識部位が異なり、相対的に親和力の弱い抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体を、不溶性担体粒子にそれぞれ独立して結合させた抗体感作粒子を用いた粒子増強免疫測定方法であって、それぞれの抗体感作粒子の総重量に対する抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体の結合量が、５重量％未満であるヒト体液中のシスタチンＣ測定方法。
  2. 　不溶性担体粒子の平均粒子径が０．１～０．４μｍである請求項１記載のヒト体液中のシスタチンＣ測定方法。
  3. 　抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体が機能部位を含む抗体断片あるいは組換え型抗体である請求項１又は２記載のヒト体液中のシスタチンＣ測定方法。
  4. 　高親和性の抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体の解離定数（ｋｄ値）が１ｎＭ未満で、該解離定数で相対的に親和力の弱い抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体の解離定数を除した比が２以上である請求項１記載のヒト体液中のシスタチンＣ測定方法。
  5. 　ヒト体液が血清、血漿、滑液、乳、唾液、脳脊髄液、精漿、羊水、尿又は涙液である請求項１～４のいずれか１項記載のヒト体液中のシスタチンＣ測定方法。
  6. 　高親和性のヒトシスタチンＣモノクローナル抗体と、それとは認識部位が異なり、相対的に親和力の弱い抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体を、不溶性担体粒子にそれぞれ独立して結合させた抗体感作粒子であって、それぞれの抗体感作粒子の総重量に対する抗ヒトシスタチンＣモノクローナル抗体の結合量が５重量％未満である抗体感作粒子を含有する、ヒト体液中のシスタチンＣの粒子増強免疫測定試薬。
  7. 　不溶性担体粒子の平均粒子径が０．１～０．４μｍである請求項６記載の測定試薬。
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