JPS63235868A - リウマチ因子定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は抗原抗体反応による凝集によりリウマチ因子を
簡便かつ精度良く定量する方法に関する。

（従来の技術） 慢性関節リウマチは自己免疫疾患のひとつである。自己
免疫疾患とは、免疫系の機構に障害が生じるため、自己
の血清蛋白や組織を非自己血清蛋白や組織であると認識
するために起こる。その結果、抗体が産生される。例え
ば上記慢性関節リウマチ患者の血清中にはリウマチ因子
（１？ｈｅｕｍａ　ｔｏ　１ｄＦａｃｔｏｒ　；　ＲＦ
　）と呼ばれる蛋白が高頻度に出現する。このリウマチ
因子は、ローズ（Ｒｏｓｅ）らによって発見されて以来
、慢性リウマチの血清学的検査の重要な検査項目のひと
つとなっている。このリウマチ因子は、上記血清蛋白の
一種である自己ＩｇＧが誤認識されて生じた抗体である
と考えられ。

その本体もまた。　１８Ｇおよび／またはイムノグロブ
リンＭ　（ＩｇＭ）であることが知られている。

リウマチ因子の検出もしくは定量には免疫学的な種々の
手法が用いられ得るが１通常、受身凝集反応が簡便であ
るために汎用されている。例えば。

ウサギＩｇＧ　（リウマチ因子と反応し得る）を担持さ
せた不活性担体粒子を適当な緩衝液などに懸濁させた診
断試薬をウェル内で検体と混合すると。

上記リウマチ因子とウサギＴｇＧとの間に抗原抗体反応
が起こり、凝集が生じて円形の像が形成される。上記不
活性担体粒子としては、ヒツジ赤血球やラテックス粒子
が用いられている。このように。

受身凝集反応によりリウマチ因子を簡便かつ安価に定性
あるいは定量することが可能であるが１次のような欠点
がある。■検体によっては、凝集像がはっきりした形で
形成されないため、陽性および陰性の識別が困難な場合
がある。■強陽性の検体の場合、ウェル内の沈降物がウ
ェル内面をすべり落ちて形がくずれて正円とならず、そ
の結果。

定量的な判定が困難となる。■肉眼による目視観察によ
るため個人差によるバラツキが生じる。リウマチ因子を
測定することは、病態の把握を正確に行ううえで重要で
あるため、リウマチ因子を高精度でかつ簡便に定量し得
る方法の開発が望まれている。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものでありその目的
とするところは、検体中のリウマチ因子を精度よくかつ
簡便に定量する方法を提供することにある。本発明の他
の目的は、簡便にかつ安価に実施しうる従来の受身凝集
反応によるリウマチ因子定量法を改良し２次の特徴を有
し、精度が高くかつ再現性のあるリウマチ因子の定量方
法を提供することにある。■凝集像が鮮明であるため陽
性および陰性の識別が正確になされ得る。■ウェル内の
沈降物が正円を形成するため判定が容易である。０個人
差によるバラツキを生じない。

（問題点を解決するための手段および作用）本発明のり
ウマ予定量法は、ウェル内面にリウマチ因子と反応しう
る生理活性物質を結合させる工程、および該ウェルにリ
ウマチ因子と反応しうる生理活性物質を不活性担体粒子
に担持させた診断試薬および検体を加えて反応させる工
程を包含する受身凝集反応で°あり、そのことにより上
記目的が達成される。

本発明方法に用いられるリウマチ因子と反応しうる生理
活性物質としては、リウマチ因子と特異的に抗原抗体反
応しうる蛋白（抗原）、および／またはヒトＩｇＧもし
くはヒトＩｇＭと抗原抗体反応しうる抗体が挙げられる
。リウマチ因子の本体は上述のように、　　ＩｇＧをは
原として認識するヒトＩｇＭおよび／またはヒトＩｇＧ
であり、これらと特異的に抗原抗体反応しうる蛋白とし
ては、ヒトＩｇＧおよびウサギＩｇＧがある。上記抗体
としては、抗ヒ）１ｇ（ウサギ、ヤギ、ブタなどの動物
にヒトＩｇＧを免疫して得られる）、抗ヒトγ鎖、抗ヒ
トμ鎖などがある。これらの抗体のうち抗ヒトｒｇはヒ
ト　ＩｇＧおよびヒト　ＩｇＭの両者に反応し、抗ヒト
γ鎖（γ鎖はＩｇＧのＨ鎖に相当）はヒト　ＩｇＧに、
そして抗ヒトμ鎖（μ鎖はＩｇＭのＨ鎖に相当）はヒト
１ｇＭに反応する。これらのうちで特に好適に用いられ
るのは、ウサギにヒトＩｇを免疫して得た抗ヒト　Ｉｇ
である。

本発明方法によりリウマチ因子を定量するには。

まず、上記生理活性物質をその内面に結合させたウェル
を有するプレートを調製する。ここでウェルとは９通常
、マイクロタイターなどに使用する複数個のくぼみを持
った反応用プレートの該くぼみの部分を指すが、抗原抗
体反応による凝集反応の像が目視観察できる容器であれ
ばよく、特に限定されない。上記生理活性物質を例えば
、適当な緩衝液の溶液としてウェルに分注し、乾燥（例
えば凍結乾燥）して、該生理活性物質を物理的にウェル
内面に結合させる方法；γ−アミノプロビルトリエトキ
シレラン、ゲルタールアルデヒドなどの結合試薬を用い
てウェル内面に化学的に結合させる方法などが採用され
得る。

リウマチ因子と反応しうる生理活性物質を不活性担体粒
子に担持させた診断試薬としては、従来のタイプの診断
試薬が利用され得る。不活性担体粒子としては９例えば
、ヒツジ、ヒト　ニワトリなどの赤血球；ポリスチレン
などのラテックス上子が用いられる。これらに上記生理
活性物質が物理吸着、化学的な結合などの通常の方法に
より担持される。

上記生理活性物質が担持されたウェルに、血清などの検
体および上記診断試薬を加えると、血清中に含有される
リウマチ因子および生理活性物質が抗原抗体反応により
結合し、凝集物を形成する。

本発明方法においては反応ウェル内面にあらかじめ生理
活性物質が固定化されているため、ウェル上の生理活性
物質に上記凝集物（詳しくは凝集物中のリウマチ因子）
が結合する。そのためウェル内の凝集物が速やかにウェ
ル内面に結合し、肉眼で観察しうる凝集像が速やかに形
成される。ウェル内面に凝集物が捕捉されるので、従来
のように。

特に強拍性の場合、凝集物がウェル内面を滑り落ちて凝
集像が（ずれ判定しにくくなるような事態が回避される
。形成された凝集像は鮮明であるため、陰・陽性がまぎ
られしい領域の検体も正確に判定がなされる。

本発明方法においては、さらに１反応時にリウマチ因子
と反応しうる生理活性物質を遊離（フリー）の状Ｂ（他
の不活性担体などに担持させない状Ｂ）で存在させても
よい。フリーの状態の生理活性物質が存在すると１反応
時の凝集物にこのフリーの生理活性物質が結合するので
凝集塊が大きくなり、その結果、該凝集塊が沈降しやす
（なり速やかに凝集像が形成される。凝集像もより鮮明
となり、より正確で迅速な測定がなされ得る。このフリ
ーの状態の生理活性物質は２反応液中に２０００ｐｇ／
ｄ以下、好ましくは１０〜１０００　ｐ　ｇ／　ｍｉの
濃度となるように添加される。フリーの生理活性物質の
量が多すぎると凝集物中のリウマチ因子の結合部位にこ
のフリーの生理活性物質が結合する結果。

該リウマチ因子とウェル内面に固定された生理活性物質
とが反応する部位がなくなるため、凝集物をウェル内面
に捕捉できなくなる。そのため、生理活性物質をウェル
内面に固定化することによる効果が得られなくなる。

本発明方法においては、ウェル内面に固定する生理活性
物質９診断試薬に用いられる生理活性物質およびフリー
の生理活性物質は、リウマチ因子と反応する性質を有し
ている限り同一化合物であってもそれぞれ異なっていて
もよい。

本発明方法と同様に生理活性物質をウェル内面に結合さ
せる従来の方法としては、酵素免疫測定法が挙げられる
。この方法により２例えば検体中の抗原を検出する場合
には、まず、ウェルに上記抗原と反応しうる抗体をあら
かじめ結合させておき、これに検体および酵素を結合さ
せた抗体（標識化抗体）加える。このことにより、ウェ
ル上の抗体および標識化抗体が検体中の抗原を介して結
合される。次にこれを洗浄し、上記抗原−抗体反応の結
合物（Ｂｏｕｎｄ　：　Ｂ）と過剰の標識化抗体などの
未結合物（ｐｒｅｅ　；　Ｆ）との分離（Ｂ／Ｆ分離）
を行う。このウェル上に残存する抗原−抗体結合物の酵
素活性を種々の方法により測定することにより検体中の
抗原が定量される。このように酵素免疫測定法は、　Ｂ
／Ｆ分離を行いウェル上の標識（酵素）量を測定する方
法であり２本発明の凝集像を目視判定する方法とは異な
る。

本発明の生理活性物質をフリーで添加する方法に類似の
方法としては、抗原抗体反応の反応液中にフリーの抗体
を加える方法が、特開昭５９−９２３５３号公報に記載
されている。しかし、この公報の方法は例えば検体中の
抗原とラテックスに担持させた診断試薬とにより生じる
濁度を光学的に測定する定量法であるため２本発明の生
理活性物質をウェルに固定して反応の凝集像を判定する
測定法とは異なる。さらに、上記公報の方法においては
。

ラテックス上の抗体とフリーの抗体とは同種であるが１
本法においては、必ずしも同種である必要はない。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

実生拠上 （Ａ）抗ヒトイムノグロブリン感作プレートの調製：ヒ
トＩｇＧ　（シグマ社製）を完全フロインドアジュバン
トと混合し、これを家兎に１ｍｇ／回の割合で２週間間
隔にて４回注射し、免疫を行った。

この家兎から採血して血清を得、これを遠心分離して、
抗血清（抗ヒトイムノグロブリン）を得た。

この抗血清を３５％硫酸アンモニウム溶液で塩析した後
、　ＤＥＡＥ−セルロースによるカラムクロマトグラフ
ィー（ｐｔ＋　８．３　０．０３Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｃ
Ｉ　Ｂｕｆｆｅｒ）を行い、抗ヒトイムノグロブリン　
ウサギＩｇＧ画分を得た。このＩｇＧ画分をｐＨ７，０
０，１Ｍリン酸緩衝液に透析した後、同緩衝液で０．２
■／−の溶液とした。

これを９６穴マイクロプレート（三光純薬製）のウェル
に０．２５ｄ／ウエルの割合で分注した。これを３７℃
で２時間静置した後、４℃で一晩放置した。

ウェル内の余分な溶液を除去した後凍結乾燥した。

（ｂ）ウサギＩｇＧ結合ラテックスの調製：ウサギＩｇ
Ｇ（シグマ社製）をｐＨ８，２０，１Ｍグリシン−Ｎａ
ＯＨ緩衝液に０．２■／−となるように溶解し２等容量
のラテックス液（日本合成ゴム社製、固形分１％）を加
えて混合した。３７°Ｃにて３時間加温した後。

遠心洗浄を行いウサギＩｇＧ感作ラテックスを得た。

（Ｃ）　　リウマチ因子の測定：リウマチ患者血゛清を
ゼラチン−ベロナール緩衝液で１０倍希釈し、さらに同
緩衝液を用いて２倍段階希釈を行い、２０〜２５６０倍
まで８段階に希釈された検体を得た。これら検体各２５
μｌを（Ａ）項で得られたプレートの各ウェルに分注し
た。これに（Ｂ）項で得られたウサギＩｇＧ感作ラテッ
クス（固形分０．５％）２５μ！加えて１２０分間静置
した。その凝集像を第１図（ａ）に示す（陽性検体）。

別に正常人血？ｎを用いて同様に操作を行った。その結
果を第１図（ａ）に示°す（陰性検体）。第１図および
後述の第２図〜第３図において凝集像の斜線を付した部
分は、均一な沈降・凝集状態であることを示す。

止較■上 抗ヒトＩｇＧ　（ウサギ）を感作させていないプレート
を用いたこと以外は実施例１と同様である。

その結果を第１図（ｂ）に示す。

第１図（ａ）および（ｂ）から、抗ヒトＴｇＧ感作プレ
ートを用いた本発明方法（実施例１）においては。

凝集像は均一な正円となるためリウマチ因子が正確に検
出されることがわかる。これに対して、従来の方法（比
較例１）では、高濃度検体においては抗原抗体反応によ
る沈降物が正円とならずくずれるため判定を誤るおそれ
があり、正確な判定がなされにくい。正常人血清を用い
た陰性検体においては、いずれの方法によっても凝集像
は形成さレス、ウェル中央部にラテックスのボタン状の
沈降像が認められるのみであり、希釈倍率による差も認
められなかった。

実施例１の方法においては、ウェルに結合した抗ヒトＩ
ｇＧ　（抗体）にリウマチ因子が抗原として結合し、さ
らにこのリウマチ因子の他の結合部位がラテックス上の
ウサギＩｇＧに抗体として結合するのが基本的な結合の
原理であると考えられる。

実施±１ リウマチ因子の測定時にフリーの抗ヒトＩｇＧ　（ウサ
ギ）を最終濃度が１００μｇ／−となるように加えたこ
と以外は実施例１と同様である。その結果を第２図に示
す。第２図から、フリーの抗体である抗ヒトＩｇＧが加
えられた本実施例の場合は２実施例１に比べ、希釈率が
３２０倍および６４０含においてさらに鮮明で大きな凝
集像が得られる。、そのため、陰・陽性の判定のまぎら
れしい領域においても、より正確な測定がなされること
が明らかである。

次ＪＬ［生１ （ａｌウサギＩｇＧ感作プレートの調製：正常ウサギ血
清を３５％硫酸アンモニウム溶液で塩析し、　ＤＥＡＥ
−セルロースによるカラムクロマトグラフィー（ｐＨ８
，３０，０３Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｃｌ　Ｂｕｆｆｅｒ）
を行い、ウサギＩｇＧ画分を得た。このＩｇＧ画分を用
い、実施例１（＾）項に準じて操作してマイクロプレー
トのウェル上に固定し、ウサギＩｇＧ惑作プレートを得
た。

（Ｂ）　　リウマチ因子の測定二本実施例（Ａ）項で得
られたプレートを用い、実施例１（Ｃ）項に準じて測定
を行った。その結果を第３図に示す。第３図から２本実
施例の場合も実施例１と同様に正確な測定がなされるこ
とが明らかである。

本実施例の方法においては、抗原としてウェルに結合し
たウサギＩｇＧ　（抗原）にリウマチ因子が抗体として
結合し、さらにこのリウマチ因子の他の結合部位がラテ
ックス上のウサギＩｇＧに抗体として結合するのが基本
的な結合の原理であると考えられる。

（発明の効果） 本発明方法によれば、このように、従来の受身凝集反応
の改良により、リウマチ因子の定量が精度良くかつ短時
間のうちになされる。ウェル内に凝集像が鮮明に形成さ
れるため判定の個人差によるバラツキが少なく、再現性
に優れる。特殊な装置や試薬を使用しないため安価にリ
ウマチ因子の定量が行われ得る。

４、　ヌ　　の　　゛　なう■ 第１図（ａ）、第２図および第３図は本発明方法により
血清中のリウマチ因子を定量したときに形成された凝集
像を、そして第１図（ｂ）は従来の受身凝集反応法によ
り血清中のリウマチ因子を定量したときに形成された凝
集像を示す。

第１図 ｋＬシ１１１　ノド釈イ＠牢

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ウェル内面にリウマチ因子と反応しうる生理活性物
   質を結合させる工程、および 該ウェルにリウマチ因子と反応しうる生理活性物質を不
   活性担体粒子に担持させた診断試薬および検体を加えて
   反応させる工程、 を包含する受身凝集反応によるリウマチ因子定量法。 ２、前記診断試薬および検体を加えた反応系にリウマチ
   因子と反応しうる生理活性物質が遊離状態で存在する特
   許請求の範囲第１項に記載のリウマチ因子定量法。 ３、前記生理活性物質が、リウマチ因子と特異的に抗原
   抗体反応しうる蛋白、および／またはヒトイムノグロブ
   リンＧもしくはヒトイムノグロブリンＭと抗原抗体反応
   しうる抗体である特許請求の範囲第１項に記載のリウマ
   チ因子定量法。 ４、前記蛋白がヒトイムノグロブリンＧおよび／または
   ウサギイムノグロブリンＧであり、そして前記抗体が抗
   ヒトイムノグロブリン、抗ヒトγ鎖および抗ヒトμ鎖の
   うちの少なくとも一種である特許請求の範囲第３項に記
   載のリウマチ因子定量法。