JP2001502795A

JP2001502795A - 血液型抗原および抗体の検出に有用な方法および装置

Info

Publication number: JP2001502795A
Application number: JP10518360A
Authority: JP
Inventors: フレーム、トーマス、エイチ．; ハッチャー、デービッド、イー．; モールズ、ジョン、ジェイ．
Original assignee: ガンマバイオロジカルズインコーポレイテッド
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 2001-02-27
Also published as: AU4503297A; WO1998016832A1; AU4650797A; WO1998016831A1; US5905028A; EP0934523A4; CA2266674A1; EP0934523A1

Abstract

(57)【要約】血液型群抗原および抗体を検出する方法および装置が開示される。当該方法は直接または間接アッセイである。直接アッセイは、２層の免疫反応性粒子（その第一層にはプロテインＧが共役され、第二層にはプロテインＡが共役されている）を含む反応管に赤血球サンプルを添加することを含む。血液型抗原に特異的な抗体が当該粒子上のリガンドに共役される。続いて反応管は、当該粒子上の抗体に結合しない赤血球を当該反応管の底に押しつけるために遠心される。間接アッセイは、赤血球、被験血清または血漿サンプルを得て、さらに、検出すべきものが抗原であるか抗体であるかによって既知の抗体または抗原試薬とこれらを混合することを含む。混合物を反応管内で２層の粒子上（その第一層にはプロテインＧが共役され、第二層にはプロテインＡが共役されている）で保温する。当該反応管は、当該粒子上の抗体に結合しない赤血球を反応管の底に押しつけるために遠心される。陽性反応では、粒子内に目で見て検出可能な結合赤血球のラインまたはゾーンが生じる。陰性反応では、反応管の底に目で見て検出可能な非結合赤血球ゾーンが生じる。

Description

【発明の詳細な説明】血液型抗原および抗体の検出に有用な方法および装置本発明は免疫アッセイ検査の分野に関し、より具体的には血液型抗原および抗体の検出に関する。種々の抗原および抗体についての血液検査は日常的に行われている。例えば、患者が輸血を受ける前に、多くの基礎的検査が患者および供血者の両者の血液サンプルについて実施されなければならない。特に、ＡＢＯおよびＲｈ血液型の決定のために血液型を判定しなければならない。輸血を行う前に、患者の血清を適合性について検査（または交差適合試験）し、血清が特定の供血者の赤血球上に存在する抗原に対する抗体を含んでいるか否かを決定する必要がある。さらにまた、血清中に存在することが判明した抗体の数は増加している。ある種の抗体の有無を決定することは、ある種の疾患の診断および治療において極めて重要である。血液型検査、適合性検査および抗体スクリーニングは、通常何らかのタイプの凝集免疫アッセイによって実施される。簡単で応用範囲が広いために凝集アッセイは血液検査で用いられる最も一般的な方法の１つになった。凝集アッセイは、比較的簡単に実施でき、しかも高価な検出装置を用いないで目で検出または読み取ることができる。古典的で単純な直接凝集アッセイ（例えば抗Ａ血清によるＡ型赤血球の凝集）では、Ａ型抗原を有する細胞を抗体によって直接凝集させる。このタイプの検査法の重大な欠陥の１つは、検査されるべき個々の血液型抗原が弱く発現されている赤血球では、目で見て陽性反応を適切に決定できるほど凝集または凝集塊が形成されない傾向があるということである。さらにまた、いくつかの事例では、ＩｇＧクラスの抗体は高い親和性で赤血球に結合するが、凝集を誘発できない。抗ＩｇＧ抗体の添加は赤血球上に存在する抗体を架橋させて凝集を引き起こす。このタイプの反応の例は古典的間接クームス（Coombs）検査であるが、この検査では検査血清を先ず被験赤血球と保温し、さらに赤血球を洗浄して過剰の未結合抗体を除去し、続いて抗グロブリン血清（クームス試薬）と混合する。ラピエールらは、血液成分（赤血球または血清）の型判定用の試薬（抗体または抗原）の存在下で不活性粒子を用いる凝集アッセイの変法を報告した(Lapierr eら、Transfusion 30:109-113(1990))。間接検査のためには、試薬（例えば血清）および血液成分（例えば赤血球）を混合して一定の時間保温する。混合物を７０×ｇで約１０分遠心して、凝集試薬溶液（一般に抗ヒトＩｇＧ、クームス試薬）を含む媒体中で不活性粒子（すなわちデキストランゲル）床に沈澱させる。凝集赤血球は不活性粒子マトリックス内に捕捉され陽性反応を表示する。陰性反応では、赤血球は粒子を通り過ぎて反応管の底に沈澱する。ラピエールの方法では不活性粒子マトリックス上に凝集赤血球を捕捉することによって陽性反応を表示するので、弱陽性反応では外観が顕著に変動する。一般に弱陽性反応では、赤血球のいくらかが反応管の底に沈澱し、残りは多数の凝集塊として捕捉される。凝集赤血球塊のサイズは抗原／抗体反応の強さに左右される。したがって、反応が弱い場合、凝集塊は小さく粒子マトリックスを通過する可能性が高い。ラピエールの方法は実施が簡単な検査を提供するが、弱陽性反応では読み取りが依然として困難である。したがって、弱陽性反応が存在する場合により簡単でより融通性があり読み取リが容易なアッセイを確立するために、この分野では血液型判定アッセイ技術の改良の余地がある。本発明は、融通性を有し迅速で正確な改善された血液型決定システムを提供する。そのような検査の結果、偽陰性反応が減少する。本発明の方法は血液型抗原および抗体の検出を目的とする。本方法は、免疫反応性アフィニティークロマトグラフィー技術を利用して血液型抗原および抗体を検出する。本発明の方法の主要な用い方として２つのタイプのアッセイ、直接アッセイおよび間接アッセイが想定されている。この方法は、抗体を結合させるリガンドが共有結合によって結合されている粒子を用いる。したがって、この粒子は免疫学的に反応性を有する。この免疫反応性粒子は種々の物質で構成できるが、アガロースが好ましい。リガンドは、いくつかの免疫グロブリン結合性タンパク質の１つ、例えばプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇまたはカッパロック(KappaLock)でありうるが、ＩｇＧクラス抗体が用いられるか(例えば直接検査)、またはＩｇＧクラス抗体を検査する（例えば間接検査）場合にはプロテインＧが好ましい。本発明の特に好ましい実施態様では、免疫反応性粒子は反応管に入れられる。反応管の免疫反応性粒子集団は粒子マトリックスを形成する。この粒子マトリックスは二層の粒子を含む：すなわち、抗体を結合させるリガンド（好ましくはプロテインＧ）が共有結合によって結合させられている第一層粒子、および抗体を結合させるリガンド（好ましくはプロテインＡ）が共有結合によって結合させられている第二層粒子である。第一層の粒子は多様な物質で構成できるが、セファロースが好ましい。第二層の粒子は多様な物質で構成できるが、セファクリルが好ましい。全ての粒子は抗体結合性リガンドと共有結合によって結合しているので、全ての粒子が免疫反応性である。それにもかかわらず、各層の粒子は、それを構成する物質およびそれと共有結合している抗体結合性リガンドが異なっているので、各粒子層は別個の免疫反応性粒子層である。本発明の特に好ましい実施態様では、当該粒子は反応管に充填される。第一層の免疫反応性粒子が第二層の免疫反応性粒子の上に重層されるように粒子を反応管に入れる。第一層の免疫反応性粒子と第二層の免疫反応性粒子との好ましい比は約１：９である。直接アッセイでは、赤血球は反応管内の粒子床の上に重層される。この免疫反応性粒子には対象抗原に特異的な抗体がリガンドを介してそれら粒子表面に結合している。反応管を遠心して非結合赤血球を管の底に沈澱させる。陽性反応は反応管の上部の粒子に赤血球を結合させ、反応管の上部１／２に赤血球の明瞭なラインを生じるであろう。陰性反応は、実質的に全ての赤血球を反応管の底に沈澱させるであろう。弱陽性反応の場合、相応の量または質の被験抗原を有する赤血球は反応管の上部１／２の粒子と結合し明瞭なゾーンを生じるであろう。残余の大半の赤血球は反応管の底に沈澱するであろう。赤血球と粒子との結合は、赤血球上の抗原と粒子上のリガンドに結合させた抗体との親和性による。本発明の特に好ましい実施態様を用いる直接アッセイでは、第一の免疫反応性粒子層のみが、粒子表面にリガンドを介して結合させた対象抗原特異的抗体を有する。したがって、反応管の遠心に続いて非結合性赤血球は試験管の底に沈澱するであろう。陽性反応では赤血球は免疫反応性粒子と結合し、反応管の免疫反応性粒子の上部で結合赤血球の明瞭なラインを生じるであろう。陰性反応では実質的に全ての赤血球が反応管の底に沈澱する。弱陽性反応の場合は、相応の量および質の被験抗原をもつ赤血球は、反応管の上部粒子中の免疫性粒子と結合し明瞭なゾーンを生じ、残余の赤血球は反応管の底に沈澱するであろう。間接アッセイでは、赤血球表面上の抗原が血清中に存在する抗体と反応するために十分な時間、赤血球と血清が一緒に保温される。この赤血球／血清混合物を遠心して赤血球結合抗体を免疫反応性粒子に暴露する。遠心工程は、一切の非結合性赤血球が粒子マトリックスを通過するために十分な時間である。陽性反応では、赤血球上の抗原に付着した抗体に対するリガンドの親和性によって粒子と結合した赤血球の明瞭なラインが生じる。陰性反応では、赤血球は反応管の底に沈澱する。弱陽性反応の場合は、赤血球のいくらかは反応管の上部１／２でラインを形成し、残余は反応管の底に沈澱するであろう。本発明の特に好ましい実施態様を用いる間接アッセイでは、陽性反応は、赤血球上の抗原に付着した抗体に対するリガンドの親和性によって、反応管内粒子の上部に存在する免疫反応性粒子と結合した赤血球の明瞭なラインを生じる。陰性反応では、赤血球は反応管の底に沈澱する。弱陽性反応の場合は、赤血球のいくらかは、反応管内粒子の上部に存在する免疫反応性粒子内にラインを形成し、残余は反応管の底に沈澱するであろう。直接アッセイ（すなわち抗原／抗体反応）で赤血球を粒子と結合させる反応は、赤血球を凝集させる反応と同じである。しかしながら、ここでは反応管内の粒子間間隙を通過するには大きすぎる凝集塊を形成させる代わりに、血球を直接粒子に結合させ互いに結合させない。したがって、本発明の反応は親和性反応であって凝集反応ではない。同様に間接アッセイでは、保温中に赤血球抗原に固定された抗体に対してリガンドが有する親和性によって赤血球は粒子と結合することになる。赤血球の凝集ではなく、赤血球の粒子への付着が存在する。したがって本発明の方法は、粒子に対する赤血球の親和性によって陽性反応を表示する。結果として本発明の方法では従来技術の方法よりも陽性反応が明瞭であり確実である。図１Ａは強陽性反応の側面図である。この場合、結合赤血球は非常に明瞭で太いラインを反応管の上部１／２に形成する。図１Ｂは弱陽性反応の側面図である。この場合、相応の量または質の抗原／抗体反応が赤血球を粒子に結合させ、反応管の上部１／２に明瞭なラインを形成する。同様な結合を生じる相応の量または質の抗原／抗体反応を生じない赤血球は反応管の底に沈澱するであろう。図１Ｃは陰性反応の側面図である。この場合、いずれの赤血球も粒子に結合するために必要な抗原／抗体反応を惹起せず、赤血球は粒子に結合しないので反応管の底に沈澱する。図１Ｄは、本発明の特に好ましい実施態様である第一および第二の免疫反応性粒子マトリックス層を充填した反応管の側面図である。図２Ａは、好ましい一体型６管列ユニットの立面図である。図２Ｂは、同じ一体型６管列ユニットの上面図である。図２Ｃは、同じ一体型６管列ユニットの側面図である。図２Ｄは、四角に切った基底部を示す同じ一体型６管列ユニットの末端図である。図２Ｅは、図２Ｄに示した反対側の端の末端図で、図２Ｄよりもわずかに細い基底部を示している。本発明の方法は、２つのタイプのアッセイに使用することが想定されている。第一のタイプは直接アッセイで、この場合、赤血球抗原に対する抗体は、反応管内の粒子と共有結合によって結合されているリガンドに共役（couple）される。続いて赤血球はリガンド結合抗体を介して粒子に結合する。第二のタイプは間接アッセイである。この場合、赤血球は血清抗体に暴露され、混合物は抗体を赤血球に結合させるために保温される。続いて赤血球・抗体複合物を粒子上のリガンドと結合させる。粒子本発明の方法で用いられる粒子は、リガンドを共役させることができる、凝集アッセイで用いることができるいずれの粒子でもよい。しかしながら、当該粒子は好ましくはアガロース、セファロースまたはラテックスである。ただし、リガンドを共役させることができる他のタイプの粒子もまた本発明の範囲内に含まれる。これらの粒子の形状は一般にビーズである。最も好ましいものはアガロースおよびセファロースである。これらの粒子はビーズ状ゲルの形状をとる。特に好ましい実施態様では、第一の免疫反応性粒子層に用いられる粒子は、リガンドを共役させることができる凝集アッセイで用いられるいずれの粒子でもよい。しかしながら、これらの粒子は好ましくはアガロース、セファロースまたはラテックスで、ただしリガンドを共役させることができる他のタイプの粒子もまた本発明の範囲内に含まれる。これらの粒子の形状は一般にビーズである。好ましいものはアガロースおよびセファロースである。本発明の方法の実施態様で使用される特に好ましいものは、ファルマシア・バイオテック社(Pharmacia Biote ch)のプロテインＧセファロース４Ｂファストフロー（Protein G Sepharose 4B Fast Flow）である。本発明の方法の特に好ましい実施態様で第二の免疫反応性粒子層に用いられる粒子は、以下の基準に適合しなければならない：（１）プロテインＧセファロース４Ｂファストフロー粒子と混合したとき、セファロース粒子が当該粒子の上部に層を形成するように、すなわち非セファロース粒子がセファロース粒子より速く沈澱するように、非セファロース粒子は反応容器中で沈降し、さらに、（２）プロテインＧセファロース４Ｂファストフロー粒子と混合したとき、非セファロース粒子は反応管列の完璧な充填を可能にするために十分流動性を有していなければならない。第二の免疫反応性粒子層に用いられる特に好ましい粒子はセファクリルＳ−１００、Ｓ−２００およびＳ−４００である。最も好ましいものはセファクリルＳ −２００である。図１Ｄで示したように、第二の免疫反応性粒子層４は反応管の最大容積を占有し、第一の免疫反応性粒子層２は当該第二の免疫反応性粒子層の上に配置される。リガンド免疫グロブリン分子と結合し、共有結合によって粒子と共役しうる多数のリガンドが知られている(例えばプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇおよびカッパロック)。ＩｇＧ免疫グロブリンが用いられるかまたは検査される場合は、プロテインＧがアッセイで使用するために特に好ましいリガンドである。プロテインＧが好ましい理由の１つは、殆どのＩｇＧ免疫グロブリンに対してプロテインＧはプロテインＡより強い親和性を有することである。プロテインＧはまた、ある種のＩｇＧサブクラス（例えばヒトＩｇＧ３、マウスＩｇＧ１およびラットＩｇＧ２ａ）とプロテインＡより極めて強い親和性で結合する。プロテインＧはヒトＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＤとは結合しない。プロテインＧは、Ｇ群連鎖球菌から単離精製された細菌の細胞壁タンパクである。プロテインＧは哺乳類ＩｇＧ免疫グロブリンとそのＦｃ部分を介して結合する。プロテインＧはＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部分とのみ結合するので、免疫グロブリンの抗体部分はその対応する抗原と反応するためになお利用可能な状態で、しかも当該免疫グロブリンは当該粒子と結合したままの状態である。天然のプロテインＧがＤＮＡ分析によって配列決定された。このＤＮＡ分析によって、２種のＩｇＧ結合ドメイン並びにアルブミンおよび細胞表面結合部位が特定された。イムノピュア(ImmunoPure)(登録商標)固定プロテインＧは市販ルートで入手可能な粒子製品で、アガロースゲルビーズ粒子の表面にプロテインＧが固定されている。本製品はピアス社（Pierce，イリノイ州、ロックフォード）から入手できる。当該固定プロテインＧは遺伝子工学によってアルブミンおよび細胞表面結合領域が除去され、それによって免疫グロブリン以外の他の一切との結合が最小限に抑えられている。イムノピュア（登録商標）固定プロテインＧは、架橋６％ビーズ状アガロースに共有結合によって連結された（ビーズのグルタルアルデヒド活性化）組換えプロテインＧからなる。この物質は５０％スラリーとして供給される。この物質は１ｍｌのゲルにつき１１ｍｇのヒトＩｇＧを結合させる。プロテインＡは数株の黄色ブドウ球菌によって産生される細胞壁成分である。プロテインＡは、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧのＦｃ領域を特異的に結合させることができる。プロテインＡ分子は、いくつかの種のＩｇＧ由来のＦｃ領域と相互作用することができる４つの高親和性結合部位を有する。プロテインＡはいくつかのＩｇＧサブグループと相互作用するが、他のものとは反応しない。例えば、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４と強く結合し、一方ＩｇＧ３とは結合しない。さらにまた、いくつかの事例ではモノクローナル抗体はプロテインＡと結合しない。固定プロテインＡはピアス社から市販ルートで入手できる。この固定プロテインＡは高度に精製されたプロテインＡで、架橋ビーズ状アガロースに共有結合によって共役されている。この固定プロテインＡの典型的な結合能は、ゲル１ｍｌにつき１２〜１５ｍｇのヒトＩｇＧである。プロテインＡ／Ｇは、遺伝子工学的に操作されたタンパク質で、プロテインＡおよびプロテインＧの両方のＩｇＧ結合プロフィールを合わせもつ。この遺伝子工学によって製造されたプロテインＡ／Ｇは、プロテインＡ由来の４つのＦｃ結合ドメインおよびプロテインＧ由来の２つの結合ドメインを含むようにデザインされている。プロテインＡ／Ｇは全てのヒトＩｇＧサブクラスと結合する。さらに、プロテインＡ／ＧはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤに結合するがＩｇＤへの結合度は低い。したがって、プロテインＡ／Ｇは、非ＩｇＧクラスの免疫グロブリンの検査、または非ＩｇＧクラスの免疫グロブリンを用いる検査で好ましいリガンドであろう。ピアス社はまた、ビーズ状アガロースに共有結合させた固定プロテインＡ／Ｇをイムノピュア（登録商標）固定プロテインＡ／Ｇの商標名で供給している。カッパロック(KappaLock)は、アーストン社(Aaston，Inc.，Falmouth Road，マサチューセッツ州、Wellesley)から入手できる全カッパ軽鎖結合性タンパク質である。これはペプトストレプトコツカス属（Peptostreptococcus）の一菌株のＤＮＡから遺伝子工学によって製造された。このタンパク質は、全ての抗体タイプの軽鎖カッパ領域と結合する。カッパロックは遺伝子工学によって、天然の細菌タンパク質の有するアルブミンおよび細胞壁結合領域が削除されている。得られたタンパク質は４つの抗体結合ドメインを有するが、特に重鎖または免疫グロブリンのＦｃ領域とは結合しない。カッパ軽鎖は異なる抗体クラス間で共通であるので、カッパロックは重鎖のクラスに関係なくカッパ軽鎖を有する抗体と結合するであろう。カッパロックは種々の支持体、特にアガロースビーズに固定できる。固定カッパロックは、マウスＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＡおよびヒトＩｇＭを捕捉するであろう。全ての好ましいリガンドは、アガロースビーズのような固相マトリックス（例えばセファロース・ファルマシア）に例えばハーンらが記載したような既知の技術(Hearnら、Methods in Enzymology 35:102-117(1987))を用いて共有結合によって結合させることができる。一般には、これらビーズは、化学薬剤（例えばグルタルアルデヒド、カルボニルジイミジゾル、シアノゲンブロミドヒドロキシ− スクシンイミド、トシルクロリドなど）によって先ず活性化される。続いて選択したリガンドを共有結合によってビーズに結合させ、リガンドを支持体に極めて安定的に連結させることができる。特に好ましい実施態様では、第一の免疫反応性粒子層で使用されるリガンドは、以下のいくつかの免疫グロブリン結合タンパク質の１つであろう。例えばプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇまたはカッパロック（登録商標）であるが、ＩｇＧクラスの抗体を用いる場合（例えば直接試験）またはＩｇＧ抗体について検査する場合（例えば間接試験）はプロテインＧが好ましい。第二の免疫反応性粒子層用にはプロテインＡが特に好ましい。第二の免疫反応性粒子層で用いられる特に好ましい粒子は、粒子にリガンドが結合されていない状態で入手することができる。そのような場合には、下記の工程ＡおよびＢに設定した手順が好ましい：Ａ．セファクリルＳ−２００のグルタルアルデヒド活性化１．必要量の食塩水洗浄セファクリルＳ−２００を０．５Ｍの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で３回洗浄。２．排気フード内で等容積の６．２５％グルタルアルデヒド含有０．５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を添加。３．当該混合物のｐＨを測定し、必要に応じて調整。ｐＨは７．２〜７．６の範囲内になければならない。４．回転器上で一晩穏やかに攪拌しながら３７℃で混合物を保温。５．活性化セファクリルＳ−２００を０．５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２回洗浄。これでセファクリルＳ−２００は共役準備完了。Ｂ．活性化セファクリルＳ−２００へのプロテインＡの共役．１．約１００μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌ、好ましくは約２５０μｇ／ｍｌの組換えプロテインＡ（ピアス社）を０．５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中に含む溶液の等容積を添加。回転器上で室温で一晩保温。２．０．５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２回、１ＭのＮａＣｌ含有０．５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で１回、活性化プロテインＡセファクリルゲルを洗浄。３．０．５Ｍエタノールアミン含有０．５Ｍのナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）の等容積を添加。回転器上で室温で４時間保温。４．０．９％ＮａＣｌで１回、ＲｅＡＣＴゲル緩衝液で２回活性化プロテインＡセファクリルを洗浄。５．活性化プロテインＡセファクリルを１．５容積のＲｅＡＣＴゲル緩衝液で再懸濁。当業者には当該不活性粒子にリガンドを結合させるために他の方法も用いることができることは理解されよう。経験を通じて、リガンド（特にプロテインＧ）は、調製された免疫反応性粒子（例えばプロテインＧセファロース４Ｂファーストフロー）から漏出することがあることが分かった。このような漏出は、調製粒子の有効保存期間を短縮させ、不正確な検査結果を生じる可能性があるので望ましくない。調製免疫反応性粒子のグルタルアルデヒド処理は、リガンドの粒子への結合有効性を高めることが示された。好ましいグルタルアルデヒド処理は文献に記載されている(R．Kowal，R.G．Pa rsons，Analytical Biochemistry，102:72-76(1980))。この処理は、約０．０１５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド（Sigma Chemical Company）含有炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ約８．８）の４容積を調製免疫反応性粒子に添加し、混合物を１時間静置することを含む。１時間後に上清を吸引し、約１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ約７．８）を加えて一切の未処理アルデヒド基を封鎖する。混合物を約１時間室温で保温する。１時間後にトリス緩衝液を吸引し、７．５％（ｗ／ｖ）フィコール４００(Ficoll 400)、５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ（緩衝液１）を含む１．２％ＮａＣｌで、以下の工程を用いて４回洗浄する：（１）緩衝液１を添加、（２）粒子を沈澱、（３）緩衝液１を吸引、（４）この操作を繰り返す。抗体および抗原試薬として用いられる抗体または抗原は、検査される抗体または抗原によって異なる。同定された血液抗原（したがって抗体）の数は極めて大きく、なお多くの抗原および抗体が同定され続けている。国際輸血学会（International Societ y of Blood Transfusion)は「血液型群命名学1990」という表題の論文を発表した(Blood group Terminology 1990，Vox．Sang．58:152-169(1990)、この文献は参照により本明細書に含まれる₎。本方法に適した赤血球抗原の非限定的例示リストは１５３ページに記載されている。しかしながら、以下の抗体および抗原が特に好ましい：Ａ、Ｂ、Ｃ、ｃ、Ｃ^w、Ｅ、ｅ、Ｋ、Ｆｙ^a、Ｆｙ^b、Ｊｋ^a、Ｊｋ^b 、Ｓおよびｓ。対象となる種々の抗体および抗原の検査に使用するために方法を調整する場合、使用される抗体または検査される抗体のアイソタイプと結合できるリガンドを選択するか、また別にはブリッジ抗休（例えばＩｇＭ抗体のためには抗ＩｇＭＩｇＧ）を用いることができる。したがって、抗ＩｇＭ-ＩｇＧ抗体が“ブリッジ ”としてリガンドに共役され、ＩｇＭ抗体は当該抗ＩｇＭ-ＩｇＧ抗体に結合するであろう。直接アッセイ直接アッセイでは免疫反応性粒子は以下のように調製できる：共有結合によって共役されたガンドをもつ粒子を先ず遠心し、上清を取り除き廃棄する。適切に希釈した抗体試薬の適量と当該粒子を穏やかに混合し、混合物を約１５分静置して、粒子上のリガンドに抗体を結合させる。粒子に添加される希釈抗体試薬の量は、用いられる抗体の由来および濃度によって左右される。混合物を遠心し、上清を取り除き抗体非含有溶液（例えばデキストラン含有緩衝液）と交換する。したがって、免疫反応性粒子の懸濁液は一般に溶液中に遊離抗体を全くまたはほとんど含まない。特に好ましい緩衝液は、フィコール４００、ＢＳＡ、ＮａＮ₃およびＮａＣｌを含む(ＲｅＡＣＴゲル緩衝液、ガンマバイオロジカルズインコーポレイテッド(Gamma Biologicals，Inc.)より入手可能)。１０００ｍｌのＲｅＡＣＴゲル緩衝液は以下のとおリである：上記成分を混合した後、溶液をろ過しｐＨを測定しなければならない。ｐＨは２０℃で約７．２でなければならない。適量の免疫反応性粒子懸濁液（例えば２０〜１５０μｌ）を反応管にピペットで入れ、粒子を反応管の底に沈澱させて、粒子を被覆する実質的に粒子を含まないデキストラン緩衝液ゾーンを作る。いくつかの実施態様では、多数の中性粒子（すなわち、粒子表面に結合したリガンドをもたない粒子）を免疫反応性粒子に混合してアッセイを安価に実施できるようにすることができる。特に好ましい実施態様では、各タイプの免疫反応性粒子の適量を０．９％ＮａＣｌで３回、続いて７．５％（ｗ／ｖ）フィコール４００および５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡを含む１．２％ＮａＣｌから成る溶液（緩衝液１）で３回洗浄する。最後の洗浄の後で、各サンプルから上清を完全に取り除き、各粒子サンプルを１．５容の新しい緩衝液に再懸濁して完全に混合する。続いて粒子サンプルを第一の免疫反応性粒子層約１部：第二の免疫反応性粒子層約９部の割合で合わせる。当業者には他の調製工程を用いることができること、およびその他の粒子割合も同様に有効であることは理解されよう。第一および第二の免疫反応性粒子層混合物の適量（例えば２０〜１５０μｌ）をピペットで反応管に入れ、粒子を反応管の底に沈降させる。また別には、反応管を約ｌ０００ｇで約１５秒遠心してもよい。いずれの場合にも、得られるものは粒子を覆う実質的に粒子を含まない緩衝液ゾーンである。一般に、被験赤血球は既に患者から採取され、ある種の血液型抗原の有無の決定のために提出されているであろう。赤血球は慣用的な技術で全血から分離し、約０．５〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で赤血球懸濁液を低イオン強度溶液で調製する。ガンマバイオロジカルズインコーポレイテッド(Gamma Biologicals， Inc.)のガンマN-HANCE(登録商標)をこの溶液のために用いることができる。アランらの報告(J.C.Allanら、Transfusion 30:423-26(1990))を改変した低イオン強度溶液がこの目的のために特に好ましい。適量の赤血球懸濁液（例えば０．５〜１％懸濁液の１５〜７５μｌ）を反応管に加え、当該反応管を非結合赤血球を底に押しつけるために十分な時間遠心する。好ましくは、遠心器は、遠心によって生じた遠心力が反応管の長軸に沿って働くように調整したローターを有する。結果として、遠心工程中に生じた遠心力は非結合赤血球を反応管の底に一層強力に沈澱させるように働くであろう。遠心工程当業者には、使用される遠心条件は、多くの因子（例えば使用される反応容器および遠心器のデザイン並びにタイプ）によって異なることは理解されよう。２工程または３工程の遠心手順が好ましい。一般に、最初の遠心工程は、赤血球をデキストラン溶液中を通過させるために約８００〜１２００ｇの範囲の高遠心力で約１０〜３０秒の範囲の短時間である。第二の遠心工程は、赤血球を免疫反応性粒子と接触させるために用いられる。この工程は、約３００〜６００ｇの範囲の低い遠心力で１５〜４５秒間実施される。第三の遠心工程は、未結合赤血球をビーズマトリックス中を通過させるために用いられる。この第三の遠心工程は、約８００〜１２００ｇ、より好ましくは約１３００〜１６００ｇの範囲の高遠心力で約４５〜９０秒間実施される。第三の遠心工程は、結合および非結合赤血球の分離を実施するために必要とされる時間を顕著に減少させる。分離はまた第二の遠心工程時間を約５〜１０分に延長させることによっても可能である。間接アッセイ間接アッセイでは、粒子表面にリガンドが結合した適量の免疫反応性粒子（例えば１５〜１５０μｌ）を取り、さらに適量の希釈液、例えばデキストラン含有緩衝食塩水（例えば３０〜３００μｌ）を当該粒子と混合する。抗体スクリーニングのために間接アッセイを実施する場合は、ｐＨが約７のデキストラン／食塩水緩衝液を用いるのが有利である。適量の混合物（例えば２０〜１５０μｌ）をピペットで反応管に取り、約１５分間粒子を沈降させ、粒子を覆う実質的に粒子を含まないデキストラン緩衝液ゾーンを得る。適量の強化剤（例えば１５〜１００μｌ）を反応管に加える。適量の赤血球懸濁液（例えば１５〜７５μｌ）を適切な媒体（例えば低イオン強度強化剤溶液）に懸濁させる。強化剤は、抗原または抗体結合が生じる速度を速め、陽性反応が発生する場合はより強い反応をもたらすように作用する。特に好ましい強化剤は、ガンマバイオロジカルズインコーポレイテッド(Gamma Biologicals，Inc. ，テキサス州、ヒューストン)からガンマN-HANCE(登録商標)として市販されている低イオン強度強化溶液である。適量の被験赤血球懸濁液（例えば０．５〜１％懸濁液の１５〜７５μｌ）を強化剤溶液に懸濁させ、続いて適量の検査血清（例えば１５〜７５μｌ）を添加する。続いて反応管を抗体／抗原反応を生じさせるために十分な条件下で保温する。好ましい条件は、約３７℃で約５〜３０分の保温で、より好ましくは約１０分の保温である。続いて、非結合赤血球を粒子間間隙を通過して反応管の底に沈澱させるために十分な時間反応管を遠心する。間接アッセイで特に好ましい実施態様を用いる場合は、適量の第一および第二の反応性粒子層を０．９％のＮａＣｌで３回、７．５％（ｗ／ｖ）フィコール４００および５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ含有１．２％ＮａＣｌ（緩衝液ｌ）で３回洗浄する。最後の洗浄後に、上清を各サンプルから完全に取り除き、両粒子サンプルを１．５容の新しい緩衝液１に再浮遊させて完全に混合する。続いて粒子サンプルを第一の免疫反応性粒子層約１部：第二の免疫反応性粒子層約９部の割合で合わせる。当業者には他の調製工程を用いることができること、およびその他の粒子割合も同様に有効であることは理解されよう。適量の混合物（例えば２０〜１５０μｌ）をピペットで反応管に入れ、約１５分間かけて粒子を反応管の底に沈降させ、粒子を覆う実質的に粒子を含まない緩衝液ゾーンを得る。また別には、反応管を約１０００ｇで約１５秒遠心して同じ結果を得ることができる。適量の検査血清または血漿（例えば１５〜７５μｌ）を反応管に添加する。続いて、アランらの論文(Allanら、Transfusion)を改変した好ましくは低濃度イオン保存溶液中に懸濁した赤血球の適量（例えば１５〜７５μｌ）を反応管に加える。好ましい赤血球懸濁液濃度は約０．８％である。続いて反応管を抗体／抗原反応が生じるために十分な条件下で保温する。好ましい条件は約３７℃で約５〜３０分の保温で、より好ましくは約１５分間の保温である。非結合赤血球が粒子マトリックスを通過するために十分な時間反応管を遠心して、反応管の底に非結合赤血球を沈澱させる間接アッセイと直接アッセイとを比較した場合、間接アッセイでは抗体は赤血球に添加され混合物は遠心工程の前に保温されることが特記される。したがって、赤血球が粒子及び結合されたリガンドに暴露される前に、抗体および抗原は反応する機会をもつ。直接アッセイでは、抗体は粒子上のリガンドと共役され、赤血球は粒子間隙を遠心によって通過させられるまで抗体に暴露されない。間接アッセイでは、検査血清中の抗体と反応する赤血球は、赤血球上の抗原と結合した抗体と粒子上のリガンドとの間の相互作用を介して粒子と結合する。陽性反応の検出は直接アッセイと同じで、陽性反応は反応管の上部１／２に結合赤血球の明瞭なラインを形成し、弱陽性反応は反応管の上部１／２に結合赤血球ラインおよび一般には反応管の底に沈澱したある程度の非結合赤血球を形成し、陰性反応では全ての非結合赤血球が反応管の底に沈澱する。本発明の方法で用いられる反応管は重要ではない。考慮されなければならない最も重要な要素は、親和性反応が遠心中に生じるように反応管は適切な高さの粒子カラムを提供するということである。３から４ｍｍの粒子カラムが存在する場合は、マイクロリットルプレートのマイクロウェルを用いて良好な結果が得られた。さらにまた有用なものは微量遠心管などである。好ましい実施態様では、複数の反応管を合わせて、例えば図２Ａに示したように一体型管列ユニットを作製することができる。図２Ａは６本の反応管１０を含む一体型管列ユニットを示している。各反応管はその上部１２で封入でき、その結果、直接アッセイ、間接アッセイまたはその混合アッセイで使用するために適した活性化粒子を予め充填した管列を販売できる。図２Ｃで示したように、各反応管は上部が実質的により広く、反応管の管部１６の上方に反応ウェル１４を形成する。反応ウェルは先細リゾーン１８で細くなり、その結果遠心工程時に反応ウェルに存在する赤血球は反応管の管部に誘導される。充填される場合は、反応管には免疫反応性粒子およびデキストラン溶液がこの先細リゾーンに充填される。図２Ｂでは、先細リゾーンは４つの平坦面２０を有し、その平坦面の各々の交差部に谷２２をもつことが示されている。各平坦面は、反応ウェルと合流するゾーンの上部で最も広く、その後各平坦面は、先細リゾーンの終了部に反応管が達するまでゾーンを通して徐々に細くなる。各反応管は先の尖った末端部２４を有する。この構造によって、反応管の尖った先端部に非結合赤血球がとして顕著な沈澱が集められる。反応管の管部１６は、高さが約３〜４ｍｍの免疫反応性粒子カラムを提供できる寸法を有する。当該管列は、個別情報を固定できるように標識面２６をもつようにデザインされている。図２Ｄおよび２Ｅに示すように、一体型管列ユニットの各末端部は異なっていて、反応管の大量充填時にはこれら管列の向きを示すインデックスが得られる。したがって、管列の一端は他端と識別できる。ユニット管列は適切ないずれの材料（例えばプラスチックなど）を用いて製造してもよいが、好ましくは、一般にポリメチルペンテンとして知られている生物学的および化学的に不活性なプラスチックであるＴＰＸ（登録商標）で製造される。ＴＰＸ（登録商標）はミツイペトロケミカルズ（アメリカ）リミテッドから供給されている。例えば直接検査のための実施態様では、配列された管には注文に応じて予め選択された種々のリガンド結合抗体が充填される。例えば、血液型判定用の好ましい管列は以下の抗体を含むことができる：抗Ａ、抗Ｂ、抗ＡＢ、抗Ｄ(例えばＦ８Ｄ８）、抗Ｄ（例えばＧＡＭＡ−４０１）および適切なコントロール(リガンドのみ)。以下の実施例は、当業者が本発明の方法を実施できるように提供される。これらの実施例は、本発明者らが当該発明と見なすものの範囲を限定しようとするものではない。測定条件の特徴を明らかにするために用いられる数字は正確であるように心掛けたが、ある程度の実験的誤差および偏差は存在しえよう。実施例１直接アッセイを用いた赤血球上のＡ血液型抗原の有無に関する検査Ａ．特異的抗Ａアガロースビーズの調製２ｍｌのイムノピュア（登録商標）固定プロテインＧを１０００ｇで約２分遠心し、上清を取り除き廃棄した。２ｍｌの予め希釈したマウスモノクローナル抗Ａ抗体サンプル（クローン４６Ｇ５マウスＩｇＧ３アイソタイプ）を添加した。このモノクローナル抗Ａ抗体を、７．５％デキストラン（ｗ／ｖ）含有０．０１Ｍクエン酸緩衝食塩水（ｐＨ５．０）で希釈した。内容物を穏やかに混合し、１５分静置した。アガロース／抗体混合物を１０００ｇで約２分遠心し、上清を取リ出して凝集アッセイで残留抗Ａ活性について検査した。当該検査は以下の態様で実施した：上清サンプルをＡ陽性赤血球を凝集させる能力について検査した。凝集は認められず、抗体が粒子に完全に結合したことを示唆した。Ｂ．反応管の調製微量定量盤（サーモウェル・ポリカーボネート微量定量盤コスター）の個々のマイクロウェルを反応管として用いた。特異的抗Ａアガロースビーズを十分に混合し、当該混合物の７０μｌをピペットで各マイクロウェルに入れた。検査を続ける前に、ウェルの底にアガロースビーズを沈降させた(約１５分)。Ｃ．検査手順赤血球はクエン酸添加血液サンプルまたは液体窒素保存のいずれかから入手した。血液サンプルは、ＦＤＡ承認抗Ａおよび抗ＡＢ血液型判定試薬を用いて予め型分けされている。低イオン強度溶液(Gamma N-hance，ガンマバイオロジカルズインコーポレイテッド)を用いて赤血球サンプルの０．８％懸濁液を調製した。約０．８％の赤血球懸濁液１５マイクロリットルをピペットで反応管に入れた。続いてこの微量定量盤をセロヒュージＩＩ（Sero-fuge II，Clay-Adams）で９００〜１０００ｇで１５秒、５００ｇで３０秒、最後に９００〜１０００ｇで４５秒遠心した。遠心力が反応管の長軸に沿って働くように改変したローターを使用した。Ｄ．結果／解釈赤血球がＡ血液型抗原を有する場合、赤血球はマトリックスの上部で抗Ａアガロースビーズと結合する(図１Ａ)。赤血球がＡ血液型抗原の弱い発現を有する場合(例えばＡ₃またはＡ_x)、いくらかの赤血球はマトリックスの上部で抗Ａアガロースビーズと結合し、さらにいくらかはウェルの底に集められるであろう(図１Ｂ)。赤血球がＡ抗原をもたない場合、全ての赤血球はウェルの底に集められるであろう(図１Ｃ)。この実験で観察された結果は下記の表１に示す。表１ＡＢＯ血液型Ｂ血液型抗原の有無についての赤血球の検査は、抗Ａ試薬の代わりに抗Ｂ試薬を用いて同様な態様で実施することができる。抗体の供給源は、ヒトポリクローン性、ヒトモノクローン性またはマウスモノクローン性などのいずれでもよい。抗体の免疫グロブリンクラスがＩｇＧでない場合は、第二の抗体がＩｇＧ由来であることを条件としてこの第二の抗体（例えば抗ヒトＩｇＭまたは抗カッパまたは抗ラムダ抗体）によって、ＩｇＧでない抗体をプロテインＧリガンドに結合させることができる。また別に、プロテインＡ／Ｇをゲル粒子に結合させる場合は、プロテインＡ／Ｇに結合するいずれの抗体も用いることができる。実施例２直接アッセイによる赤血球上のＲｈＤ抗原の有無に関する検査赤血球はクエン酸添加血液サンプルまたは液体窒素保存のいずれかから入手した。血液サンプルはＦＤＡ承認抗Ｄ血液型判定試薬を用いて予め型分けした。低イオン強度溶液(Gamma N-hance，ガンマバイオロジカルズインコーポレイテッド)で赤血球の０．８％懸濁液を調製した。反応管の調製および検査手順は、抗Ｄ・ＩｇＧｌ抗体（ヒトモノクローナル抗体Ｆ８Ｄ８）を抗Ａ抗体の代わりに用いた点を除いて先に実施例１で述べたものと同一である。Ａ．結果／解釈赤血球がアカゲザルＤ抗原の通常の発現を示す場合、赤血球は固相マトリックスの上部で抗Ｄアガロース粒子と結合するであろう(図１Ａ)。赤血球がＤ抗原( 例えばＤ^u)を（定量的に）弱く発現する場合またはＤ抗原の定性的変種（例えばＤＶＩ変種）を発現する場合、いくらかの赤血球はマトリックスの上部で抗Ｄアガロース粒子と結合し、さらにいくらかはウェルの底に集められるであろう(図１Ｂ)。赤血球がアカゲザルＤ抗原をもたない場合、全ての赤血球はウェルの底に集められるであろう(図１Ｃ)。この実験で観察された結果は下記の表２に示す。表２ＲｈＤ他のＲｈ抗原（例えばＣ、ｃ、Ｅまたはｅなど）の有無についての赤血球の検査は、抗Ｄ抗体の代わりに当該特異的試薬を用いて同様な態様で実施することができる。抗体の供給源は、ヒトポリクローン性(例えばアフィニティー精製)、ヒトモノクローン性またはマウスモノクローン性などのいずれでもよい。抗体の免疫グロブリンクラスがＩｇＧでない場合は、第二の抗体がＩｇＧ由来であることを条件としてこの第二の抗体（例えば抗ヒトＩｇＭまたは抗カッパまたは抗ラムダ抗体）によって、ＩｇＧでない抗体はプロテインＧに結合させることができる。また別に、プロテインＡ／Ｇをゲル粒子に結合させる場合は、プロテインＡ／Ｇに結合するいずれの抗体も用いることができる。実施例３間接アッセイによる赤血球上のＦｙ^a抗原の有無に関する検査この検査方法は、非アフィニティー精製ヒトポリクローン抗血清を用いて実施した。Ａ．プロテインＧアガロース粒子の調製２ｍｌの固定プロテインＧ（イムノピユア（登録商標）Ｇ）を９００〜１００Ｏｇで約２分遠心し、上清を取り除き廃棄した。２ｍｌの７．５％デキストラン（ｗ／ｖ）含有０．０１Ｍクエン酸緩衝食塩水（ｐＨ５．０）をプロテインＧに添加し十分に混合した。Ｂ．反応管の調製上記のプロテインＧ混合物７０マイクロリットルを、微量定量盤（サーモウェル・ポリカーボネート微量定量盤コスター）のマイクロウェルにピペットで入れた。ウェルの基底部にアガロース粒子を沈降させた(約１５分)。Ｃ．検査手順低イオン強度強化溶液(Gamma N-hance，ガンマバイオロジカルズインコーポレイテッド）５０マイクロリットルを各ウェルに添加した。赤血球はクエン酸添加血液サンプルまたは市販の試薬赤血球パネルのいずれかから入手し、ＦＤＡ承認抗Ｆｙ^a血液型判定試薬を用いて予め型分けした。低イオン強度溶液を用いて０．８％赤血球懸濁液を調製した。０．８％の被験赤血球懸濁液１５マイクロリットルを各ウェルに添加し、続いて２５１の抗Ｆｙ^a検査血清を加えた。続いてこの微量定量盤を３７℃で１０分保温した。反応管をセロヒュージＩＩ（Sero -fuge II，Clay-Adams）で９００〜１０００ｇで１５秒、５００ｇで３０秒、さらに９００〜１０００ｇで４５秒遠心した。遠心力が反応管の長軸に沿って働くように改変したローターを使用した。Ｄ．結果／解釈赤血球がＦｙ^a血液型抗原を有する場合、赤血球はマトリックスの上部でプロテインＧアガロース粒子と結合する(図１Ａ)。赤血球がＦｙ^a抗原をもたない場合、全ての赤血球はウェルの底に集められるであろう(図１Ｃ)。この実験で観察された結果は下記の表３に示す。表３Ｆｙ^a抗原式ダッフィ血液型の表現型この検査手順は、赤血球抗原に対する特異的なＩｇＧ抗体を含むポリクローンまたはモノクローナル抗血清を組み合わせて、いずれの赤血球抗原の型分けにも用いることができる。実施例４間接アッセイによる抗体スクリーニングまたは適合性検査使用した赤血球は市販ルートで入手できる試薬用赤血球パネル(Gamma Biologi cals，Inc.)で、これはメーカーによって予めＦＤＡ承認血液型試薬（利用可能な場合）を用いて特異的抗原について型分けされている。血清サンプルは、ガンマバイオロジカルズインコーポレイテッドの鑑定検査室から取り寄せた患者サンプルから得られた。各血清サンプルは、それに対して抗体が誘導された抗原を発現している少なくとも１つの赤血球懸濁液（陽性コントロール）について、さらに当該抗体によって認識される抗原を欠く少なくとも１つの赤血球懸濁液（陰性コントロール）について検査された。反応管の調製および検査手順は、既知の抗原組成の赤血球（抗体スクリーニング）またはドナー赤血球（適合性検査）のいずれかを患者またはドナーの血清標本と組み合わせて使用したという点を除いて、実施例３で述べたものと同様である。Ａ．結果／解釈患者またはドナーの血清標本が、ＩｇＧ抗体もしくは検査で用いられた赤血球上に存在する抗原に対して誘導された抗体を含む場合は、赤血球はマトリックス上部でプロテインＧアガロース粒子と結合するであろう(図１Ａ)。弱い抗原・抗体反応の場合には、赤血球のいくらかはマトリックス上部でプロテインＧアガロース粒子と結合し、さらに、いくらかは反応管の底に集められるであろう(図１Ｂ)。血清標本が赤血球上に存在する抗原に対する抗体を含まない場合は、全ての赤血球は反応管の底に集められるであろう(図１Ｃ)。この実験で観察された結果は表４に示す。表４実施例５赤血球のＲｈＤ抗原の有無に関する抗ＤヒトモノクローンＩｇＭを用いる間接アッセイによる検査Ａ．特異的抗Ｄ-ＩｇＭアガロースビーズの調製プロテインＧはＩｇＭ抗体とは直接結合しないであろう。したがって、ＩｇＭ抗体と結合することができるゲルを作製するために、ブリッジ抗休をまずプロテインＧアガロースビーズに結合させることができる。以下の実施例では、ヒトカッパ軽鎖に特異的なマウスモノクローン抗体を利用して、抗ＤヒトモノクローンＩｇＭカッパ鎖をアガロースビーズに結合させる。２ｍｌのイムノピュア（登録商標）固定プロテインＧを１０００ｇで約２分遠心し、上清を取り出し廃棄した。予め希釈した抗ヒトカッパ軽鎖マウスモノクローン抗体（クローン５Ｆ３マウスＩｇＧ１アイソタイプ）サンプル２ｍｌを添加した。培養上清を含むこのモノクローン抗体は０．０１Ｍクエン酸緩衝食塩水（ｐＨ５．０）で希釈された。内容物を穏やかに混合し、１５分静置した。アガロース／抗体混合物を１０００ｇで約２分遠心し、上清を除去して残余の抗カッパ活性について凝集アッセイで検査した。当該検査は以下の態様で実施した：予めＩｇＧカッパ軽鎖抗体で被覆した赤血球を凝集する能力について、プロテインＧアガロースビーズとの保温を実施していない予め希釈した抗カッパ抗体サンプルと、プロテインＧアガロースビーズで予備保温した希釈抗カッパ抗体サンプルとを並行して検査した。予備保温サンプルは陰性反応を示し、全ての抗カッパ抗体はプロテインＧアガロースビーズに結合したことを示唆した。抗Ｄヒトモノクローン抗体（クローンＧＡＭＡ−４０１ＩｇＭカッパ軽鎖）サンプル２ｍｌを抗カッパ／プロテインＧアガロースペレットに添加した。培養上清を含むモノクローン抗体を０．０１Ｍクエン酸緩衝食塩水（ｐＨ５．０）で希釈した。内容物を穏やかに混合し、１５分静置した。アガロース／抗体混合物を１０００ｇで約２分遠心し、上清を取り出し抗Ｄ活性について凝集アッセイで検査した。当該検査は以下の態様で実施した：抗カッパ／プロテインＧアガロースビーズとの保温を実施していない抗Ｄサンプルと、抗カッパ／プロテインＧアガロースビーズで予備保温したサンプルとを並行して力価を測定し、ＲｈＤ陽性赤血球を凝集させる能力について検査した。予備保温サンプルは顕著な力価の低下を示し、抗Ｄ抗体はマトリックスに結合したことを示唆した。一切の未結合抗Ｄ抗体を除去するために、この抗Ｄ／抗カッパ／プロテインＧアガロースビーズを０．８５％ＮａＣｌで３回洗浄した。最後の洗浄の後で、７．５％デキストラン（ｗ／ｖ）含有０．０１Ｍクエン酸緩衝食塩水溶液（ｐＨ５．０）の２ｍｌをビーズに添加し十分に混合した。赤血球は、ＦＤＡ承認抗Ｄ血液型試薬を用いて予め型分けされたクエン酸添加血液から得た。０．８％の赤血球懸濁液を低イオン強度溶液(Gamma N-HANCE(登録商標)、Gamma Biologicals，Inc.)で調製した。反応管の調製および検査手順は、先に実施例１で述べたものと実質的に同一である。Ａ．結果／解釈赤血球がアカゲザルＤ抗原の通常の発現を示す場合、赤血球は固相マトリックスの上部で抗Ｄアガロース粒子と結合するであろう(図１Ａ)。赤血球がＤ抗原を（定量的に）弱く発現する場合は(例えば弱Ｄ、正式にはＤ^Uと称される)、赤血球のいくらかはマトリックスの上部で抗Ｄアガロース粒子と結合し、さらにいくらかは反応管の底に集められるであろう(図１Ｂ)。赤血球がアカゲザルＤ抗原をもたない場合、全ての赤血球は反応管の底に集められるであろう(図１Ｃ)。この実験で観察された結果は下記の表５に示す。表５ＩｇＭ抗体による他の血液型抗原の有無に関する赤血球検査は同様な態様で実施できる。また別の利点および変更は当業者には明らかであろう。本発明はしたがって、前述の具体的事例または代表的な実施例に限定されない。それゆえ、本開示発明の一般的概念の範囲を外れることなく当該詳細な記述から改変が為されえるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者モールズ、ジョン、ジェイ. アメリカ合衆国 77043 テキサス州ヒューストンオークポイントドライブ 10235

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程を含む赤血球上の血液型抗原を検出する方法：被験赤血球サンプルを得て；当該サンプルを反応管に添加し、ここで当該反応管は長軸を有し、かつ粒子マトリックスを含み、当該粒子マトリックスは複数の免疫反応性粒子を含み、当該マトリックスは、当該粒子表面に共役させたプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、および普遍的カッパ軽鎖結合タンパク質から成る群から選ばれる免疫グロブリン結合リガンド、および当該粒子上の当該リガンドに共役させた当該血液型抗原に特異的な抗体を有する第一の免疫反応性粒子層、および当該粒子表面に共役させた免疫グロブリン結合リガンドプロテインＡを有する第二の免疫反応性粒子層、および緩衝液をさらに含み、当該第一の免疫反応性粒子層が当該第二の免疫反応性粒子層の上に重層されるように当該粒子マトリックスが当該反応管に配置されており；当該免疫反応性粒子上の当該抗体と結合しない赤血球を当該反応管の底に沈澱させるために十分な時間、当該反応管を遠心し；当該粒子と当該赤血球との結合またはその欠如を検出し；さらに当該血液型抗原の存在と結合を相関させる。２．以下の工程を含む赤血球上の血液型抗原を検出する方法：被験赤血球サンプルを得て：当該サンプルを反応管に添加し、ここで当該反応管は長軸を有し、かつ粒子マトリックスを含み、当該粒子マトリックスは複数の免疫反応性粒子を含み、当該マトリックスは、当該粒子表面に共役させたプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、および普遍的カッパ軽鎖結合タンパク質から成る群から選ばれる免疫グロブリン結合リガンド、当該リガンドに共役させたブリッジ抗体、および当該粒子上の当該ブリッジ抗体に共役させた当該血液型抗原に特異的な抗体を有する第一の免疫反応性粒子層、および当該粒子表面に共役させた免疫グロブリン結合リガンドプロテインＡを有する第二の免疫反応性粒子層、および緩衝液をさらに含み、当該第一の免疫反応性粒子層が当該第二の免疫反応性粒子層の上に重層されるように当該粒子マトリックスが当該反応管に配置されており；当該免疫反応性粒子上の当該リガンドに共役させた当該ブリッジ抗体に共役させた当該抗体と結合しない赤血球を当該反応管の底に沈澱させるために十分な時間、当該反応管を遠心し；当該粒子と当該赤血球との結合またはその欠如を検出し；さらに当該血液型抗原の存在と結合を相関させる。３．以下の工程を含む血液型判定で赤血球抗原を検出する方法、被験赤血球サンプルを得て；既知赤血球抗原に特異的な抗体調製物とともに、当該抗原が存在している場合には当該抗体が当該抗原に結合するために十分な時間および条件下で当該赤血球を反応管内で保温し、ここで当該反応管は長軸を有し、かつ粒子マトリックスを含み、当該粒子マトリックスは複数の免疫反応性粒子を含み、当該マトリックスは、当該粒子表面に共役させたプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、および普遍的カッパ軽鎖結合タンパク質から成る群から選ばれる免疫グロブリン結合リガンドを有する第一の免疫反応性粒子層、および当該粒子表面に共役させた免疫グロブリン結合リガンドプロテインＡを有する第二の免疫反応性粒子層、および緩衝液をさらに含み、当該第一の免疫反応性粒子層が当該第二の免疫反応性粒子層の上に重層されるように当該粒子マトリックスが当該反応管に配置されており；当該免疫反応性粒子上の当該リガンドと結合しない赤血球を当該反応管の底に沈澱させるために十分な時間、当該反応管を遠心し；さらに、当該赤血球上の当該抗原の存在を当該粒子と当該赤血球との結合と相関させる。４．以下の工程を含む赤血球抗原に特異的な血清抗体または血漿抗体を検出する方法、その表面に既知抗原を有する赤血球サンプルを得て；血清および血漿から成る群から選ばれる、当該抗原に対する抗体について検査されるべき血液成分を得て；当該抗体が存在している場合には当該赤血球上の当該抗原に当該抗体が結合するために十分な時間および条件下で当該赤血球および当該血液成分を反応管内で保温し、ここで当該反応管は長軸を有し、かつ粒子マトリックスを含み、当該粒子マトリックスは複数の免疫反応性粒子を含み、当該粒子マトリックスは、当該粒子表面に共役させたプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、および普遍的カッパ軽鎖結合タンパク質から成る群から選ばれる免疫グロブリン結合タンパク質を含むリガンドを有する第一の免疫反応性粒子層、および当該粒子表面に共役させた免疫グロブリン結合リガンドプロテインＡを有する第二の免疫反応性粒子層、および緩衝液をさらに含み、当該第一の免疫反応性粒子層が当該第二の免疫反応性粒子層の上に重層されるように当該粒子マトリックスが当該反応管に配置されており；当該免疫反応性粒子上の当該リガンドと結合しない赤血球を当該反応管の底に沈澱させるために十分な時間、当該反応管を遠心し；さらに、当該抗体の存在を当該粒子と当該赤血球との結合と相関させる。５．当該抗体が、抗Ａ、抗Ｂ、抗ＡＢ、抗Ｄ、抗Ｃ、抗ｃ、抗Ｅ、抗ｅ、抗Ｋ、抗Ｆｙ^a、抗Ｆｙ^b、抗Ｊｋ^a、抗Ｊｋ^b、抗Ｓおよび抗ｓから成る群から選ばれる請求項１または３の方法。６．当該遠心によって生じる遠心力が当該反応管の長軸に沿って作用するように対応させたローターを有する遠心器を用いて当該遠心が実施される請求項１、２、３または４の方法。７．当該遠心が、約８００〜１２００ｇの範囲で約１０〜３０秒の範囲の時間、約３００〜６００ｇの範囲で約１５〜４５秒の範囲の時間、約１３００〜１６００ｇの範囲で約４５〜９０秒の範囲の時間実施される請求項６の方法。８．以下の工程を含む赤血球抗原に特異的な血清抗体を検出する方法、その表面に既知抗原を有する赤血球サンプルを得て；当該抗原に対する抗体について検査するべき、血清および血漿から成る群から選ばれる血液成分を得て；当該赤血球および当該血液成分を反応管内で約１５分間３７℃で保温し、ここで当該反応管は長軸を有し、かつ粒子マトリックスを含み、当該粒子マトリックスは複数の免疫反応性粒子を含み、当該粒子マトリックスは、当該粒子の各々の表面に共役させたプロテインＧを有する第一の免疫反応性粒子層、および当該粒子表面に共役させた免疫グロブリン結合リガンドプロテインＡを有する第二の免疫反応性粒子層、および緩衝液をさらに含み、当該第一の免疫反応性粒子層が当該第二の免疫反応性粒子層の上に重層されるように当該粒子マトリックスが当該反応管に配置されており；当該反応管を約９００〜１０００ｇで約１５秒、続いて約５００ｇで約３０秒、続いて約１３００〜１６００ｇで約９０秒、当該遠心によって生じる遠心力が当該遠心管の長軸に沿って作用するように対応させた遠心器を用いて遠心し；当該免疫反応性粒子上の当該プロテインＧと赤血球との結合またはその欠如を検出し；さらに、当該検査抗体の存在を結合と相関させる。９．当該第一の免疫反応性粒子層が、アガロース、セファロースおよびラテックスから成る群から選ばれる物質で製造される請求項１、２、３、４、または８の方法。１０．当該第二の免疫反応性粒子層がプラスチック材で製造される請求項１、２、３、４または８の方法。１１．当該第二の免疫反応性粒子層が、セファクリルＳ−１００、セファクリルＳ−２００およびセファクリルＳ−４００から成る群から選ばれる請求項１、２、３、４、または８の方法。１２．当該赤血球が、低イオン強度溶液中での検査のために約０．５〜１．０％（ｗ／ｖ）の赤血球懸濁液を生じるように調製される請求項１、２、３、４、または８の方法。１３．当該既知抗原がＡ、Ｂ、Ｄ、Ｃ、ｃ、Ｃ^w、Ｅ、ｅ、Ｋ、Ｆｙ^a、Ｆｙ^b、Ｊｋ^a、Ｊｋ^b、Ｓおよびｓから成る群から選ばれる請求項４または８の方法。１４．当該被験抗体が、抗Ａ、抗Ｂ、抗ＡＢ、抗Ｄ、抗Ｃ、抗ｃ、抗Ｅ、抗ｅ、抗Ｋ、抗Ｆｙ^a、抗Ｆｙ^b、抗Ｊｋ^a、抗Ｊｋ^b、抗Ｓおよび抗ｓから成る群から選ばれる請求項４または８の方法。１５．当該被験抗原がＡ、Ｂ、Ｄ、Ｃ、ｃ、Ｃ^w、Ｅ、ｅ、Ｋ、Ｆｙ^a、Ｆｙ^b、Ｊｋ^a、Ｊｋ^b、Ｓおよびｓから成る群から選ばれる請求項３の方法。１６．当該第二の免疫反応性粒子層が、当該粒子上の当該リガンドに共役させた当該血液型抗原に特異的な抗体を有する請求項１の方法。