CN111356921B - 原位系列稀释方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了通过原位系列稀释确定样品中分析物浓度的方法。
Description
背景技术
在血库中，当在孕妇中检测到能够引起新生儿或胎儿的溶血性疾病的具有临床意义的抗体时，通过进行抗体滴定来确定抗体滴度(或半定量浓度)。在整个怀孕期间，都要重复母体的抗体滴度以确定抗体的滴度或浓度是否升高。抗体滴度增加三倍或更多倍稀释被认为具有临床意义，并表明胎儿红细胞(RBC)具有相应抗体的抗原。一旦滴度达到临界阈值，并且胎儿至少在胎龄18周时，将进行其他研究，例如超声、多普勒超声检查、羊膜穿刺或心脏穿刺。这些方法可监测胎儿的贫血水平，并指出需要进行宫内输血或其他干预措施。
在分离多种抗体，抗体鉴定以及在单采血液供体血小板单位或要跨过ABO边界移植的器官上进行ABO异血凝素滴度测定中，也需要在临床上进行抗体滴定。也可以进行抗体滴定用于以下目的：(i)评估红细胞试剂的抗原位点密度，(ii)评估新抗血清的特性或将新批次与以前的抗血清进行比较，(iii)研究所谓的高滴度低亲合力(HTLA)抗体(例如，已知属于Knops血型系统的抗体)，(iv)确定自身抗体在温暖抗体免疫溶血性贫血(WAIHA)中的相对特异性，(v)对来自可溶性血型物质分泌者的唾液进行研究，(vi)在无法获得试剂或无法成功从细胞中去除IgG时，确定直接抗球蛋白测试(DAT)阳性细胞的抗原状态，以及(vii)确定冷自身抗体的滴度、特异性和热幅值，例如抗I。
通常通过对患者血浆进行连续两倍的稀释，然后与具有相应抗原的选定红细胞(RBC)进行反应强度分级来对抗体进行滴定。滴度结果报告为血浆最高稀释度的倒数，表明宏观凝集。患者血浆或血清的稀释应在分开的样品管中进行，而不是直接在免疫诊断测试设备中进行，以防止样品被测试设备中的试剂污染。
发明内容
本文描述了通过原位系列稀释确定样品中分析物浓度的方法。该方法包括但不限于确定样品中抗体的滴度，确定抗原浓度和产生校准曲线。所公开的方法可用于免疫诊断测试。已经发现了将样品原位或直接在测试装置(例如凝胶测试卡)中而不是在分开的试管中稀释的方法。令人惊讶的是，在测试装置中进行样品稀释时，保留了孵育室和反应室之间的气隙，并且在测试装置中进行稀释时，样品没有被测试装置中的试剂污染。
在一个实施方案中，提供了一种通过原位系列稀释确定样品中分析物浓度的方法。在该方法中，提供了一种免疫诊断测试卡，其包括支撑多个垂直放置的微管的基本平坦的支撑件。测试卡中的每个微管都有用于接收样品的孵育室和包含分离基质的反应室。将稀释剂添加到至少一个孵育室中。–将样品直接系列稀释到其中具有稀释剂的每个孵育室中。将能够与分析物复合以形成试剂-分析物复合物的试剂加入其中具有稀释剂和/或样品的每个孵育室中。样品和试剂的混合物通过重力和/或离心作用使其沉降。通过确定样品的最高稀释度来确定分析物的浓度，在该最高稀释度下在分离基质之上或之内检测到试剂-分析物复合物。
在另一个实施方案中，通过原位系列稀释确定样品中分析物浓度的方法包括提供免疫诊断测试卡，其包括支撑多个垂直放置的微管的基本平坦的支撑件。每个微管具有用于接收样品的孵育室和包括分离基质和能够与分析物复合以形成试剂-分析物复合物的试剂的反应室。将稀释剂添加到至少一个孵育室中。将样品直接系列稀释到其中具有稀释剂的每个孵育室中。通过重力和/或离心使测试卡发生沉淀。通过确定样品的最高稀释度来确定分析物的浓度，在该最高稀释度下在分离基质之上或之内检测到试剂-分析物复合物。
附图说明
图1是可以在根据本发明的实施方案的方法中使用的免疫诊断测试卡的正视图。
图2A–2B显示了如实施例1中所述的抗-D滴定实验的结果(抗-D血浆预稀释500倍)。图2A是使用参比方法的测试卡结果的图像。图2B是使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图3A-3B显示了如实施例1中所述的抗-Kell滴定实验的结果(抗-Kell预稀释50倍)。图3A是使用参比方法的测试卡结果的图像。图3B是使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图4A-4D显示了如实施例1中所述的抗-Fyb滴定实验的结果。图4A-4B是使用参比方法的测试卡结果的图像。图4C-4D是使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图5A-5B显示了如实施例1中所述的抗-M滴定实验的结果。图5A是使用参比方法的测试卡结果的图像。图5B是使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图6A-6F显示了如实施例1中所述的抗-C滴定实验的结果。图6A-6C是使用参比方法的测试卡结果的图像。图6D-6F是使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图7A-7B显示了如实施例1中所述的抗-Kpb滴定实验的结果。图7A是使用参比方法的测试卡结果的图像。图7B是使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图8A-8D显示了如实施例1中所述的抗-Jka滴定实验的结果。图8A-8B是使用参比方法的测试卡结果的图像。图8C-8D是使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图9A-9C显示了如实施例1中所述的抗-D孵育室AHG污染实验的结果。图9A是使用参比方法的测试卡结果的图像。图9B是使用参比方法的受污染孔(即，被凝胶污染并在使用前离心)的测试卡结果的图像。图9C是具有污染孔的使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图10A-10F显示了如实施例1中所述的抗-Kell孵育室AHG污染实验的结果。图10A-10B是使用参比方法的测试卡结果的图像。图10C-10D是具有污染孔的使用参比方法的测试卡结果的图像。图10E-10F是具有污染孔的使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图11A-11F显示了如实施例1中所述的抗-Fyb孵育室AHG污染实验的结果。图11A-11B是使用参比方法的测试卡结果的图像。图11C-11D是具有污染孔的使用参比方法的测试卡结果的图像。图11E-11F是具有污染孔的使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图12A-12F显示了如实施例1中所述的抗-S孵育室AHG污染实验的结果。图12A-12B是使用参比方法的测试卡结果的图像。图12C-12D是具有污染孔的使用参比方法的测试卡结果的图像。图12E-12F是具有污染孔的使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图13A-13C显示了如实施例1中所述的抗-M孵育室AHG污染实验的结果。图13A是使用参比方法的测试卡结果的图像。图13B是具有污染孔的使用参比方法的测试卡结果的图像。图13C是具有污染孔的使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图14A-14I显示了如实施例1中所述的抗-C孵育室AHG污染实验的结果。图14A-14C是使用参比方法的测试卡结果的图像。图14D-14F是具有污染孔的使用参比方法的测试卡结果的图像。图14G-14I是具有污染孔的使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图15A-15C显示了如实施例1中所述的抗-Kpb孵育室AHG污染实验的结果。图15A是使用参比方法的测试卡结果的图像。图15B是具有污染孔的使用参比方法的测试卡结果的图像。图15C是具有污染孔的使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图16A-16F显示了使用实施例1中所述的三种血浆A样品进行反定型滴定实验的结果。每个样品均采用参比方法以及测试卡方法中的稀释进行测定。图16A-16B是第一血浆A样品的测试卡结果的图像。图16C-16D是第二血浆A样品的测试卡结果的图像。图16E-16F是第三血浆A样品的测试卡结果的图像。
图17A-17O显示了使用实施例1中所述的三种血浆O样品进行反定型滴定实验的结果。每个样品均采用参比方法以及测试卡方法中的稀释进行测定。图17A-17D是第一血浆O样品的测试卡结果的图像。图17E-17H是第二血浆O样品的测试卡结果的图像。图17I-17J是第三血浆O样品的测试卡结果的图像。
图18A-18B显示了如实施例2所述的实验结果，其中校准物在试管中或直接在测试卡中进行稀释。图18A是使用参比方法的测试卡结果的图像，其中校准物在试管中进行系列稀释。图18B是使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
图19A-19B显示了如实施例3所述的实验结果，其中测定了抗原(人IgA)的浓度。图19A是使用参比方法的测试卡结果的图像。图19B是使用测试卡方法中的稀释的测试卡结果的图像。
发明详述
本文提供了通过系列稀释确定样品中分析物浓度的方法。
I.定义
术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。
术语“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含能够非共价、可逆并以特定方式结合相应抗原的免疫球蛋白的片段的多肽。该术语包括但不限于同种型IgA，IgD，IgE，IgG和IgM的多克隆或单克隆抗体。
术语“抗原”是指被抗体识别的分子、化合物或复合物，即可以被抗体特异性结合的分子。该术语可以指可以被抗体特异性识别的任何分子，包括但不限于蛋白质(例如，血型蛋白质，天然蛋白质，天然蛋白质的片段或重组蛋白质)，多肽，多糖，脂质，与蛋白质或多糖复合的脂质，碳水化合物，化学部分或其组合。
术语“蛋白质”是指氨基酸聚合物或一组两种或更多种相互作用或结合的氨基酸聚合物。
术语“系列稀释”是指物质在溶液中的逐步稀释。每个步骤不一定具有相同的稀释因数。
术语“提供免疫诊断测试卡”是指使用所述免疫诊断测试卡执行该方法的事实。
II.方法
现在将描述通过样品的原位系列稀释(例如血浆，血清，校准物/标准品)确定样品中分析物浓度的方法。在一些实施方案中，分析物是针对红细胞抗原的抗体，并且该抗体包括但不限于：抗-A抗体，抗-B抗体(或抗ABO抗体)，抗-C抗体，抗-c抗体，抗-D抗体，抗-E抗体，抗-e抗体，抗-Fya抗体，抗-Fyb抗体，抗-Jka抗体，抗-Kell抗体，抗-k抗体，抗-Kpa抗体，抗-Kpb抗体，抗-M抗体，抗-N抗体，抗-S抗体和抗-s抗体。在某些实施方案中，分析物是抗原。在一些实施方案中，分析物是针对抗原包被的微球的抗体。在某些实施方案中，分析物是被抗体包被的微球捕获的抗原。在一些实施方案中，分析物是任何其他配体，例如生物素或链霉亲和素。如本文所用，“配体”是与生物分子形成复合物以用于生物学目的的物质。
在一个实施方案中，该方法包括提供免疫诊断测试卡100(图1)。测试卡100包括基本平坦的支撑件102，支撑件102支撑多个垂直布置的微管(或测试单元)104(例如，至少一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个或八个)，每个微管具有用于接收样品的孵育室106和包括分离基质110的反应室108。测试卡100和微管104可以由包括但不限于聚乙烯、聚氯乙烯或聚苯乙烯的材料形成。可以将微管104胶合或焊接至测试卡100的上部，或者可以通过例如泡罩包装将微管104与测试卡一体地制造。微管104通常是圆柱形的，其中孵育室106的直径大于反应室108的直径。在一些实施方案中，在孵育室106和反应室108之间的微管104的部分具有逐渐变细的直径112。
在一些实施方案中，反应室108至少包括分离基质(例如凝胶)和上清液(例如液体上清液)。在一些实施方案中，反应室108还包含试剂。在一些实施方案中，试剂(或至少一种试剂)存在于上清液中。试剂能够与分析物(或与分析物之一)复合(例如结合)以形成试剂-分析物复合物。在一些实施方案中，试剂包括其上具有抗原、抗体或任何其他分析物配体(例如，链霉亲和素)的包被的颗粒(例如，乳胶颗粒、微球或微粒)或红细胞(RBC)。RBC上的抗原将取决于要滴定的抗体。例如，在抗体是抗-D抗体的实施方案中，RBC上的抗原将是D抗原。在一些实施方案中，反应室108还包含网状剂，其可以存在于例如上清液和/或分离基质110中。如本文所用，网状剂是使敏化的红细胞或敏化的乳胶颗粒交联的生物分子。网状剂的例子包括但不限于：二抗(例如抗人球蛋白或抗人IgA抗体)，蛋白A和配体(例如链霉亲和素)。
在一些实施方案中，分离基质110是凝胶，例如包含葡聚糖丙烯酰胺的聚电解质凝胶。在一些实施方案中，分离基质110是惰性材料，包括但不限于琼脂糖，聚丙烯酰胺，聚葡聚糖，苯乙烯-二乙烯基苯聚合物或玻璃珠。
在某些实施方案中，微管104还包括在分离基质110上方(例如，在孵育室106和反应室108之间)的气隙。在一些实施方案中，微管104在分离基质110上方包含油层(或任何低密度不混溶化合物，例如专利申请WO2016/184924中公开的低密度不混溶化合物)。油层中的示例性油可包括但不限于：合成油，有机油，矿物油或石蜡油。在一些实施方案中，微管104在孵育室106和反应室108之间包括气隙和油层。
该方法的下一步包括将稀释剂(例如缓冲液，AB血浆，AB血清或含有0.9％氯化钠和6％牛血清白蛋白的溶液)添加至测试卡100中至少一个孵育室106。在一些实施方案中，从第二孵育室开始将稀释剂添加到孵育室106。在一些实施方案中，将5-200微升稀释剂添加到至少一个孵育室106中。添加到孵育室中的稀释剂的最大体积将取决于孵育室的容量和稀释因数。
在该方法的下一步骤中，将样品直接系列稀释到其中具有稀释剂的每个孵育室106中。在一些实施方案中，将样品稀释到跨多个测试卡的孵育室中。在某些实施方案中，系列稀释是两倍或更少的稀释(例如1：0.1、1：0.5、1：0.75等)。一些实施方案中，系列稀释是两倍或更多倍系列稀释(例如，至少1：1、1：2、1：3或更多的稀释)。在示例性的两倍系列稀释实施方案中，将5–200微升(或等于稀释剂量的体积)的样品添加到前两个孵育室中。在第二孵育室中，例如通过(手动或自动)吹打两次至五次或更多次，将样品与稀释剂混合。在孵育室和反应室之间具有气隙或油层的实施方案中，将样品与稀释剂混合而不干扰气隙或油层。使用干净的移液器吸头以防止残留，然后将第二孵育室中一定体积(例如5–200微升)的混合物添加到下一个孵育室中，进行混合，依此类推，直到最后一个孵育室，从中取出5-200微升并丢弃。例如，在一个实施方案中，将10微升的混合物从第二孵育室移出，添加至下一个孵育室并进行混合。然后将第三孵育室中的10微升混合物转移到下一个孵育室，依此类推，直到最后一个孵育室，从中取出10微升并丢弃。在孵育室中产生的示例性稀释因数是1x，2x，4x，8x，16x和32x。
在一些实施方案中，包括反应室108不包含试剂的实施方案中，该方法的下一步骤包括将试剂添加到每个孵育室106中。在一些实施方案中，在将试剂添加到孵育室106之后，将其与稀释的样品混合。在一些实施方案中，包被的微球或微粒用于捕获相应的抗体或抗原。
在该方法的下一步骤中，任选地将测试卡100在37℃、室温或4℃下孵育适当的时间量(例如5至15分钟)，以使试剂与稀释的样品相互作用。然后使测试卡100发生沉降(例如，通过离心或重力作用)，以基于尺寸将凝集的RBC与非凝集的RBC分离。在一个实施方案中，将测试卡100以适当的时间和足够的速度进行离心(例如，以85xg的速度离心5-10分钟)以将凝集的RBC与未凝集的RBC分离。凝集的RBC被捕获在分离基质110的顶部或内部，而非凝集的RBC在微管104的底部形成沉淀。
在确定抗体滴度的实施方案中，该方法的最后一步包括确定样品的最高稀释度，在该最高稀释度下在分离基质110之上或之内检测到试剂-抗体复合物(例如凝集物)(例如，基于相应测试卡的使用说明进行试剂-抗体复合物的视觉检测)。在一些实施方案中，抗体滴度是观察到对应于“+”的反应强度的试剂-抗体复合物的样品的最高稀释度。在一些实施方案中，试剂-抗体复合物是视觉或光学检测的。在某些实施方案中，该方法进一步包括确定每种稀释度的反应等级。在一些实施方案中，该方法进一步包括确定抗体滴度得分，并且抗体滴度得分是分配给每个反应的得分值的总和。
在确定抗原浓度的实施方案中，该方法的最后步骤包括确定样品的最高稀释度，在该最高稀释度下在分离基质110之上或之内检测到抗人球蛋白-抗原复合物。在一些实施方案中，人球蛋白-抗原复合物是视觉或光学检测的。
附加披露和可诉主题
第1项：一种通过原位系列稀释确定样品中分析物浓度的方法，该方法包括：。
提供免疫诊断测试卡，所述测试卡包括基本平坦的支撑件，所述支撑件支撑多个垂直放置的微管，每个微管均具有用于接收样品的孵育室和包含分离基质的反应室，其中所述反应室包含能够与分析物复合形成试剂-分析物复合物的试剂；
将稀释剂添加到至少一个孵育室中；
将样品直接系列稀释到其中具有稀释剂的每个孵育室中；
通过重力和/或离心作用使测试卡发生沉降；和
通过确定样品的最高稀释度来确定分析物的浓度，在所述最高稀释度下在分离基质之上或之内检测到试剂-分析物复合物。
第2项：根据第1项所述的方法，其中，确定分析物的浓度的步骤包括确定抗体的滴度，所述滴度是观察到对应于“+”的反应强度的试剂-抗体复合物的样品的最高稀释度。
第3项：根据第2项所述的方法，进一步包括确定抗体终点，所述抗体终点是具有可见试剂-抗体复合物的样品的最高稀释度。
第4项：根据第2项或第3项所述的方法，进一步包括确定抗体滴度得分，所述抗体滴度得分是分配给每个反应的得分值的总和。
第5项：根据第2项所述的方法，其中，确定分析物的浓度的步骤包括确定抗原的浓度。
第6项：根据第1-5项中任一项所述的方法，其中，所述分离基质是包含葡聚糖丙烯酰胺的凝胶。
第7项：根据第1-6项中任一项所述的方法，其中，所述反应室包含网状剂。
第8项：根据第7项所述的方法，其中，所述网状剂是二抗。
第9项：根据第8项所述的方法，其中，所述二抗是抗人球蛋白或抗人IgA抗体。
第10项：根据第1项所述的方法，其中，所述系列稀释样品的步骤包括将样品直接系列稀释到同一个测试卡或多个测试卡之间的每个孵育室中。
第11项：根据第1-10项中任一项所述的方法，其中，所述试剂包括红细胞或其上具有抗原或抗体的包被颗粒。
第12项：根据第2-4项中任一项所述的方法，其中，所述抗体针对红细胞抗原。
第13项：根据第12项所述的方法，其中，所述抗体选自：抗-A抗体，抗-B抗体，抗-D抗体，抗-C抗体，抗-c抗体，抗-E抗体，抗-e抗体，抗-Fya抗体，抗-Fyb抗体，抗-Kell抗体，抗-k抗体，抗-Kpa抗体，抗-Kpb抗体，抗-M抗体，抗-N抗体，抗-S抗体和抗-s抗体。
第14项：根据第1-13项中任一项所述的方法，其中，每个微管还包括在所述孵育室和所述反应室之间的气隙。
第15项：根据第1-14项中任一项所述的方法，其中，每个微管在所述孵育室和所述反应室之间还包含低密度不混溶化合物。
第16项：根据第15项所述的方法，其中，所述低密度不混溶化合物包括选自合成油、有机油、矿物油和石蜡油的油。
第17项：根据第1-16项中任一项所述的方法，进一步包括在将样品直接系列稀释到其中具有稀释剂的每个孵育室中的步骤之后，向其中具有稀释剂和/或样品的每个孵育室中添加另外的试剂，其中所述试剂能够与分析物复合以形成试剂-分析物复合物。
第18项：根据第17项所述方法，进一步包括在将另外的试剂添加到其中具有稀释剂和/或样品的每个孵育室中的步骤之后，孵育测试卡。
第19项：根据第1-18项中任一项所述的方法，其中，系列稀释样品的步骤包括将样品至少两倍系列稀释到其中具有稀释剂的每个孵育室中。
第20项：根据第1-19项中任一项所述的方法，其中，系列稀释样品的步骤包括将样品小于两倍系列稀释到其中具有稀释剂的每个孵育室中。
第21项：根据第1-20项中任一项所述的方法，其中，系列稀释样品的步骤包括将样品两倍系列稀释到其中具有稀释剂的每个孵育室中。
第22项：根据第1-21项中任一项所述的方法，其中，所述样品选自血清、血浆和校准物。
第23项：根据第1-22项中任一项所述的方法，其中，所述分析物是抗体或抗原。
III.实施例
实施例1–直接在微管中的样品稀释与参比稀释方法的比较
在该实施例中，将直接在微管中的样品稀释与在分开的管中的样品稀释进行了比较。
材料
1.ID-卡
·ID-卡LISS/Coombs(DiaMed GmbH,Bio-Rad)
·ID-卡NaCl,酶测试和冷凝集素(DiaMed GmbH,Bio-Rad)
2.试剂红细胞
·ID-DiaCell I,II,III(DiaMed GmbH,Bio-Rad)
·ID-DiaCell ABO(DiaMed GmbH,Bio-Rad)
3.稀释介质–ID-滴定溶液,(DiaMed GmbH,Bio-Rad)
4.样品
·抗-D,来自人患者,在0.9％NaCl/6％BSA中以1:500稀释
·抗-Kell,在ID-滴定溶液中以1:50稀释
·抗-Fyb,抗-S,抗-M,抗-C,抗-Kpb,抗-Jka，来自人患者
·来自捐赠者的新鲜血浆:3个血浆A和3个血浆O
5.稀释管–溶血玻璃管,Ratiolab(参比2600131)
方法
1.参比稀释方法
a.根据要执行的稀释步骤的数量，例如：试管1(未稀释样品，1/1)，试管2(稀释度1/2)，试管3(稀释度1/4)等，鉴定悬浮液试管。
b.在每个悬浮液试管中分配500μl ID-滴定溶液，但管1(未稀释)除外。
c.在试管1和试管2中分配500μl样品。更换吸头，并通过吹打4-5次来混合试管2的内容物。
d.从该混合物中取出500μl，将其分配到试管3中。更换吸头，并通过吹打4-5次来混合试管3的内容物。
e.使用干净的吸头混合并转移至各稀释度，对所有稀释度继续相同的过程。从最终试管中取出500μl稀释的样品，如果需要进一步稀释，请保存以备使用。
请注意，用于进行系列两倍稀释的体积(此处为500μl)必须适合样品体积的可用性以及所用的悬浮液试管。
f.立即进行ID-卡LISS/Coombs或ID-卡NaCl，酶测试和冷凝集素的测试，如下：
·鉴定ID-卡微管的适当稀释度。
·在每个微管中转移50μl试剂红细胞，然后从最高稀释度到最低稀释度，每个稀释样品中转移25μl(对于ID-卡LISS/Coombs)或50μl(对于ID-卡NaCl，酶测试和冷凝集素)。
·在ID-孵育机中将ID-卡LISS/Coombs于37℃孵育15分钟，或将ID-卡NaCl，酶测试和冷凝集素在室温下孵育10分钟。
·在ID离心机中将ID卡离心10分钟。
·读取并记录反应结果。
2.在测试卡方法中稀释
a.鉴定ID-卡微管的适当稀释度。
b.除第一个微管(未稀释的样品)外，在每个ID卡微管中分配25μl(对于ID-卡LISS/Coombs)或50μl(对于ID-卡NaCl，酶测试和冷凝集素)的ID-滴定溶液。
c.在ID卡微管1和2中分配了25μl(对于ID-卡LISS/Coombs)或50μl(对于ID-卡NaCl，酶测试和冷凝集素)样品。更换吸头，并通过吹打4-5次来混合微管2的内容物。
d.从该混合物中取出25μl(对于ID-卡LISS/Coombs)或50μl(对于ID-卡NaCl，酶测试和冷凝集素)并分配到微管3中。更换吸头，并通过吹打4-5次来混合微管3的内容物。
e.使用干净的吸头混合并转移至各稀释度，对所有稀释度继续相同的过程。从最终的微管中取出25μl(对于ID-卡LISS/Coombs)或50μl(对于ID-卡NaCl，酶测试和冷凝集素)的稀释样品。
f.稀释后立即将50μl试剂红细胞添加到每个微管中。
g.在ID-孵育机中将ID-卡LISS/Coombs于37℃孵育15分钟，或将ID-卡NaCl，酶测试和冷凝集素在室温下孵育10分钟。
h.在ID离心机中将ID卡离心10分钟。
i.读取并记录反应结果。
3.孵育机的AHG污染
·通过摇动测试卡，直到孵育室在视觉上观察到凝胶和上清液，用LISS/Coombs的AHG人工污染孵育室。然后按照供应商的建议在使用前以85xg的速度离心10分钟以回收-ID卡。
结果
反应等级和样品稀释度见图2A-17J。所有测试均与参比同时进行。间接抗球蛋白(抗体筛选)滴定测试卡的图像如图2A至8D所示。图9A-15C中显示了其中的孔被AHG污染并随后离心后用于间接抗球蛋白滴定测试卡的测试卡图像。反定型测试卡的图像显示在图16A-17J中。发明人观察到，在孵育室中进行系列稀释时，容易保留孵育室与反应室之间的气隙。
每种滴定的滴度和凝集分数结果列于表1。滴度是产生“+”反应的最高稀释度的倒数，并且反应强度按照AABB技术手册中所述进行评分(对于每种稀释度，根据反应等级报告得分值，并在所有稀释度中求和)。终点是具有可见聚集体的最高稀释度的倒数。
表1–滴度，得分和终点
表1中的结果表明，将抗血清在孵育室内混合(即在测试卡方法中稀释)显示出与在分开的测试管中进行滴定(即参比)相同的性能。结果还显示，一旦在测试之前将卡离心，由于例如恶劣的运输条件导致的AHG污染孵育室不会影响凝胶的性能。因此，表1中显示的结果表明方法之间的滴度、得分和终点没有显著差异，可以在凝胶测试卡的孵育室内进行稀释以确定抗体滴度，而不会导致凝胶试剂污染样品。
实施例2-生成校准曲线
在该实施例中，测试了直接在测试卡中稀释校准物(或标准品)以生成校准曲线的可行性。
材料
1.ID-卡LISS/Coombs(DiaMed GmbH,Bio-Rad)
2.IH-QC1(DiaMed GmbH,Bio-Rad)(上清液含有抗-D 0.05UI/mL。抗-D 0.05IU/ml是根据世界卫生组织01/572国际标准进行标准化的，该标准由外部认可的参考实验室通过连续流量测定法控制。)
3.ID-DiaCell I(DiaMed,GmbH,Bio-Rad)
4.ID-滴定溶液(DiaMed GmbH,Bio-Rad)
5.稀释管–溶血玻璃管,Ratiolab(参比2600131)
方法
1.参比稀释–使用与实施例1相同的方法，使用ID卡LISS/Coombs。IH-QC1(抗-D0.05UI/mL)是用于稀释的样品。
2.在测试卡方法中稀释–使用与实施例1相同的方法，使用ID卡LISS/Coombs。IH-QC1(抗-D 0.05UI/mL)是用于稀释的样品。
结果
结果示于图18A和18B。反应等级和样品稀释度见图。两种方法都获得了相似的结果，说明可以通过直接在测试卡的孵育室中稀释校准物来生成校准曲线。
实施例3–抗原浓度的测定
在该实施例中，测试了使用包被的颗粒确定抗原浓度的可行性。
材料
1.ID-卡IgA缺陷测试(DiaMed GmbH,Bio-Rad)
2.ID-PaGIA IgA缺陷颗粒(DiaMed GmbH,Bio-Rad)
3.ChromoPure人IgA(Jackson Immunoresearch)(4.8mg/mL)
4.ID-滴定溶液(DiaMed GmbH,Bio-Rad)(人IgA以1μg/mL在ID-滴定溶液中稀释。该样品也可以视为校准物)
5.稀释管–溶血玻璃管,Ratiolab(参比2600131)
方法
1.参比稀释方法
a.根据要执行的稀释步骤的数量，例如：试管1(未稀释样品，1/1)，试管2(稀释度1/2)，试管3(稀释度1/4)，鉴定悬浮液试管。
b.在每个悬浮液试管中分配500μl ID-滴定溶液，但管1(未稀释)除外。
c.在试管1和微管2中以1μg/mL分配500μl人IgA。更换吸头，并通过吹打4-5次来混合试管2的内容物。
d.从该混合物中取出500μl，将其分配到试管3中。更换吸头，并通过吹打4-5次来混合试管3的内容物。
e.使用干净的吸头混合并转移至各稀释度，对所有稀释度继续相同的过程。从最终试管中取出500μl稀释的样品，如果需要进一步稀释，请保存以备使用。
请注意，用于进行系列两倍稀释的体积(此处为500μl)必须适合样品体积的可用性以及所用的悬浮液试管。
f.立即进行ID-卡IgA缺陷检测中的检测，如下所示：
·鉴定ID-卡微管的适当稀释度。
·从最高稀释度到最低稀释度，将10μl的各个稀释样品转移到每个微管中，然后转移50μl ID-PaGIA IgA缺陷颗粒。
·在室温下孵育5分钟。
·在ID离心机中将ID-卡离心10分钟。
·读取并记录反应结果。
2.在测试卡方法中稀释
a.鉴定ID-卡IgA缺陷测试微管的适当稀释度。
b.在每个ID-卡微管中分配10μl ID-滴定溶液，第一个微管除外(未稀释的样品)。
c.在试管1和微管2中以1μg/mL分配10μl人IgA。更换吸头，并通过吹打4-5次来混合微管2的内容物。
d.从该混合物中取出10μl，将其分配到微管3中。更换吸头，并通过吹打4-5次来混合微管3的内容物。使用干净的吸头混合并转移至各稀释度，对所有稀释度继续相同的过程。从最终的微管中，取出10μl稀释样品。
f.稀释后，立即向每个微管中加入50μl ID-PaGIA IgA缺陷颗粒。
g.在室温下孵育5分钟。
h.在ID离心机中将-ID卡离心10分钟。
i.读取并记录反应结果。
结果
结果示于图19A和19B。反应等级和样品稀释度见图。两种方法都获得了相似的结果，说明可以通过直接在测试卡的孵育室中稀释抗原来确定抗原浓度。
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本说明书中引用的所有专利、专利申请、网络资源和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。当本说明书的内容与本发明引用的任何参考材料或任何现有技术之间存在矛盾之处的时候，以本说明书为准。所述矛盾之处包括现有技术对词或词组的定义与本说明书对相同的词或词组明确给出的定义之间的差异。
Claims (23)
1.一种通过原位系列稀释确定样品中分析物浓度的方法，所述方法包括：
提供免疫诊断测试卡，所述测试卡包括基本平坦的支撑件，所述支撑件支撑多个垂直放置的微管，每个微管具有用于接收样品的孵育室和包含分离基质的反应室，所述孵育室和所述反应室由气隙分离；
将稀释剂添加到至少一个孵育室中；
将样品直接系列稀释到其中具有稀释剂的每个孵育室中；
将试剂添加到其中具有稀释剂和/或样品的每个孵育室中，所述试剂能够与分析物复合形成试剂-分析物复合物；
使样品和试剂的混合物通过重力和/或离心作用发生沉降；和
通过确定样品的最高稀释度来确定分析物的浓度，在所述最高稀释度下在分离基质之上或之内检测到试剂-分析物复合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，确定分析物的浓度的步骤包括确定抗体的滴度，所述滴度是观察到对应于“+”的反应强度的试剂-抗体复合物的样品的最高稀释度。
3.如权利要求2所述的方法，进一步包括确定抗体终点，所述抗体终点是具有可见试剂-抗体复合物的样品的最高稀释度。
4.如权利要求2或3所述的方法，进一步包括确定抗体滴度得分，所述抗体滴度得分是分配给每个反应的得分值的总和。
5.如权利要求1所述的方法，其中，确定分析物的浓度的步骤包括确定抗原的浓度。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述分离基质是聚电解质凝胶。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述聚电解质凝胶是葡聚糖丙烯酰胺。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述反应室还包含网状剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述网状剂是二抗。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述二抗是抗人球蛋白或抗人IgA抗体。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述系列稀释样品的步骤包括将样品直接系列稀释到同一个测试卡或多个测试卡之间的每个孵育室中。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述试剂包括红细胞或其上具有抗原或抗体的包被颗粒。
13.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其中，所述抗体针对红细胞抗原。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述抗体选自：抗-A抗体，抗-B抗体，抗-D抗体，抗-C抗体，抗-c抗体，抗-E抗体，抗-e抗体，抗-Fya抗体，抗-Fyb抗体，抗-Kell抗体，抗-k抗体，抗-Kpa抗体，抗-Kpb抗体，抗-M抗体，抗-N抗体，抗-S抗体和抗-s抗体。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，每个微管在所述孵育室和所述反应室之间还包含低密度不混溶化合物。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述低密度不混溶化合物包括选自合成油、有机油、矿物油和石蜡油的油。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，进一步包括在将试剂添加到其中具有稀释剂和/或样品的孵育室之后，混合所述试剂与所述样品。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，进一步包括在将试剂添加到其中具有稀释剂和/或样品的孵育室之后，孵育所述测试卡。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，系列稀释样品的步骤包括将样品至少两倍系列稀释到其中具有稀释剂的每个孵育室中。
20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，系列稀释样品的步骤包括将样品小于两倍系列稀释到其中具有稀释剂的每个孵育室中。
21.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，系列稀释样品的步骤包括将样品两倍系列稀释到其中具有稀释剂的每个孵育室中。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述样品选自血清、血浆和校准物。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述分析物是抗体或抗原。
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