ES2966641T3 - Procedimiento de dilución seriada in situ - Google Patents
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Abstract
En el presente documento se proporcionan métodos para determinar la concentración de un analito en una muestra utilizando diluciones en serie in situ. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de dilución seriadain situ
Antecedentes
En los bancos de sangre, cuando se detecta un anticuerpo clínicamente significativo capaz de causar una enfermedad hemolítica del recién nacido o del feto en una mujer embarazada, el título del anticuerpo (o concentración semicuantitativa) se determina realizando una titulación de anticuerpos. A lo largo del embarazo, se repite el título de anticuerpos de la madre para determinar si se produce un aumento del título o de la concentración del anticuerpo. Un aumento del título de anticuerpos en tres o más diluciones se considera clínicamente significativo y sugiere que los hematíes fetales (RBC) poseen el antígeno del anticuerpo correspondiente. Una vez que el título alcance un umbral crítico y el feto tenga al menos dieciocho semanas de edad gestacional, se realizarán estudios adicionales, como ecografía, ecografía Doppler, amniocentesis o cordocentesis. Estos procedimientos controlan el nivel de anemia en el feto e indican la necesidad de transfusión intrauterina u otras intervenciones.
La titulación de anticuerpos también está indicada clínicamente para separar anticuerpos múltiples, identificar anticuerpos y realizar titulaciones de isohemaglutinina ABO en unidades de plaquetas de donantes de aféresis u órganos que se van a trasplantar a través de fronteras ABO. La valoración de anticuerpos también puede realizarse para (i) evaluar la densidad del sitio del antígeno de los reactivos de eritrocitos, (ii) evaluar las características de un nuevo antisuero o comparar un nuevo lote con uno anterior, (iii) investigar los llamados anticuerpos de alto título y baja avidez (HTLA) (por ejemplo, anticuerpos conocidos por pertenecer al sistema de grupos sanguíneos Knops), (iv) determinar la especificidad relativa de los autoanticuerpos en la anemia hemolítica inmune por anticuerpos calientes (WAIHA), (v) realizar estudios sobre la saliva de secretores de sustancia soluble del grupo sanguíneo, (vi) determinar el estado antigénico de células positivas a la prueba de antiglobulina directa (DAT) cuando no se disponga de reactivos o no se consiga eliminar la IgG de las células a tipificar y (vii) determinar el título, la especificidad y la amplitud térmica de un autoanticuerpo frío, por ejemplo, anti-I.
Los anticuerpos suelen valorarse realizando diluciones dobles seriadas del plasma del paciente y calificando la intensidad de la reactividad con glóbulos rojos (GR) seleccionados que posean el antígeno correspondiente. Los resultados de un título se indican como el recíproco de la dilución más alta de plasma que demuestra aglutinación macroscópica. Las diluciones del plasma o suero del paciente se realizan en tubos de muestra separados en lugar de directamente en el dispositivo de prueba de inmunodiagnósti
reactivo en el dispositivo de prueba. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. 4, 305, 721 divulga un procedimiento para determinar una concentración de un analito en una muestra mediante dilución seriadain situ,el procedimiento comprende: proporcionar una tarjeta de prueba de inmunodiagnóstico, añadir un diluyente a al menos una de las áreas de incubación; diluir en serie la muestra directamente en cada una de las áreas de incubación que tienen diluyente en la misma; añadir un reactivo a cada una de las áreas de incubación que tienen diluyente y/o muestra en la misma, en donde el reactivo es capaz de formar un complejo con el analito para formar un complejo reactivo-analito; exponer la mezcla de muestra y reactivo a sedimentación; y determinar la concentración del analito determinando una dilución máxima de la muestra a la que se detecta un complejo reactivo-analito en la tarjeta. Una tarjeta de prueba de inmunodiagnóstico similar se conoce por el documento W<o>2016/184924.
Sumario
En el presente documento se describen procedimientos para determinar la concentración de un analito en una muestra mediante dilución seriadain situ.Los procedimientos incluyen la determinación del título de un anticuerpo en una muestra, la determinación de la concentración de antígeno y la generación de una curva de calibración. Los procedimientos divulgados encuentran utilidad en las pruebas de inmunodiagnóstico. En los procedimientos divulgados, la muestra se diluyein situo directamente en el dispositivo de prueba (por ejemplo, una tarjeta de prueba de gel) en lugar de en tubos separados. Sorprendentemente, el espacio de aire entre las cámaras de incubación y de reacción se conservó mientras se realizaban diluciones de muestras en el dispositivo de prueba, y la muestra no se contaminó con reactivo en el dispositivo de prueba mientras se diluía en el dispositivo de prueba.
En particular, la invención proporciona un procedimiento para determinar la concentración de un analito en una muestra mediante dilución seriadain situ,el procedimiento, que comprende:
proporcionar una tarjeta de prueba de inmunodiagnóstico, la tarjeta de prueba comprende un soporte sustancialmente plano que soporta una pluralidad de microtubos dispuestos verticalmente, cada microtubo tiene una cámara de incubación para recibir la muestra y una cámara de reacción que comprende una matriz de separación, la cámara de incubación y la cámara de reacción están separadas por un espacio de aire;
añadir un diluyente a al menos una de las cámaras de incubación;
dilución seriada de cada muestra directamente en cada una de las cámaras de incubación que contienen diluyente; adición de un reactivo a cada una de las cámaras de incubación que contienen diluyente y/o muestra, en las que el reactivo puede formar un complejo con el analito para formar un complejo reactivoanalito;
exponer la mezcla de muestra y reactivo a sedimentación por gravitación y/o centrifugación; y
determinar la concentración del analito determinando una dilución máxima de la muestra en la que se detecta un complejo reactivo-analito en la matriz de separación o dentro de ella.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es una vista frontal de una tarjeta de prueba inmunodiagnóstica que puede utilizarse en procedimientos según realizaciones de la invención.
Las FIG. 2A - 2B muestran los resultados de un experimento de valoración anti-D como se describe en el Ejemplo 1 (el plasma anti-D se prediluye 500x). La FIG. 2A es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando un procedimiento de referencia. La FIG. 2B es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando una dilución en el procedimiento de la tarjeta de prueba.
Las FIG. 3A - 3B muestran los resultados de un experimento de valoración anti-Kell como el descrito en el Ejemplo 1 (anti-Kell prediluido 50x). FIG. 3A es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia. La FIG. 3B es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba.
Las FIG. 4A - 4D muestran los resultados de un experimento de valoración anti-Fyb como el descrito en el Ejemplo 1. Las FIG. 4A - 4B son imágenes de los resultados de las tarjetas de prueba utilizando el procedimiento de referencia. Las FIG. 4C - 4D son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba.
Las FIG. 5A - 5B muestran los resultados de un experimento de valoración anti-M como el descrito en el Ejemplo 1. La FIG. 5A es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia. La FIG. 5B es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba.
Las FIG. 6A - 6F muestran los resultados de un experimento de valoración anti-C como el descrito en el Ejemplo 1. Las FIG. 6A - 6C son imágenes de los resultados de las tarjetas de prueba utilizando el procedimiento de referencia. Las FIG. 6D - 6F son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba.
Las FIG. 7A - 7B muestran los resultados de un experimento de valoración anti-Kpb como el descrito en el Ejemplo 1. La FIG. 7A es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia. La FIG. 7B es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba.
Las FIG. 8A - 8D muestran los resultados de un experimento de valoración anti-Jka como el descrito en el Ejemplo 1. Las FIG. 8A - 8B son imágenes de los resultados de las tarjetas de prueba utilizando el procedimiento de referencia. Las FIG. 8C - 8D son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba.
Las FIG. 9A - 9C muestran los resultados de un experimento de contaminación por AHG en cámara de incubación anti-D como se describe en el Ejemplo 1. La FIG. 9A es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia. La FIG. 9B es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia con pocillos contaminados (es decir, contaminados con gel y centrifugados antes de su uso). La FIG. 9C es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba con pocillos contaminados.
Las FIG. 10A - 10F muestran los resultados de un experimento de contaminación por AHG en cámara de incubación anti-Kell como se describe en el Ejemplo 1. Las FIG. 10A - 10B son imágenes de los resultados de las tarjetas de prueba utilizando el procedimiento de referencia. Las FIG. 10C - 10D son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia con pozos contaminados. Las FIG. 10E - 10F son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba con pozos contaminados.
Las FIG. 11A- 11F muestran los resultados de un experimento de contaminación por AHG en cámara de incubación anti-Fyb como se describe en el Ejemplo 1. Las FIG. 11A- 11B son imágenes de los resultados de las tarjetas de prueba utilizando el procedimiento de referencia. Las FIG. 11C - 11D son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia con pozos contaminados. Las FIG. 11E - 11F son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba con pozos contaminados.
Las FIG. 12A - 12F muestran los resultados de un experimento de contaminación por AHG en cámara de incubación anti-S como se describe en el Ejemplo 1. Las FIG. 12A - 12B son imágenes de los resultados de las tarjetas de prueba utilizando el procedimiento de referencia. Las FIG. 12C - 12D son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia con pozos contaminados. Las FIG. 12E - 12F son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba con pozos contaminados.
Las FIG. 13A - 13C muestran los resultados de un experimento de contaminación por AHG en cámara de incubación anti-M como se describe en el Ejemplo 1. La FIG. 13A es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia. La FIG. 13B es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia con pozos contaminados. La FIG. 13C es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba con pocillos contaminados.
Las FIG. 14A - 14I muestran los resultados de un experimento de contaminación por AHG en cámara de incubación anti-C como se describe en el Ejemplo 1. Las FIG. 14A - 14C son imágenes de los resultados de las tarjetas de prueba utilizando el procedimiento de referencia. Las FIG. 14D - 14F son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia con pozos contaminados. Las FIG. 14G - 14I son imágenes de resultados de tarjetas de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba con pozos contaminados.
Las FIG. 15A - 15C muestran los resultados de un experimento de contaminación por AHG en cámara de incubación anti-Kpb como se describe en el Ejemplo 1. La FIG. 15A es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia. La FIG. 15B es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia con pozos contaminados. La FIG. 15C es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba con pocillos contaminados.
Las FIG. 16A - 16F muestran los resultados de un experimento de valoración de tipificación inversa con tres muestras de plasma A como se describe en el Ejemplo 1. Cada muestra se analizó con el procedimiento de referencia y con el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba. Las FIG. 16A - 16B son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba para la primera muestra de plasma A. Las FIG. 16C - 16D son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba para la segunda muestra de plasma A. Las FIG. 16E - 16F son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba para la tercera muestra de plasma A.
Las FIG. 17A - 17J muestran los resultados de un experimento de titulación de tipificación inversa con tres muestras de plasma O como se describe en el Ejemplo 1. Cada muestra se analizó con el procedimiento de referencia y con el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba. Las FIG. 17A - 17D son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba para la primera muestra de plasma O. Las FIG. 17E - 17H son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba para la segunda muestra de plasma O. Las FIG. 17I - 17J son imágenes de los resultados de la tarjeta de prueba para la tercera muestra de plasma O.
Las FIG. 18A - 18B muestran los resultados de un experimento como el descrito en el Ejemplo 2 en el que el calibrador se diluye en tubos o directamente en la tarjeta de ensayo. La FIG. 18A es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia en el que se calibra en diluciones seriadas en tubos. La FIG. 18B es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba.
Las FIG. 19A - 19B muestran los resultados de un experimento como el descrito en el Ejemplo 3 en el que se determina una concentración de un antígeno (IgA humana). La FIG. 19A es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de referencia. La FIG. 19B es una imagen de los resultados de la tarjeta de prueba utilizando el procedimiento de dilución en la tarjeta de prueba.
Descripción detallada
Se proporcionan procedimientos para determinar la concentración de un analito en una muestra mediante dilución seriada.
I. Definiciones
Los términos "un" o "una" significan "uno o más" El término "comprender" y sus variantes, como "comprende" y "que comprende", cuando preceden a la recitación de una etapa o un elemento, significan que la adición de otras etapas o elementos es opcional y no está excluida. En la práctica de esta invención pueden utilizarse cualesquiera procedimientos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos utilizados con frecuencia en el presente documento y no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación.
El término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido de la familia de las inmunoglobulinas o a un polipéptido que comprende fragmentos de una inmunoglobulina capaz de unirse de forma no covalente, reversible y específica a un antígeno correspondiente. El término incluye anticuerpos policlonales o monoclonales de las clases de isotipo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
El término "antígeno" se refiere a una molécula, compuesto o complejo que es reconocido por un anticuerpo, es decir, que puede ser unido específicamente por el anticuerpo. El término puede referirse a cualquier molécula que pueda ser reconocida específicamente por un anticuerpo, incluyendo una proteína (por ejemplo, una proteína del grupo sanguíneo, una proteína nativa, un fragmento de una proteína nativa o una proteína recombinante), un polipéptido, un polisacárido, un lípido, un lípido formador de complejo con una proteína o un polisacárido, un carbohidrato, una fracción química o combinaciones de los mismos.
El término "proteína" se refiere a un polímero de aminoácidos o a un conjunto de dos o más polímeros de aminoácidos que interactúan o se unen.
El término "dilución seriada" se refiere a una dilución escalonada de una sustancia en solución. Cada etapa no tiene necesariamente factores de dilución idénticos.
La expresión "proporcionar una tarjeta de prueba de inmunodiagnóstico" se refiere al hecho de que el procedimiento se realiza utilizando dicha tarjeta de prueba de inmunodiagnóstico.
II. Procedimientos
Ahora se describirá un procedimiento para determinar la concentración de un analito en una muestra mediante diluciones seriadasin situde la muestra (por ejemplo, plasma, suero, calibrador/estándar). En algunas realizaciones, el analito es un anticuerpo dirigido contra un antígeno de glóbulos rojos y el anticuerpo incluye anticuerpo anti-A, anticuerpo anti-B (o anticuerpo anti-ABO), anticuerpo anti-C, anticuerpo anti-c, anticuerpo anti-D anticuerpo anti-E, anticuerpo anti-e, anticuerpo anti-Fya, anticuerpo anti-Fyb, anticuerpo anti-Jka, anticuerpo anti-Kell, anticuerpo anti-K, anticuerpo anti-Kpa, anticuerpo anti-Kpb, anticuerpo anti-M, anticuerpo anti-N, anticuerpo anti-S y anticuerpo anti-s. En ciertas realizaciones, el analito es un antígeno. En algunas realizaciones, el analito es un anticuerpo dirigido contra microesferas recubiertas de antígeno. En ciertas realizaciones, el analito es un antígeno capturado por microesferas recubiertas de anticuerpos. En algunas realizaciones, el analito es cualquier otro ligando, por ejemplo, biotina o estreptavidina. Tal como se utiliza aquí, un "ligando" es una sustancia que forma un complejo con una biomolécula para servir a un propósito biológico.
En una realización, el procedimiento comprende proporcionar una tarjeta de prueba inmunodiagnóstica 100 (FIG. 1). La tarjeta de prueba 100 comprende un soporte sustancialmente plano 102 que soporta una pluralidad de microtubos (o unidades de prueba) dispuestos verticalmente 104 (por ejemplo, al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho), cada microtubo tiene una cámara de incubación 106 para recibir la muestra y una cámara de reacción 108 que comprende una matriz de separación 110. La tarjeta de prueba 100 y los microtubos 104 pueden estar formados de materiales que incluyen, entre otros, polietileno, cloruro de polivinilo o poliestireno. Los microtubos 104 pueden pegarse o soldarse a una porción superior de la tarjeta de prueba 100 o pueden fabricarse integralmente con la tarjeta de prueba mediante, por ejemplo, envasado en blíster. Los microtubos 104 son generalmente de forma cilíndrica, teniendo la cámara de incubación 106 un diámetro mayor que la cámara de reacción 108. En algunas realizaciones, una porción del microtubo 104 entre la cámara de incubación 106 y la cámara de reacción 108 tiene un diámetro cónico 112.
En algunas realizaciones, la cámara de reacción 108 comprende al menos una matriz de separación (por ejemplo, un gel) y un sobrenadante (por ejemplo, un sobrenadante líquido). En algunas realizaciones, la cámara de reacción 108 comprende además un reactivo. En algunas realizaciones, el reactivo (o al menos uno de los reactivos) está presente en el sobrenadante. El reactivo o reactivos son capaces de formar complejos (por ejemplo, unirse) con el analito (o con uno de los analitos) para formar un complejo reactivo-analito. En algunas realizaciones, el reactivo comprende una partícula recubierta (por ejemplo, una partícula de látex, una microesfera o una micropartícula) o un glóbulo rojo que contiene un antígeno, un anticuerpo o cualquier otro ligando de analito (por ejemplo, estreptavidina). El antígeno del glóbulo rojo dependerá del anticuerpo que se vaya a valorar. Por ejemplo, en una realización en la que el anticuerpo es un anticuerpo anti-D, el antígeno en los glóbulos rojos será el antígeno D. En algunas realizaciones, la cámara de reacción 108 comprende además un agente de reticulación, que puede estar presente, por ejemplo, en el sobrenadante y/o en la matriz de separación 110. Tal como se utiliza en el presente documento, un agente de reticulación es una biomolécula que reticula glóbulos rojos sensibilizados o partículas de látex sensibilizadas. Los agentes de reticulación ejemplares incluyen un anticuerpo secundario, (por ejemplo, anticuerpo antiglobulina humana o anti IgA humana), Proteína A, y un ligando (por ejemplo, estreptavidina).
En algunas realizaciones, la matriz de separación 110 es un gel, por ejemplo, un gel de polielectrolito que comprende acrilamida dextrano. En algunas realizaciones, la matriz de separación 110 es un material inerte que incluye agarosa, poliacrilamida, polidextrano, polímeros de estireno-divinilbenceno o perlas de vidrio.
En ciertas realizaciones, el microtubo 104 comprende además un espacio de aire por encima de la matriz de separación 110 (por ejemplo, entre la cámara de incubación 106 y la cámara de reacción 108). En algunas realizaciones, el microtubo 104 comprende una capa de aceite (o cualquier compuesto inmiscible de baja densidad, por ejemplo, un compuesto inmiscible de baja densidad como se describe en el documento WO2016/184924) por encima de la matriz de separación 110. Los aceites ejemplares de la capa de aceite pueden incluir, entre otros, aceite sintético, aceite orgánico, aceite mineral o aceite parafínico. En algunas realizaciones, el microtubo 104 comprende una cámara de aire y una capa de aceite entre la cámara de incubación 106 y la cámara de reacción 108.
La siguiente etapa del procedimiento comprende la adición de diluyente (por ejemplo, tampón, plasma AB, suero AB, o una solución que tenga 0,9% de cloruro sódico y 6% de albúmina de suero bovino) a al menos una de las cámaras de incubación 106 de la tarjeta de prueba 100. En algunas realizaciones, el diluyente se añade a las cámaras de incubación 106 empezando por la segunda cámara de incubación. En algunas realizaciones, se añaden 5 - 200 microlitros de diluyente a al menos una de las cámaras de incubación 106. El volumen máximo de diluyente añadido a la cámara de incubación dependerá de la capacidad de la cámara de incubación y del factor de dilución.
En la siguiente etapa del procedimiento, la muestra se diluye en serie directamente en cada una de las cámaras de incubación 106 que contienen diluyente. En algunas realizaciones, la muestra se diluye en cámaras de incubación a través de múltiples tarjetas de prueba. En ciertas realizaciones, la dilución seriada es una dilución doble o inferior (por ejemplo, 1:0,1, 1:0,5, 1:0,75, etc.). En algunas realizaciones, la dilución seriada es una dilución en serie de dos o más veces (por ejemplo, al menos 1 : 1, 1:2, 1:3, o más dilución). En una realización ejemplar de dilución seriada doble, se añaden 5-200 pl (o un volumen igual a la cantidad de diluyente) de la muestra a las dos primeras cámaras de incubación. En la segunda cámara de incubación, la muestra se mezcla con diluyente, por ejemplo, pipeteando arriba y abajo (manual o automáticamente) de dos a cinco veces o más. En las realizaciones que tienen un espacio de aire o una capa de aceite entre las cámaras de incubación y de reacción, la muestra se mezcla con el diluyente sin perturbar el espacio de aire o la capa de aceite. Utilizando una punta de pipeta limpia para evitar el arrastre, se añade un volumen (por ejemplo, 5 - 200 pl) de la mezcla de la segunda cámara de incubación a la siguiente cámara de incubación, se mezcla, y así sucesivamente hasta la última cámara de incubación, de la que se extraen y desechan 5 - 200 pl. Por ejemplo, en una realización, se extraen 10 microlitros de la mezcla de la segunda cámara de incubación, se añaden a la siguiente cámara de incubación y se mezclan. a continuación, 10 pl de la mezcla de la tercera cámara de incubación se transfieren a la siguiente cámara de incubación, y así sucesivamente hasta la última cámara de incubación, de la que se extraen y desechan 10 pl. Un factor de dilución resultante ejemplar en las cámaras de incubación es 1x, 2x, 4x, 8x, 16x y 32x.
En algunas realizaciones, incluyendo realizaciones en las que la cámara de reacción 108 no comprende un reactivo, la siguiente etapa del procedimiento comprende añadir un reactivo a cada una de las cámaras de incubación 106. En algunas realizaciones, el reactivo se mezcla con la muestra diluida después de añadirlo a la cámara de incubación 106. En algunas realizaciones, se utilizan microesferas o micropartículas recubiertas para capturar los anticuerpos o antígenos correspondientes.
En la siguiente etapa del procedimiento, la tarjeta de prueba 100 se incuba opcionalmente a 37 °C, temperatura ambiente o 4 °C durante un tiempo apropiado (por ejemplo, 5-15 min) para permitir que el reactivo interactúe con la muestra diluida. A continuación, la tarjeta de prueba 100 se expone a sedimentación (por ejemplo, por centrifugación o gravitación) para separar los glóbulos rojos aglutinados de los no aglutinados en función de su tamaño. En una realización, la tarjeta de prueba 100 se centrifuga durante una cantidad adecuada de tiempo y a una velocidad suficiente (por ejemplo, 5 - 10 min a 85xg) para separar los glóbulos rojos aglutinados de los no aglutinados. Los glóbulos rojos aglutinados se capturan en la parte superior o dentro de la matriz de separación 110, y los glóbulos rojos no aglutinados forman un precipitado en el fondo del microtubo 104.
En las realizaciones en las que se está determinando el título de un anticuerpo, la última etapa del procedimiento comprende determinar la dilución más alta de la muestra a la que se detecta un complejo reactivo-anticuerpo (por ejemplo, un aglutinante) sobre o dentro de la matriz de separación 110 (por ejemplo, la detección visual del complejo reactivo-anticuerpo se basa en las instrucciones de uso de la tarjeta de prueba correspondiente). En algunas realizaciones, el título de anticuerpos es la dilución más alta de la muestra para la que se observa un complejo reactivoanticuerpo correspondiente a una intensidad de reacción de "+". En algunas realizaciones, el complejo reactivoanticuerpo se detecta visual u ópticamente. En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende además determinar el grado de reacción para cada dilución. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además determinar una puntuación del título de anticuerpos y la puntuación del título de anticuerpos es la suma de los valores de puntuación asignados a cada reacción.
En las realizaciones en las que se determina la concentración de un antígeno, la última etapa del procedimiento comprende determinar la dilución más alta de la muestra en la que se detecta un complejo antiglobulina humanaantígeno sobre o dentro de la matriz de separación 110. En ciertas realizaciones, el complejo globulina-antígeno antihumano se detecta visual u ópticamente.
111. Ejemplos
Ejemplo 1 - Comparación de la dilución de la muestra directamente en un microtubo con el procedimiento de dilución de referencia
En este ejemplo, se comparó la dilución de la muestra directamente en un microtubo con la dilución de la muestra en tubos separados.
Materiales
1. Tarjetas de identificación (ID_Cards)
<o>ID-Card LISS/Coombs (DiaMed GmbH, Bio-Rad)
<o>ID-Card NaCl, prueba de enzimas y aglutininas en frío (DiaMed GmbH, Bio-Rad)
2. Glóbulos rojos reactivos
<o>ID-DiaCell I, II, III (DiaMed GmbH, Bio-Rad)
<o>ID-DiaCell ABO (DiaMed GmbH, Bio-Rad)
3. Medio de dilución - ID-Titration Solution, (DiaMed GmbH, Bio-Rad)
4. Muestras
<o>Anti-D, de pacientes humanos, diluido 1:500 en NaCl 0,9% / BSA 6%
<o>Anti-Kell, diluido 1:50 en solución de titulación ID
<o>Anti-Fyb, anti-S, anti-M, anti-C, anti-Kpb, anti-Jka de pacientes humanos
<o>Plasma fresco de donantes: 3 plasma A y 3 plasma O
5. Tubos de dilución - Tubos de vidrio para hemólisis, Ratiolab (Ref. 2600131)
Procedimiento
1. Procedimiento de referencia para la dilución
a. Se identificaron los tubos de suspensión en función del número de etapas de dilución que deben realizarse, por ejemplo, tubo 1 (muestra sin diluir,1/1), tubo 2 (dilución 1/2), tubo 3 (dilución 1/4). b. Se dispensaron 500 pl de ID-Titration Solution en cada tubo de suspensión, excepto en el tubo 1 (sin diluir).
c. Se dispensaron 500 pl de muestra en los tubos 1 y 2. Se cambiaron las puntas y se mezcló el contenido del tubo 2 pipeteando arriba y abajo 4-5 veces.
d. A partir de esta mezcla, se extrajeron 500 pl y se dispensaron en el tubo 3. Se cambiaron las puntas y se mezcló el contenido del tubo 3 pipeteando arriba y abajo 4-5 veces.
e. Se continuó con el mismo procedimiento para todas las diluciones utilizando puntas limpias para mezclar y transferir a cada dilución. Del último tubo, se extrajeron 500 pl de muestra diluida y se guardaron para utilizarlos si se necesitaban más diluciones. Obsérvese que el volumen utilizado para realizar la dilución doble seriada (en este caso 500 pl) debe adaptarse a la disponibilidad de volumen de muestra, así como a los tubos de suspensión utilizados. f. Se procedió inmediatamente a las pruebas en ID-Card LISS/Coombs o ID-Card NaCl, Prueba de Enzimas y Aglutininas en Frío, como sigue:
■ Se identificaron microtubos ID-Card para las diluciones adecuadas.
■ Se transfirieron 50 pl de hematíes reactivos en cada microtubo, seguidos de 25 pl (para ID-Card LISS/Coombs) o 50 pl (para ID-Card NaCl, Enzyme Test y Cold Agglutinins) de cada muestra diluida, de mayor a menor dilución.
■ Se incubaron durante 15 min a 37 °C en ID-Incubator para ID-Card LISS/Coombs o 10 min a TA para ID-Card NaCl, Enzyme Test y Cold Agglutinins.
■ Se centrifugaron durante 10 min las ID-Cards en la ID-Centrifuge.
■ Se leyeron y registraron los resultados de la reacción.
2. Dilución en el procedimiento de la tarjeta de prueba
a. Se identificaron microtubos ID-Card para las diluciones apropiadas.
b. Se dispensaron 25 |jl (para ID-Card LISS/Coombs) o 50 |jl (para ID-Card NaCI, Enzyme Test y Cold Agglutinins) de ID-Titration Solution en cada microtubo de iD-Card con excepción del primer microtubo (muestra sin diluir).
c. Se dispensaron 25 μl (para ID-Card LISS/Coombs) o 50 μl (para ID-Card NaCl, Enzyme Test y Cold Agglutinins) de muestra en los microtubos ID-Card 1 y 2. Se cambiaron las puntas y se mezcló el contenido del microtubo 2 pipeteando arriba y abajo 4-5 veces.
d. De esta mezcla, se extrajeron 25 μl (para ID-Card LISS/Coombs) o 50 μl (para ID-Card NaCl, Enzyme Test y Cold Agglutinins) y se dispensaron en el microtubo 3. Se cambiaron las puntas y se mezcló el contenido del microtubo 3 pipeteando arriba y abajo 4-5 veces.
e. Se continuó con el mismo procedimiento para todas las diluciones utilizando puntas limpias para mezclar y transferir a cada dilución. Del microtubo final, se extrajeron 25 μl (para ID-Card LISS/Coombs) o 50 μl (para ID-Card NaCl, Enzyme Test y Cold Agglutinins) de muestra diluida.
f. Inmediatamente después de la dilución, se añadieron 50 μl de reactivo de hematíes en cada microtubo.
g. Se incubaron durante 15 min a 37 °C en ID-Incubator para ID-Card LISS/Coombs o 10 min a temperatura ambiente para ID-Card NaCl, Enzyme Test y Cold Agglutinins.
h. Se centrifugaron durante 10 min las ID-Cards en la ID-Centrifuge.
i. Se leyeron y registraron los resultados de la reacción.
3. Contaminación por AHG de la cámara de incubación
<o>Las cámaras de incubación se contaminaron artificialmente con el AHG del LISS/Coombs agitando la tarjeta de prueba hasta que se observó visualmente gel y sobrenadante en las cámaras de incubación. A continuación, las ID-Cards se recuperaron por centrifugación, 10 min a 85xg antes de su uso, tal como recomienda el proveedor.
Resultados
El grado de reacción y la dilución de la muestra se muestran en las FIGS. 2A - 17J. Todas las pruebas se realizaron simultáneamente con el procedimiento de referencia. Las imágenes de las tarjetas de prueba de valoración de antiglobulina indirecta (detección de anticuerpos) se muestran en las FIGS. 2A - 8D. Las imágenes de la tarjeta de prueba en la que los pocillos se contaminaron con AHG y luego se centrifugaron antes de su uso en una tarjeta de prueba de valoración indirecta de antiglobulina se muestran en las FIGS. 9A - 15C. Las imágenes de las tarjetas de prueba de tipificación inversa se muestran en las FIGS. 16A - 17J. El inventor observó que el espacio de aire entre la cámara de incubación y la cámara de reacción se conservaba fácilmente mientras se realizaban diluciones seriadas en las cámaras de incubación.
Los resultados del título y de la puntuación de aglutinación para cada titulación se muestran en la Tabla 1. El título es el recíproco de la dilución más alta que produce una reacción "+", y la fuerza de las reacciones se puntuó como se describe en el Manual Técnico de la AABB (para cada dilución, se comunica un valor de puntuación basado en el grado de reacción y sumado sobre todas las diluciones). El punto final es el recíproco de la dilución más alta con agregados visibles.
Tabla 1 - Puntuaciones de los títulos y criterios de valoración
Los resultados de la Tabla 1 muestran que la mezcla de antisueros dentro de la cámara de incubación (es decir, el procedimiento de dilución en la tarjeta de ensayo) mostró el mismo rendimiento que la realización de la valoración en tubos de ensayo separados (es decir, el procedimiento de referencia). Los resultados también muestran que la contaminación de la cámara de incubación con AHG debido, por ejemplo, a malas condiciones de transporte, no afectó al rendimiento del gel una vez centrifugadas las tarjetas antes de la prueba. Por lo tanto, los resultados mostrados en la Tabla 1 no ilustran ninguna diferencia significativa en el título, puntuación y punto final entre los procedimientos y que las diluciones para determinar un título de anticuerpo pueden realizarse dentro de las cámaras de incubación de la tarjeta de prueba de gel sin contaminar la muestra con reactivo de gel.
Ejemplo 2- Generación de la curva de calibración
En este ejemplo, se probó la viabilidad de diluir un calibrador (o estándar) directamente en la tarjeta de prueba para generar una curva de calibración.
Materiales
1. ID-Card LISS/Coombs (DiaMed GmbH, Bio-Rad)
2. IH-QC1 (DiaMed GmbH, Bio-Rad) (El sobrenadante contiene anti-D a 0,05 UI/ml. El anti-D 0,05 UI/ml está estandarizado frente al Estándar Internacional 01/572 de la Organización Mundial de la Salud, controlado por un laboratorio de referencia externo acreditado mediante Ensayo de Flujo Continuo)
3. ID-DiaCell I (DiaMed, GmbH, Bio-Rad)
4. Solución ID-Titration (DiaMed GmbH, Bio-Rad)
5. Tubos de dilución - Tubos de vidrio para hemólisis, Ratiolab (Ref. 2600131)
Procedimientos
1. Procedimiento de referencia para la dilución - Se utilizó el mismo procedimiento que para el Ejemplo 1 utilizando la ID-Card LISS/Coombs. El IH-QC1 (anti-D 0,05 UI/ml) fue la muestra para la dilución.
2. Dilución en el procedimiento de la tarjeta de prueba - Se utilizó el mismo procedimiento que para el Ejemplo 1 utilizando la tarjeta ID LISS/Coombs. El IH-QC1 (anti-D 0,05 UI/ml) es la muestra para la dilución.
Resultados
Los resultados se muestran en las FIGS. 18A y 18B. El grado de reacción y la dilución de la muestra se indican en las figuras. Se obtuvieron resultados similares para ambos procedimientos, lo que ilustra que la curva de calibración puede generarse diluyendo un calibrador directamente en las cámaras de incubación de la tarjeta de prueba.
Ejemplo 3 - Determinación de la concentración de un antígeno
En este ejemplo, se probó la viabilidad de utilizar partículas recubiertas para determinar una concentración de antígeno.
Materiales
1. Prueba ID-Card de deficiencia de IgA (DiaMed GmbH, Bio-Rad)
2. ID-PaGIA Partícula de deficiencia de IgA (DiaMed GmbH, Bio-Rad)
3. IgA Humana CromoPura (Jackson Immunoresearch) (4,8 mg/ml)
4. ID-Titration Solution (DiaMed GmbH, Bio-Rad) (La IgA humana se diluye a 1 pg/ml en ID-Titration Solution. Esta muestra puede considerarse también como calibrador)
5. Tubos de dilución - Tubos de vidrio para hemólisis, Ratiolab (Ref. 2600131)
Procedimientos
1. Procedimiento de referencia para la dilución
a. Se identificaron los tubos de suspensión en función del número de etapas de dilución que deben realizarse, por ejemplo, tubo 1 (muestra sin diluir, 1/1), tubo 2 (dilución 1/2), tubo 3 (dilución 1/4). b. Se dispensaron 500 pl de ID-Titration Solution en cada tubo de suspensión, excepto en el tubo 1 (sin diluir).
c. Se dispensaron 500 pl de IgA Humana a 1 pg/ml en el tubo 1 y en el microtubo 2. Se cambiaron las puntas y se mezcló el contenido del tubo 2 pipeteando arriba y abajo 4-5 veces.
d. De esta mezcla, se extrajeron 500 pl y se dispensaron en el tubo 3. Se cambiaron las puntas y se mezcló el contenido del tubo 3 pipeteando arriba y abajo 4-5 veces.
e. Se continuó con el mismo procedimiento para todas las diluciones utilizando puntas limpias para mezclar y transferir a cada dilución. Del último tubo, se extrajeron 500 μl de muestra diluida y se guardaron para utilizarlos si se necesitaban más diluciones. Obsérvese que el volumen utilizado para realizar la dilución doble seriada (en este caso 500 μl ) debe adaptarse a la disponibilidad de volumen de muestra, así como a los tubos de suspensión utilizados. f. Se procedió inmediatamente a la prueba de deficiencia de IgA en ID-Card de la siguiente manera:
■ Se identificaron microtubos ID-Card para las diluciones adecuadas.
■ Se transfirieron 10 μl de cada muestra diluida, de la dilución más alta a la más baja en cada microtubo, seguidos de 50 μl de partículas ID-PaGIA IgA deficientes.
■ Se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente.
■ Se centrifugaron durante 10 min las ID-Cards en la ID-Centrifuge.
■ Se leyeron y se registraron los resultados de la reacción.
2. Dilución en el procedimiento de la tarjeta de prueba
a. Se identificaron los microtubos de la prueba de deficiencia de IgA ID-Card para las diluciones apropiadas.
b. Se dispensaron 10 μl de ID-Titration Solution en cada uno de los microtubos ID-Card a excepción del primer microtubo (muestra sin diluir).
c. Se dispensaron 10 μl de IgA humana a 1 jg/m l en los microtubos ID-Card 1 y 2. Se cambiaron las puntas y se mezcló el contenido del microtubo 2 pipeteando arriba y abajo 4-5 veces.
d. De esta mezcla, se extrajeron 10 μl y se dispensaron en el microtubo 3. Se cambiaron las puntas y se mezcló el contenido del microtubo 3 pipeteando arriba y abajo 4-5 veces.
e. Se continuó con el mismo procedimiento para todas las diluciones utilizando puntas limpias para mezclar y transferir a cada dilución. Del microtubo final, se extrajeron 10 μl de muestra diluida.
f. Inmediatamente después de la dilución, se añadieron 50 μl de partículas ID-PaGIA IgA deficientes a cada microtubo.
g. Se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente.
h. Se centrifugaron durante 10 min las ID-Cards en la ID-Centrifuge.
i. Se leyeron y se registraron los resultados de la reacción.
Resultados
Los resultados se muestran en las FIGS. 19A y 19B. El grado de reacción y la dilución de la muestra se indican en las figuras. Se obtuvieron resultados similares con ambos procedimientos, lo que ilustra que la concentración de antígeno puede determinarse diluyendo el antígeno directamente en las cámaras de incubación de la tarjeta de prueba.
Claims (15)
1. Un procedimiento de determinación de la concentración de un analito en una muestra mediante dilución seriadain situ,comprendiendo el procedimiento:
proporcionar una tarjeta de prueba de inmunodiagnóstico, comprendiendo la tarjeta de prueba un soporte sustancialmente plano que soporta una pluralidad de microtubos dispuestos verticalmente, cada microtubo tiene una cámara de incubación para recibir la muestra y una cámara de reacción que comprende una matriz de separación, estando la cámara de incubación y la cámara de reacción separadas por un espacio de aire; añadir un diluyente a al menos una de las cámaras de incubación;
diluir en serie la muestra directamente en cada una de las cámaras de incubación que contienen diluyente; añadir un reactivo a cada una de las cámaras de incubación que contienen diluyente y/o muestra, en las que el reactivo pueda formar un complejo con el analito para formar un complejo reactivo-analito; exponer la mezcla de muestra y reactivo a sedimentación por gravitación y/o centrifugación; y determinar la concentración del analito determinando una dilución máxima de la muestra en la que se detecta un complejo reactivo-analito en la matriz de separación o dentro de ella.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación de la concentración del analito comprende determinar un título de un anticuerpo y el título es la dilución más alta de la muestra para la que se observa un complejo reactivo-anticuerpo correspondiente a una fuerza de reacción de "+".
3. El procedimiento de la reivindicación 2, que comprende además (i) determinar un punto final de anticuerpos y el punto final de anticuerpos es la dilución más alta de la muestra que tiene complejos reactivo-anticuerpo visibles; y/o (ii) determinar una puntuación de título de anticuerpos y la puntuación de título de anticuerpos es la suma de los valores de puntuación asignados a cada reacción.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación de la concentración del analito comprende la determinación de la concentración de un antígeno.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en el que la matriz de separación es un gel de polielectrolito, preferentemente el gel de polielectrolito es acrilamida dextrano.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que la cámara de reacción comprende además un agente de reticulación, preferiblemente el agente de reticulación es un anticuerpo secundario, más preferiblemente el anticuerpo secundario es globulina antihumana o anticuerpo anti-IgA humana.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de dilución seriada de la muestra comprende diluir en serie la muestra directamente en cada una de las cámaras de incubación en la misma tarjeta de prueba o entre tarjetas de prueba.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el reactivo comprende un glóbulo rojo o una partícula recubierta que contiene un antígeno o anticuerpo sobre ella.
9. El procedimiento de la reivindicación 2 o 3, en el que el anticuerpo se dirige contra un antígeno de glóbulos rojos, preferiblemente el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo anti-A, anticuerpo anti-B, anticuerpo anti-D, anticuerpo anti-C, anticuerpo anti-c, anticuerpo anti-E, anticuerpo anti-e, anticuerpo anti-Fya, anticuerpo anti-Fyb, anticuerpo anti-Kell, anticuerpo anti-K, anticuerpo anti-Kpa, anticuerpo anti-Kpb, anticuerpo anti-M, anticuerpo anti-N, anticuerpo anti-S y anticuerpo anti-s.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, en el que cada microtubo comprende además un compuesto inmiscible de baja densidad entre la cámara de incubación y la cámara de reacción, preferentemente el compuesto inmiscible de baja densidad comprende un aceite seleccionado del grupo que consiste en aceite sintético, aceite orgánico, aceite mineral y aceite parafínico.
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, que comprende además mezclar el reactivo y la muestra después de la etapa de añadir el reactivo a cada una de las cámaras de incubación que tienen diluyente y/o muestra en su interior.
12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11, que comprende además incubar la tarjeta de prueba después de la etapa de añadir el reactivo a cada una de las cámaras de incubación que tienen diluyente y/o muestra en su interior.
13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12, en el que la etapa de dilución seriada de la muestra comprende (i) al menos una dilución seriada doble de la muestra en cada una de las cámaras de incubación que tienen diluyente en su interior; o (ii) menos de una dilución seriada doble de la muestra en cada una de las cámaras de incubación que tienen diluyente en su interior; o (iii) una dilución seriada doble de la muestra en cada una de las cámaras de incubación que tienen diluyente en su interior.
14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en suero, plasma y un calibrador.
15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, en el que el analito es un anticuerpo o un antígeno.
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