JP2018163064A - 異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット - Google Patents
異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018163064A JP2018163064A JP2017060874A JP2017060874A JP2018163064A JP 2018163064 A JP2018163064 A JP 2018163064A JP 2017060874 A JP2017060874 A JP 2017060874A JP 2017060874 A JP2017060874 A JP 2017060874A JP 2018163064 A JP2018163064 A JP 2018163064A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- latex
- antigen
- antibody
- insoluble carrier
- measurement
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
上述のように本発明の含有液は、物理吸着粒子、及び、化学結合粒子、の双方を含有する含有液である。
上述したように、物理吸着粒子も化学結合粒子も、共にラテックスとして提供されることが好適である。ラテックスは、水中にポリマーの微粒子(ラテックス粒子)が安定に分散したエマルジョンである。
(ア)担持抗体
不溶性担体粒子に対して担持させる抗体は、標的抗原に対して結合する抗体であり、標的抗原の種類、抗体のタイプ、サブタイプ、抗体分子の一部が用いられる結合性断片としての態様については、前述した通りである。
抗原の不溶性担体粒子への担持は、物理吸着法、化学結合法、それぞれ常法に従って行うことができる。
本発明の含有液は、上記の物理吸着粒子の含有液と、化学結合粒子の含有液を混合することにより作製できる。
本発明の含有液は、本発明の測定用試薬として使用される。
本発明の測定方法では、上述した本発明の含有液を用いて標的抗原の測定を行う。すなわち、本発明の含有液を、標的抗原を含有し得る検体と接触させて、当該含有液の不溶性担体粒子に担持された抗体と、検体中の標的抗原との抗原抗体反応による当該微粒子の凝集反応を検出することができる。
本発明のキットは、本発明の測定方法を行うための測定用キットであり、本発明の含有液を構成要素として含むものである。
1.ラテックス
本実施例において用いたラテックスは下記の通りである。ここに示した粒径表示は、上記の記載に合わせてμm単位であるが、本実施例における粒径表示はnm単位を用いている。
・0.082μmポリスチレンラテックス(高親水性、以下、物理ラテックス1という)
・0.085μmポリスチレンラテックス(以下、物理ラテックス2という)
・0.106μmポリスチレンラテックス(高親水性、以下、物理ラテックス3という)
・0.111μmポリスチレンラテックス(以下、物理ラテックス4という)
・0.125μmポリスチレンラテックス(以下、物理ラテックス5という)
・0.125μmポリスチレンラテックス(高親水性、以下、物理ラテックス6という)
・0.200μmポリスチレンラテックス(以下、物理ラテックス7という)
・0.204μmポリスチレンラテックス(高親水性、以下、物理ラテックス8という)
・0.240μmポリスチレンラテックス(以下、物理ラテックス9という)
・0.299μmポリスチレンラテックス(以下、物理ラテックス10という)
・0.340μmポリスチレンラテックス(以下、物理ラテックス11という)
・0.079μmカルボキシラテックス(以下、化学ラテックス1という)
・0.164μmカルボキシラテックス(以下、化学ラテックス2という)
・0.236μmカルボキシラテックス(以下、化学ラテックス3という)
・0.260μmカルボキシラテックス(以下、化学ラテックス4という)
・0.308μmカルボキシラテックス(以下、化学ラテックス5という)
(1)担持モノクローナル抗体
抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体:前述したモノクローナル抗体の製造方法に準じて作製した。すなわち、マウスを免疫対象動物として、ヒトCRPで免疫を行い、当該ヒトCRP免疫マウスのB細胞とマウスミエローマ細胞を融合したハイブリドーマを作製し、限界希釈法によるクローニングで樹立した当該ハイブリドーマをマウス腹腔に投与して腹水化を行った。得られた腹水を回収して、遠心分離を行い、不溶物を除去後、さらに硫安沈殿を行い、抗体を回収し、その後、QAEカラムにて当該抗体の精製を行って、所望の抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体を得た。
(1)物理吸着法による担持
10mg/mLの上記の抗体の0.01M HEPES緩衝液(pH7.4)溶液の所定量を、精製水で全量2.0mLに希釈した後、前記希釈溶液に0.25%ポリスチレンラテックス溶液16mLを混合した。混合液を室温で10分間攪拌した後、10%BSA溶液の所定量を添加し精製水で全量を20mLとした。さらに、56℃で4時間加熱処理した後、遠心分離で未吸着抗体を除去した。遠心分離にて未吸着抗体を除去したラテックスを0.01M HEPES緩衝液(pH7.4)に再分散させ、10%BSA0.4mLを添加し、同緩衝液で全量8.0mLとした後、56℃で2時間加熱した。加熱後の抗体吸着ラテックス含有液を濾過し、ラテックス濃度0.5%の物理吸着ラテックスを作製した。
5.3%カルボキシラテックス含有液0.943mLを精製水で全量1.11mLに希釈した後、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩をカルボキシル基の1モル等量添加し、15分攪拌反応させカルボキシル基を活性化した。カルボキシル基を活性化させたラテックス含有液に、0.5M MES緩衝液(pH6.6)2.0mL及び精製水の所定量を添加した後、10mg/mLの上記の抗体の0.01M HEPES緩衝液(pH7.4)溶液の所定量を添加し、室温で4時間反応させた。反応終了後、10%BSA溶液0.72mLを添加し、更に室温で1時間反応させた後、56℃で4時間加熱処理した。遠心分離にて未結合抗体を除去したラテックスを0.01M HEPES緩衝液(pH7.4)に再分散させ、10%BSA溶液0.25mLを添加し、「56℃で4時間加熱処理」した。加熱後の抗体結合ラテックス含有液を濾過し、ラテックス濃度1.0%の化学結合ラテックスを作製した。
2.0M LiCl、0.76M又は1.14M L−アルギニン塩酸塩及び0.2%NaN3を含む0.1M HEPES緩衝液(pH7.4)2.5mLに、前記(1)で調製した所定容量の物理吸着ラテックス及び前記(2)で調製した所定容量の化学結合ラテックスを添加し、精製水にて全量5.0mLとして、物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスを所定比率で含むラテックス分散液を調製した。
本実施例における測定は、濁度法を用いて行った。
(1)粒径が82−125nmの小粒径ラテックス及び粒径が200−204nmの大粒径ラテックスにおける検討
抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体を1.25mg/m2で担持させた物理ラテックス1−8を用いた測定系における、CRP濃度範囲が100mg/dLまでの572/804nmでの吸光度の変化を検証した(表1、図1)。なお、第2試薬のラテックスの含有量は0.1%である。表1中の「+」は、ラテックスの親水性の程度を示し、+数が多いほど親水性である。
抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体を1.75mg/m2で担持させた物理ラテックス7、物理ラテックス9−11を用いた測定系における、ヒトCRP濃度範囲が100mg/dLまでの572/804nmでの吸光度の変化を検証した(表2、図2)。なお、第2試薬のラテックスの含有量は0.1%である。
大粒径ラテックス(物理ラテックス7)に対して、抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体の担持量を0.25−2mg/m2の範囲で変化させた測定系における、CRP濃度範囲が100mg/dLまでの572/804nmでの吸光度の変化を検証した(表3、図3)。なお、第2試薬のラテックスの含有量は0.1%である。
小粒径ラテックス(物理ラテックス1)に対して、抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体の物理吸着に依る担持量を0.2−1.2mg/m2の範囲で変化させた測定系における、CRP濃度範囲が100mg/dLまでの572/804nmでの吸光度の変化を検証した(表4−1、図4)。比較のために、抗ヒトCRPヤギポリクローナル抗体を物理ラテックス1に1.06mg/m2を、物理吸着に依り担持させた例の検証も行った(表4−2、図4)。なお、本例における第2試薬のラテックスの含有量は、この比較系を含めて0.25%である。
物理吸着法に依る小粒径ラテックス(物理ラテックス1)と大粒径ラテックス(物理ラテックス7)とを、0.125%の物理ラテックス1と、0.05%の物理ラテックス7を含有する第2試薬を用いた測定系において、CRP濃度範囲が100mg/dLまでの572/804nmでの吸光度の変化を検証した(表5、図5)。なお、大粒径ラテックスの抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体の担持量は、1.75mg/m2であり、小粒径ラテックスの当該担持量は0.20−1.20mg/m2の間で変化させた。比較のために、抗ヒトCRPヤギポリクローナル抗体を1.06mg/m2で、小粒径ラテックス(物理ラテックス1)に、物理吸着法で担持させた例(第2試薬中のラテックス濃度は0.15%)の検証も併せて行った。
(1)大粒径のラテックスにおける検討
抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体の担持量が2.5mg/m2の4種の大粒径のラテックス(化学ラテックス2−5)を用いた測定系において、CRP濃度範囲が100mg/dLまでの572/804nmでの吸光度の変化を検証した(表6、図6−1(2.00mg/dLまでの低濃度領域の抜粋拡大図)、図6−2(100mg/dLまでの濃度領域))。比較のために、抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体の担持量が1.75mg/m2の物理ラテックス7を用いた測定系を用いた。
抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体を0.300、0.325、0.350、0.400mg/m2で担持した化学ラテックス1を用いた4種の測定系において、CRP濃度範囲が100mg/dLまでの572/804nmでの吸光度の変化を検証した(表7−1、図7)。比較のために、抗ヒトCRPヤギポリクローナル抗体を1.06mg/m2で、小粒径ラテックス(物理ラテックス1)に、物理吸着法で担持させた例の検証も併せて行った(表7−2、図7)。なお、本例における第2試薬のラテックスの含有量は、この比較系を含めて0.15%である。
(1)化学結合単独系との比較検討
化学結合ラテックスは、抗体を担持する際の仕上げの加熱時間(上記3(2)の「56℃で4時間加熱処理」の「4時間」が該当する)の長短が、標的抗原に対する反応性が異なることが知られている。本例では、当該加熱時間を原則の4時間の他、6時間及び8時間の系を設定し、当該加熱時間の相違により異なる反応性を有する化学結合ラテックス(化学ラテックス1に担持)単独(表8−1、図8−1)と、当該化学結合ラテックスと物理吸着ラテックスを組み合わせて用いた場合の相違を検討した(表8−1、図8−2)。ここで用いた物理吸着ラテックスは、物理ラテックス7に対して、抗体の担持量を1.5mg/m2として吸着させたものである。ここで用いられた化学結合ラテックスの抗体結合量、結合pH、仕上げの加熱温度、当該加熱時間、各系のラテックスの第2試薬中の濃度は、表8−1に示した通りである。
物理ラテックス7に対して、抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体の担持(担持量:1.5mg/m2)を行い、物理吸着ラテックスとし、かつ、化学ラテックス1に対して所定の抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体の担持(担持量:0.4mg/m2)を行い、化学結合ラテックスとした。
モノクローナル抗体を担持した物理・化学ラテックス混合系と、抗ヒトCRPヤギポリクローナル抗体を1.06mg/m2担持した小粒径の物理ラテックス(物理ラテックス1)(第2試薬中0.125%)と抗ヒトCRPマウスポリクローナル抗体を1.5mg/m2担持した大粒径の物理ラテックス(物理ラテックス7)(第2試薬中0.035%)の混合系との相関性の検討を行い、モノクローナル抗体を担持した物理・化学ラテックス混合系の特異性を確認した。
Claims (13)
- 物理吸着により所定の標的抗原に対する抗体が担持された不溶性担体粒子、及び、化学結合により当該標的抗原に対する抗体が担持された不溶性担体粒子、の双方を含有する不溶性担体粒子の含有液を、前記標的抗原を含有し得る検体と接触させて、前記不溶性担体粒子に担持された抗体と、前記検体中の標的抗原との抗原抗体反応による前記不溶性担体粒子の凝集反応を検出して、前記標的抗原を測定することを特徴とする、抗原測定方法。
- 化学結合により不溶性担体粒子に担持された抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項1に記載の抗原測定方法。
- 物理吸着により不溶性担体粒子に担持された抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の抗原測定方法。
- 不溶性担体粒子は、ラテックス粒子であることを特徴とする、請求項1−3のいずれか1項に記載の抗原測定方法。
- 標的抗原は、多価抗原であることを特徴とする、請求項1−4のいずれか1項に記載の抗原測定方法。
- 標的抗原は、C反応性蛋白質(CRP)であることを特徴とする、請求項1−5のいずれか1項に記載の抗原測定方法。
- 検体中の所定の標的抗原との抗原抗体反応による不溶性担体粒子の凝集反応を検出する、抗原の測定用試薬であって、物理吸着により前記所定の標的抗原に対する抗体が担持された不溶性担体粒子、及び、化学結合により前記所定の標的抗原に対する抗体が担持された不溶性担体粒子、の双方を含有する不溶性担体粒子の含有液であることを特徴とする、抗原の測定用試薬。
- 化学結合により不溶性担体粒子に担持された抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項7に記載の測定用試薬。
- 物理吸着により不溶性担体粒子に担持された抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項8に記載の測定用試薬。
- 不溶性担体粒子は、ラテックス粒子であることを特徴とする、請求項7−9のいずれか1項に記載の測定用試薬。
- 標的抗原は、多価抗原であることを特徴とする、請求項7−10のいずれか1項に記載の抗原測定方法。
- 標的抗原は、C反応性蛋白質(CRP)であることを特徴とする、請求項7−11のいずれか1項にに記載の測定用試薬。
- 請求項7−12のいずれか1項に記載の測定用試薬及び希釈液を含むことを特徴とする、測定用キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017060874A JP6890444B2 (ja) | 2017-03-27 | 2017-03-27 | 異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017060874A JP6890444B2 (ja) | 2017-03-27 | 2017-03-27 | 異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018163064A true JP2018163064A (ja) | 2018-10-18 |
JP6890444B2 JP6890444B2 (ja) | 2021-06-18 |
Family
ID=63859252
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017060874A Active JP6890444B2 (ja) | 2017-03-27 | 2017-03-27 | 異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6890444B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112798794A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-14 | 迪亚莱博(张家港)生物科技有限公司 | 一种α1酸性糖蛋白检测试剂盒 |
JP7366922B2 (ja) | 2018-10-25 | 2023-10-23 | 島津ダイアグノスティクス株式会社 | 集菌方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011257243A (ja) * | 2010-06-08 | 2011-12-22 | Shino-Test Corp | 試料中のc反応性蛋白質の測定試薬、測定方法及び測定範囲の拡大方法 |
WO2014073464A1 (ja) * | 2012-11-06 | 2014-05-15 | 国立大学法人 群馬大学 | 三日熱マラリアと熱帯熱マラリアの双方を検出するペプチドおよび抗体検査材料 |
-
2017
- 2017-03-27 JP JP2017060874A patent/JP6890444B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011257243A (ja) * | 2010-06-08 | 2011-12-22 | Shino-Test Corp | 試料中のc反応性蛋白質の測定試薬、測定方法及び測定範囲の拡大方法 |
WO2014073464A1 (ja) * | 2012-11-06 | 2014-05-15 | 国立大学法人 群馬大学 | 三日熱マラリアと熱帯熱マラリアの双方を検出するペプチドおよび抗体検査材料 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7366922B2 (ja) | 2018-10-25 | 2023-10-23 | 島津ダイアグノスティクス株式会社 | 集菌方法 |
CN112798794A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-14 | 迪亚莱博(张家港)生物科技有限公司 | 一种α1酸性糖蛋白检测试剂盒 |
CN112798794B (zh) * | 2020-12-30 | 2023-11-17 | 迪亚莱博(张家港)生物科技有限公司 | 一种α1酸性糖蛋白检测试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6890444B2 (ja) | 2021-06-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6532594B2 (ja) | 生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット及び生体試料中の測定対象物質を定量する方法 | |
JPS60256057A (ja) | 免疫学的測定法 | |
CN111417856A (zh) | 抑制靶干扰作用的抗药物抗体测定法 | |
JP6982226B2 (ja) | 抗ヒトIgG4モノクローナル抗体、およびその抗体を利用したヒトIgG4測定試薬 | |
JPH06317589A (ja) | アッセイ干渉を排除したイムノアッセイ法およびキット | |
HUE027662T2 (en) | Procedures for Determining Antibodies to Medicine | |
WO2017150518A1 (ja) | 生体試料中の胆汁酸を定量するためのキット及び生体試料中の胆汁酸を定量する方法 | |
CN105988000A (zh) | 一种测定甘胆酸浓度的试剂盒及方法 | |
JP2009098138A (ja) | 高感度免疫測定方法 | |
JP2001502795A (ja) | 血液型抗原および抗体の検出に有用な方法および装置 | |
JP2677753B2 (ja) | 凝集イムノアッセイ法 | |
WO2006025401A1 (ja) | 抗原の測定方法及びそのための試薬 | |
JP6660932B2 (ja) | L−fabpの免疫学的測定方法及び該方法に用いられる測定試薬 | |
JP6890444B2 (ja) | 異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット | |
JP2018173334A (ja) | 免疫学的測定方法及びそれに用いる試薬キット | |
CN110579597A (zh) | 检测14-3-3 eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂盒及其应用 | |
JP7022198B2 (ja) | 試薬キット、測定キットおよび測定方法 | |
JP4490197B2 (ja) | ジアセチルスペルミンの測定方法および測定試薬キット | |
JP2001337092A (ja) | 免疫学的測定方法及び測定用試薬 | |
JPWO2016136917A1 (ja) | 免疫学的測定方法及び該方法に用いられる測定試薬 | |
JP7315966B2 (ja) | 生物学的試料中の遊離aimの免疫学的分析方法 | |
CN117030997B (zh) | 一种小分子化合物的均相免疫分析方法 | |
CN110579592A (zh) | 检测14-3-3eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂盒及其应用 | |
CN117285624B (zh) | 抗犬NT-proBNP双特异性抗体及试剂盒 | |
JP2005512074A (ja) | 血清または血漿存在下でのラテックス微粒子の非特異的集合を低減する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200110 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20201124 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201208 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210127 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210518 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210525 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6890444 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |