JP7366922B2 - 集菌方法 - Google Patents
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Description
[1] 検体にアルブミン、カゼイン、加水分解カゼイン、乳蛋白質及びゼラチンからなる群より選択される1以上の蛋白質を添加し、得られた凝集体を回収することを特徴とする、検体中のグラム陽性細菌(ただし、マイコプラズマを除く)、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される1以上の微生物の集菌方法。
[2] グラム陽性細菌(ただし、マイコプラズマを除く)及び/又はグラム陰性細菌の集菌方法である前項[1]記載の方法。
[3] 検体に前記蛋白質を添加した後のpHが5.0超11.0以下である前項[1]又は[2]記載の方法。
[4] 検体が、滅菌水、生理食塩水、液体培地、生体試料、培養上清、緩衝液及びリンゲル液からなる群より選択される液体検体である前項[1]~[3]のいずれか1項記載の方法。
[5] グラム陽性細菌の集菌方法である、前項[1]~[4]のいずれか1項記載の方法。
[6] グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属及びバチルス属からなる群より選択される1以上である前項[1]~[5]のいずれか1項記載の方法。
[7] グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス・アウレウス、バチルス・サブチリス及びクロストリジウム・スポロゲネスからなる群より選択される1以上である前項[1]~[5]のいずれか1項記載の方法。
[8] 検体に、さらに水不溶性担体を添加する前項[1]~[7]のいずれか1項記載の方法。
[9] 前項[1]~[8]のいずれか1項記載の方法によって集菌されたグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される1以上の微生物をポリメラーゼ連鎖反応に付すことを特徴とする、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される1以上の微生物の測定方法。
[10] 前項[1]~[8]のいずれか1項記載の方法によって集菌されたグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される1以上の微生物を増菌することを特徴とする、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される1以上の微生物の測定方法。
羊血液寒天培地(商品名:ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製)を用いて前培養したスタフィロコッカス・アウレウス(S.aureus)を生理食塩水に懸濁し、濁度をマクファーランド1.0とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を103倍希釈したものを希釈菌液とし、0.1mLの希釈菌液を24.9mLの生理食塩水に添加した。これに、350μLの30%(w/v)BSA溶液(ウシ血清由来BSA溶液、脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製)及び2.5μLの10%(w/v)ラテックス溶液(粒径315nmのポリスチレン系ラテックス粒子(IMMUTEX(登録商標、JSRライフサイエンス株式会社製)))を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離(20,000G、15分間、10℃)し、上清を除去し、1mLの試験液とした。この試験液を10倍希釈した菌液を、羊血液寒天培地(前記と同様)に10μL接種して、一晩培養を行った(37℃、好気条件)。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を106倍希釈したものを100μL羊血液寒天培地(前記と同様)に接種した。
羊血液寒天培地(商品名:ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製)又はチョコレート寒天培地(商品名:ニッスイプレートチョコレート寒天培地EXII、日水製薬株式会社製)を用いて前培養したコリネバクテリウム・レナーレ(C.renale)、ナイセリア・メニンギティス(N.meningitis)及びエシュリキア・コリ(E.coli)を生理食塩水に懸濁し、濁度をマクファーランド1.0とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を103倍希釈したものを希釈菌液とし、0.1mLの希釈菌液を24.9mLの生理食塩水に添加した。これに、350μLの30%(w/v)BSA溶液(脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製)を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離(20,000G、15分、10℃)し、上清を除き1mLの試験液とした。この試験液を10倍希釈した菌液(ただし、コリネバクテリウム・レナーレについては、試験液を用いた。)を、羊血液寒天培地(前記と同様)又はチョコレート寒天培地(前記と同様)に接種して、一晩培養を行った(37℃、好気条件)。この際、ナイセリア・メニンギティスについては、アネロパック・CO2(株式会社スギヤマゲン製)を用いて、37℃の条件下で培養した。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を106倍希釈したものを100μL羊血液寒天培地(前記と同様)に接種した。
羊血液寒天培地(商品名:ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製)を用いて前培養したスタフィロコッカス・アウレウス(S.aureus)を生理食塩水に懸濁し、濁度をマクファーランド1.0とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を103倍希釈したものを希釈菌液とし、0.1mLの希釈菌液を24.9mLの生理食塩水に添加した。これに、350μLの30%(w/v)BSA溶液(脂肪酸フリー、和光純薬株式会社製)、ゼラチン又は乳蛋白質(商品名:ブロックエース、DSファーマバイオメディカル社製)をそれぞれ添加した。各溶液を攪拌後、遠心分離(20,000G、15分、10℃)し、上清を除去し、1mLの試験液とした。この試験液を10倍希釈した菌液を、羊血液寒天培地(前記と同様)に接種して、一晩培養を行った(37℃、好気条件)。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を106倍希釈したものを100μL羊血液寒天培地(前記と同様)に接種した。
羊血液寒天培地(商品名:ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製)を用いて前培養したコリネバクテリウム・レナーレ(C.renale)及びエンテロコッカス・フェカーリス(E.faecalis)をそれぞれ生理食塩水に懸濁し、マクファーランド1.0とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を103倍希釈したものを希釈菌液とし、0.1mLの希釈菌液を24.9mLの生理食塩水に添加した。これに、350μLの30%(w/v)BSA溶液、及び水不溶性担体として2.5μLの10%(w/v)ラテックス溶液を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離(20,000G、15分間、10℃)し、上清を除去し、1mLの試験液とした。この試験液を10倍希釈したものを、90μLずつ羊血液寒天培地(前記と同様)に接種して、一晩培養を行った(37℃、好気条件)。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を105倍希釈したものを100μL羊血液寒天培地(前記と同様)に接種した。
羊血液寒天培地(商品名:ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製)を用いて前培養したスタフィロコッカス・アウレウス(S.aureus)を生理食塩水に懸濁し、濁度をマクファーランド1.0とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を103倍希釈したものを希釈菌液とし、0.1mLの希釈菌液を24.9mLのpH6.0、pH7.0、pH8.0の0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液にそれぞれ添加した。これらに、350μLの30%(w/v)BSA溶液(ウシ血清由来BSA溶液、脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製)を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離(20,000G、15分間、10℃)し、上清を除去し、1mLの試験液とした。この試験液を10倍希釈した菌液を、羊血液寒天培地(前記と同様)に10μL接種して、一晩培養を行った(37℃、好気条件)。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を生理食塩水で106倍希釈したものを100μL羊血液寒天培地(前記と同様)に接種したものを使用した。
羊血液寒天培地(商品名:ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製)を用いて前培養したクロストリジウム・スポロジェネス(C.sporogenes)を生理食塩水に懸濁し、濁度をマクファーランド1.0とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を103倍希釈したものを希釈菌液とし、0.1mLの希釈菌液を24.9mLの生理食塩水にそれぞれ添加した。これに、350μLの30%(w/v)BSA溶液(ウシ血清由来BSA溶液、脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製)を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離(20,000G、15分間、10℃)し、上清を除去し、1mLの試験液とした。この試験液を10倍希釈した菌液を、羊血液寒天培地(前記と同様)に10μL接種して、アネロメイト-P「ニッスイ」(日水製薬株式会社製)を用いて、一晩培養を行った(37℃)。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を生理食塩水で106倍希釈したものを100μL羊血液寒天培地(前記と同様)に接種した。
羊血液寒天培地(商品名:ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製)を用いて前培養したスタフィロコッカス・アウレウス(S.aureus)を生理食塩水に懸濁し、濁度をマクファーランド1.0とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を103倍希釈したものを希釈菌液とし、0.1mLの希釈菌液を24.9mLのpH4.3の0.01Mクエン酸ナトリウム緩衝液にそれぞれ添加した。これらに、350μLの30%(w/v)BSA溶液(ウシ血清由来BSA溶液、脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製)を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離(20,000G、15分間、10℃)し、上清を除去し、1mLの試験液とした。この試験液を10倍希釈した菌液を、羊血液寒天培地(前記と同様)に10μL接種して、一晩培養を行った(37℃、好気条件)。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を生理食塩水で106倍希釈したものを100μL羊血液寒天培地(前記と同様)に接種したものを使用した。
2個のBioBall550(商品名:Bioball550、ビオメリュー・ジャパン株式会社製)を25mLの生理食塩水に添加し、1100CFU/25mL相当の菌懸濁液を調製した。その後、350μLの30%(w/v)BSA溶液(ウシ血清由来BSA溶液、脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製)及び水不溶性担体として2.5μLの10%(w/v)ラテックス溶液を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離(20,000G、15分間、10℃)し、上清を除去し、1mLの試験液とした。この試験液を、羊血液寒天培地(商品名:ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製)に100μL接種して、一晩培養を行った(37℃、好気条件)。
Claims (8)
- 検体にアルブミン、カゼイン、加水分解カゼイン、乳蛋白質及びゼラチンからなる群より選択される1以上の蛋白質を添加し、得られた凝集体を回収することを特徴とする、検体中のグラム陽性細菌(ただし、マイコプラズマを除く)、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される1以上の微生物の集菌方法であって、
検体が、滅菌水、生理食塩水、液体培地、生体試料、培養上清、緩衝液及びリンゲル液からなる群より選択される液体検体であり、
検体に前記蛋白質を添加した後のpHが5.0超11.0以下である、集菌方法。 - グラム陽性細菌(ただし、マイコプラズマを除く)及び/又はグラム陰性細菌の集菌方法である請求項1記載の方法。
- グラム陽性細菌の集菌方法である、請求項1又は2記載の方法。
- グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属及びバチルス属からなる群より選択される1以上である請求項1~3のいずれか1項記載の方法。
- グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス・アウレウス、バチルス・サブチリス及びクロストリジウム・スポロゲネスからなる群より選択される1以上である請求項1~3のいずれか1項記載の方法。
- 検体に、さらに水不溶性担体を添加する請求項1~5のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1~6のいずれか1項記載の方法によって検体からグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される1以上の微生物を集菌し、集菌された微生物をポリメラーゼ連鎖反応に付すことを特徴とする、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される1以上の微生物の測定方法。
- 請求項1~6のいずれか1項記載の方法によって検体からグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される1以上の微生物を集菌し、集菌された微生物を増菌することを特徴とする、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される1以上の微生物の測定方法。
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