WO2020085420A1 - 集菌方法 - Google Patents

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梨紗 柳田
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日水製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for collecting microorganisms.
  • Microbial contamination is one of the important management indicators for reagents used in food and drink, pharmaceuticals, regenerative medicine, etc. Therefore, a method is known in which sterilization is performed by using an autoclave or a filter to avoid microbial contamination.
  • sterilization is difficult, they need to be processed aseptically and finally checked for microbial contamination.
  • it is necessary to confirm that the effect of the sterilization process was sufficient.
  • even if a very small amount of microbe is mixed it is difficult to detect it with high accuracy.
  • there are a large number of specimens it is not realistic to test all of them. Therefore, methods for efficiently collecting or separating microorganisms have been considered.
  • MDP1 protein that binds to sugar on the cell surface
  • a method of collecting cells simply and with high efficiency it is known that a protein called MDP1 that binds to sugar on the cell surface can be used as an aggregation promoter to precipitate the cells without centrifugation.
  • a method of adding a solid support such as particles to which an antibody is immobilized has been reported (see, for example, Patent Document 1).
  • MDP1 is a protein of Mycobacterium bovis (BCG), and there is a problem that the process of purifying MDP1 is complicated.
  • BCG Mycobacterium bovis
  • the microorganism-extracted protein is contaminated with not only various proteins (including enzymes such as DNAse and RNAse) but also contaminants such as DNA and RNA.
  • enzymes such as DNAse and RNAse
  • DNA and RNA contaminants such as DNA and RNA.
  • an object of the present invention is to provide means for collecting microorganisms with a simple operation and high efficiency.
  • the present inventor has conducted diligent studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, a protein selected from five specific types whose structures and the like are easily obtained, and is preferably water
  • the present inventors have completed the present invention by discovering that one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi can be collected as aggregates with high efficiency by adding an insoluble carrier.
  • the present invention relates to the following [1] to [10].
  • a gram in a sample which comprises adding to the sample one or more proteins selected from the group consisting of albumin, casein, hydrolyzed casein, milk protein and gelatin, and collecting the obtained aggregates.
  • the method according to the above item [1] which is a method for collecting Gram-positive bacteria (excluding mycoplasma) and / or Gram-negative bacteria.
  • the method according to the above [1] or [2], wherein the pH after adding the protein to the sample is more than 5.0 and 11.0 or less.
  • [10] Enriching one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi, which have been collected by the method according to any one of [1] to [8] above.
  • the method of the present invention by adding a protein which is easily available and is selected from the known five specific species, has extremely high efficiency as compared with the case where no protein is added.
  • One or more microorganisms selected from the group consisting of can be collected.
  • gram-positive bacteria, gram-negative bacteria which are test strains for validation in the sterility test method defined in Japanese Pharmacopoeia (17th revision) 4.06, and It is possible to efficiently collect one or more microorganisms selected from the group consisting of fungi.
  • microorganisms it is not necessary to prepare microorganisms according to the inspection date and to prepare microbial proteins and microbial extracted proteins, and the solvent and reagents necessary for preparing them are Gram-positive bacteria, Gram-positive bacteria, It is highly convenient because it is not necessary to confirm that one or more microorganisms selected from the group consisting of negative bacteria and fungi are not contaminated.
  • the method of the present invention allows the separation of even a small amount of one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi by optionally using a water-insoluble carrier such as latex particles.
  • a water-insoluble carrier such as latex particles.
  • the method of the present invention since the method of the present invention has a low possibility of damaging the bacteria, it is possible to culture the collected bacteria, etc., and thus it is possible to use the colonies after the culture for other tests. is there.
  • cell-derived DNA, RNA, DNA degrading enzyme, RNA degrading enzyme, and other proteins are not contaminated, which facilitates the nucleic acid amplification reaction operation after cell collection.
  • "collection of one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi” means the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi contained in a sample. Isolation / concentration of one or more selected microorganisms. By collecting one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi, the subsequent sterility test can be easily carried out.
  • the method for collecting one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi of the present invention is selected from the group consisting of albumin, casein, hydrolyzed casein, milk protein and gelatin as a sample. It collects aggregates formed by adding one or more proteins.
  • the Gram-positive bacterium means a bacterium that is stained dark blue or dark purple by Gram stain.
  • Gram-positive bacteria are generally bacteria with a thick cell wall and no outer membrane, and are characterized by a thick peptidoglycan layer.
  • Gram-positive bacteria are divided into Gram-positive cocci and Gram-positive bacilli depending on the shape.
  • mycoplasma is classified as a Gram-positive bacterium for convenience, it is excluded from the Gram-positive bacteria of the present invention because it has no cell wall and cannot be Gram-stained.
  • Gram-positive cocci include Staphylococcus genus [eg Staphylococcus aureus, etc. ], The genus Enterococcus [eg, Enterococcus faecalis, etc. ], The genus Streptococcus [eg, Streptococcus pneumoniae, etc. ], Etc., but are not limited to these.
  • genus Clostridium eg, Clostridium sporogenes, etc.
  • Corynebacterium genus for example, Corynebacterium renale (Corynebacterium renale) and the like.
  • Genus Bacillus eg, Bacillus subtilis, etc.
  • the like but are not limited thereto.
  • Gram-positive bacteria it is preferable to target at least one selected from Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, and Clostridium sporogenes.
  • Staphylococcus aureus Bacillus subtilis
  • Clostridium sporogenes are test strains in the validation of the sterility test method defined in Japanese Pharmacopoeia (17th revision) 4.06, and are used for the sterility test by carrying out the bacterium collection method of the present invention. The sterility of the sample can be guaranteed.
  • the gram-negative bacterium means a bacterium whose crystal violet stain is decolorized in Gram stain.
  • Gram-negative bacteria generally have an outer membrane covered with lipopolysaccharide and a thin cell wall with a peptidoglycan layer.
  • Gram-negative bacteria are divided into Gram-negative cocci and Gram-negative bacilli according to their shape.
  • Neisseria genus eg, Neisseria meningitis, etc.
  • the genus Bayronella eilonella parvola] and the like. ] But is not limited to these.
  • genus Escherichia eg Escherichia coli, etc.
  • Genus Salmonella eg, Salmonella enteritidis, etc.
  • the genus Enterobacter eg, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, etc.
  • the genus Bacteroides eg, Bacteroides fragilis, etc.
  • Pseudomonas genus for example, (including Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), Pseudomonas cepacia (Pseudomonas putida), but not limited to these], etc.]
  • the fungus in the present invention includes the genus Candida [eg, Candida albicans]. ], And Aspergillus genus [Aspergillus brasiliensis (Aspergillus brasiliensis)], and the like, but are not limited thereto.
  • Gram-negative bacteria and fungi can be collected without adding a protein, but the method of adding a protein of the present invention can improve the efficiency of collecting bacteria. Therefore, the sample can be collected Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans and Aspergillus brassensis, which are the test strains in the validation of the sterility test. It can be used to ensure sterility.
  • the sample means a sample for testing the presence or absence of infection of one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi, and is preferably liquid.
  • the sample water (sterile water, distilled water, etc.), physiological saline, liquid medium (for example, one used for culturing cells such as eukaryotic cells, for example, RPMI1640, DMEM, ⁇ -MEM, HANKS, etc.), biological sample, culture supernatant, buffer (eg, Tris-HCl buffer, HEPES buffer, MOPS buffer, HEPPS buffer, TAPS buffer, phosphate buffer (PBS), etc.) adjusted to a predetermined pH, Ringer's solution, etc. There is.
  • the specimen may also be a cell suspension supernatant or a culture supernatant after culturing cells.
  • the protein used in the present invention includes albumin (eg, bovine serum albumin (BSA), human serum albumin, primate serum albumin, rabbit serum albumin, rodent serum albumin, equine serum albumin, goat serum albumin, sheep serum albumin). , Dog serum albumin, guinea pig serum albumin, chicken serum albumin, swine serum albumin, and other animal albumins), casein, hydrolyzed casein, milk protein (eg, trade name: Block Ace (DS Pharma Biomedical)) and gelatin It is one or more types.
  • BSA bovine serum albumin
  • a sterile protein from the viewpoint of avoiding bacterial contamination when one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi are subjected to PCR (polymerase chain reaction) after the bacteria are collected, it is preferable to use a sterile protein. preferable. These proteins can be used alone or in combination of two or more.
  • aggregates obtained by adding the protein to a sample are collected. Specifically, first, a sample and the protein are added to a centrifuge tube. It may be stirred or left for any time (eg, 1 second to 60 minutes) to ensure agglomeration.
  • the obtained aggregate can be collected by, for example, centrifugation.
  • the centrifugal force in centrifugation is not particularly limited, but is, for example, 3,000 to 30,000 G, preferably 5,000 to 28,000 G, and more preferably 14,000 to 25,000 G.
  • the centrifugation time is not particularly limited, but is, for example, 10 seconds to 120 minutes, preferably 1 minute to 60 minutes, more preferably 10 minutes to 30 minutes.
  • the temperature at the time of centrifugation is not particularly limited, but is, for example, 4 to 35 ° C, preferably 7 to 30 ° C, more preferably 10 to 25 ° C.
  • the sample may be optionally subjected to physical treatment and / or chemical treatment in order to obtain the aggregate.
  • physical treatment include heat treatment, ultrasonic irradiation treatment, freezing and melting treatment.
  • chemical treatment include chemical reagent treatment, for example, denaturation treatment using a digestive enzyme, a surfactant, a lysing agent and the like.
  • the amount of the protein used is not particularly limited as long as it can sufficiently aggregate one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi.
  • the amount is preferably 1 to 500 mg, more preferably 0.2 to 100 mg, still more preferably 2 to 20 mg.
  • the pH after adding the protein to the sample is not particularly limited, but in the case of obtaining live cells, one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi A range that does not modify, for example, more than 5.0 and 11.0 or less is preferable, 5.1 to 10.0 is more preferable, 6.0 to 8.0 is further preferable, and 6.8 to 7.4 is Even more preferable. Further, the addition of protein and the collection of aggregates of one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi are, for example, 4-35 ° C, preferably 7-30 ° C, more preferably Can be performed under the condition of 10 to 25 ° C.
  • a water-insoluble carrier can be added in addition to the protein.
  • the water-insoluble carrier is not particularly limited as long as it can aggregate one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi when used in combination with the above protein. Absent.
  • latex particles for example, organic polymer latex particles
  • latex particles that have been subjected to processing such as physical adsorption or chemical bonding through carboxyl groups, colored cellulose Examples thereof include particles, silica particles, gold colloid particles and the like.
  • latex particles, particularly organic polymer latex particles are preferable in terms of aggregability of one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi.
  • the shape of the water-insoluble carrier is not particularly limited, but a spherical shape or a substantially spherical shape is preferable from the viewpoint of sufficiently aggregating one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi.
  • the particle size of the water-insoluble carrier is not particularly limited, but from the viewpoint of visibility and the convenience of experiments, for example, the average particle size is preferably 10 to 2,000 nm, more preferably 50 to 1,500 nm, It is preferably 100 to 1,000 nm.
  • the particle size of the water-insoluble carrier can be measured, for example, by using an electron microscope (TEM) method.
  • the amount of the water-insoluble carrier used is not particularly limited as long as it can sufficiently aggregate one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi. It is 0.0005 to 10 mg, preferably 0.001 to 1 mg, and more preferably 0.002 to 0.1 mg.
  • the present invention also provides a Gram-positive bacterium by subjecting a residue containing one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi collected by the above method to polymerase chain reaction (PCR). , A method of measuring one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-negative bacteria and fungi.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the method comprises using a residue containing an aggregate of one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi obtained by the method described above, in a commercially available kit (for example, bacterial DNA extraction).
  • DNA is extracted by a known method using a kit (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.) or the like, and a known PCR method or its modification (for example, real-time PCR) is performed to detect gram-positive bacteria, gram-negative bacteria and fungi under known conditions.
  • a detection test for one or more microorganisms selected from the group consisting of by using a primer and a probe for a region conserved in one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi, It is possible to detect one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi by using primers and probes that target the region specific to the microorganism to be detected. It is also possible to identify one or more microorganisms.
  • the present invention also relates to a kit for collecting one or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi, which further comprises the above-mentioned protein for a sample, preferably a water-insoluble carrier.
  • the protein and water-insoluble carrier contained in the kit are as described above.
  • the kit may optionally be accompanied by a manual explaining the above operations.
  • the present invention allows the cells to be collected while maintaining the growth ability of at least one microorganism selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi to be collected.
  • One or more microorganisms selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi can also be used for various tests.
  • the collected Gram-positive bacteria, Gram-positive bacteria can also be used for measurement of the number of one or more microorganisms selected from the group consisting of negative bacteria and fungi, identification tests such as biochemical tests, and drug susceptibility tests.
  • sheep blood agar medium trade name: Nissui plate sheep blood agar medium, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • BSA solution bovine serum-derived BSA solution, fatty acid-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 10% (w / v) latex solution particle size 315 nm Polystyrene-based latex particles (IMMUTEX (registered trademark, manufactured by JSR Life Science Co., Ltd.)) were added. After stirring these solutions, they were centrifuged (20,000 G, 15 minutes, 10 ° C.), and the supernatant was removed to give 1 mL of test solution.
  • a 10-fold dilution of this test solution was inoculated into a sheep blood agar medium (as described above) in an amount of 10 ⁇ L, and overnight culture was carried out (37 ° C., aerobic condition).
  • a cell suspension was diluted 10 6- fold and 100 ⁇ L of sheep blood agar medium (same as above) was inoculated.
  • DNA is extracted from the test solution using a bacterial nucleic acid DNA extraction kit (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), and Yeast-made Taq DNA polymerase (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), forward primer: aggttttgatcMtggctcag (SEQ ID NO: 1), reverse.
  • Real-time PCR was performed using a primer: ctttacgcccaRtRaWtccg (SEQ ID NO: 2) and a probe: 6FAM-tNttaccccggctctctggcacg-BHQ (SEQ ID NO: 3). The reaction was carried out at 95 ° C. for 5 seconds and then 45 cycles of 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds as one cycle.
  • Table 1 shows the results of the culture test.
  • Table 2 shows the PCR results.
  • Example 2 Relationship between Gram stainability and bactericidal effect Sheep blood agar medium (trade name: Nissui plate sheep blood agar medium, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or chocolate agar medium (trade name: Nissui plate chocolate agar medium EXII, Sun) Suspension of Corynebacterium renale (C. renale), Neisseria meningitidis (N. meningitis), and Escherichia coli (E. coli) pre-cultured by using Suishaku Pharmaceutical Co., Ltd. To prepare a bacterial suspension in which MacFarland was 1.0.
  • a 10 3 -fold dilution of the bacterial suspension was used as a diluted bacterial solution, and 0.1 mL of the diluted bacterial solution was added to 24.9 mL of physiological saline.
  • 350 ⁇ L of 30% (w / v) BSA solution (fatty acid free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. After stirring these solutions, centrifugation (20,000 G, 15 minutes, 10 ° C.) was performed to remove the supernatant to obtain 1 mL of a test solution.
  • test solution (however, for Corynebacterium renale, the test solution was used) was inoculated into sheep blood agar medium (as above) or chocolate agar medium (as above). Then, overnight culture was performed (37 ° C., aerobic condition). At this time, Neisseria meningititis was cultured under the condition of 37 ° C. using Aneropack CO2 (manufactured by Sugiamagen Co., Ltd.). For comparison, a cell suspension was diluted 10 6- fold and 100 ⁇ L of sheep blood agar medium (same as above) was inoculated.
  • DNA is extracted from the test solution using a bacterial DNA nucleic acid extraction kit (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), and Yeast-made Taq DNA polymerase (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), forward primer: aggttttgatcMtggctcag (SEQ ID NO: 1), reverse Real-time PCR was performed using a primer: ctttacgcccaRtRaWtccg (SEQ ID NO: 2) and a probe: 6FAM-tNttaccccgggctgctggcacg-BHQ (SEQ ID NO: 3). The reaction was carried out at 95 ° C. for 5 seconds and then 45 cycles of 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds as one cycle.
  • a bacterial DNA nucleic acid extraction kit manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.
  • Yeast-made Taq DNA polymerase manufactured by Mitsui Chemicals
  • Table 3 shows the results of the culture test.
  • Table 4 shows the PCR results.
  • Example 3 Bacterial collection effect depending on protein type Staphylococcus aureus (S. aureus) pre-cultured using sheep blood agar medium (trade name: Nissui plate sheep blood agar medium, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)
  • a bacterial suspension was prepared by suspending the solution in saline and adjusting the turbidity to 1.0. Then, a 10 3 -fold dilution of the bacterial suspension was used as a diluted bacterial solution, and 0.1 mL of the diluted bacterial solution was added to 24.9 mL of physiological saline.
  • DNA is extracted from the test solution using a bacterial DNA nucleic acid extraction kit (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), and Yeast-made Taq DNA polymerase (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), forward primer: aagttttgatcMtggctcag (SEQ ID NO: 1), reverse primer: Real-time PCR was carried out using ctttacgcccaRtRaWtccg (SEQ ID NO: 2), probe: 6FAM-tNttaccccgggctgctggcacg-BHQ (SEQ ID NO: 3). The reaction was carried out at 95 ° C. for 5 seconds and then 45 cycles of 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds as one cycle.
  • a bacterial DNA nucleic acid extraction kit manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.
  • Yeast-made Taq DNA polymerase manufactured by Mitsui Chemicals, Inc
  • Table 5 shows the results of the culture test.
  • Table 6 shows the PCR results.
  • gelatin also showed a Cq value equivalent to that of BSA in PCR. Therefore, Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus can be efficiently collected by using not only BSA but also gelatin as a protein.
  • Example 4 Bacteria Collection Test Using Water-Insoluble Carrier Corynebacterium renale (C. renale) precultured using sheep blood agar medium (trade name: Nissui plate sheep blood agar medium, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) And Enterococcus faecalis were suspended in physiological saline to prepare a bacterial suspension having a MacFarland of 1.0. Then, a 10 3 -fold dilution of the bacterial suspension was used as a diluted bacterial solution, and 0.1 mL of the diluted bacterial solution was added to 24.9 mL of physiological saline.
  • sheep blood agar medium trade name: Nissui plate sheep blood agar medium, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Enterococcus faecalis were suspended in physiological saline to prepare a bacterial suspension having a MacFarland of 1.0. Then, a 10 3 -fold d
  • test solution 350 ⁇ L of a 30% (w / v) BSA solution and 2.5 ⁇ L of a 10% (w / v) latex solution as a water-insoluble carrier were added. After stirring these solutions, they were centrifuged (20,000 G, 15 minutes, 10 ° C.), and the supernatant was removed to give 1 mL of test solution. A 10-fold dilution of this test solution was inoculated into sheep blood agar medium (as described above) in an amount of 90 ⁇ L, and overnight culture was carried out (37 ° C., aerobic condition). For comparison, a cell suspension was diluted 10 5 times and 100 ⁇ L of sheep blood agar medium (same as above) was inoculated.
  • DNA is extracted from the test solution using a bacterial DNA nucleic acid extraction kit (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), and Yeast-made Taq DNA polymerase (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), forward primer: aggttttgatcMtggctcag (SEQ ID NO: 1), reverse Real-time PCR was performed using a primer: ctttacgcccaRtRaWtccg (SEQ ID NO: 2) and a probe: 6FAM-tNttaccccgggctgctggcacg-BHQ (SEQ ID NO: 3). The reaction was carried out at 95 ° C. for 5 seconds and then 45 cycles of 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds as one cycle.
  • a bacterial DNA nucleic acid extraction kit manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.
  • Yeast-made Taq DNA polymerase manufactured by Mitsui Chemicals
  • Table 7 shows the results of the culture test.
  • Table 8 shows the PCR results.
  • Example 5 Effect of pH at the time of collecting bacteria Staphylococcus aureus (S. aureus) pre-cultured using sheep blood agar medium (trade name: Nissui plate sheep blood agar medium, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)
  • a bacterial suspension was prepared by suspending the solution in saline and adjusting the turbidity to 1.0. Then, a 10 3 -fold diluted bacterial suspension was used as a diluted bacterial solution, and 0.1 mL of the diluted bacterial solution was added to 24.9 mL of a 0.01 M sodium phosphate buffer of pH 6.0, pH 7.0, and pH 8.0. Each was added to the liquid.
  • BSA solution bovine serum-derived BSA solution, fatty acid-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • BSA solution bovine serum-derived BSA solution, fatty acid-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • a 10-fold dilution of this test solution was inoculated into a sheep blood agar medium (as described above) in an amount of 10 ⁇ L, and overnight culture was carried out (37 ° C., aerobic condition).
  • a cell suspension was used, which was prepared by inoculating 100 ⁇ L sheep blood agar medium (as described above) with a 10 6- fold dilution of the bacterial suspension in physiological saline.
  • DNA is extracted from the test solution using a bacterial DNA nucleic acid extraction kit (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), and Yeast-made Taq DNA polymerase (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), forward primer: aggttttgatcMtggctcag (SEQ ID NO: 1), reverse Real-time PCR was performed using a primer: ctttacgcccaRtRaWtccg (SEQ ID NO: 2) and a probe: 6FAM-tNttaccccgggctgctggcacg-BHQ (SEQ ID NO: 3). The reaction was carried out at 95 ° C. for 5 seconds and then 45 cycles of 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds as one cycle.
  • a bacterial DNA nucleic acid extraction kit manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.
  • Yeast-made Taq DNA polymerase manufactured by Mitsui Chemicals
  • Table 9 shows the results of the culture test.
  • Staphylococcus aureus which is a gram-positive coccus, can be collected in any of pH ranges of pH 6.0, pH 7.0, and pH 8.0. Was found to be culturable. From the results of Table 10, almost no change was confirmed in the pH after addition of BSA.
  • Table 11 shows the PCR results.
  • Clostridium sporogenes (C. sporogenes) pre-cultured using sheep blood agar medium (trade name: Nissui plate sheep blood agar medium, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was suspended in physiological saline. A bacterial suspension was prepared which was turbid and had a turbidity of 1.0. Then, a 10 3 -fold diluted bacterial suspension was used as a diluted bacterial solution, and 0.1 mL of the diluted bacterial solution was added to 24.9 mL of physiological saline.
  • sheep blood agar medium trade name: Nissui plate sheep blood agar medium, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • BSA solution bovine serum-derived BSA solution, fatty acid-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • BSA solution bovine serum-derived BSA solution, fatty acid-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 10 ⁇ L of a bacterial solution obtained by diluting this test solution 10-fold into sheep blood agar medium (same as above) was cultured overnight using Anelomate-P “Nissui” (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.). (37 ° C).
  • a bacterial suspension was diluted 10 6 times with physiological saline to inoculate 100 ⁇ L sheep blood agar medium (same as above).
  • DNA is extracted from the test solution using a bacterial DNA nucleic acid extraction kit (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), and Yeast-made Taq DNA polymerase (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), forward primer: aggttttgatcMtggctcag (SEQ ID NO: 1), reverse Real-time PCR was performed using a primer: ctttacgcccaRtRaWtccg (SEQ ID NO: 2) and a probe: 6FAM-tNttaccccgggctgctggcacg-BHQ (SEQ ID NO: 3). The reaction was carried out at 95 ° C. for 5 seconds and then 45 cycles of 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds as one cycle.
  • a bacterial DNA nucleic acid extraction kit manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.
  • Yeast-made Taq DNA polymerase manufactured by Mitsui Chemicals
  • Table 12 shows the results of the culture test.
  • Table 13 shows the PCR results.
  • Example 7 Effect of pH in acidic range Staphylococcus aureus (S. aureus) precultured using sheep blood agar medium (trade name: Nissui plate sheep blood agar medium, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to physiological saline.
  • a bacterial suspension was prepared by suspending the suspension in water and adjusting the turbidity to 1.0. Then, a 10 3 -fold dilution of the bacterial suspension was used as a diluted bacterial solution, and 0.1 mL of the diluted bacterial solution was added to 24.9 mL of 0.01 M sodium citrate buffer having a pH of 4.3.
  • BSA solution bovine serum-derived BSA solution, fatty acid-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • BSA solution bovine serum-derived BSA solution, fatty acid-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • a 10-fold dilution of this test solution was inoculated into a sheep blood agar medium (as described above) in an amount of 10 ⁇ L, and overnight culture was carried out (37 ° C., aerobic condition).
  • a cell suspension was used, which was prepared by inoculating 100 ⁇ L sheep blood agar medium (as described above) with a 10 6- fold dilution of the bacterial suspension in physiological saline.
  • DNA is extracted from the test solution using a bacterial DNA nucleic acid extraction kit (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), and Yeast-made Taq DNA polymerase (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), forward primer: aggttttgatcMtggctcag (SEQ ID NO: 1), reverse Real-time PCR was performed using a primer: ctttacgcccaRtRaWtccg (SEQ ID NO: 2) and a probe: 6FAM-tNttaccccgggctgctggcacg-BHQ (SEQ ID NO: 3). The reaction was carried out at 95 ° C. for 5 seconds and then 45 cycles of 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds as one cycle.
  • a bacterial DNA nucleic acid extraction kit manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.
  • Yeast-made Taq DNA polymerase manufactured by Mitsui Chemicals
  • Table 14 shows the results of the culture test.
  • Table 16 shows the PCR results.
  • Example 8 Collection of two Candida albicans bacteria BioBall550 (trade name: Bioball550, manufactured by Biomerieu Japan KK) was added to 25 mL of physiological saline to prepare a bacterial suspension corresponding to 1100 CFU / 25 mL. Then, 350 ⁇ L of 30% (w / v) BSA solution (bovine serum-derived BSA solution, fatty acid-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 2.5 ⁇ L of 10% (w / v) latex solution as a water-insoluble carrier were used. Was added. After stirring these solutions, they were centrifuged (20,000 G, 15 minutes, 10 ° C.), and the supernatant was removed to give 1 mL of test solution.
  • BSA solution bovine serum-derived BSA solution, fatty acid-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Table 17 shows the results of the culture test.

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Abstract

簡便な作業かつ高い効率で微生物を集菌する手段の提供。　検体にアルブミン、カゼイン、加水分解カゼイン、乳蛋白質及びゼラチンからなる群より選択される１以上の蛋白質を添加し、得られた凝集体を回収することを特徴とする、検体中のグラム陽性細菌（ただし、マイコプラズマを除く）、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の集菌方法。

Description

集菌方法
　本発明は、微生物の集菌方法に関する。
　微生物の汚染は、飲食品、医薬品、再生医療等に用いられる試薬の重要な管理指標の一つである。そのため、オートクレーブやフィルターを用いることで滅菌を行い、微生物の汚染を回避する方法が知られている。しかし、滅菌が困難な場合は、それらを無菌的に処理し、最終的に微生物汚染がないことを検査する必要がある。また、仮に滅菌処理をしたとしても、滅菌処理の効果が十分であったことを確認する必要がある。一方で、極めて小さな微生物が微量混入したとしても、これを精度よく検出することは難しい。また、検体が大量にある場合、これらの全てを検査することも現実的ではない。そこで、微生物を効率的に集菌又は分離する方法が考えられてきた。
　例えば、細胞を簡便かつ高効率に収集する方法としては、細胞表面の糖に結合するＭＤＰ１という蛋白質を凝集促進剤として用いて、遠心分離を行うことなく細胞を沈殿させることができることが知られている。加えて、抗体が固定化された粒子等の固体支持体を加える方法も報告されている（例えば、特許文献１参照）。
　また、微生物抽出蛋白質を添加し、かつ細胞懸濁液のｐＨを１から５とすることで細菌を凝集させ、細菌懸濁液から細菌細胞を分離する方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。
　しかしながら、特許文献１の方法において、ＭＤＰ１はマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｂｏｖｉｓ、ＢＣＧ）の蛋白質であり、ＭＤＰ１を精製する過程が煩雑であるという問題があった。また、特許文献２の方法において、微生物抽出蛋白質には、様々な蛋白質（ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ等の酵素を含む）だけではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の夾雑物が混入していることが、集菌後の微生物の検査に影響を与える可能性があり、さらに細胞懸濁液のｐＨを調整する必要がある点も煩雑であった。
　このようなことから、煩雑な作業なしに高い効率で微生物を集菌する方法が求められている。
特開２０１０－１０４２５０号公報 特開昭５０－１３５２７５号公報
　従って、本発明の課題は、簡便な作業かつ高い効率で微生物を集菌する手段を提供することである。
　かかる実情に鑑み、本発明者は前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、検体に入手が容易で構造等が判明している特定の５種から選択される蛋白質を、好ましくはさらに水不溶性担体を添加することによって、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物が高い効率で凝集体として集菌できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、以下の［１］～［１０］に関する。
［１］　検体にアルブミン、カゼイン、加水分解カゼイン、乳蛋白質及びゼラチンからなる群より選択される１以上の蛋白質を添加し、得られた凝集体を回収することを特徴とする、検体中のグラム陽性細菌（ただし、マイコプラズマを除く）、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の集菌方法。
［２］　グラム陽性細菌（ただし、マイコプラズマを除く）及び／又はグラム陰性細菌の集菌方法である前項［１］記載の方法。
［３］　検体に前記蛋白質を添加した後のｐＨが５．０超１１．０以下である前項［１］又は［２］記載の方法。
［４］　検体が、滅菌水、生理食塩水、液体培地、生体試料、培養上清、緩衝液及びリンゲル液からなる群より選択される液体検体である前項［１］～［３］記載の方法。
［５］　グラム陽性細菌の集菌方法である、前項［１］～［４］のいずれか１項記載の方法。
［６］　グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属及びバチルス属からなる群より選択される１以上である前項［１］～［５］のいずれか１項記載の方法。
［７］　グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス・アウレウス、バチルス・サブチリス及びクロストリジウム・スポロゲネスからなる群より選択される１以上である前項［１］～［５］のいずれか１項記載の方法。
［８］　検体に、さらに水不溶性担体を添加する前項［１］～［７］のいずれか１項記載の方法。
［９］　前項［１］～［８］のいずれか１項記載の方法によって集菌されたグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物をポリメラーゼ連鎖反応に付すことを特徴とする、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の測定方法。
［１０］　前項［１］～［８］のいずれか１項記載の方法によって集菌されたグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を増菌することを特徴とする、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の測定方法。
　本発明の方法は、入手が容易で既知の特定の５種から選択される蛋白質を添加することにより、無添加の場合と比較して、極めて高い効率で、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を集菌することができる。また、本発明の方法を用いることで、検体から、日本薬局方（第十七改正）４．０６において規定される無菌試験法でのバリデーションの供試菌株であるグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を効率的に集菌することができる。
　また、本発明の方法では検査日に合わせて微生物を調製し、微生物蛋白質や微生物抽出蛋白質の調製をする必要がないうえに、それらを調製するために必要な溶媒及び試薬にグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物が混入していないことを確認する必要がないため、利便性が高い。
　さらに、本発明の方法は、任意にラテックス粒子等の水不溶性担体を用いることにより、少量のグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物であっても、分離後の凝集体が拡散しにくくなると同時に目視で確認しやすくなることで、集菌により菌を沈殿させた後の上清の除去が容易となる。
　さらにまた、本発明の方法は、細菌を傷つける可能性が低いことから、集菌した細菌を培養等することができるため、培養後のコロニーを用いて他の試験に供試することも可能である。
　加えて、本発明の方法は、細胞由来のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素、その他の蛋白質が混入することがなくなるため、集菌後の核酸増幅反応操作が容易となる。
　以下、本発明について好ましい形態を中心に具体的に説明する。なお、本発明はこれら実施形態に何ら制約されるものではない。
　本発明において、「グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の集菌」とは、検体中に含まれるグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を分離・濃縮することである。グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を集菌することによって、その後に行われる無菌試験を容易に行うことができる。
　本発明のグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の集菌方法は、検体にアルブミン、カゼイン、加水分解カゼイン、乳蛋白質及びゼラチンからなる群より選択される１以上の蛋白質を添加することで形成される凝集体を回収するものである。
　本発明において、グラム陽性細菌とは、グラム染色により紺青色又は濃紫色に染色される細菌をいう。グラム陽性細菌は一般的に、細胞壁が厚く、外膜のない菌であり、ペプチドグリカン層が厚いという特徴を有する。グラム陽性細菌は、形状により、グラム陽性球菌及びグラム陽性桿菌に分けられる。なお、マイコプラズマは、便宜上グラム陽性細菌として分類されるが、細胞壁を持たずグラム染色できないことから、本発明におけるグラム陽性細菌からは除かれる。
　グラム陽性球菌には、スタフィロコッカス属［例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）等。］、エンテロコッカス属［例えば、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）等。］、ストレプトコッカス属［例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等。］等が含まれるが、これらに限定されない。
　グラム陽性桿菌には、クロストリジウム属［例えば、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）等。］、コリネバクテリウム属［例えば、コリネバクテリウム・レナーレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｅｎａｌｅ）等。］、バチルス属［例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等］等が含まれるが、これらに限定されない。
　これらのグラム陽性細菌のうち、スタフィロコッカス・アウレウス、バチルス・サブチリス及びクロストリジウム・スポロゲネスから選ばれる１以上を対象とすることが好ましい。これらの細菌は、日本薬局方（第十七改正）４．０６において規定される無菌試験法のバリデーションにおける供試菌株であり、本発明の集菌方法を実施することにより、無菌試験に使用される試料の無菌性を担保することができる。
　本発明において、グラム陰性細菌とは、グラム染色においてクリスタルバイオレットによる染色が脱色される細菌をいう。グラム陰性細菌は一般的に、リポ多糖類に覆われた外膜を有し、ペプチドグリカン層が薄い細胞壁を有する。グラム陰性細菌は、形状により、グラム陰性球菌及びグラム陰性桿菌に分けられる。
　グラム陰性球菌には、ナイセリア属［例えば、ナイセリア・メニンギティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）等。］、ベイロネラ属［ベイロネラ・パルブラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｏｌａ）等。］が含まれるが、これらに限定されない。
　グラム陰性桿菌には、エシュリキア属［例えば、エシュリキア・コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等。］、サルモネラ属［例えば、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）等。］、エンテロバクター属［例えば、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等。］、バクテロイデス属［例えば、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）等。］、シュードモナス属［例えば、（シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・セパシア（Pｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等。］が含まれるが、これらに限定されない。
　本発明における真菌には、カンジダ属［例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）等。］、アスペルギルス属［アスペルギルス・ブラジリエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）］等が含まれるが、これらに限定されない。
　本発明において、グラム陰性細菌及び真菌は蛋白質を添加しなくても集菌可能であるが、本発明の前記蛋白質を添加する方法によって、集菌効率を向上することができる。よって、試料が無菌試験のバリデーションにおける供試菌株であるスタフィロコッカス・アウレウス、バチルス・サブチリス、クロストリジウム・スポロゲネス、シュードモナス・エルギノーサ、カンジダ・アルビカンス及びアスペルギルス・ブラシレンシスを集菌することができ、かかる試料の無菌性を担保するのに用いることができる。
　本発明において、検体とは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の感染の有無を試験するための試料をいい、液状であることが好ましい。例えば、検体としては、水（滅菌水、蒸留水等）、生理食塩水、液体培地（例えば、真核細胞等の細胞を培養するために用いられるもの、例えば、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、α―ＭＥＭ、ＨＡＮＫＳ等）、生体試料、培養上清、緩衝液（例えば、所定のｐＨに調製したＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＨＥＰＰＳバッファー、ＴＡＰＳバッファー、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等）、リンゲル液等がある。検体はまた、細胞懸濁上清又は細胞を培養した後の培養上清でもよい。
　本発明において用いられる蛋白質は、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、霊長類血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、齧歯類血清アルブミン、ウマ類血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、モルモット血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミン、ブタ血清アルブミン等の動物アルブミン）、カゼイン、加水分解カゼイン、乳蛋白質（例えば、商品名：ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル製））及びゼラチンから選択される１種以上である。グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を集菌後ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に付した際の菌の混入を避ける観点から、無菌の蛋白質を用いることが好ましい。これらの蛋白質は、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　本発明のグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の集菌方法では、検体に前記蛋白質を添加して得られた凝集体を回収する。具体的には、まず、遠心チューブに検体及び前記蛋白質を加える。凝集を確実にするために、任意の時間（例えば、１秒間～６０分間）攪拌又は放置してもよい。得られた凝集体の回収は、例えば、遠心分離により行うことができる。遠心分離において遠心力は、特に限定されないが、例えば、３，０００～３０，０００Ｇであり、好ましくは５，０００～２８，０００Ｇ、より好ましくは１４，０００～２５，０００Ｇである。遠心分離時間は、特に限定されないが、例えば、１０秒間～１２０分間、好ましくは１分間～６０分間、より好ましくは１０分間～３０分間である。遠心分離時の温度は、特に限定されないが、例えば、４～３５℃、好ましくは７～３０℃、より好ましくは１０～２５℃である。遠心分離を行うことで、遠心チューブ下部に、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の凝集体が沈殿する。その後上清を除去してグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の凝集体を残渣として得ることができる。必要に応じて、この遠心分離及び上清を除去する工程を２回以上繰り返してもよい。
　なお、前記凝集体を得るために、検体には任意に物理的処理及び／又は化学的処理を施してもよい。物理的処理としては、加熱処理、超音波照射処理、凍結、溶融処理等が挙げられる。化学的処理としては、化学試薬処理、例えば、消化酵素、界面活性剤、溶菌剤等を用いる変性処理等が挙げられる。
　前記蛋白質の使用量は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を十分に凝集できる量であれば特に限定されないが、例えば、検体１ｍＬに対して０．１～５００ｍｇが好ましく、より好ましくは０．２～１００ｍｇ、さらに好ましくは２～２０ｍｇである。
　検体に前記蛋白質を添加した後のｐＨは特に限定されないが、生菌を得ることを目的とする場合には、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物が変性しない範囲、例えば５．０超１１．０以下が好ましく、５．１から１０．０がより好ましく、６．０～８．０の範囲がさらに好ましく、６．８～７．４の範囲がいっそう好ましい。また、蛋白質の添加、並びにグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の凝集体の回収は、例えば、４～３５℃、好ましくは７～３０℃、より好ましくは１０～２５℃の条件で行うことができる。
　本発明において前記蛋白質に加えて、水不溶性担体を添加することができる。水不溶性担体としては、前記蛋白質と併用することで、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を凝集することができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、ポリスチレン、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレート等のラテックス粒子（例えば有機高分子ラテックス粒子）、物理吸着用やカルボキシル基を介した化学結合用といった処理加工を施したラテックス粒子、着色セルロース粒子、シリカ粒子、金コロイド粒子等が挙げられる。これらのうち、ラテックス粒子、特に有機高分子ラテックス粒子が、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の凝集性の点で好ましい。水不溶性担体を添加することにより、遠心分離後の菌体の凝集体が可視化できるため、上清を除去する際に菌体が除去されることを防ぐことができる。
　水不溶性担体の形状は、特に限定されないが、球状または略球状であることが、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を十分に凝集する観点から好ましい。
　水不溶性担体の粒子径は、特に限定されるものではないが、視認性及び実験の簡便性から、例えば、平均粒子径が１０～２，０００ｎｍが好ましく、より好ましくは５０～１，５００ｎｍ、さらに好ましくは１００～１，０００ｎｍである。水不溶性担体の粒子径は、例えば、電子顕微鏡（ＴＥＭ）法を用いて測定することができる。
　水不溶性担体の使用量は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を十分に凝集できる量であれば特に限定されないが、例えば、検体１ｍＬに対して０．０００５～１０ｍｇ、好ましくは０．００１～１ｍｇ、さらに好ましくは０．００２～０．１ｍｇである。
　前記蛋白質と水不溶性担体の重量比は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の凝集性の点から、例えば、前記蛋白質：水不溶性担体＝１：１～５０，０００：１が好ましく、より好ましくは１０：１～１０，０００：１であり、さらに好ましくは２００：１～１，０００：１である。
　本発明はまた、前記の方法によって集菌されたグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を含む残渣をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に付すことによってグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を測定する方法に関する。
　該方法は、前記の方法で得られたグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の凝集体を含む残渣を用いて、市販のキット（例えば、細菌ＤＮＡ抽出キット（三井化学株式会社製）等）で公知の方法によりＤＮＡ抽出を行い、公知のＰＣＲ法やその変法（例えば、リアルタイムＰＣＲ）により、公知の条件によってグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の検出試験を行うことができる。この際、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物に保存された領域を対象としたプライマー及びプローブを用いることで、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の検出が可能であり、検出したい微生物特有の領域を対象とするプライマー及びプローブを用いることで、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の同定をすることも可能である。
　本発明はまた、検体に対して前記蛋白質、好ましくはさらに水不溶性担体を含む、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の集菌用キットに関する。該キットに含まれる蛋白質及び水不溶性担体は前記の通りである。該キットには、適宜前記のような操作を説明したマニュアルが添付されていてもよい。
　本発明はさらに、集菌の対象となるグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の増殖能を保持した状態で集菌することができるので、集菌したグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を様々な検査に利用することもできる。例えば、集菌したグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を平板培地、液体培地等に接種することで増菌し、集菌されたグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の数の測定、生化学検査等の同定試験や、薬剤感受性試験等に用いることもできる。
　次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制約されるものではない。
実施例１　蛋白質と水不溶性担体による集菌効果
　羊血液寒天培地（商品名：ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製）を用いて前培養したスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を生理食塩水に懸濁し、濁度をマクファーランド１．０とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を１０3倍希釈したものを希釈菌液とし、０．１ｍＬの希釈菌液を２４．９ｍＬの生理食塩水に添加した。これに、３５０μＬの３０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液（ウシ血清由来ＢＳＡ溶液、脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製）及び２．５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ラテックス溶液（粒径３１５ｎｍのポリスチレン系ラテックス粒子（ＩＭＭＵＴＥＸ（登録商標、ＪＳＲライフサイエンス株式会社製）））を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離（２０，０００Ｇ、１５分間、１０℃）し、上清を除去し、１ｍＬの試験液とした。この試験液を１０倍希釈した菌液を、羊血液寒天培地（前記と同様）に１０μＬ接種して、一晩培養を行った（３７℃、好気条件）。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を１０6倍希釈したものを１００μＬ羊血液寒天培地（前記と同様）に接種した。
　また、試験液から細菌核酸ＤＮＡ抽出キット（三井化学株式会社製）を用いてＤＮＡを抽出し、Ｙｅａｓｔ-ｍａｄｅ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（三井化学株式会社製）、フォワードプライマー：ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃＭｔｇｇｃｔｃａｇ（配列番号１）、リバースプライマー：ｃｔｔｔａｃｇｃｃｃａＲｔＲａＷｔｃｃｇ（配列番号２）、プローブ：６ＦＡＭ－ｔＮｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｃｇ-ＢＨＱ（配列番号３）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。反応は９５℃で５秒間の後、９５℃で５秒間及び６０℃で３０秒間を１サイクルとして、４５サイクル行った。
　培養試験の結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果から、ＢＳＡ単独で添加した場合、及びＢＳＡとラテックスを組み合わせて添加した場合は、ラテックス単独で添加した場合や生理食塩水を添加した場合に比較して、集菌なしの数値に近いコロニー数を示した。したがって、ＢＳＡを添加することで、グラム陽性細菌であるスタフィロコッカス・アウレウスを効率的に集菌することができる。また、ＢＳＡに加えてラテックスを添加することにより、遠心分離時の沈殿物が可視化され、上清を除去することが容易であった。
　次に、ＰＣＲの結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果から、ＰＣＲにおいても、ＢＳＡ単独で添加した場合、及びＢＳＡとラテックスを組み合わせて添加した場合は、濃縮なしのＣｑ値に近い値を示した。したがって、ＢＳＡを添加して濃縮することにより、グラム陽性細菌であるスタフィロコッカス・アウレウスを十分に集菌することができる。一方、生理食塩水を添加した場合やラテックス単独で添加した場合は、Ｃｑ値が高くなり、集菌が不十分であった。
実施例２　グラム染色性と集菌効果の関係
　羊血液寒天培地（商品名：ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製）又はチョコレート寒天培地（商品名：ニッスイプレートチョコレート寒天培地ＥＸII、日水製薬株式会社製）を用いて前培養したコリネバクテリウム・レナーレ（Ｃ．ｒｅｎａｌｅ）、ナイセリア・メニンギティス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）及びエシュリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を生理食塩水に懸濁し、濁度をマクファーランド１．０とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を１０3倍希釈したものを希釈菌液とし、０．１ｍＬの希釈菌液を２４．９ｍＬの生理食塩水に添加した。これに、３５０μＬの３０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液（脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製）を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離（２０，０００Ｇ、１５分、１０℃）し、上清を除き１ｍＬの試験液とした。この試験液を１０倍希釈した菌液（ただし、コリネバクテリウム・レナーレについては、試験液を用いた。）を、羊血液寒天培地（前記と同様）又はチョコレート寒天培地（前記と同様）に接種して、一晩培養を行った（３７℃、好気条件）。この際、ナイセリア・メニンギティスについては、アネロパック・ＣＯ２（株式会社スギヤマゲン製）を用いて、３７℃の条件下で培養した。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を１０6倍希釈したものを１００μＬ羊血液寒天培地（前記と同様）に接種した。
　また、試験液から細菌ＤＮＡ核酸抽出キット（三井化学株式会社製）を用いてＤＮＡを抽出し、Ｙｅａｓｔ－ｍａｄｅ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（三井化学株式会社製）、フォワードプライマー：ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃＭｔｇｇｃｔｃａｇ（配列番号１）、リバースプライマー：ｃｔｔｔａｃｇｃｃｃａＲｔＲａＷｔｃｃｇ（配列番号２）、プローブ：６ＦＡＭ－ｔＮｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｃｇ－ＢＨＱ（配列番号３）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。反応は９５℃で５秒間の後、９５℃で５秒間及び６０℃で３０秒間を１サイクルとして、４５サイクル行った。
　培養試験の結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３の結果から、グラム陽性桿菌であるコリネバクテリウム・レナーレは、生理食塩水では集菌することができないのに対し、ＢＳＡを添加することによって集菌が可能となった。一方、グラム陰性球菌であるナイセリア・メニンギティス及びグラム陰性桿菌であるエシュリキア・コリでは、ＢＳＡを添加しなくても集菌可能であったが、ＢＳＡを添加することで、集菌効率が向上した。
　次に、ＰＣＲの結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４の結果から、ＰＣＲでも、グラム陽性桿菌であるコリネバクテリウム・レナーレは、生理食塩水を添加した場合と比較して、ＢＳＡを添加した場合にＣｑ値が低くなった。一方で、グラム陰性球菌であるナイセリア・メニンギティス及びグラム陰性桿菌であるエシュリキア・コリでは、ＢＳＡを添加した場合、生理食塩水と集菌なしの場合に比べ、Ｃｑ値がやや低くなった。
実施例３　蛋白質の種類による集菌効果
　羊血液寒天培地（商品名：ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製）を用いて前培養したスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を生理食塩水に懸濁し、濁度をマクファーランド１．０とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を１０3倍希釈したものを希釈菌液とし、０．１ｍＬの希釈菌液を２４．９ｍＬの生理食塩水に添加した。これに、３５０μＬの３０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液（脂肪酸フリー、和光純薬株式会社製）、ゼラチン又は乳蛋白質（商品名：ブロックエース、ＤＳファーマバイオメディカル社製）をそれぞれ添加した。各溶液を攪拌後、遠心分離（２０，０００Ｇ、１５分、１０℃）し、上清を除去し、１ｍＬの試験液とした。この試験液を１０倍希釈した菌液を、羊血液寒天培地（前記と同様）に接種して、一晩培養を行った（３７℃、好気条件）。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を１０6倍希釈したものを１００μＬ羊血液寒天培地（前記と同様）に接種した。
　試験液から細菌ＤＮＡ核酸抽出キット（三井化学株式会社製）を用いてＤＮＡを抽出し、Ｙｅａｓｔ-ｍａｄｅ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（三井化学株式会社製）、フォワードプライマー：ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃＭｔｇｇｃｔｃａｇ（配列番号１）、リバースプライマー：ｃｔｔｔａｃｇｃｃｃａＲｔＲａＷｔｃｃｇ（配列番号２）、プローブ：６ＦＡＭ－ｔＮｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｃｇ－ＢＨＱ（配列番号３）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。反応は９５℃で５秒間の後、９５℃で５秒間及び６０℃で３０秒間を１サイクルとして、４５サイクル行った。
　培養試験の結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５の結果から、ＢＳＡ単独、乳蛋白質（ブロックエース）単独、及びゼラチン単独の場合、生理食塩水を添加した場合に比較して、集菌なしの数値に近いコロニー数を示した。
　ＰＣＲの結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６の結果から、ＰＣＲにおいても、ゼラチンはＢＳＡと同等のＣｑ値を示した。したがって、蛋白質としてＢＳＡだけでなく、ゼラチンを使用しても、グラム陽性細菌であるスタフィロコッカス・アウレウスを効率的に集菌することができる。
実施例４　水不溶性担体を用いた集菌試験
　羊血液寒天培地（商品名：ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製）を用いて前培養したコリネバクテリウム・レナーレ（Ｃ．ｒｅｎａｌｅ）及びエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）をそれぞれ生理食塩水に懸濁し、マクファーランド１．０とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を１０3倍希釈したものを希釈菌液とし、０．１ｍＬの希釈菌液を２４．９ｍＬの生理食塩水に添加した。これに、３５０μＬの３０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液、及び水不溶性担体として２．５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ラテックス溶液を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離（２０，０００Ｇ、１５分間、１０℃）し、上清を除去し、１ｍＬの試験液とした。この試験液を１０倍希釈したものを、９０μＬずつ羊血液寒天培地（前記と同様）に接種して、一晩培養を行った（３７℃、好気条件）。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を１０5倍希釈したものを１００μＬ羊血液寒天培地（前記と同様）に接種した。
　また、試験液から細菌ＤＮＡ核酸抽出キット（三井化学株式会社製）を用いてＤＮＡを抽出し、Ｙｅａｓｔ－ｍａｄｅ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（三井化学株式会社製）、フォワードプライマー：ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃＭｔｇｇｃｔｃａｇ（配列番号１）、リバースプライマー：ｃｔｔｔａｃｇｃｃｃａＲｔＲａＷｔｃｃｇ（配列番号２）、プローブ：６ＦＡＭ－ｔＮｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｃｇ－ＢＨＱ（配列番号３）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。反応は９５℃で５秒間の後、９５℃で５秒間及び６０℃で３０秒間を１サイクルとして、４５サイクル行った。
　培養試験の結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７の結果から、グラム陽性桿菌であるコリネバクテリウム・レナーレを集菌する際にＢＳＡとラテックスの組み合わせを添加した場合、集菌を実施しなかった理論値に対して９７％の回収率であった。一方、生理食塩水を添加した場合は、理論値の０％であった。したがって、ＢＳＡ及びラテックスの組み合わせを添加した場合、コリネバクテリウム・レナーレの集菌効率が極めて高かった。
　また、グラム陽性球菌であるエンテロコッカス・フェカーリスを集菌する際にＢＳＡとラテックスの組み合わせを添加した場合、集菌を実施しなかった理論値の９０％の回収率であった。一方、生理食塩水を添加した場合は、理論値の１０％の回収率であった。したがって、ＢＳＡとラテックスの組み合わせにより、エンテロコッカス・フェカーリスの集菌効率が極めて高いことが分かった。
　さらに、いずれの試験においても、ＢＳＡに加えてラテックスを添加することにより遠心分離時の沈殿物が可視化され、上清を除去することが容易であった。
　次に、ＰＣＲの結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８の結果から、ＰＣＲにおいても、ＢＳＡとラテックスの組み合わせを添加して集菌を行った場合、集菌を実施しなかった理論値のＣｑに近い値を示し、十分な集菌効率であった。一方、生理食塩水のみを添加した場合、Ｃｑ値が高くなり、集菌が不十分であった。
実施例５　集菌時のｐＨによる影響
　羊血液寒天培地（商品名：ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製）を用いて前培養したスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を生理食塩水に懸濁し、濁度をマクファーランド１．０とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を１０3倍希釈したものを希釈菌液とし、０．１ｍＬの希釈菌液を２４．９ｍＬのｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０の０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液にそれぞれ添加した。これらに、３５０μＬの３０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液（ウシ血清由来ＢＳＡ溶液、脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製）を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離（２０，０００Ｇ、１５分間、１０℃）し、上清を除去し、１ｍＬの試験液とした。この試験液を１０倍希釈した菌液を、羊血液寒天培地（前記と同様）に１０μＬ接種して、一晩培養を行った（３７℃、好気条件）。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を生理食塩水で１０6倍希釈したものを１００μＬ羊血液寒天培地（前記と同様）に接種したものを使用した。
　また、試験液から細菌ＤＮＡ核酸抽出キット（三井化学株式会社製）を用いてＤＮＡを抽出し、Ｙｅａｓｔ－ｍａｄｅ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（三井化学株式会社製）、フォワードプライマー：ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃＭｔｇｇｃｔｃａｇ（配列番号１）、リバースプライマー：ｃｔｔｔａｃｇｃｃｃａＲｔＲａＷｔｃｃｇ（配列番号２）、プローブ：６ＦＡＭ－ｔＮｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｃｇ－ＢＨＱ（配列番号３）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。反応は９５℃で５秒間の後、９５℃で５秒間及び６０℃で３０秒間を１サイクルとして、４５サイクル行った。
　培養試験の結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　また、ＢＳＡ添加後のｐＨ値を３回測定した。測定結果を、その平均値とともに表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表９から、ＢＳＡを添加した場合、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０のいずれのｐＨ領域であっても、グラム陽性球菌であるスタフィロコッカス・アウレウスを集菌することができ、それらは培養可能であることが分かった。なお、表１０の結果から、ＢＳＡの添加後のｐＨについては、変動が殆ど確認されなかった。
　次に、ＰＣＲの結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１１の結果から、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０の各リン酸ナトリウム緩衝液にＢＳＡを添加した場合、集菌を行わなかった場合と近いＣｑ値を示した。一方で、ＢＳＡを加えなかった検体液を添加した場合、Ｃｑ値が集菌を行わなかった場合よりも高い値を示したことから、集菌が不十分であった。
実施例６　クロストリジウム・スポロジェネスの結果
　羊血液寒天培地（商品名：ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製）を用いて前培養したクロストリジウム・スポロジェネス（Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）を生理食塩水に懸濁し、濁度をマクファーランド１．０とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を１０3倍希釈したものを希釈菌液とし、０．１ｍＬの希釈菌液を２４．９ｍＬの生理食塩水にそれぞれ添加した。これに、３５０μＬの３０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液（ウシ血清由来ＢＳＡ溶液、脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製）を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離（２０，０００Ｇ、１５分間、１０℃）し、上清を除去し、１ｍＬの試験液とした。この試験液を１０倍希釈した菌液を、羊血液寒天培地（前記と同様）に１０μＬ接種して、アネロメイト－Ｐ「ニッスイ」（日水製薬株式会社製）を用いて、一晩培養を行った（３７℃）。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を生理食塩水で１０6倍希釈したものを１００μＬ羊血液寒天培地（前記と同様）に接種した。
　また、試験液から細菌ＤＮＡ核酸抽出キット（三井化学株式会社製）を用いてＤＮＡを抽出し、Ｙｅａｓｔ－ｍａｄｅ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（三井化学株式会社製）、フォワードプライマー：ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃＭｔｇｇｃｔｃａｇ（配列番号１）、リバースプライマー：ｃｔｔｔａｃｇｃｃｃａＲｔＲａＷｔｃｃｇ（配列番号２）、プローブ：６ＦＡＭ－ｔＮｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｃｇ－ＢＨＱ（配列番号３）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。反応は９５℃で５秒間の後、９５℃で５秒間及び６０℃で３０秒間を１サイクルとして、４５サイクル行った。
　培養試験の結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２の結果から、グラム陽性桿菌であるクロストリジウム・スポロジェネスを集菌する際にＢＳＡを添加した場合、集菌を実施しなかった理論値に対して１５１％の回収率であった。一方、生理食塩水を添加した場合は、理論値の５７％であった。したがって、ＢＳＡ及びラテックスの組み合わせを添加した場合、クロストリジウム・スポロジェネスの集菌効率が極めて高かった。
　次に、ＰＣＲの結果を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１３の結果から、ＰＣＲにおいても、ＢＳＡを添加して集菌を行った場合、集菌を実施しなかった理論値のＣｑ値に近い値を示し、十分な集菌効率であった。一方、生理食塩水のみを添加した場合、Ｃｑ値が高くなり、集菌が不十分であった。
実施例７　酸性域のｐＨによる影響
　羊血液寒天培地（商品名：ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製）を用いて前培養したスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を生理食塩水に懸濁し、濁度をマクファーランド１．０とした菌懸濁液を調製した。その後、菌懸濁液を１０3倍希釈したものを希釈菌液とし、０．１ｍＬの希釈菌液を２４．９ｍＬのｐＨ４．３の０．０１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液にそれぞれ添加した。これらに、３５０μＬの３０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液（ウシ血清由来ＢＳＡ溶液、脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製）を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離（２０，０００Ｇ、１５分間、１０℃）し、上清を除去し、１ｍＬの試験液とした。この試験液を１０倍希釈した菌液を、羊血液寒天培地（前記と同様）に１０μＬ接種して、一晩培養を行った（３７℃、好気条件）。なお、集菌を行わない比較対象として、菌懸濁液を生理食塩水で１０6倍希釈したものを１００μＬ羊血液寒天培地（前記と同様）に接種したものを使用した。
　また、試験液から細菌ＤＮＡ核酸抽出キット（三井化学株式会社製）を用いてＤＮＡを抽出し、Ｙｅａｓｔ－ｍａｄｅ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（三井化学株式会社製）、フォワードプライマー：ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃＭｔｇｇｃｔｃａｇ（配列番号１）、リバースプライマー：ｃｔｔｔａｃｇｃｃｃａＲｔＲａＷｔｃｃｇ（配列番号２）、プローブ：６ＦＡＭ－ｔＮｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｃｇ－ＢＨＱ（配列番号３）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。反応は９５℃で５秒間の後、９５℃で５秒間及び６０℃で３０秒間を１サイクルとして、４５サイクル行った。
　培養試験の結果を表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　また、ＢＳＡ添加後のｐＨ値を３回測定した。測定結果を、その平均値とともに表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表１４から、ＢＳＡの添加の有無にかかわらず、ｐＨ４．３のｐＨ領域であれば、グラム陽性球菌であるスタフィロコッカス・アウレウスを集菌することができた。なお、表１５の結果から、ＢＳＡの添加後のｐＨについては、変動が殆ど確認されなかった。
　次に、ＰＣＲの結果を表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表１６の結果から、ＢＳＡの添加の有無にかかわらず、ｐＨ４．３のクエン酸ナトリウム緩衝液の場合、集菌を行わなかった場合と近いＣｑ値を示した。
実施例８　カンジダ・アルビカンスの集菌
　２個のＢｉｏＢａｌｌ５５０（商品名：Ｂｉｏｂａｌｌ５５０、ビオメリュー・ジャパン株式会社製）を２５ｍＬの生理食塩水に添加し、１１００ＣＦＵ／２５ｍＬ相当の菌懸濁液を調製した。その後、３５０μＬの３０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液（ウシ血清由来ＢＳＡ溶液、脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製）及び水不溶性担体として２．５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ラテックス溶液を添加した。それらの溶液を攪拌後、遠心分離（２０，０００Ｇ、１５分間、１０℃）し、上清を除去し、１ｍＬの試験液とした。この試験液を、羊血液寒天培地（商品名：ニッスイプレート羊血液寒天培地、日水製薬株式会社製）に１００μＬ接種して、一晩培養を行った（３７℃、好気条件）。
　培養試験の結果を表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表１７の結果から、グラム陽性を示す真菌であるカンジダ・アルビカンスを集菌する際にＢＳＡ及びラテックスを添加した場合、理論値に対して８０．５％であり、生理食塩水を加えた場合の６５．９％よりも回収効率が良好であった。

Claims (10)

  1. 　検体にアルブミン、カゼイン、加水分解カゼイン、乳蛋白質及びゼラチンからなる群より選択される１以上の蛋白質を添加し、得られた凝集体を回収することを特徴とする、検体中のグラム陽性細菌（ただし、マイコプラズマを除く）、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の集菌方法。
  2. 　グラム陽性細菌（ただし、マイコプラズマを除く）及び／又はグラム陰性細菌の集菌方法である請求項１記載の方法。
  3. 　検体に前記蛋白質を添加した後のｐＨが５．０超１１．０以下である請求項１又は２記載の方法。
  4. 　検体が、滅菌水、生理食塩水、液体培地、生体試料、培養上清、緩衝液及びリンゲル液からなる群より選択される液体検体である請求項１～３記載の方法。
  5. 　グラム陽性細菌の集菌方法である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属及びバチルス属からなる群より選択される１以上である請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス・アウレウス、バチルス・サブチリス及びクロストリジウム・スポロゲネスからなる群より選択される１以上である請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  8. 　検体に、さらに水不溶性担体を添加する請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項記載の方法によって集菌されたグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物をポリメラーゼ連鎖反応に付すことを特徴とする、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の測定方法。
  10. 　請求項１～８のいずれか１項記載の方法によって集菌されたグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物を増菌することを特徴とする、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び真菌からなる群より選択される１以上の微生物の測定方法。
PCT/JP2019/041658 2018-10-25 2019-10-24 集菌方法 WO2020085420A1 (ja)

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