JP6890444B2 - 異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット - Google Patents
異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP6890444B2 JP6890444B2 JP2017060874A JP2017060874A JP6890444B2 JP 6890444 B2 JP6890444 B2 JP 6890444B2 JP 2017060874 A JP2017060874 A JP 2017060874A JP 2017060874 A JP2017060874 A JP 2017060874A JP 6890444 B2 JP6890444 B2 JP 6890444B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- latex
- antibody
- antigen
- insoluble carrier
- particles
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims description 195
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 95
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 93
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 93
- 238000005259 measurement Methods 0.000 title claims description 60
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 43
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 title description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 title description 5
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 227
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 227
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 77
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 65
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 claims description 60
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 claims description 60
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 44
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 42
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 101000942118 Homo sapiens C-reactive protein Proteins 0.000 description 24
- 101000922020 Homo sapiens Cysteine and glycine-rich protein 1 Proteins 0.000 description 24
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 24
- 102000051143 human CRP Human genes 0.000 description 24
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 230000008859 change Effects 0.000 description 23
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 15
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 14
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 13
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 13
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 10
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 229940124280 l-arginine Drugs 0.000 description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 238000010556 emulsion polymerization method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 2
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 2
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 108700028909 Serum Amyloid A Proteins 0.000 description 2
- 102000054727 Serum Amyloid A Human genes 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)C(N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000011546 CRP measurement Methods 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical compound NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 239000003154 D dimer Substances 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 108010052295 fibrin fragment D Proteins 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010030 laminating Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010558 suspension polymerization method Methods 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、生体物質の測定方法に関する発明であり、更に具体的には異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子、を混合して用いる抗原の測定手段に関する発明である。
現在不溶性担体粒子を用いた診断薬においては、特に免疫学的測定方法の１つとしてラテックス凝集法を用いる試薬が汎用されている。
ラテックス凝集法では、液相中において抗原又は抗体を担持させたラテックスを用い、抗体又は抗原を検出する測定系を形成する。免疫複合体の形成によりラテックス粒子が凝集する性質に基づき、凝集の程度を目視により確認するか、光学的に濁度の増加を吸光度又は散乱光強度の変化として測定を行うことができる（以下、ラテックス法ともいう：特許文献１）。
ラテックス法は、操作が簡便であり、自動分析装置にも比較的容易に適用でき、現在盛んに用いられている臨床検査方式の一つである。
特許文献２には、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）に対する抗体が特定のスペーサーを介して担持されたラテックスを用いた、ＣＲＰ測定試薬が開示されている。
不溶性担体として最も汎用されているラテックスに抗体を担持させる場合、概ね物理吸着法又は化学結合法のいずれかの方式の担持方法が用いられる（これらの担持方法の内容については後述する）。物理吸着法は、担持工程が比較的単純であり、かつ、抗体の高密度担持も比較的容易であり高い反応性を得やすいという利点を有するが、その反面で標的抗原に対する広い測定範囲を得ることが難しい傾向が認められる。他方、化学結合法は、広い測定範囲を得ることが比較的容易であるが、担持に手間が掛かりコスト高であり、技術的には抗体の高密度担持が難しい傾向が認められる。
また、担持抗体として、通常はポリクローナル抗体が用いられているが、ポリクローナル抗体の場合は、これを産生する免疫動物の個体差が大きいためにロット差も大きく、一定性能の抗体の確保が難しく、歩留まりに問題が認められる。特に、測定範囲の確保のために抗体の反応特性を設定する必要がある場合、ポリクローナル抗体では、その調整は困難である。その点、ポリクローナル抗体に代えてモノクローナル抗体を、例えば、測定範囲確保のための担持抗体として用いれば、上記の問題を解決できる筈である。
しかしながら、ラテックス粒子にモノクローナル抗体を担持させて種々の検討を行ったところ、特に、「広い検出範囲と低濃度領域における優れた検出感度」が要求される測定対象において、実用化への困難性が認められることが明らかになった。
このような状況下で、本発明は、抗体が担持された不溶性担体粒子の抗原測定における、測定範囲の拡大、及び、検出感度の向上、を課題としてなされたものである。
初めに本発明者らは、より広い測定範囲と、より低濃度における高感度検出が望まれる生体関連物質を標的抗原として、当該標的抗原に対する抗体を、物理吸着法と化学結合法の２種類の方式により、不溶性担体に担持させて、当該標的抗原の検出性能を検討した。
その結果、これらの方式各々で標的抗原に対する抗体を不溶性担体に担持させた場合には、十分な実用性が認められなかった。しかしながら驚くべきことに、物理吸着法により抗体が担持された不溶性担体と、化学結合法により抗体が担持された不溶性担体を混合して用いた場合には、広い測定範囲と低濃度における高感度測定性を兼ね備えた標的抗原の測定が可能であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、物理吸着により所定の標的抗原に対する抗体が担持された不溶性担体粒子（以下、物理吸着粒子ともいう）、及び、化学結合により当該標的抗原に対する抗体が担持された不溶性担体粒子（以下、化学結合粒子ともいう）、の双方を含有する不溶性担体粒子の含有液（以下、本発明の含有液ともいう）を、前記標的抗原を含有し得る検体と接触させて、前記不溶性担体粒子に担持された抗体と、前記検体中の標的抗原との抗原抗体反応による前記不溶性担体粒子の凝集反応を検出して、前記標的抗原を測定することを特徴とする抗原測定方法（以下、本発明の測定方法ともいう）、である。
上記の「所定の標的抗原」における「所定の」とは、例えば、「選択された」と言い換えることができる。測定の対象として選択された標的抗原として「定められた」、又は、「選択された」、という意味であり、一旦定められ、又は、一旦選択されれば、当該標的抗原は一意的に確定する。
本発明において不溶性担体粒子に担持される「抗体」は、特に断らない限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであっても良い。また、「抗体」、「モノクローナル抗体」又は「ポリクローナル抗体」は、それぞれの抗体の全体分子のみならず、標的抗原に結合する限り、抗体の断片又はその修飾物（結合性断片）であっても良い。さらに、これらの抗体は、二価抗体であっても、一価抗体であっても良い。抗体の結合性断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）2断片、Ｆａｂ'断片、Ｆｖ断片、１個のＦａｂとＦｃを有するＦａｂ／ｃ断片等が挙げられる。また、抗体として、キメラ抗体、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は可変部以外をヒト抗体由来構造に置換したマウス等とヒトとのキメラ抗体等が例示される。また、抗体のクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又は、ＩｇＡであり、サブクラスは限定されない。さらに抗体は、公知の方法で作製されたものであっても、市販品でも良い。
物理吸着粒子と化学結合粒子に担持されている抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であっても良いが、上述したように、ポリクローナル抗体を選択する場合には一定性能の抗体の確保が難しいという問題点が認められる。また、モノクローナル抗体を選択する利点として、標的抗原の特定のエピトープに対する抗体として選択することが可能であり、これによりラテックスの凝集性能のコントロールが容易になる点が挙げられる。
物理吸着粒子に担持されている抗体と、化学結合粒子に担持されている抗体は、標的抗原が同一であれば、互いに同一の種類の抗体であっても、異なる種類の抗体であっても良い。異なる種類の抗体としては、例えば、一方がモノクローナル抗体で、他方がポリクローナル抗体の場合が挙げられる。また、一方がマウス抗体であって、他方がヤギ抗体等、互いが異なる動物由来の抗体である場合が挙げられる。また、一方が全抗体であって、他方が結合性断片である場合が挙げられる。また、互いの抗体のクラス・サブクラスが異なる場合が挙げられる。
さらに、物理吸着粒子に担持されている抗体同士、又は、化学結合粒子に担持されている抗体同士が、上記の「異なる種類の抗体」であっても良い。
さらに本発明は、物理吸着粒子、及び、化学結合粒子、の双方を含有する不溶性担体粒子の含有液（以下、本発明の含有液ともいう）であることを特徴とする、抗原の測定用試薬（以下、本発明の測定用試薬ともいう）である。
本発明における物理吸着法は、不溶性担体粒子と抗体との静電的相互作用（疎水性相互作用）を利用して、直接的な接触により不溶性担体粒子に当該抗体を吸着させることにより担持させる手法である。
本発明における化学結合法は、不溶性担体粒子表面又は抗体のカルボキシル基とアミノ基をカルボジイミド等のカップリング試薬により共有結合させる方法、不溶性担体粒子表面のアルデヒド基やトシル基等と抗体のアミノ基とを結合させる方法等、により不溶性担体粒子に物質を結合させることにより担持させる手法である。
物理吸着粒子も化学結合粒子も、共にラテックスとして提供されることが好適である。その他、シリカコロイド、磁性粒子、金属コロイド等の不溶性担体粒子を用いることができる。本発明の含有液は、不溶性担体粒子を含有していれば、その含有状態は特に限定されない。すなわち、含有液としては、分散液、乳化液、浮遊液、沈殿液、多層分離液等が挙げられる。本発明の含有液は、緩衝液を基礎とした分散液が典型的である。また、含有液中の不溶性担体粒子は、必要に応じた表面処理が施されていてもよい。
物理吸着粒子は、上記の規定通りに物理吸着法により所定の抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）が担持された不溶性担体粒子である。物理吸着粒子の平均粒径は特に限定されず、０．０１μｍ−１．０μｍが好適であり、さらに好適には０．０５μｍ−０．３５μｍである。物理吸着粒子は、物理吸着法を行う対象となる不溶性担体粒子の含有液に、吸着対象抗体を接触させることにより作製することができる。
化学結合粒子は、上記の規定通りに化学結合法により所定の抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）が担持された不溶性担体粒子である。化学結合粒子の平均粒径は特に限定されず、０．０１μｍ−１．０μｍが好適であり、さらに好適には０．０５μｍ−０．３５μｍである。化学結合粒子は、化学結合法を行う対象となる不溶性担体粒子の含有液に、結合対象抗原を共有結合させる操作を行うことにより作製することができる。
本発明の含有液は、好適には、「物理吸着粒子の含有液」と「化学結合粒子の含有液」を混合することにより調製することができる。
物理吸着粒子と化学結合粒子の混合比（質量比）は、好適には１０：１−１：１０（物理吸着粒子：化学結合粒子）、さらに好適には５：１−１：５（物理結合粒子：化学結合粒子）、最も好適には３：１−１：３（物理結合粒子：化学結合粒子）である。
標的抗原は生体関連物質全般から広く選択することが可能であり、限定されず、蛋白質の他、糖鎖や脂質等も標的抗原とすることができる。例えば、多価抗原、すなわち、同一のサブユニットを複数有する多量体抗原、を標的抗原として選択することが好ましい。多価抗原としては、種々の酵素やヘモグロビン等の血色素が挙げられる。多価抗原の中でも、広い測定範囲が要求され、かつ、低濃度での測定が要求されるもの、例えば、ＣＲＰ、ＦＥＲ（フェリチン）、Ｄ−ダイマー、免疫グロブリン等は、標的抗原として特に好ましい。多価抗原以外であっても、広い測定範囲が要求され、かつ、低濃度での測定が要求される抗原、例えば、ＳＡＡ（血清アミロイドＡ）等は、好適な標的抗原として例示される。また、標的抗原量が測定範囲を超える検体は、通常希釈再検がなされるが、本発明により測定上限が拡大されることにより、この希釈再検率を低下させることが可能となり、「広い測定範囲が要求され、かつ、低濃度での測定が要求される抗原」以外であっても、本発明の適用は医療経済的に好適である。
なお、本発明における標的抗原を保有する動物の種類は限定されない。動物の種類は、本発明の抗原測定方法を用いるべき動物であり、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ等の愛玩動物や家畜等として用いられている哺乳動物が主に例示される。上記において例示した標的抗原は、ヒトを想定した例示であるが、ヒト以外の動物の対応する標的抗原でもあり得る。例えば、ＣＲＰは、ヒト以外の動物、例えば、イヌにも存在しており、獣医学の分野で、イヌＣＲＰ（ヒトＣＲＰと同一では無い）の測定が広く行われている。本明細書、特許請求の範囲において「ＣＲＰ」と記載されている場合には、特に断らない限りヒトＣＲＰである場合もイヌＣＲＰである場合もあり、さらに他の動物のＣＲＰでもあり得る。これは他の標的抗原においても同様である。なお、例えばヒトＣＲＰと記載した場合は、ヒトＣＲＰのみを意味する。
上記の本発明の含有液を、標的抗原を含有し得る検体と接触させて、当該含有液の不溶性担体粒子に担持された抗体と、検体中の標的抗原との抗原抗体反応による当該担体粒子の凝集反応の程度を検出することができる。
「標的抗原を含有し得る検体」は、標的抗原を含有する可能性がある生体からの分離物であれば特に限定されず、例えば、血液、血清、血漿、尿、リンパ液、 刺液、髄液、汗、唾液、胃液、肺洗浄液、糞便等が挙げられる。これらのうち、血液、血清、血漿が好適である。
凝集反応は、スライド凝集法、光学測定法、マイクロタイター法、フィルター分離法等を用いて、不溶性担体粒子の凝集を検出することにより、所望の標的抗原の測定を行うことができる。
本発明は、本発明の測定用試薬を含む測定用キット（以下、本発明のキットともいう）を提供する。本発明のキットは、さらに希釈液を含むことが好適である。
本発明により、広い測定範囲と共に、低濃度領域における高い検出感度を伴って標的抗原を測定する手段が提供される。
１．本発明の含有液
上述のように本発明の含有液は、物理吸着粒子、及び、化学結合粒子、の双方を含有する含有液である。
上述のように本発明の含有液は、物理吸着粒子、及び、化学結合粒子、の双方を含有する含有液である。
（１）不溶性担体粒子の調達
上述したように、物理吸着粒子も化学結合粒子も、共にラテックスとして提供されることが好適である。ラテックスは、水中にポリマーの微粒子（ラテックス粒子）が安定に分散したエマルジョンである。
上述したように、物理吸着粒子も化学結合粒子も、共にラテックスとして提供されることが好適である。ラテックスは、水中にポリマーの微粒子（ラテックス粒子）が安定に分散したエマルジョンである。
ラテックスの作製方法は、乳化重合法、ソープフリー乳化重合法、シード重合法、ステージフィード乳化重合法、パワーフィード重合法、懸濁重合法等の常法を用いて行うことが可能である。粒径の調節も、これらのラテックスの調製方法の各々における常法を用いて行うことができる。例えば、乳化重合法であれば、モノマー、乳化剤、開始剤の種類と量、重合温度等を調節することにより、ラテックスの粒径の調節を行うことができる。ラテックスの市販品を用いることも当然に可能である。
ラテックスの種類は、物理吸着粒子の作製に用いられる物理吸着法、又は、化学結合粒子の作製に用いられる化学結合法、を適用することができる限りにおいて特に限定されず、物理吸着法及び化学結合法のそれぞれに適した種類を選択することが好適である。
物理吸着法に適したラテックスとしては、ポリスチレンラテックス、極低カルボン酸ラテックス、親水基局在化ラテックス等が挙げられる。
化学結合法に適したラテックスとしては、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、トシル基、スルフヒドリル基、又は、エポキシ基等を表面に有するラテックス粒子を含有するラテックスが挙げられる。
物理吸着法に適したラテックスであっても、又は、化学結合法に適したラテックスであっても、着色が施された着色ラテックスや、蛍光物質が施された蛍光ラテックスを用いることも可能である。
前述のように、物理吸着を行うラテックス粒子も化学結合を行うラテックス粒子の粒径も特に限定されず、０．０１μｍ−１．０μｍが好適であり、さらに好適には０．０５μｍ−０．３５μｍである。
さらにこれら双方の担持方式のラテックス粒子のそれぞれにおいて、担持モノクローナル抗体と標的抗原の性質に応じた適切な反応性と測定範囲を得るために、測定において用いるラテックス粒子の粒径の組合せを決定することができる。すなわち、免疫反応によるラテックスの凝集性を高めたい場合には大きな粒径（０．１５−０．３５μｍ）が必要となるが、当該凝集性が所望の程度であれば小さな粒径（０．１５μｍ未満）を選択することも可能である。また、抗体の担持量によりラテックスの凝集性を調整することも可能である。すなわち、ラテックスが同一の粒径であれば、抗体の担持量が多い方が標的抗原に対する反応性は向上するが、測定範囲が狭まる傾向がある。抗体担持量の少ないラテックスの作製は、化学結合法に依ることが好ましい。
上述したように、ラテックス粒子以外の不溶性担体粒子として、シリカコロイド粒子、磁性粒子、金属コロイド粒子等が挙げられる。これらの不溶性担体粒子には、物理吸着又は化学結合に適した官能基を付加する粒子表面の改質を行うことにより、本発明において用いることが可能な不溶性担体粒子とすることが可能である。
ラテックス等の不溶性担体粒子の含有液には、必要に応じて不溶性担体粒子以外の成分、例えば、各種電解質、緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、増感剤等が含有されていてもよい。
（２）不溶性担体粒子への担持工程
（ア）担持抗体
不溶性担体粒子に対して担持させる抗体は、標的抗原に対して結合する抗体であり、標的抗原の種類、抗体のタイプ、サブタイプ、抗体分子の一部が用いられる結合性断片としての態様については、前述した通りである。
（ア）担持抗体
不溶性担体粒子に対して担持させる抗体は、標的抗原に対して結合する抗体であり、標的抗原の種類、抗体のタイプ、サブタイプ、抗体分子の一部が用いられる結合性断片としての態様については、前述した通りである。
本発明における標的抗原に対する抗体の製造方法は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であっても、それぞれ常法に従って行うことが可能であり、免疫原は、標的抗原の全部又は一部、さらにその改変物である。当該免疫原は、天然に存在する成分（蛋白質、ペプチド、糖鎖、脂質等）であっても、組換え蛋白質であっても、化学合成ペプチドであっても良い。アミノ酸配列等が天然物の標的抗原から改変された改変物は、標的抗原に対するモノクローナル抗体を製造するための標的抗原となる限り許容される。また、必要に応じて免疫原性の向上のためにハプテンを用いることも可能である。ハプテンとしては、通常はハプテンとして用いられ得る物質を任意に選択することが可能であり、例えば、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等をハプテンとして選択することができる。
免疫は一般的方法により、例えば、上記免疫原を、免疫の対象とする動物に静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等で投与することにより行うことができる。
このように免疫を行って得られた抗血清として、ポリクローナル抗体を得ることができる。ポリクローナル抗体は市販品を用いることも可能である。
所望の標的抗原に対するモノクローナル抗体は、上記のように免疫した動物の免疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作出し、これにより標的抗原を認識する抗体を産生するクローンを選択し、このクローンを培養することにより製造することができる。
また、免疫される動物は特に限定されるものではなく、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ等を広く用いることができるが、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが望ましい。さらに、免疫される動物として、遺伝子組換え動物を用いることも可能である。遺伝子組換え動物は、特に、抗体の由来としてヒトを選択する場合に有用である。具体的には、ヒト抗体遺伝子導入マウス等を選択して、ヒト抗体からなるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製することができる。
このようにして得られるモノクローナル抗体は、標的抗原に特異的に結合する抗体である。なお、本発明においては、モノクローナル抗体の市販品を用いることも可能であることは、上述した通りである。
（イ）抗原の担持工程
抗原の不溶性担体粒子への担持は、物理吸着法、化学結合法、それぞれ常法に従って行うことができる。
抗原の不溶性担体粒子への担持は、物理吸着法、化学結合法、それぞれ常法に従って行うことができる。
物理吸着法は、例えば、０．１−１質量％程度で不溶性担体粒子を含有する含有液を、担持しようとする抗体と混合し、不溶性担体粒子に当該モノクローナル抗体を担持させることができる。さらに遠心分離を用いて未吸着の抗体と、抗体担持担体粒子を分け、水性溶媒中に再分散させることにより、物理吸着粒子の含有液を作製することができる。
化学結合法は、不溶性担体粒子表面の官能基を利用し、担持しようとするモノクローナル抗体を共有結合で結合する。例えば、不溶性担体粒子表面の官能基が、カルボキシル基、水酸基、アミノ基の場合は、それぞれ、カルボジイミド、ブロムシアン、グルタルアルデヒドを活性剤として利用することでモノクローナル抗体を不溶性担体粒子表面に共有結合させることが可能である。活性化剤で事前に不溶性担体粒子表面の官能基を活性化させてからモノクローナル抗体と接触させることも可能であり、活性化剤とモノクローナル抗体を同時に不溶性担体粒子と接触させてもよい。不溶性担体粒子表面の官能基が、アルデヒド基、トシル基である場合には、活性剤を用いる必要がない。さらに、不溶性担体粒子とモノクローナル抗体の間に、オリゴアミノ酸やアミノカルボン酸等のスペーサー分子を入れて共有結合を行うことも可能である。
このようにして、物理吸着粒子と化学結合粒子を作製することができる。物理吸着粒子と化学結合粒子は、水性溶媒中で不溶性担体粒子の含有液として保存される。
（３）本発明の含有液の作製
本発明の含有液は、上記の物理吸着粒子の含有液と、化学結合粒子の含有液を混合することにより作製できる。
本発明の含有液は、上記の物理吸着粒子の含有液と、化学結合粒子の含有液を混合することにより作製できる。
本発明の含有液中における、それぞれの抗体担持担体粒子の含有比（質量比）は、所望する測定範囲と反応性によっても異なるが、好適には１０：１−１：１０（物理吸着粒子：化学結合粒子）、さらに好適には５：１−１：５（物理結合粒子：化学結合粒子）、最も好適には３：１−１：３（物理結合粒子：化学結合粒子）である。
本発明の含有液には、必要に応じて、例えば、各種電解質、緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、増感剤等が含有されていてもよいことは、前述した通りである。
（４）本発明の測定用試薬
本発明の含有液は、本発明の測定用試薬として使用される。
本発明の含有液は、本発明の測定用試薬として使用される。
２．抗体による測定
本発明の測定方法では、上述した本発明の含有液を用いて標的抗原の測定を行う。すなわち、本発明の含有液を、標的抗原を含有し得る検体と接触させて、当該含有液の不溶性担体粒子に担持された抗体と、検体中の標的抗原との抗原抗体反応による当該微粒子の凝集反応を検出することができる。
本発明の測定方法では、上述した本発明の含有液を用いて標的抗原の測定を行う。すなわち、本発明の含有液を、標的抗原を含有し得る検体と接触させて、当該含有液の不溶性担体粒子に担持された抗体と、検体中の標的抗原との抗原抗体反応による当該微粒子の凝集反応を検出することができる。
「標的抗原を含有し得る検体」は、被測定抗体を含有する可能性があるものであれば特に限定されないことは、前述の通りである。
３．本発明のキット
本発明のキットは、本発明の測定方法を行うための測定用キットであり、本発明の含有液を構成要素として含むものである。
本発明のキットは、本発明の測定方法を行うための測定用キットであり、本発明の含有液を構成要素として含むものである。
本発明の含有液以外の本発明のキットにおける構成要素としては、例えば、測定対象となる標的抗原の標準品、精度管理用試料、希釈液等が挙げられる。希釈液は、本発明の含有液を希釈して測定を行うための液体であり、標的抗原の測定を実質的に阻害しない限り、特に限定されない。希釈液には、例えば、各種電解質、緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、増感剤等が含有されていてもよい。
本発明の含有液と同様、希釈液は、緩衝液を基礎とした水性液体が典型的である。本発明の含有液が、緩衝液を基礎とした分散液である場合、希釈液において、含有液の緩衝液と同一または類似の緩衝液を用いることが好ましい。
後述する実施例においては、用時希釈液である第１試薬が上記の希釈液であり、ラテックス分散液である第２試薬が本発明の含有液である。これらの第１試薬と第２試薬を構成要素として含むものが、本発明のキットの具体例の一つである。
以下、本発明の実施例を記載する。％は、特に断らない限り質量／容量％である。例えば、化学結合ラテックス濃度０．１１０％、物理吸着ラテックス濃度０．０３０％の場合、溶液１０００ｍＬ当たり、化学結合粒子１．１０ｇ、物理吸着粒子０．３ｇを含む。
また、「表１−９の反応性の単位」と「図１−９の縦軸の単位」は、吸光度変化量（Ｄａｂｓ）を１００００倍したものである。
［製造例］
１．ラテックス
本実施例において用いたラテックスは下記の通りである。ここに示した粒径表示は、上記の記載に合わせてμｍ単位であるが、本実施例における粒径表示はｎｍ単位を用いている。
１．ラテックス
本実施例において用いたラテックスは下記の通りである。ここに示した粒径表示は、上記の記載に合わせてμｍ単位であるが、本実施例における粒径表示はｎｍ単位を用いている。
（１）物理吸着法を行うラテックス
・０．０８２μｍポリスチレンラテックス（高親水性、以下、物理ラテックス１という）
・０．０８５μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス２という）
・０．１０６μｍポリスチレンラテックス（高親水性、以下、物理ラテックス３という）
・０．１１１μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス４という）
・０．１２５μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス５という）
・０．１２５μｍポリスチレンラテックス（高親水性、以下、物理ラテックス６という）
・０．２００μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス７という）
・０．２０４μｍポリスチレンラテックス（高親水性、以下、物理ラテックス８という）
・０．２４０μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス９という）
・０．２９９μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス１０という）
・０．３４０μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス１１という）
・０．０８２μｍポリスチレンラテックス（高親水性、以下、物理ラテックス１という）
・０．０８５μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス２という）
・０．１０６μｍポリスチレンラテックス（高親水性、以下、物理ラテックス３という）
・０．１１１μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス４という）
・０．１２５μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス５という）
・０．１２５μｍポリスチレンラテックス（高親水性、以下、物理ラテックス６という）
・０．２００μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス７という）
・０．２０４μｍポリスチレンラテックス（高親水性、以下、物理ラテックス８という）
・０．２４０μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス９という）
・０．２９９μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス１０という）
・０．３４０μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス１１という）
（２）化学結合法を行うラテックス
・０．０７９μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス１という）
・０．１６４μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス２という）
・０．２３６μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス３という）
・０．２６０μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス４という）
・０．３０８μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス５という）
・０．０７９μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス１という）
・０．１６４μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス２という）
・０．２３６μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス３という）
・０．２６０μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス４という）
・０．３０８μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス５という）
２．使用した抗体
（１）担持モノクローナル抗体
抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体：前述したモノクローナル抗体の製造方法に準じて作製した。すなわち、マウスを免疫対象動物として、ヒトＣＲＰで免疫を行い、当該ヒトＣＲＰ免疫マウスのＢ細胞とマウスミエローマ細胞を融合したハイブリドーマを作製し、限界希釈法によるクローニングで樹立した当該ハイブリドーマをマウス腹腔に投与して腹水化を行った。得られた腹水を回収して、遠心分離を行い、不溶物を除去後、さらに硫安沈殿を行い、抗体を回収し、その後、ＱＡＥカラムにて当該抗体の精製を行って、所望の抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体を得た。
（１）担持モノクローナル抗体
抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体：前述したモノクローナル抗体の製造方法に準じて作製した。すなわち、マウスを免疫対象動物として、ヒトＣＲＰで免疫を行い、当該ヒトＣＲＰ免疫マウスのＢ細胞とマウスミエローマ細胞を融合したハイブリドーマを作製し、限界希釈法によるクローニングで樹立した当該ハイブリドーマをマウス腹腔に投与して腹水化を行った。得られた腹水を回収して、遠心分離を行い、不溶物を除去後、さらに硫安沈殿を行い、抗体を回収し、その後、ＱＡＥカラムにて当該抗体の精製を行って、所望の抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体を得た。
（２）比較用ポリクローナル抗体： 抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体（株式会社日本バイオテスト研究所製）を用いた。
３．ラテックスの担持工程
（１）物理吸着法による担持
１０ｍｇ／ｍＬの上記の抗体の０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）溶液の所定量を、精製水で全量２．０ｍＬに希釈した後、前記希釈溶液に０．２５％ポリスチレンラテックス溶液１６ｍＬを混合した。混合液を室温で１０分間攪拌した後、１０％ＢＳＡ溶液の所定量を添加し精製水で全量を２０ｍＬとした。さらに、５６℃で４時間加熱処理した後、遠心分離で未吸着抗体を除去した。遠心分離にて未吸着抗体を除去したラテックスを０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に再分散させ、１０％ＢＳＡ０．４ｍＬを添加し、同緩衝液で全量８．０ｍＬとした後、５６℃で２時間加熱した。加熱後の抗体吸着ラテックス含有液を濾過し、ラテックス濃度０．５％の物理吸着ラテックスを作製した。
（１）物理吸着法による担持
１０ｍｇ／ｍＬの上記の抗体の０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）溶液の所定量を、精製水で全量２．０ｍＬに希釈した後、前記希釈溶液に０．２５％ポリスチレンラテックス溶液１６ｍＬを混合した。混合液を室温で１０分間攪拌した後、１０％ＢＳＡ溶液の所定量を添加し精製水で全量を２０ｍＬとした。さらに、５６℃で４時間加熱処理した後、遠心分離で未吸着抗体を除去した。遠心分離にて未吸着抗体を除去したラテックスを０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に再分散させ、１０％ＢＳＡ０．４ｍＬを添加し、同緩衝液で全量８．０ｍＬとした後、５６℃で２時間加熱した。加熱後の抗体吸着ラテックス含有液を濾過し、ラテックス濃度０．５％の物理吸着ラテックスを作製した。
遠心分離による未吸着抗原除去後にラテックスの再分散に用いる０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の容量を適宜変更することにより、作製する物理吸着ラテックスの濃度を適宜調整することができる（化学結合についても同様）。
（２）化学結合法による担持
５．３％カルボキシラテックス含有液０．９４３ｍＬを精製水で全量１．１１ｍＬに希釈した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩をカルボキシル基の１モル等量添加し、１５分攪拌反応させカルボキシル基を活性化した。カルボキシル基を活性化させたラテックス含有液に、０．５Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．６）２．０ｍＬ及び精製水の所定量を添加した後、１０ｍｇ／ｍＬの上記の抗体の０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）溶液の所定量を添加し、室温で４時間反応させた。反応終了後、１０％ＢＳＡ溶液０．７２ｍＬを添加し、更に室温で１時間反応させた後、５６℃で４時間加熱処理した。遠心分離にて未結合抗体を除去したラテックスを０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に再分散させ、１０％ＢＳＡ溶液０．２５ｍＬを添加し、「５６℃で４時間加熱処理」した。加熱後の抗体結合ラテックス含有液を濾過し、ラテックス濃度１．０％の化学結合ラテックスを作製した。
５．３％カルボキシラテックス含有液０．９４３ｍＬを精製水で全量１．１１ｍＬに希釈した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩をカルボキシル基の１モル等量添加し、１５分攪拌反応させカルボキシル基を活性化した。カルボキシル基を活性化させたラテックス含有液に、０．５Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．６）２．０ｍＬ及び精製水の所定量を添加した後、１０ｍｇ／ｍＬの上記の抗体の０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）溶液の所定量を添加し、室温で４時間反応させた。反応終了後、１０％ＢＳＡ溶液０．７２ｍＬを添加し、更に室温で１時間反応させた後、５６℃で４時間加熱処理した。遠心分離にて未結合抗体を除去したラテックスを０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に再分散させ、１０％ＢＳＡ溶液０．２５ｍＬを添加し、「５６℃で４時間加熱処理」した。加熱後の抗体結合ラテックス含有液を濾過し、ラテックス濃度１．０％の化学結合ラテックスを作製した。
（３）ラテックス分散液の調製
２．０Ｍ ＬｉＣｌ、０．７６Ｍ又は１．１４Ｍ Ｌ−アルギニン塩酸塩及び０．２％ＮａＮ3を含む０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）２．５ｍＬに、前記（１）で調製した所定容量の物理吸着ラテックス及び前記（２）で調製した所定容量の化学結合ラテックスを添加し、精製水にて全量５．０ｍＬとして、物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスを所定比率で含むラテックス分散液を調製した。
２．０Ｍ ＬｉＣｌ、０．７６Ｍ又は１．１４Ｍ Ｌ−アルギニン塩酸塩及び０．２％ＮａＮ3を含む０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）２．５ｍＬに、前記（１）で調製した所定容量の物理吸着ラテックス及び前記（２）で調製した所定容量の化学結合ラテックスを添加し、精製水にて全量５．０ｍＬとして、物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスを所定比率で含むラテックス分散液を調製した。
物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスの添加量を適宜選択することで、種々の混合比率とすることができる。
４．測定系
本実施例における測定は、濁度法を用いて行った。
本実施例における測定は、濁度法を用いて行った。
第１試薬は、用時希釈液であって、０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、１．０Ｍ ＬｉＣｌ、０．２５Ｍ Ｎａ2ＳＯ3、０．３８Ｍ又は０．５７Ｍ Ｌ−Ａｒｇ・ＨＣｌ、０．１％ ＮａＮ3 ｐＨ７．４、残量は精製水である。
第２試薬は、ラテックス分散液であって、０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、１．０Ｍ ＬｉＣｌ、０．３８Ｍ Ｌ−Ａｒｇ・ＨＣｌ、０．１％ ＮａＮ3、Ｌａｔｅｘ所定量 ｐＨ７．４、残量は精製水である（参考例２（１）、実施例１（１）、実施例２を除く）。
測定は、ＴＢＡ−１２０ＦＲ（東芝メディカルシステムズ社製）を用いて行った。
試料は、ヒトＣＲＰ（ロッシュ社製）を、ヒトＣＲＰが存在しない血清で倍々希釈を行ったものを用いた。
なお、以下に言及する図と表における「ＣＲＰ」は、「ヒトＣＲＰ」を意味している。また、「ヤギ抗体」とは、「抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体」を意味している。
［参考例１］ 物理吸着法でモノクローナル抗体を担持したラテックスについての検討
（１）粒径が８２−１２５ｎｍの小粒径ラテックス及び粒径が２００−２０４ｎｍの大粒径ラテックスにおける検討
抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体を１．２５ｍｇ／ｍ2で担持させた物理ラテックス１−８を用いた測定系における、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表１、図１）。なお、第２試薬のラテックスの含有量は０．１％である。表１中の「＋」は、ラテックスの親水性の程度を示し、＋数が多いほど親水性である。
（１）粒径が８２−１２５ｎｍの小粒径ラテックス及び粒径が２００−２０４ｎｍの大粒径ラテックスにおける検討
抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体を１．２５ｍｇ／ｍ2で担持させた物理ラテックス１−８を用いた測定系における、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表１、図１）。なお、第２試薬のラテックスの含有量は０．１％である。表１中の「＋」は、ラテックスの親水性の程度を示し、＋数が多いほど親水性である。
物理吸着法単独で、ラテックスの粒径（８２ｎｍ−２０４ｎｍ）と親水性を試したいずれの例も、低濃度領域で一気に吸光度が上昇して、最大２０００Ｄａｂｓ程度で頭打ちになってしまった。従って、低濃度から高濃度までの広い測定範囲でのヒトＣＲＰの定量的な測定はできず、低濃度域のみの定量測定のみが可能であることが明らかになった。
（２）粒径が２００ｎｍ−３４０ｎｍの大粒径ラテックスにおける検討
抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体を１．７５ｍｇ／ｍ2で担持させた物理ラテックス７、物理ラテックス９−１１を用いた測定系における、ヒトＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表２、図２）。なお、第２試薬のラテックスの含有量は０．１％である。
抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体を１．７５ｍｇ／ｍ2で担持させた物理ラテックス７、物理ラテックス９−１１を用いた測定系における、ヒトＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表２、図２）。なお、第２試薬のラテックスの含有量は０．１％である。
物理吸着法単独で、ラテックスの粒径（２００ｎｍ−３４０ｎｍ）を試したいずれの例も、上記（１）と実質的には同様の結果が認められた。従って、上記（１）と併せて、粒径に依らず、物理吸着ラテックス単独では十分に広い測定範囲を確保できないことが確認された。
（３）大粒径ラテックスを用いた担持抗体量についての検討
大粒径ラテックス（物理ラテックス７）に対して、抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持量を０．２５−２ｍｇ／ｍ2の範囲で変化させた測定系における、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表３、図３）。なお、第２試薬のラテックスの含有量は０．１％である。
大粒径ラテックス（物理ラテックス７）に対して、抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持量を０．２５−２ｍｇ／ｍ2の範囲で変化させた測定系における、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表３、図３）。なお、第２試薬のラテックスの含有量は０．１％である。
物理吸着法単独の場合、担持抗体量が少ないほど定量可能範囲は広くなるが、担持抗体量減量に伴い反応性も低下することが明らかになった。
（４）小粒径ラテックスを用いた担持抗体量についての検討
小粒径ラテックス（物理ラテックス１）に対して、抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の物理吸着に依る担持量を０．２−１．２ｍｇ／ｍ2の範囲で変化させた測定系における、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表４−１、図４）。比較のために、抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体を物理ラテックス１に１．０６ｍｇ／ｍ2を、物理吸着に依り担持させた例の検証も行った（表４−２、図４）。なお、本例における第２試薬のラテックスの含有量は、この比較系を含めて０．２５％である。
小粒径ラテックス（物理ラテックス１）に対して、抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の物理吸着に依る担持量を０．２−１．２ｍｇ／ｍ2の範囲で変化させた測定系における、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表４−１、図４）。比較のために、抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体を物理ラテックス１に１．０６ｍｇ／ｍ2を、物理吸着に依り担持させた例の検証も行った（表４−２、図４）。なお、本例における第２試薬のラテックスの含有量は、この比較系を含めて０．２５％である。
得られた結果は、大粒径ラテックスを用いた上記（３）と実質的に同様であった。これに比べて抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体の系は、反応性と定量可能範囲の広さ、共に、比較的中低濃度領域において良好であった。
（５）小粒径と大粒径のラテックスを混合した場合の検討
物理吸着法に依る小粒径ラテックス（物理ラテックス１）と大粒径ラテックス（物理ラテックス７）とを、０．１２５％の物理ラテックス１と、０．０５％の物理ラテックス７を含有する第２試薬を用いた測定系において、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表５、図５）。なお、大粒径ラテックスの抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持量は、１．７５ｍｇ／ｍ2であり、小粒径ラテックスの当該担持量は０．２０−１．２０ｍｇ／ｍ2の間で変化させた。比較のために、抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体を１．０６ｍｇ／ｍ2で、小粒径ラテックス（物理ラテックス１）に、物理吸着法で担持させた例（第２試薬中のラテックス濃度は０．１５％）の検証も併せて行った。
物理吸着法に依る小粒径ラテックス（物理ラテックス１）と大粒径ラテックス（物理ラテックス７）とを、０．１２５％の物理ラテックス１と、０．０５％の物理ラテックス７を含有する第２試薬を用いた測定系において、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表５、図５）。なお、大粒径ラテックスの抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持量は、１．７５ｍｇ／ｍ2であり、小粒径ラテックスの当該担持量は０．２０−１．２０ｍｇ／ｍ2の間で変化させた。比較のために、抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体を１．０６ｍｇ／ｍ2で、小粒径ラテックス（物理ラテックス１）に、物理吸着法で担持させた例（第２試薬中のラテックス濃度は０．１５％）の検証も併せて行った。
得られた結果は、上記（４）と同様であった。抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体を用いた例は、検出反応性、測定範囲の広さ、共に良好であったが、抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体担持の場合は、小粒子と大粒子の混合系においても十分な測定範囲が得られなかった。
［参考例２］ 化学結合法でモノクローナル抗体を担持したラテックスについての検討
（１）大粒径のラテックスにおける検討
抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持量が２．５ｍｇ／ｍ2の４種の大粒径のラテックス（化学ラテックス２−５）を用いた測定系において、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表６、図６−１（２．００ｍｇ／ｄＬまでの低濃度領域の抜粋拡大図）、図６−２（１００ｍｇ／ｄＬまでの濃度領域））。比較のために、抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持量が１．７５ｍｇ／ｍ2の物理ラテックス７を用いた測定系を用いた。
（１）大粒径のラテックスにおける検討
抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持量が２．５ｍｇ／ｍ2の４種の大粒径のラテックス（化学ラテックス２−５）を用いた測定系において、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表６、図６−１（２．００ｍｇ／ｄＬまでの低濃度領域の抜粋拡大図）、図６−２（１００ｍｇ／ｄＬまでの濃度領域））。比較のために、抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持量が１．７５ｍｇ／ｍ2の物理ラテックス７を用いた測定系を用いた。
なお、この例において用いられた第２試薬（ラテックス分散液）は、０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、１．０Ｍ ＬｉＣｌ、０．３８Ｍ Ｌ−Ａｒｇ・ＨＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１％ ＮａＮ3、０．０２５％Ｌａｔｅｘ ｐＨ７．４、であり、残量は精製水である。
いずれの例も、ＣＲＰが低濃度領域における反応性は良好であったが、高濃度領域を含めた広い測定範囲は認められなかった。
（２）小粒径のラテックスにおける検討
抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体を０．３００、０．３２５、０．３５０、０．４００ｍｇ／ｍ2で担持した化学ラテックス１を用いた４種の測定系において、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表７−１、図７）。比較のために、抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体を１．０６ｍｇ／ｍ2で、小粒径ラテックス（物理ラテックス１）に、物理吸着法で担持させた例の検証も併せて行った（表７−２、図７）。なお、本例における第２試薬のラテックスの含有量は、この比較系を含めて０．１５％である。
抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体を０．３００、０．３２５、０．３５０、０．４００ｍｇ／ｍ2で担持した化学ラテックス１を用いた４種の測定系において、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表７−１、図７）。比較のために、抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体を１．０６ｍｇ／ｍ2で、小粒径ラテックス（物理ラテックス１）に、物理吸着法で担持させた例の検証も併せて行った（表７−２、図７）。なお、本例における第２試薬のラテックスの含有量は、この比較系を含めて０．１５％である。
化学結合では、高いプロゾーン性能を有する小粒径ラテックスを作製可能であるが、低濃度領域の反応性が低いことが明らかになった。また、抗体の担持量に応じて反応性が向上し、抗体担持量により反応性を調製できることが確認された。
［実施例１］ 物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスの混合系の検討
（１）化学結合単独系との比較検討
化学結合ラテックスは、抗体を担持する際の仕上げの加熱時間（上記３（２）の「５６℃で４時間加熱処理」の「４時間」が該当する）の長短が、標的抗原に対する反応性が異なることが知られている。本例では、当該加熱時間を原則の４時間の他、６時間及び８時間の系を設定し、当該加熱時間の相違により異なる反応性を有する化学結合ラテックス（化学ラテックス１に担持）単独（表８−１、図８−１）と、当該化学結合ラテックスと物理吸着ラテックスを組み合わせて用いた場合の相違を検討した（表８−１、図８−２）。ここで用いた物理吸着ラテックスは、物理ラテックス７に対して、抗体の担持量を１．５ｍｇ／ｍ2として吸着させたものである。ここで用いられた化学結合ラテックスの抗体結合量、結合ｐＨ、仕上げの加熱温度、当該加熱時間、各系のラテックスの第２試薬中の濃度は、表８−１に示した通りである。
（１）化学結合単独系との比較検討
化学結合ラテックスは、抗体を担持する際の仕上げの加熱時間（上記３（２）の「５６℃で４時間加熱処理」の「４時間」が該当する）の長短が、標的抗原に対する反応性が異なることが知られている。本例では、当該加熱時間を原則の４時間の他、６時間及び８時間の系を設定し、当該加熱時間の相違により異なる反応性を有する化学結合ラテックス（化学ラテックス１に担持）単独（表８−１、図８−１）と、当該化学結合ラテックスと物理吸着ラテックスを組み合わせて用いた場合の相違を検討した（表８−１、図８−２）。ここで用いた物理吸着ラテックスは、物理ラテックス７に対して、抗体の担持量を１．５ｍｇ／ｍ2として吸着させたものである。ここで用いられた化学結合ラテックスの抗体結合量、結合ｐＨ、仕上げの加熱温度、当該加熱時間、各系のラテックスの第２試薬中の濃度は、表８−１に示した通りである。
さらに比較のために、抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体を１．０６ｍｇ／ｍ2担持した小粒径の物理ラテックス（物理ラテックス１）（第２試薬中０．１２５％）と抗ヒトＣＲＰマウスポリクローナル抗体を１．５ｍｇ／ｍ2担持した大粒径の物理ラテックス（物理ラテックス７）（第２試薬中０．０３５％）の混合系における反応性を検討した（表８−２、図８−３）。
なお、この実施例１（１）において用いられた第２試薬（ラテックス分散液）は、０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、１．０Ｍ ＬｉＣｌ、０．５７Ｍ Ｌ−Ａｒｇ・ＨＣｌ、０．１％ ＮａＮ3、所定量のＬａｔｅｘ ｐＨ７．４、であり、残量は精製水である。
化学結合ラテックス単独の系では、仕上げの加熱時間を４時間から８時間まで延長することにより、反応性が低下したが、物理・化学ラテックス混合系では、化学結合ラテックス自体の反応性の差異が吸収され、系同士の反応性の差異が縮小した。しかも、化学結合ラテックス単独の系との比較のみならず、モノクローナル抗体を用いた大粒径物理吸着ラテックスとモノクローナル抗体を用いた小粒径化学結合ラテックスの混合系は、モノクローナル抗体を用いた大粒径物理吸着ラテックスとポリクローナル抗体を用いた小粒径物理吸着ラテックスの混合系よりも、低濃度領域での検出感度が高く、広い測定範囲であった。
（２）物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスの混合比率の検討
物理ラテックス７に対して、抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持（担持量：１．５ｍｇ／ｍ2）を行い、物理吸着ラテックスとし、かつ、化学ラテックス１に対して所定の抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持（担持量：０．４ｍｇ／ｍ2）を行い、化学結合ラテックスとした。
物理ラテックス７に対して、抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持（担持量：１．５ｍｇ／ｍ2）を行い、物理吸着ラテックスとし、かつ、化学ラテックス１に対して所定の抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持（担持量：０．４ｍｇ／ｍ2）を行い、化学結合ラテックスとした。
(ア) 化学結合ラテックス濃度を第２試薬中０．１１０％に固定して、物理吸着ラテックス濃度を同０．０３０−０．０５０％とした場合の測定系における、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表９−１、図９−１）。
(イ) 物理吸着ラテックス濃度を第２試薬中０．０４０％に固定して、化学結合ラテックス濃度を同０．１１０−０．１４０％とした場合の測定系における、ＣＲＰ濃度範囲が１００ｍｇ／ｄＬまでの５７２／８０４ｎｍでの吸光度の変化を検証した（表９−２、図９−２）。
検討された物理・化学ラテックス混合系は、いずれも低濃度での高い検出感度が認められ、高濃度での優れたプロゾーン性能が認められた。また、大粒径と小粒径の混合比率を調整することにより、感度域における反応性や高濃度域の測定範囲を調整できることが分かった。
［実施例２］ ＣＲＰ相関性
モノクローナル抗体を担持した物理・化学ラテックス混合系と、抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体を１．０６ｍｇ／ｍ2担持した小粒径の物理ラテックス（物理ラテックス１）（第２試薬中０．１２５％）と抗ヒトＣＲＰマウスポリクローナル抗体を１．５ｍｇ／ｍ2担持した大粒径の物理ラテックス（物理ラテックス７）（第２試薬中０．０３５％）の混合系との相関性の検討を行い、モノクローナル抗体を担持した物理・化学ラテックス混合系の特異性を確認した。
モノクローナル抗体を担持した物理・化学ラテックス混合系と、抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体を１．０６ｍｇ／ｍ2担持した小粒径の物理ラテックス（物理ラテックス１）（第２試薬中０．１２５％）と抗ヒトＣＲＰマウスポリクローナル抗体を１．５ｍｇ／ｍ2担持した大粒径の物理ラテックス（物理ラテックス７）（第２試薬中０．０３５％）の混合系との相関性の検討を行い、モノクローナル抗体を担持した物理・化学ラテックス混合系の特異性を確認した。
物理・化学ラテックス混合系における物理吸着ラテックスは「物理ラテックス７」を用い、抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体の担持量を１．５ｍｇ／ｍ2として吸着させたものである。また当該ラテックス混合系における化学結合ラテックスは「化学ラテックス１」を用い、抗体担持量は０．４０ｍｇ／ｍ2、仕上げの加熱温度は５６℃、加熱時間は８時間である。また、当該ラテックス混合系第２試薬における物理吸着ラテックス濃度は０．０４％であり、化学結合ラテックス濃度は０．１１０％である。
なお、この実施例２の物理・化学混合系において用いられた第２試薬（ラテックス分散液）は、０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、１．０Ｍ ＬｉＣｌ、０．５７Ｍ Ｌ−Ａｒｇ・ＨＣｌ、０．１％ ＮａＮ3、所定量のＬａｔｅｘ ｐＨ７．４、であり、残量は精製水である。
検体は、ヒト血清検体５０例を用いた。
結果を表１０と図１０に示す。個々の検体における具体的な測定値は表１０に示した。図１０は、表１０に示された結果をプロットして得た相関図であり、横軸が上記対照系を用いた比較例において得られた測定値（ｍｇ／ｄＬ）であり、縦軸が物理・化学混合系において得られた測定値（ｍｇ／ｄＬ）である。
この結果より、本発明の物理・化学混合系のヒトＣＲＰの低濃度領域における測定値は、対照品の測定値と、ほぼ傾き１の正の相関を示すことが明らかになった。
Claims (13)
- 物理吸着により所定の標的抗原に対する抗体が担持された不溶性担体粒子、及び、化学結合により当該標的抗原に対する抗体が担持された不溶性担体粒子、の双方を含有する不溶性担体粒子の含有液を、前記標的抗原を含有し得る検体と接触させて、前記不溶性担体粒子に担持された抗体と、前記検体中の標的抗原との抗原抗体反応による前記不溶性担体粒子の凝集反応を検出して、前記標的抗原を測定することを特徴とする、抗原測定方法。
- 化学結合により不溶性担体粒子に担持された抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の抗原測定方法。
- 物理吸着により不溶性担体粒子に担持された抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗原測定方法。
- 不溶性担体粒子は、ラテックス粒子であることを特徴とする、請求項１−３のいずれか１項に記載の抗原測定方法。
- 標的抗原は、多価抗原であることを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項に記載の抗原測定方法。
- 標的抗原は、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）であることを特徴とする、請求項１−５のいずれか１項に記載の抗原測定方法。
- 検体中の所定の標的抗原との抗原抗体反応による不溶性担体粒子の凝集反応を検出する、抗原の測定用試薬であって、物理吸着により前記所定の標的抗原に対する抗体が担持された不溶性担体粒子、及び、化学結合により前記所定の標的抗原に対する抗体が担持された不溶性担体粒子、の双方を含有する不溶性担体粒子の含有液であることを特徴とする、抗原の測定用試薬。
- 化学結合により不溶性担体粒子に担持された抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項７に記載の測定用試薬。
- 物理吸着により不溶性担体粒子に担持された抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項８に記載の測定用試薬。
- 不溶性担体粒子は、ラテックス粒子であることを特徴とする、請求項７−９のいずれか１項に記載の測定用試薬。
- 標的抗原は、多価抗原であることを特徴とする、請求項７−１０のいずれか１項に記載の測定用試薬。
- 標的抗原は、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）であることを特徴とする、請求項７−１１のいずれか１項に記載の測定用試薬。
- 請求項７−１２のいずれか１項に記載の測定用試薬及び希釈液を含むことを特徴とする、測定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017060874A JP6890444B2 (ja) | 2017-03-27 | 2017-03-27 | 異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017060874A JP6890444B2 (ja) | 2017-03-27 | 2017-03-27 | 異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018163064A JP2018163064A (ja) | 2018-10-18 |
| JP6890444B2 true JP6890444B2 (ja) | 2021-06-18 |
Family
ID=63859252
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017060874A Active JP6890444B2 (ja) | 2017-03-27 | 2017-03-27 | 異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6890444B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3872166A4 (en) * | 2018-10-25 | 2022-09-14 | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. | CELL COLLECTION METHOD |
| CN112798794B (zh) * | 2020-12-30 | 2023-11-17 | 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 | 一种α1酸性糖蛋白检测试剂盒 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5786188B2 (ja) * | 2010-06-08 | 2015-09-30 | 株式会社シノテスト | 試料中のｃ反応性蛋白質の測定試薬、測定方法及び測定範囲の拡大方法 |
| JP6192018B2 (ja) * | 2012-11-06 | 2017-09-06 | 国立大学法人群馬大学 | 三日熱マラリアと熱帯熱マラリアの双方を検出するペプチドおよび抗体検査材料 |
-
2017
- 2017-03-27 JP JP2017060874A patent/JP6890444B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2018163064A (ja) | 2018-10-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6532594B2 (ja) | 生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット及び生体試料中の測定対象物質を定量する方法 | |
| JPS60256057A (ja) | 免疫学的測定法 | |
| US10883986B2 (en) | Kit for quantitatively determining bile acid in biological sample, and method for quantitatively determining bile acid in biological sample | |
| JPH06317589A (ja) | アッセイ干渉を排除したイムノアッセイ法およびキット | |
| EP2322562A1 (en) | Monoclonal antibody, and immunoassay using same | |
| JP2001502795A (ja) | 血液型抗原および抗体の検出に有用な方法および装置 | |
| US20100216257A1 (en) | Method of Assaying Antigen and Reagent Therefor | |
| JP2009098138A (ja) | 高感度免疫測定方法 | |
| JP2677753B2 (ja) | 凝集イムノアッセイ法 | |
| JP6890444B2 (ja) | 異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット | |
| WO2016136863A1 (ja) | Ｌ－ｆａｂｐの免疫学的測定方法及び該方法に用いられる測定試薬 | |
| JP2000221196A (ja) | 免疫測定方法 | |
| TW202246774A (zh) | 免疫學測定方法、免疫學測定用試劑及其套組、非特異性反應抑制方法以及非特異性反應抑制劑 | |
| CA2939789C (en) | Red blood cell detection | |
| JP7254036B2 (ja) | その場段階希釈法 | |
| JP2005512074A (ja) | 血清または血漿存在下でのラテックス微粒子の非特異的集合を低減する方法 | |
| JP7315966B2 (ja) | 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法 | |
| CN117285624B (zh) | 抗犬NT-proBNP双特异性抗体及试剂盒 | |
| US11255849B2 (en) | Kit for quantitatively determining substance to be measured in biological sample | |
| JPH0894620A (ja) | 抗原−抗体反応による微量物質の定量法 | |
| JP3598701B2 (ja) | 不溶性担体を用いた免疫化学的測定方法 | |
| AU2015213838A1 (en) | Crossmatching blood samples | |
| Abdufattoevna et al. | MODERN BASICS OF IMMUNOCHEMICAL REACTIONS | |
| JPH09196921A (ja) | モノクローナル抗体担持不溶性担体及びその調製方法 | |
| JP2000074919A (ja) | 免疫学的測定試薬及び免疫学的測定試薬の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200110 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20201124 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201208 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210127 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210518 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210525 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6890444 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |