JPH0894620A - 抗原−抗体反応による微量物質の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 レート法よりも測定感度及び再現性に優れ
た、エンドポイント法による免疫学的定量法を提供す
る。 【構成】 分析対象物に対する抗体又は抗原により感作
された粒子状の不活性担体を含む水溶液と、分析対象物
を含む試料を、抗原−抗体反応に基づき凝集反応を起こ
させ、該反応混合物に特定波長の光を照射してその吸光
度を測定することにより、試料中の分析対象物濃度を定
量する方法において； (1)凝集反応開始前及び(2)凝集反応完結時の２点の吸光
度を測定することを特徴とする抗原−抗体反応による微
量物質の定量法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原−抗体反応を利用
した微量物質の定量方法に関する。より詳細には凝集反
応に基づく吸光度変化を測定することによる微量物質の
定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】試料中、特に生体成分中の微量物質を検
出及び定量するため、その感度の高さから従来より抗原
−抗体反応が利用され、種々の形態及び形式による測定
法が開発され、広く普及してきた。

【０００３】抗原−抗体反応を物質の定性及び定量に応
用した一つの形式として、凝集反応（agglutination re
action）に基づく方法がある。凝集反応とは、細菌や赤
血球などの比較的大きい物質（粒子状物質）に抗原又は
抗体を感作し、この抗原又は抗体感作担体と抗体又は抗
原を反応させると凝集塊が形成される現象をいう。この
現象を利用し、粒子状物質として赤血球等に代えてカオ
リン、ラテックス、ベントナイトなどを用いた生体成分
中の微量物質の定性及び定量方法が知られている。

【０００４】一般に反応速度がＳ字曲線（いわゆるシグ
モイド型曲線）を示す反応（例えば酵素反応など）にお
いて吸光度変化を指標として物質の定量を行う方法は、
(1)反応が最も急激に進行するＳ字曲線がほぼ直線状と
なる期間中の少なくとも２時点における特定波長の光に
対する吸光度を測定し、その２時点間の吸光度変化量か
ら定量すべき物質の濃度を決定する形式（いわゆるレー
ト法）及び(2)反応が完結しＳ字曲線がほぼプラトーに
達した後の吸光度を測定し、反応開始前と反応完結後の
２時点間の吸光度変化量から分析すべき物質の濃度を決
定する形式（いわゆるエンドポイント法）に分けられ
る。

【０００５】抗原−抗体反応に基づく凝集反応の反応速
度も、いわゆるシグモイド型と呼ばれるＳ字曲線とな
り、上記のような吸光度分析が可能である。

【０００６】レート法による凝集反応に基づく物質の定
量方法としては、例えば特公昭５８−１１５７５号公
報、特公昭６２−４３１３８号公報に記載されている方
法が知られている。これらの方法は、いずれも抗原−抗
体反応開始後少なくとも２時点の吸光度を測定し、その
吸光度の変化から定量すべき物質の濃度を凝集反応の速
度から計算するものである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】現在、一般に普及して
いるのはレート法であり、レート法では、測定精度を改
善するため、抗原−抗体反応を速く進行させるために撹
拌を行い、測定時点数を多くし、秒単位で吸光度測定を
行うなど、測定操作は煩雑となっていた。

【０００８】従来、凝集反応によるエンドポイント法
は、レート法に比べて測定精度及び再現性において劣る
といわれ、また、エンドポイント法は反応完結後に吸光
度を測定するため、レート法に比べ測定時間が長く、よ
り短時間で測定結果を得たいという時代の流れから、こ
れまでエンドポイント法は顧みられず、その測定精度や
再現性を改良しようという試みは行われなかった。

【０００９】本発明は、凝集反応による物質の定量法で
あって、レート法よりも簡便で、且つ測定精度及び再現
性に優れた、エンドポイント法による方法を提供するこ
とを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記理由
により現在まで詳細な検討がなされてこなかった凝集反
応に基づくエンドポイント法による定量法について鋭意
検討を行ったところ、定量すべき物質（以下、「分析対
象物」という）に対する抗体又は抗原を感作（担持）さ
せる粒子状不活性担体の平均粒径及び感作させる抗体又
は抗原の量を調節するこができ、よって、凝集反応によ
り形成される凝集塊が沈降する速度を調節すれば測定精
度及び再現性に優れた微量物質の定量可能となることを
見出し本発明を完成させた。

【００１１】すなわち、本発明は分析対象物に対する抗
体又は抗原により感作された粒子状の不活性担体を含む
水溶液と、分析対象物を含む試料を、抗原−抗体反応に
基づき凝集反応を起こさせ、該反応混合物に特定波長の
光を照射してその吸光度を測定することにより、試料中
の分析対象物濃度を定量する方法において； (1)凝集反応開始前及び(2)凝集反応完結時の２点の吸光
度を測定することを特徴とする抗原−抗体反応による微
量物質の定量法を要旨とする。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おける分析対象物は、広く抗原−抗体反応の抗原又は抗
体となり得るものであり、具体的には下記のものが挙げ
られる。

【００１３】(A)完全抗原 キモトリプシン、ラクテート・デヒドロゲナーゼ（ＬＤ
Ｈ）、アポリポ蛋白とその分画、リポプロテイン
（ａ）、フィブリノゲン（第Ｉ因子）、ヒト血液第ＸII
I因子、プラスミノゲン、α₂−プラスミンインヒビタ
ー、プラスミノゲン・アクチベータインヒビター、プロ
テインＣ、プロテインＳ、異常フィブリノゲン、フィブ
リノペプチドＡ（ＦＰＡ）／Ｂβ_15-42、フィブリン／
フィブリノゲン分解産物（ＦＤＰ）、ＦＤＰ−Ｅ分画、
Ｄダイマー、カルシウム結合蛋白質、α₂−マクログロ
ブリン（α₂Ｍ）、ミオグロビン、ミオシン軽鎖、黄体
形成ホルモン（ＬＨ）、オキシトシン、卵胞刺激ホルモ
ン（ＦＳＨ）、妊娠特異β₁糖蛋白（ＳＰ₁）、ヒト絨毛
性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）及びそのサブユニット、ヒ
ト胎盤ラクトーゲン（ｈＰＬ）等

【００１４】(B)ハプテン 遊離トリヨードサイロニン（ＦＴ₃）、副甲状腺ホルモ
ン（ＰＴＨ）、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン
（ドーパ）、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥ
Ａ）、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（Ｄ
ＨＥＡ−Ｓ）、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、尿
中１７−ケトステロイド（１７−ＫＳ）及びその分画、
エストリオール、プロゲステロン等

【００１５】(C)上記完全抗原又はハプテンに対する抗
体及びそれから誘導されるＦａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ
´）₂分画等を包含する。

【００１６】本発明において分析対象物を含む試料と
は、例えば血液、血清、血漿、尿、体液、唾液または細
胞の抽出液、組織の抽出液等である。

【００１７】本発明において粒子状不活性担体とは、抗
原−抗体反応に対し不活性な粒子であり、測定時に用い
る液体媒体に実質的に不溶であればよく、具体的には、
例えばカオリン、ベントナイト、ポリスチレンラテック
ス、スチレン−ブタジエン共重合体、シリカまたはアル
ミナ等が挙げられ、なかでもポリスチレンラテックスが
取り扱い等の面から好ましい。

【００１８】本発明において粒子状不活性担体に感作さ
せる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗
体でもよいが、測定精度の点から分析対象物に対して特
異性が高いモノクローナル抗体の方が好ましい。これら
の抗体は通常用いられている方法で作製することができ
るが、モノクローナル抗体の調製法については後述す
る。

【００１９】粒子状不活性担体に抗原又は抗体を感作す
るには、抗原又は抗体を物理的に吸着させてもよいし、
化学的に結合させてもよい。物理的吸着及び化学的結合
は、既に数多く提案されている方法により行うことがで
きる。

【００２０】以下、抗原又は抗体を感作（担持）させた
粒子状不活性担体を単に抗体感作担体または抗原感作担
体、若しくはまとめて感作担体ということがある。

【００２１】本発明において、エンドポイント法により
精度及び再現性良く定量を行うためには、粒子状不活性
担体の平均粒径及びこれに感作する抗原又は抗体の量及
び感作された粒子状不活性担体の濃度を調節する必要が
ある。例えば、平均粒径０．０５〜０．９μｍの粒子状
の不活性担体を用いる場合は、０．１〜２０．０重量％
の抗原または不活性担体に感作させることができ、好ま
しくは２．０〜８．０重量％で感作させる。

【００２２】一般に担体粒子の粒径が小さい程、単位容
積当たりに含まれる粒子の個数が多いため、単位容積当
たりに含まれる粒子全体の表面積は大きくなる。そのた
め抗原又は抗体の感作量は多くなり、逆に粒径が大きく
なると抗原又は抗体の感作量は少なくなる。

【００２３】本発明における粒子状不活性担体に対する
抗原又は抗体の感作量は、その感作される抗原又は抗体
の種類によっても異なるが、担体の単位表面積当たり５
×１０^-3〜１５×１０^-4ｍｇ／ｃｍ²とすることが好ま
しい。

【００２４】不活性担体を懸濁させる溶液としては、後
記する希釈安定化液と同一な溶液を用いることができ
る。

【００２５】感作担体の濃度は、有利には凝集反応中の
吸光度を正確に測定できるように選ぶことができ、例え
ば不活性担体としてラテックス粒子を使用する場合に
は、反応混合物中の担体濃度は０．０６〜０．９ｍｇ／
ｍｌとすることが好ましい。

【００２６】上記範囲が好ましい理由は、粒子状の不活
性担体の平均粒径及びこれに感作させる抗原又は抗体の
量が上記範囲内であれば、凝集反応によって生じた凝集
塊が沈降する速度を本発明のエンドポイント法における
好ましい速度に調整できるからである。

【００２７】本発明の定量法における測定を行う時、抗
原又は抗体の希釈列を作成する時又はプロゾーン時の分
析対象物含有溶液を希釈するための希釈安定化液として
は、血清アルブミンを含有するトリス緩衝液、リン酸緩
衝液、トリエタノールアミン緩衝液、ホウ酸緩衝液、グ
リシン緩衝液等を用いることができる。緩衝溶液のｐＨ
は、５．０〜１０．０、好ましくは７．０〜８．５とす
ることができる。血清アルブミンとしては、ウシ血清ア
ルブミン、卵アルブミン、ヤギ血清アルブミン等を挙げ
ることができる。さらに凝集反応は、０〜４０℃の温度
において実施することが好ましく、特に２５〜３７℃の
温度で行うことが有利である。

【００２８】本発明において吸光度を測定するための照
射光の波長は、４００〜１０００ｎｍの近赤外可視領域
であり、好ましくは５５０〜７５０ｎｍ付近である。そ
の理由は、当該波長の範囲では、凝集反応前の抗原又は
抗体感作担体が分散しているときは照射光は透過する
が、抗原−抗体反応により凝集塊が生じると、照射光が
透過できなくなるためである。

【００２９】本発明において抗原−抗体反応完結時は、
分析対象物の種類及び分析対象物に対する抗原又は抗体
を感作した粒子状不活性担体の上記調製条件により変動
し、シグモイド型（Ｓ字型）の曲線がプラトーに達する
前後の、測定に最も好ましい時点を適宜決定すべきであ
る。

【００３０】本発明のエンドポイント法による定量方法
は、反応がほぼ完結するまで吸光度測定を待たなければ
ならないため、レート法に比べて測定に多少時間がかか
る。しかしながら、病院等の検査機関では機器による自
動分析が普及し、試料添加後は分析者の手を煩わすこと
なく分析結果が得られるようになった現在では、レート
法よりも多少時間が多く必要なことが大きな欠点となる
ことは考えられない。むしろ、本発明の定量法によれ
ば、反応開始前の１点と反応終了時の１点の合計２点の
吸光度を測定すればよく、さらに反応開始前の１点は、
(1)分析対象物を含有すると思われる試料を含む希釈安
定化液または(2)感作担体を含む希釈安定化液のいずれ
かで吸光度測定を１度だけ行っておけばよく（いわゆる
通常の光学分析におけるゼロ点補正に該当する）、分析
対象物を含有する試料についての測定では、実質的には
反応終了時の１点のみの吸光度測定を行えば足りる。従
って、本発明のエンドポイント法による定量法はレート
法による定量法よりも測定操作が簡易という点で有利と
いえる。

【００３１】本発明のエンドポイント法は、上述したよ
うに、レート法よりも測定時点数が同じ（２時点）か又
は少ないため、操作が簡単であり、機械による自動分析
においてもその調整が簡易であるという利点をも有す
る。

【００３２】ここで、粒子状の不活性担体に感作される
抗体がモノクローナル抗体である場合のモノクローナル
抗体の調製法について詳述する。本発明で利用するモノ
クローナル抗体は、細胞融合技術分野においてそれ自体
公知の手法を適宜に選択組み合わせてモノクローナル抗
体産生融合細胞株を形成し、該細胞株を利用して産生、
取得することができる。その製法としては、完全抗原を
マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ウシなどの動物に、例
えばアジュバントと共に皮下注射して、該動物を免疫し
た後、この免疫動物の該抗原に対する抗体産生細胞、例
えば脾細胞、胸腺細胞、リンパ節細胞および／または抹
消血細胞等の細胞を採取し、核細胞と自己増殖性を有す
るが抗体産生能を実質的に有しない適当な株化細胞、例
えばマウス骨髄腫株化細胞（ミエローマ細胞）とを、そ
れ自体公知の手法により細胞融合処理する。

【００３３】モノクローナル抗体抗体を得るためのミエ
ローマ細胞と抗体産生細胞との組み合わせは、各細胞が
融合して増殖しつつ抗体を産生することが可能であれ
ば、それぞれの細胞の由来する動物の種類は限定されな
い。

【００３４】使用されるミエローマ細胞は特に限定はな
く、多くのマウス、ラット、ウサギ、ヒトなどの動物の
細胞体を使用することができる。好ましい株化細胞は薬
剤抵抗性のものであり、かつ未融合のミエローマ細胞が
選択培地で生存せず、一方融合細胞のみが生存するよう
なものが良い。最も普通に用いられるものは８−アザグ
アニジン抵抗性の株化細胞で、これはヒポキサンチン・
グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼを欠損
し、ヒポキサンチン・アミンブテリン・チミジン（ＨＡ
Ｔ）培地に育生できない性質を有している。さらに使用
する株化細胞は「非分泌型」のものであることが好まし
い。

【００３５】該細胞融合処理は、例えば、通常イーグル
最少基本培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０などの培
地中で上記免疫マウスの脾細胞１〜５×１０⁸個と、上
記マウス骨髄腫株化細胞１〜５×１０⁷個とを、混合し
て行うことができる。融合促進剤としては、平均分子量
１０００〜６０００のポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）が好ましく、他の融合促進剤、例えばポリビニルア
ルコール、ウイルスなどを用いることができる。ＰＥＧ
の使用濃度は約３０〜５０％である。

【００３６】上述のようにして得ることができる融合細
胞含有系から融合細胞を、それ自体公知の手法を利用し
て、選別処理、抗体活性スクリーニング処理及びクロー
ニング処理して、マウスを免疫するのに用いた完全抗原
に対するモノクローナル抗体産生能を有し且つ自己増殖
能を持つ融合細胞株を取得することができる。

【００３７】上記融合細胞の選別処理は、例えば、２０
％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで細胞
融合を終えた細胞を適当に希釈し、９６ウエルマイクロ
プレートに１０⁵〜１０⁶個細胞／ウエル程度に分注し、
各ウエルに選択培地（例えばＨＡＴ培地）を加え、以後
選択培地交換を行いながら、５％ＣＯ₂培養器（３７
℃）で培養を続けることにより行うことができる。ミエ
ローマ細胞として８−アザグアニン抵抗性株を用いれ
ば、未融合のミエローマ細胞はＨＡＴ培地で死滅し、ま
た抗体産生細胞は正常細胞なのでin vitro培養では長期
間生育できない。従って培養後１０〜１４日ぐらいから
生育してくる細胞は全て融合細胞である。

【００３８】上述のようにして得ることのできる融合細
胞株の抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処
理は、常法により例えば、以下のようにして行うことが
できる。

【００３９】融合細胞の生育したウエルの培養上清の一
部を採取し、一定量の標識抗原とインキュベーション
し、標識抗原との結合能を測定することにより、目的と
する抗体を分泌しているウエルを検索する。即ち、¹²⁵
Ｉ、¹³¹Ｉなどのラジオアイソトープあるいは酵素など
で標識した抗原と培養上清を反応させた後、各反応液に
ついて抗原−抗体結合物を分離し、標識量を測定するこ
とにより、目的とする抗体の存在及び結合能を検索す
る。

【００４０】目的とする抗体活性の認められる各ウエル
中には２種以上の融合細胞が生育している可能性がある
ので、限界希釈法や軟寒天によるコロニー形成法により
クローニングを行い、モノクローナル抗体産生融合細胞
株を得る。

【００４１】上述のようにして得たモノクローナル抗体
産生細胞株を用いて、完全抗原に対するモノクローナル
抗体を取得するには、該モノクローナル抗体産生細胞株
を、例えば適当な培地に培養し、培地からモノクローナ
ル抗体を採取する方法、ミエローマ細胞由来動物と同系
の動物に該細胞株を移植し腹水中のモノクローナル抗体
を採取する方法など、それ自体公知の手法を利用して取
得することができる。

【００４２】例えば、モノクローナル抗体産生融合細胞
株を１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地な
どの培養液で培養し、その培養上清液を硫安分画、抗原
を結合させたセファロース４Ｂなどのアフィニティーク
ロマトグラフィーなどによって精製することにより目的
とするモノクローナル抗体を採取することができる。

【００４３】また、上記後者の態様によれば、例えば、
同系動物にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメ
チルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、
融合細胞を腹腔内投与することによりin vivoで融合細
胞を大量に増殖させる。その結果、形成される腹水には
高濃度のモノクローナル抗体が含まれている。この腹水
から硫安分画及び必要に応じて前記アフィニティークロ
マトグラフィーなどにより、目的とするモノクローナル
抗体を取得することができる。

【００４４】上述のようにして取得できるようなモノク
ローナル抗体は、市販品として入手することも可能であ
り、本発明の方法に利用できる。

【００４５】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。

【００４６】（実施例１） (1)抗ヒトフィブリノゲン抗体の調製 精製ヒトフィブリノゲン（コスモバイオ社製）１ｍｇを
生理食塩水１ｍｌに溶解し、コンプリートフロインド溶
解液１ｍｌを混合し、家兎に２週間間隔で５回皮下及び
趾間に注射した。抗体価が十分に上昇した段階で全採血
を行った。得られた血液を遠心分離し、上清を抗フィブ
リノゲン抗血清とした。

【００４７】得られた抗血清５０ｍｌに飽和硫安５０ｍ
ｌを加え、撹拌混合後４℃で１昼夜放置した。この混合
物を遠心分離した後、得られた沈殿を０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）４０ｍｌに溶解し、飽和硫安２０ｍ
ｌを加え４℃で１昼夜放置した。これを遠心分離して得
られた沈殿を蒸留水２ｍｌに溶解し、透析膜に入れ、透
析を行った。得られた透析内液を凍結乾燥し、５００ｍ
ｇの抗フィブリノゲン抗体を得た。

【００４８】(2)抗ヒトフィブリノゲン抗体感作ラテッ
クス試薬の調製 上記(1)で調製した抗ヒトフィブリノゲン抗体（以下、
「抗Ｆｇ」という）のグリシン緩衝溶液（濃度：１ｍｇ
／ｍｌ、ｐＨ８．２）１０ｍｌに平均粒径０．１５μｍ
のポリスチレンラテックス（セキスイ化学社製）溶液１
ｍｌを加え、室温で３０分間撹拌し、冷却下に１２，０
００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行った。沈殿した抗ヒ
トフィブリノゲン抗体感作ラテックス粒子（以下、「抗
Ｆｇ−ラテックス」という）（感作量：１０ｍｇ／ｍ
ｌ）をウシ血清アルブミン溶液（濃度：１重量％）に懸
濁させ、０．４重量％の抗Ｆｇ−ラテックス試薬を調製
した。

【００４９】(3)標準曲線の作成 希釈安定化液（０．０５重量％ウシ血清アルブミン加ト
リス緩衝液、ｐＨ８．０）１５０μｌに上記(1)で調製
した抗Ｆｇ−ラテックス試薬２５μｌを添加、混合し、
照射光波長５５０ｎｍにおける抗原−抗体反応（凝集反
応）開始前の吸光度を測定した。ついで、この混合物に
下記表１に示す濃度のフィブリン／フィブリノゲン分解
産物（以下、「ＦＤＰ」という）を含有する溶液４μｌ
を添加、振盪し、６分１５秒間抗原−抗体反応（凝集反
応）を行ない、反応が完結した後、照射波長５５０ｎｍ
での吸光度を測定した（ホフマン・ラ・ロシュ社製、測
定装置名：Ｃ０ＢＡＳ ＭＩＲＡ、以下の実施例におい
て同一の測定装置を使用した）。吸光度測定は、１濃度
につき２回ずつ行った。下記表１に各濃度における抗原
−抗体反応（凝集反応）開始前の吸光度と反応完結後の
吸光度の差及びその２検体の平均値を示した。

【００５０】

【表１】

【００５１】上記表１の測定データを標準ＦＤＰ溶液の
濃度を横軸とし、吸光度の差を縦軸とするグラフにプロ
ットし、図１に示す標準曲線を作成した。

【００５２】(4)未知試料中のＦＤＰの定量 前記(3)と同様にして、希釈安定化液１５０μｌと(2)で
調製した抗Ｆｇ−ラテックス試薬２５μｌの混合物の照
射光波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定した後、この
混合物に被検者から得た血液から常法により分離した血
清（試料溶液）４μｌを添加、振盪後６分１５秒間反応
を行い、反応完結後同波長における吸光度を測定し、
(3)で作成した標準曲線から試料中のＦＤＰ濃度を求め
た。各試料の測定は、５検体（ｎ＝５）づつ実施した。

【００５３】なお、比較のため、従来の抗原−抗体反応
継続中の少なくとも２点の吸光度測定を行うラテックス
凝集法（以下、「レート法」という）及び測定感度の高
い酵素免疫測定法（以下、「ＥＩＡ法」という）による
測定を同時に実施した。その結果を下記表２に示す。

【００５４】レート法では、本発明の方法と同一及び同
量の抗Ｆｇ−ラテックス試薬を用い、照射光波長５５０
ｎｍで、抗原−抗体反応開始から２５秒毎に３分２０秒
までの合計８点における吸光度を測定した。

【００５５】ＥＩＡ法は、ホースラディッシュペルオキ
シダーゼを用いた測定法に従って測定を行った。

【００５６】レート法及びＥＩＡ法による測定結果を下
記表２に併せて示した。表中の「ｃｖ」は、変動係数を
表し、下記式

【化１】 で算出される値であり、測定結果の精度、再現性の評価
基準となる。ｃｖが５％以下であれば測定精度、再現性
は極めて満足される。

【００５７】

【表２】

【００５８】上記の結果から、本発明方法はレート法よ
りもｃｖが小さい、すなわち測定精度及び再現性に優れ
ており、測定値もＥＩＡ法と極めてよく一致しているこ
とが分かる。

【００５９】（実施例２） (１)抗ヒト血液第ＸIII因子抗体感作ラテックス試薬の
調製 実施例１(1)と同様にして調製した抗ヒト血液第ＸIII因
子（以下、「ＦＸIII」という）抗体の水溶液（濃度：
０．５ｍｇ／ｍｌ）１０ｍｌに平均粒径０．３μｍのポ
リスチレンラテックス（セラダイン社製）溶液１ｍｌを
加え、室温下で３０分撹拌し、冷却下に１２，０００ｒ
ｐｍ、３０分間遠心分離を行った。沈殿した抗ヒト血液
第ＸIII因子抗体感作ラテックス粒子（以下、「抗ＦＸI
II−ラテックス」という）（感作量：５ｍｇ／ｍｌ）
を、ウシ血清アルブミン溶液（濃度：１重量％）に懸濁
させ、抗ＦＸIII−ラテックス濃度が０．２５重量％の
抗ＦＸIII−ラテックス試薬を調製した。

【００６０】(2)標準曲線の作成 希釈安定化液（０．０５重量％ウシ血清アルブミン加ト
リス緩衝液、ｐＨ８．０）１５０μｌに上記(1)で調製
した抗ＦＸIII−ラテックス試薬２５μｌを添加、混合
し、照射光波長５５０ｎｍにおける抗原−抗体反応（凝
集反応）開始前の吸光度を測定した。ついで、この混合
物に下記表３に示す濃度のＦＸIIIを含有する溶液５μ
ｌを添加、振盪し、１２分３０秒間抗原−抗体反応（凝
集反応）を行ない、反応が完結した後、照射波長５５０
ｎｍでの吸光度を測定した。吸光度測定は、１濃度につ
き２回実施した。下記表３に各濃度における抗原−抗体
反応（凝集反応）開始前の吸光度と反応完結後の吸光度
の差及びその２回の測定値の平均値を示した。

【００６１】

【表３】

【００６２】上記表３の測定データを標準ＦＸIII溶液
の濃度を横軸とし、吸光度の差を縦軸とするグラフにプ
ロットし、図２に示す標準曲線を作成した。

【００６３】(3)未知試料中のＦＸIIIの定量 前記(2)と同様にして、希釈安定化液１５０μｌと(1)で
調製した抗ＦＸIII−ラテックス試薬２５μｌの混合物
の照射光波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定した後、
この混合物に被検者から得た血液から常法により分離し
た血漿を適宜希釈した試料溶液５μｌを添加、振盪後１
２分３０秒間反応を行い、反応完結後同波長における吸
光度を測定し、(2)で作成した標準曲線から試料中のＦ
ＸIII濃度を求めた。

【００６４】なお、比較のため、レート法及びモノダン
シルカダベリン取込みゲル濾過法（ヤトロン社製）によ
る測定を同時に実施した。

【００６５】レート法では、本発明の方法と同一及び同
量の抗ＦＸIII−ラテックス試薬を用い、照射光波長５
５０ｎｍで、抗原−抗体反応開始から２５秒毎に７分５
秒までの１７点の吸光度を測定した。

【００６６】上記本発明の方法、レート法及びモノダン
シルカダベリン取込みゲル濾過法による測定結果を下記
表４に併せて示した。

【００６７】

【表４】

【００６８】（実施例３） (1)抗ヒトＤダイマーモノクローナル抗体の調製 (a)Ｄダイマーの精製 ヒト血漿２００ｍｌから硫酸アンモニウムによる塩析
（４０％上清、７５％沈殿）によりＤダイマー粗抽出物
６．７５ｇを得た。これをｐ−セルロースクロマトグラ
フィーカラム（２．７×１９ｃｍ）に付し、次いで未吸
着画分を濃縮し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（１ｍＭ ＣａＣ
ｌ₂、ＭｇＣｌ₂、ＭｎＣｌ₂、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ
５．０）で透析後、上記緩衝液で平衡化したコンカナバ
リンＡ−セファロースカラム（２×４５ｃｍ）に付した
後、４℃で一晩インキュベートした。次いで上記緩衝液
で蛋白質の流出がなくなるまで洗浄し、α−メチル−Ｄ
−マンノシドのグラジュエントクロマトグラフィー
（０．１Ｍ→０．５Ｍ）を行い、目的とする画分を集め
濃縮した。次いで同画分を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム
（３×４０ｃｍ）に付し、同緩衝液で蛋白質の流出がな
くなるまで洗浄後、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）及び０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．０２Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．０）を用いてグラジュエントクロマトグラ
フィーを行い、目的とする画分を集め濃縮した。次い
で、０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化
したセファクリルＳ−２００カラム（２６×８４ｃｍ）
及びセファデックスＧ−１００カラム（２．６×８８ｃ
ｍ）によるゲル濾過で精製して、精製Ｄダイマー１０４
ｍｇを得た。

【００６９】(b)抗Ｄダイマーモノクローナル抗体の調
製 上記(a)で得た精製Ｄダイマー５０μｇを完全フロイン
ドアジュバントと共にＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週
令）に３週間おきに４回皮下投与し、最後に精製Ｄダイ
マー８０μｇを静注した。

【００７０】最終免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出
して、脾細胞を採取し、デルベコのモディファイド最少
基本培地（以下、Ｄ’ＭＥＭと称す）で３回洗浄した
後、細胞数を算出し、その２×１０⁸個をマウスミエロ
ーマ細胞１×１０⁷個と混合して遠心し細胞を集めた。
このペレットに、３７℃に温めておいたポリエチレング
リコール溶液（ＰＥＧ−１００：４．２５％、ＤＭＳ
Ｏ：１．５％含有Ｄ’ＭＥＭ）１ｍｌを加え、１分間遠
心管をゆっくり回転させて細胞融合を行った。３７℃の
Ｄ’ＭＥＭを３０秒毎に２ｍｌずつ１０回加えた後遠心
分離し、得られたペレットを２０％ウシ胎児血清含有Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地でマウスミエローマ細胞として５
×１０⁴個／０．２ｍｌとなるように懸濁し、９６ウエ
ルマイクロプレートに０．２ｍｌずつ分注し、５％ＣＯ
₂培養器で培養した。２４時間後各ウエルの上清の半量
を捨て、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン・アミノプテリン
・チミジン、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４
０培地）０．１ｍｌを加え、その後３〜４日毎に半量を
ＨＡＴ培地交換を行いながら２週間培養した後、増殖し
たウエル中の培養上清の抗体活性を測定した。

【００７１】活性の認められたウエルの細胞をＢＡＬＢ
／ｃマウス胸腺細胞を含む１０％ウシ胎児血清含有ＲＰ
ＭＩ−１６４０培地で希釈し、限界希釈法によりクロー
ニングを行って１６株の抗モノクローナル抗体産生融合
細胞を得た。これを大量培養し、その培養上清からＤダ
イマーを結合させたセファロース４Ｂを用いたアフィニ
ティークロマトグラフィーに付し、モノクローナル抗体
を得た。

【００７２】また、２×１０⁶個以上の細胞をプリスタ
ン０．５ｍｌを予め投与したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔
内投与し、腹水腫瘍を作らせて腹水を得た後、この腹水
からＤダイマーを結合させたセファロース４Ｂを用いた
アフィニティークロマトグラフィーによりモノクローナ
ル抗体を得た。

【００７３】(2)抗ヒトＤダイマー抗体感作ラテックス
試薬の調製 上記(1)で調製した抗ヒトＤダイマーモノクローナル抗
体の水溶液（濃度：１．０ｍｇ／ｍｌ）１０ｍｌに平均
粒径０．２μｍのポリスチレンラテックス（セキスイ化
学社製）溶液１ｍｌを加え、室温下で３０分撹拌し、冷
却下に１２，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行っ
た。沈殿した抗ヒトＤダイマー抗体感作ラテックス粒子
（以下、「抗Ｄダイマー−ラテックス」という）（感作
量：１０ｍｇ／ｍｌ）を、ウシ血清アルブミン溶液（濃
度：１重量％）に懸濁させ、０．４重量％の抗Ｄダイマ
ー−ラテックス試薬を調製した。

【００７４】(3)標準曲線の作成 希釈安定化液（０．２重量％ウシ血清アルブミン加トリ
ス緩衝液、ｐＨ８．０）２４０μｌに上記(1)で調製し
た抗Ｄダイマー−ラテックス試薬２５μｌを添加、混合
し、照射光波長５５０ｎｍにおける抗原−抗体反応（凝
集反応）開始前の吸光度を測定した。ついで、この混合
物に下記表５に示す濃度のＤダイマーを含有する溶液２
０μｌを添加、振盪し、１４分３５秒間抗原−抗体反応
（凝集反応）を行ない、反応が完結した後、照射波長５
５０ｎｍでの吸光度を測定した。吸光度測定は、１濃度
につき２回ずつ実施した。下記表５に各濃度における抗
原−抗体反応（凝集反応）開始前の吸光度と反応完結後
の吸光度の差及びその２回の測定値の平均値を示した。

【００７５】

【表５】

【００７６】上記表５の測定データを標準Ｄダイマー溶
液の濃度を横軸とし、吸光度の差を縦軸とするグラフに
プロットし、図３に示す標準曲線を作成した。

【００７７】(4)未知試料中のヒトＤダイマーの定量 前記(2)と同様にして、希釈安定化液２４０μｌと(1)で
調製した抗Ｄダイマー−ラテックス試薬２０μｌの混合
物の照射光波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定した
後、この混合物に被検者から得た血液から常法により分
離した血清を適宜希釈した試料溶液２０μｌを添加、振
盪後１４分３５秒間反応を行い、反応完結後同波長にお
ける吸光度を測定し、(2)で作成した標準曲線から試料
中のヒトＤダイマー濃度を求めた。

【００７８】なお、比較のため、レート法及びＥＩＡ法
（富士レビオ社製）による測定を同時に実施した。

【００７９】レート法では、本発明の方法と同一及び同
量の抗Ｄダイマー−ラテックス試薬を用い、照射光波長
５５０ｎｍで、抗原−抗体反応開始から２５秒毎に６分
１５秒までの１５点において吸光度を測定した。

【００８０】上記本発明の方法、レート法及びＥＩＡ法
による測定結果を下記表６に併せて示した。

【００８１】

【表６】

【００８２】（実施例４） (1)抗ヒトリポプロテイン(a)抗体感作ラテックス試薬の
調製 実施例１(1)と同様にして調製した抗ヒトリポプロテイ
ン(a)抗体（以下、「抗Ｌｐ(a)抗体」という）のグリシ
ン緩衝液（濃度：０．７５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９．０）１
０ｍｌに平均粒径０．１μｍのポリスチレンラテックス
（セラダイン社製）溶液１ｍｌを加え、室温下で３０分
撹拌し、冷却下に１２，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分
離を行った。沈殿した抗Ｌｐ(a)抗体感作ラテックス粒
子（以下、「抗Ｌｐ(a)−ラテックス」という）（感作
量：７．５ｍｇ／ｍｌ）を、ウシ血清アルブミン溶液
（濃度：１重量％）に懸濁させ、０．４重量％の抗Ｌｐ
(a)−ラテックス試薬を調製した。

【００８３】(2)標準曲線の作成 希釈安定化液（０．０５重量％ウシ血清アルブミン加ト
リス緩衝液、ｐＨ８．０）２４０μｌに上記(1)で調製
した抗Ｌｐ(a)−ラテックス試薬２５μｌを添加、混合
し、照射光波長５７０ｎｍにおける抗原−抗体反応（凝
集反応）開始前の吸光度を測定した。ついで、この混合
物に下記表７に示す濃度のＬｐ(a)を含有する溶液４μ
ｌを添加、振盪し、５分２５秒間抗原−抗体反応（凝集
反応）を行ない、反応が完結した後、照射波長５７０ｎ
ｍでの吸光度を測定した。吸光度測定は、１濃度につき
２回ずつ実施した。下記表７に各濃度における抗原−抗
体反応（凝集反応）開始前の吸光度と反応完結後の吸光
度の差及びその２検体の平均値を示した。

【００８４】

【表７】

【００８５】上記表７の測定データを標準Ｌｐ(a)溶液
の濃度を横軸とし、吸光度の差を縦軸とするグラフにプ
ロットし、図４に示す標準曲線を作成した。

【００８６】(3)未知試料中のヒトＬｐ(a)の定量 前記(2)と同様にして、希釈安定化液２４０μｌと(1)で
調製した抗Ｌｐ(a)−ラテックス試薬２５μｌの混合物
の照射光波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した後、
この混合物に被検者から得た血液から常法により分離し
たは血清を適宜希釈した試料溶液４μｌを添加、振盪後
５分２５秒間反応を行い、反応完結後同波長における吸
光度を測定し、(2)で作成した標準曲線から試料中のヒ
トＬｐ(a)濃度を求めた。

【００８７】なお、比較のため、レート法及びＥＩＡ法
（コスモバイオ社製）による測定を同時に実施した。

【００８８】レート法では、本発明の方法と同一及び同
量の抗Ｌｐ(a)−ラテックス試薬を用い、照射光波長５
７０ｎｍで、抗原−抗体反応開始から２５秒毎に４分１
０秒までの１０点において吸光度を測定した。

【００８９】上記本発明の方法、レート法及びＥＩＡ法
による測定結果を下記表８に併せて示した。

【００９０】

【表８】

【００９１】以上の実施例１〜４の結果から、本発明の
方法による測定結果はレート法よりも、感度が高いとさ
れているＥＩＡ法等での測定結果に近く、本発明の方法
がレート法よりも測定精度が優れていることを示してい
る。

【００９２】また、本発明の方法による測定結果のｃｖ
も、レート法に比べて小さく、このことは本発明の方法
がレート法に比べて再現性に優れていることを示してい
る。

【００９３】（実施例５）平均粒径が０．０５μｍのポ
リスチレンラテックス（セキスイ化学社製）を使用した
以外は、前記実施例１(1)と同様にして抗Ｆｇ−ラテッ
クス試薬を調製した。得られた抗Ｆｇ−ラテックス試薬
を用い、前記実施例１(3)と同様にして、吸光度を測定
し、吸光度の差及びその２検体の平均値を下記表９に示
し、標準曲線を図５に示した。

【００９４】

【表９】

【００９５】さらに前記実施例１(4)と同様に未知試料
中のＦＤＰの定量を行った。その結果を下記表１０に示
した。

【００９６】

【表１０】

【００９７】（実施例６）平均粒径が０．９μｍのポリ
スチレンラテックス（セラダイン社製）を使用した以外
は、実施例１(1)と同様にして抗Ｆｇ−ラテックス試薬
を調製した。得られた抗Ｆｇ−ラテックス試薬を用い、
前記実施例１(3)と同様にして、吸光度を測定し、吸光
度の差及びその２検体の平均値を下記表１１に示し、標
準曲線を図６に示した。

【００９８】

【表１１】

【００９９】さらに前記実施例１(4)と同様に未知試料
中のＦＤＰの定量を行った。その結果を下記表１２に示
した。

【０１００】

【表１２】

【０１０１】

【発明の効果】本発明によれば、レート法よりも測定感
度及び再現性に優れた、エンドポイント法による免疫学
的定量法が提供された。

【図面の簡単な説明】

【図１】平均粒径が０．１５μｍの粒子状の不活性担体
を使用した場合のＦＤＰの標準曲線（ＦＤＰ濃度に対す
る吸光度の差）を示すグラフである。

【図２】ＦＸIIIの標準曲線（ＦＸIII濃度に対する吸光
度の差）を示すグラフである。

【図３】Ｄダイマーの標準曲線（Ｄダイマー濃度に対す
る吸光度の差）を示すグラフである。

【図４】Ｌｐ(a)の標準曲線（Ｌｐ(a)濃度に対する吸光
度の差）を示すグラフである。

【図５】平均粒径が０．０５μｍの粒子状の不活性担体
を使用した場合のＦＤＰの標準曲線（ＦＤＰ濃度に対す
る吸光度の差）を示すグラフである。

【図６】平均粒径が０．９μｍの粒子状の不活性担体を
使用した場合のＦＤＰの標準曲線（ＦＤＰ濃度に対する
吸光度の差）を示すグラフである。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分析対象物に対する抗体又は抗原により
   感作された粒子状の不活性担体を含む水溶液と、分析対
   象物を含む試料を、抗原−抗体反応に基づき凝集反応を
   起こさせ、該反応混合物に特定波長の光を照射してその
   吸光度を測定することにより、試料中の分析対象物濃度
   を定量する方法において； (1)凝集反応開始前及び(2)凝集反応完結時の２点の吸光
   度を測定することを特徴とする抗原−抗体反応による微
   量物質の定量法。
2. 【請求項２】 粒子状の不活性担体の平均粒径が０．０
   ５〜０．９μｍである請求項１に記載の定量法。
3. 【請求項３】 粒子状の不活性担体の単位表面積当たり
   の抗体又は抗原の感作量が、０．５×１０^-4〜１５×１
   ０^-4ｍｇ／ｃｍ²である請求項１に記載の定量法。
4. 【請求項４】 粒子状の不活性担体がポリスチレンラテ
   ックスである請求項１に記載の定量法。
5. 【請求項５】 分析対象物がフィブリン／フィブリノゲ
   ン分解産物（ＦＤＰ）、ヒト血液第ＸIII因子（ＦＸII
   I）、ヒトＤダイマー及びヒトリポプロテイン(a)（Ｌｐ
   (a)）から選ばれる請求項１に記載の定量法。
6. 【請求項６】 吸光度の測定波長が４００〜１０００ｎ
   ｍである請求項１に記載の定量法。
7. 【請求項７】 分析対象物が抗原であり、粒子状の不活
   性担体に感作される抗体がモノクローナル抗体である請
   求項１に記載の定量法。