JP4790818B2

JP4790818B2 - 上昇した量のｄ−ダイマーを含む保存安定性細胞性全血組成物

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Publication number: JP4790818B2
Application number: JP2008552475A
Authority: JP
Inventors: ティモシーホー; ショーレザミナスリ; ジェイムズコール; アリレザエブラヒム
Original assignee: バイオ−ラッドラボラトリーズインコーポレーティッド
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2007-01-25
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2027-01-25
Also published as: US7560283B2; WO2007089665A2; CA2634597A1; AU2007210000B2; EP1976375A2; EP1976375A4; AU2007210000A1; CA2634597C; CN101374410A; WO2007089665A3; US20070178168A1; JP2009524827A

Description

発明の背景
本発明は、深部静脈血栓症(DVT)および肺塞栓症(PE)を除外する生化学的マーカとして日常的に利用される、D-ダイマーに関する診断検査処置で使用するための液体保存安定性細胞性全血組成物の調製および適用の方法に関する。

静脈血栓塞栓症は主要な健康問題であり、様々な疾病で生じ、著しく高い死亡率および病的状態を引き起こす。静脈血栓塞栓症の最も一般的な症状は、深部静脈血栓症(DVT)と肺塞栓症(PE)である。DVTは、身体、通常は下肢の深部静脈のいずれかで発生する凝血塊(血栓)である。それは、組織損傷、皮膚病変、および手足の損失さえ招き得る重篤な疾患である。PEは、血栓の一部がはがれ、肺動脈で詰まる状態である。PEは突然死をもたらすことがある。

D-ダイマー分子はフィブリン分解の産物である。血漿中に高濃度のD-ダイマーが存在することは、線溶系(線維素塊の分解)が凝固活性化に反応し作用中であることの証明である。ヒト血漿中の、D-ダイマー正常レベルに関するカットオフ値は、性別および年齢などの要素により変化し、アッセイ法が違えば異なりうる。それ故、非常に一般的にいえば、ヒト血漿中のD-ダイマー正常レベルに関する典型的なカットオフ値は、約200〜約500 ng/mLと考えられる。静脈血栓症(DVTまたはPE)を伴う患者は、血液中に、D-ダイマー正常レベルよりもかなり高いD-ダイマーを有している。D-ダイマーレベルが先に確立されたカットオフ値を有意に上まわる場合には、患者がDVTまたはPEであることを確認するため、超音波およびX線写真撮影法などの画像処理方法を実施する。また、癌、糖尿病、外傷、心血管障害、および血腫などの、上昇したD-ダイマーレベルの他の考えられる原因が調査されうる。D-ダイマーレベルがカットオフ値を下まわる場合は、DTVおよびPEが除外され、患者が画像診断に送られることはなく、また抗凝血薬で治療されることもない。このように、患者の治療における診断ツールおよび費用節減ツールとして、D-ダイマーレベル測定を用いることができる。

異なる技術を用いる多くのD-ダイマー診断試験が文献にて述べられ、臨床検査市場に導入されている。例えば、Diagnostica Stago STA-LIATEST(登録商標)D-DI_、bioMerieux Vidas(登録商標)D-Dimer、およびDade Behring Advanced D-Dimerアッセイは、血漿中のD-ダイマーを測定する定量的試験法の一部である。Diagnostica Stago STA-LIATEST(登録商標)D-DIは、特異性抗体が共有結合しているミクロラテックス微粒子を用いる免疫比濁アッセイである。Vidas(登録商標) D-Dimerアッセイは、酵素結合性蛍光検出法を用いるツーステップ酵素イムノアッセイサンドイッチ法を用いる。また、Dade Behring Advanced D-Dimerアッセイも免疫比濁アッセイである。これらはすべて、血漿中のD-ダイマー含量を試験するための処置と関係している。

上記アッセイとは異なる、ポイントオブケア(point-of-care)の状況に適合するいくつかのアッセイが、全血標本中のD-ダイマー検査に関する市場に導入されている。これらは、例えば、検査用血漿を分離するために標本を実験室に送るより、即座の結果をもって、むしろベッドサイドまたは医療現場での検査を可能にする。全血標本中のD-ダイマー検査用の、そのような高速定性アッセイの2つの例が、Agent Biomedical Ltd.(オーストラリア)からのSimpliRED(登録商標)D-ダイマーアッセイおよびAmerican Diagnostica, Inc.からのClearview Simplify D-ダイマーアッセイである。SimpliRED(登録商標)D-ダイマーアッセイは、自己赤血球凝集反応アッセイである。活性薬剤は、赤血球細胞表面に結合するモノクローナル抗体に結合したD-ダイマー特異的モノクローナル抗体の化学複合体である。Clearview Simplify D-ダイマーアッセイは、D-ダイマー検出用に、コロイド状金粒子を結合させたD-ダイマー特異的マウスモノクローナル抗体を用いるイムノクロマトグラフィー試験である。抗体-金-D-ダイマー複合体は、2番目のD-ダイマー特異的マウス抗体が結合したゾーンに捕捉され濃縮されるまで、水溶液相中の膜を通して移動する。このゾーンでの複合体の濃縮は、膜上にピンク色/紫色の線の出現を引き起こす。この分析法では、D-ダイマー濃度が臨床的に確立されたカットオフ値を下まわる場合、可視線は現れない。

臨床診断検査室では、臨床検査法および処置の精度ならびに確度をモニタリングするために、日常的に精度管理試料(quality control material)が用いられており、これはアッセイが検査室で行われるか、患者のポイントオブケアで行われるかに関係なく行われる。最適性能を得るため、精度管理試料は、予測される分析分散に対して、実際の患者試料と同程度の感受性を有するべきである。さらに、精度管理試料は保存安定性で、その被検物質標的濃度はアッセイの臨床方針決定値の検証となるべきである。精度管理試料の他の望ましい特徴は、低価格、ロット間再現性、および製造の容易さである。

SimpliREDアッセイにおける作業が記載された初期の出版物[John et al., Thrombosis Research 58:273 (1990)](非特許文献1)では、一連の濃度を誘導する段階希釈において添加されたD-ダイマー抗原を有するO型陰性全血を対照として用いている。しかしながら、SimpliREDアッセイは血漿に基づいた対照を販売し、またClearview Simplifyアッセイで販売された対照は「低分子量D-ダイマースパイキング溶液」のみである。さらに、現在、血漿中のこのマーカーを検査するための、血漿およびバッファーに基づいたD-ダイマー対照がいくつか市販されている。一つは、Stago LIATEST(登録商標)D-Dimer Control(Diagnostica Stago, Asnieres-sur Seine, Franceから入手可能)は、陽性および陰性レベルそれぞれに対するクエン酸正常および異常なヒト血漿からなる二層凍結乾燥対照である。もう一つは、Dade Behring Advanced D-Dimer Control Plasma 1および2(Dade Behring Inc., Deerfield ILから入手可能)は、Hepesバッファーで安定化された、D-ダイマー標本で補充されたプール血漿からなり、Proclinと共に保持された、二層凍結乾燥対照である。Bio-Rad Laboratories(Hercules, CA)は、加工ヒト血漿から調製された3つの上昇したレベルのD-ダイマーおよび防腐剤を含む液体血漿に基づいた対照を提供する。しかしながら、現在、全血検査用のD-ダイマーアッセイにおける対照またはキャリブレーターとして用いられる、保存安定性細胞性全血D-ダイマー組成物は市販されていない。

全血検査用のD-ダイマーアッセイに用いるための、保存安定性細胞性全血に基づいた精度管理試料が必要である。そのような製品は、実際の患者試料と同様な性質を持ち、検査試料に対して直接用いることができ、ポイントオブケア検査用に設計されており、そのような試料を検査する際に血漿から血球を分離する必要がない。本発明は該必要性を満たし、また、ベースマトリックスとしてヒト赤血球および血漿の組合わせを用いることによって分析分散に対して患者試料と同様に反応し、アッセイの線形ダイナミックレンジを検証する標的値を有し、かつ長期使用に対し許容できる開封済みバイアルおよび未開封バイアルの安定性を提供する、などといった精度管理試料に関する他の必須の条件を満たす。

John et al., Thrombosis Research 58:273 (1990)

発明の簡単な概要
一つ目の態様において、本発明は、約4〜約9のpHおよび0〜約10 g/dLの総タンパク質含量を有する脱繊維素血漿、赤血球、安定剤、および上昇したレベルのD-ダイマーを含む全血細胞組成物を含む。

二つ目の態様において、本発明は、約4〜約9のpHおよび0〜約10 g/dLの総タンパク質含量を有する脱繊維素血漿を含む組成物と、赤血球を含む組成物および安定剤を含む組成物の結合を含む上昇したレベルのD-ダイマーを有する全血組成物を調製する方法、ならびに上昇した量のD-ダイマーを含む製品を生産するための十分な量のD-ダイマーを含む。

三つ目の態様において、本発明は、上記定義のような組成物の利用を含む全血に基づくD-ダイマーアッセイをモニタリングする方法を含み、また対照試料として、好ましくは異なる上昇量のD-ダイマーを有する、一連の2またはそれ以上のそのような組成物を含む。

また本発明は、そのような組成物を1つまたは複数含む全血D-ダイマーアッセイに関して、主に使用のために設計された対照キットを含む。キットがそのような組成物を2またはそれ以上含む場合、その後、組成物は異なる上昇量のD-ダイマーを有する。

発明の詳細な説明
本発明は、全血中のD-ダイマー測定のための診断検査方法において標準、参照物質、および/または対照として用いられうる組成物を調製するために、安定化した赤血球、加工血漿、ならびにD-ダイマー(天然、合成、または、組換え型D-ダイマーでありうる)を安定剤、そして好ましくは抗菌剤と共に用いることを含む。

通常、組成物は、約4〜約9のpHおよび0〜約10 g/dLの総タンパク質含量を有する脱繊維素血漿、赤血球、安定剤、ならびに上昇したレベルのD-ダイマーを含む全血細胞組成物である。好ましくは、組成物は、同様に約4〜約9、好ましくは約5〜約8、および最も好ましくは約6〜約7のpH、0〜約10 g/dL、好ましくは約4〜約8、最も好ましくは約5〜約7 g/dLの総タンパク質含量を有する約10〜約70、より好ましくは約40〜約60容量%の脱繊維素血漿、約10〜約70、好ましくは約30〜約55容量%の赤血球、約0.01〜約10、好ましくは約0.1〜約2.0重量％の安定剤、ならびに好ましくは最大約200μg/mLのD-ダイマーである、内在性D-ダイマーに比べて上昇した量のD-ダイマー、を含む。組成物中のタンパク質の包含は任意だが(すなわち、タンパク質含量は0でありえる)、本組成物におけるタンパク質は好ましくは、最大約10 g/dL存在する。そのような量のタンパク質を含む組成物は、より厳密に全血に似ていると思われる。好ましい態様において、本組成物はまた、約0〜約2、好ましくは約0.01〜約1重量％の1または複数の抗菌剤を含む。

本発明の組成物および方法で使用された血漿は、好ましくはヒト血漿であるが、ウシもしくはブタの血漿などの他の哺乳動物の血漿であってもよく、またはそれは当技術分野において公知のように調製された人工血漿であってもよく、また電解質、アルブミン、バッファーなどのヒト血漿のいくつかの成分を有する水溶性液体を含んでいてもよい。組成物の使用に際し、約5 mg/dL未満のフィブリン含量をもたらすように、当技術分野において公知の技術を用いて血漿を脱線維化処理する。その後、血漿の総タンパク質含量を、例えば、組成物を濃縮、または血漿、血清、もしくは等張中性水溶液で希釈することによる任意の適切な技術を用いて、約0〜約10、好ましくは約4〜約8、および最も好ましくは約5〜約7 g/dLの値へ調整する。pHをその後、約4および約9の間、好ましくは約5および約8の間、最も好ましくは約6および約7の間の値に調整する。

上記に続いて、酵素阻害剤および1または複数の抗菌剤などのさらなる任意の成分を添加してもよい。その後、これらの組成物の内在性D-ダイマー含量(「ベースマトリックス」と呼ばれることもある)を決定する。

その後、丁度記載したように調製した加工血漿を、赤血球、好ましくは濃縮赤血球、および安定剤(濃縮赤血球に含まれていてもよく、または別途添加されてもよい)と混合する。赤血球は、好ましくはヒト赤血球であるが、代わりに哺乳動物、または鳥類の赤血球であってもよい。適切な非ヒト哺乳動物の赤血球には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、およびヒツジの赤血球が含まれる。適切な鳥類赤血球には、ニワトリおよびシチメンチョウ赤血球が含まれる。結果得られる組成物は、約10〜約70、好ましくは約30〜約55容量%の赤血球を含む。

精製された、または部分的に精製されたD-ダイマー(天然、合成、もしくは組換え型のD-ダイマーであってよく、また好ましくはヒトD-ダイマーである)を、その後、D-ダイマーに関する臨床方針決定値より下、近く、および上の異なるレベルのこのマーカーを有する組成物を調製するために組成物にスパイクする。D-ダイマー未添加の組成物の試料を、一連の対照における基準値として利用し、また異なる量のスパイクD-ダイマーを有する試料を検査用の対照として利用する。本明細書において用いられる「上昇したレベルの」D-ダイマーなる用語は、典型的な内在性のD-ダイマー含量より上である、少なくとも200 ng/mL以上のD-ダイマー含量を指し、組成物のスパイク(すなわち、あらかじめ決められた上昇したD-ダイマー含量を有する対照組成物を産生するためのD-ダイマー量の添加)により達成される。心リスク評価および脳卒中評価に用いられる、例えばトロポニンI、CKMB、BNP、hsCRP、ホモシステイン、HDL、LDL、コレステロール、ならびにプロ-BNPなどの、他の生化学的マーカーもまた、組成物中にスパイクされてもよい。異なる上昇したD-ダイマー含有量を有する組成物を、その後、充填し、無菌的にふたをし、冷蔵する。

安定剤は、好ましくは赤血球組成物中に含まれるが、別個に添加されてもよい。適切な安定剤は、シアニド(例えば、青酸カリとして)およびフェリシアン化物(例えば、フェリシアン化カリウムとして)イオン類などの無機安定剤、およびセリンプロテアーゼ阻害剤を含むプロテアーゼ阻害剤、およびホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドなどの架橋剤などの有機安定剤を含む。

好ましくは、組成物は、1または複数の抗菌剤を含む。これらは、好ましくは加工血漿に組み入れられるが、組成物に別個に添加されてもよい。通常、抗菌剤の組合わせは、特定の組成物で用いられる。適した抗菌剤は、シプロフロキサシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、アミカシン、トブラマイシン、およびアンフォテリシンBを含む。

本発明のキットは、本発明の1または複数の組成物を含み、必要に応じ、上昇したレベルのD-ダイマーを含まないが類似した性質の組成物も含んでよい。定性分析において使用されるキットは、通常、上昇したレベルのD-ダイマーを有する組成物(「陽性試料」)とそうでないもの(「陰性試料」)を含む。定量分析用キットは、「低」、「中」、および「高」試料と呼ばれる、通常3つの組成物を含み、中および高の試料は異なる上昇したレベルのd-ダイマーを含み、低試料は上昇した量のD-ダイマーを含まない。

本発明を、組成物の特定の例およびそれらの性能ともに、本発明の組成物を調製する一般的な方法を含む、以下の例による非限定的な方法で示す。

一般的な方法：
赤血球の標本:
ヒトの濃縮赤血球細胞(RBCs)を、15℃で2500 RPMで20分間遠心分離する。遠心分離後、抗凝血物質を含む残留血漿を吸引し、濃縮細胞の上にある軟膜を取り除いた。その後、細胞を、エチレンジアミン四酢酸(EDTA) 6.4 g/L、MOPS 2.0 g/L、KFeCN 0.4 g/L、KCN 0.2 g/L、NaF 0.5 g/L、PEG 80.0 g/L、およびNaNO₃ 4.0 g/Lを含む等量の等張液中に再懸濁する。その後、再懸細胞を15℃で2500 RPMで20分間、再び遠心分離する。遠心分離後、懸濁液を吸引し、細胞を懸濁液中で再懸濁し、細胞を安定させるため2〜8℃で12週間保存する。

このインキュベーション期間後、安定化した赤血球を、その後、2〜8℃および2500 RPMで20分間遠心分離する。上清を除去後、濃縮細胞を等量の正常生理食塩水溶液中(NaCl 0.85 g/L、pH=7.2)で再懸濁し、遠心分離工程をもう一度繰り返した。最後の遠心分離サイクルで、上清を取り除き、濃縮赤血球を2〜8℃で保存する。この段階では、濃縮細胞の赤血球数は通常、> 6 x 10⁶RBCs/μLである。

加工血漿の標本：
正常ヒト血漿の単位をプールし、当技術分野において公知のように脱繊維化する。得られた血清の総タンパク質濃度(本明細書においてベースマトリックスと呼ぶ)を、その後、ベースマトリックスを濃縮または正常生理食塩水溶液でそれを希釈することにより、0〜約10 g/dLの範囲内の値、例えば6.0 g/dLへ調整する。ベースマトリックスのpHをその後、約4〜約9の範囲内の値、例えば約6.8〜7.0の値に調整する。酵素阻害剤アミノエチルベンゼンスルホニルフッ化物(AEBSF)を、最終濃度30 mg/Lでベースマトリックスに添加する。また、シプロフロキサシン(30 mg/L)、クロラムフェニコール(100 mg/L)、ゲンタマイシン(100 mg/L)、アミカシン(40 mg/L)、トブラマイシン(30 mg/L)、および/またはアンフォテリシンB(20 mg/L)などの抗菌剤(示されている標準値)をベースマトリックスに添加してもよい。pHを再び選択された値に調整し、ベースマトリックスにおける内在性D-ダイマーを、Stago Diagnostica STA-LIATEST D-DIアッセイなどの市販のアッセイを用いて決定する。ベースマトリックスの典型的な標本中の内在性D-ダイマー濃度は、通常、0.5μg/mLフィブリン完成品換算量(FEU)未満である。

特定の例：
脱繊維素ヒト血漿におけるD-ダイマー原液40〜80μg/mLを、天然ヒトD-ダイマーを用いて、即ち、2つの市販のアッセイの臨床方針決定値の濃度(Agen SimpliREDアッセイのD-ダイマーに関するカットオフ値は0.20μg/mL; Clearview Simplifyアッセイは0.08μg/mL)より上の濃度である、36〜44μg/mLのD-ダイマー濃度を有し、上昇したD-ダイマー組成物(「陽性レベル」もしくは「レベル2」)を調製するための6.8〜7.0のpHおよび6.0 g/dLのタンパク質含量を有する、上述のように調製されたベースマトリックスに結合することによって、調製された。ベースマトリックス組成物にD-ダイマーを添加せず、類似組成物(「陰性レベル」もしくは「レベル1」)を調製した。その後、被検物質濃度をスパイク溶液の添加後に決定し、ベースマトリックス組成物におけるD-ダイマー溶液のプールの再スパイクまたは希釈を介して、被検物質濃度に対する調節を行い、組成物の複数のレベルおよび臨床有用性を確実にした。各プールをその後、0.2μmのフィルターを通して無菌的に濾過し、2〜8℃で保存した。

上述のように調製された、安定しかつ濃縮した赤血球を、加工血漿中における赤血球の懸濁液を調製するために各プールに添加した。各プールの赤血球数を、3〜5 x 10⁶RBC/μLに調整した。各プールを滅菌処理前の小さなガラスバイアルに詰めて封をし、2〜8℃で保存した。

製品の性能：
表1は、D-ダイマーの定性的検出に関し、対照として使用する組成物の典型的なパイロット・ロットに関する回収データを含んでいる。

（表１）異なる検査法における製品の性能

このように、組成物は適切に機能した。

密封したバイアルにおける製品の保存安定性を、製品保存期限の予測に加速安定性モデルを用いて評価した。この目的ため、上記製品のバイアルを、上昇した温度(25℃)で(推奨保存温度は2〜8℃である)、被検物質の分解/劣化の観察用に予定された期間保存し、様々なインキュベーション期間の終わりにD-ダイマーについて測定した。これらの研究の結果、未開封状態で2〜8℃で保管すると製品は少なくとも1年間安定していることが予測された。

また、開封されたバイアルにおける製品の保存安定性を、臨床医による実際の使用条件をシミュレートすることにより評価した。これは、バイアルを2〜8℃で保存し、36日間の毎労働日に冷蔵庫からそれらを取り出し、バイアルを15分間室温と平衡にし、バイアルを開封し、実験室環境にそれらの内容物を曝し、その後バイアルを密封し、それらを2〜8℃での保存に戻すことにより行われた。バイアルの試料を、この研究の間測定した。表2は、すなわち、正確に行うために連続した組成物である、調製されたパイロット・ロットにおけるD-ダイマーに関する開封バイアルの安定性を示す。この研究の結果は、開封され2〜8℃で保存されると、製品が少なくとも36日間安定しうることを示す。

（表２）SimpliRED(登録商標)D-ダイマーアッセイを用いる、2〜8℃で組成物の開封バイアルにおける安定性

本発明の他の例は、非溶解性および溶解性の赤血球調製物を産生するため、高(2%)および低(0.01%)濃度のグルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドなどの赤血球固定化に通常用いられる安定剤架橋試薬として用いてもよい。さらに、動物血液、特に動物の赤血球細胞は、ヒトの血液を媒介する病原菌への潜在的暴露の危険性を最小化するために用いることができる。

通常、本発明に基づく組成物は、20〜60%のヘマトクリット値(HCT)(血液の全容量に対する赤血球の容量の比)、5〜17 g/dLのヘモグロビン濃度(Hgb)を有する。

本明細書に記載した実施例及び態様は例示のみを目的としていること、ならびに、それらに鑑みさまざまな修正または変更が当業者に示唆されるが、本出願の趣旨と範囲及び添付の特許請求の範囲に含まれることが理解される。

本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、及び特許出願は、すべての目的に関してその全文が参照によって本明細書に組み入れられる。

Claims

4〜9のpH、最大で10 g/dLのD-ダイマーを除く総タンパク質含量を有する脱繊維素血漿、赤血球、1または複数の安定剤、および内在性のD-ダイマーより上である、少なくとも200 ng/mL以上のD-ダイマー含量を含む、全血細胞組成物。
pHが6〜7である、請求項1記載の全血細胞組成物。
D-ダイマーを除く総タンパク質含量が3〜7 g/dLである、請求項1記載の全血細胞組成物。
赤血球がヒト赤血球である、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
D-ダイマーがヒトD-ダイマーである、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
血漿が哺乳動物血漿である、請求項1〜3いずれか一項記載の組成物。
1または複数の安定剤がプロテアーゼ阻害剤、架橋剤、シアン化物イオン、フェリシアン化物イオン、またはそれらの混合物を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
1もしくは複数の心リスク評価または脳卒中マーカーおよび血液凝固マーカーをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
(a)4〜9のpH、および最大で10 g/dLのD-ダイマーを除く総タンパク質含量を有する脱線維素血漿を含む加工血漿と
(b)安定化した赤血球組成物と
を組み合わせる段階、ならびに、
組成物のD-ダイマー含量が200 ng/mLより上になるように、D-ダイマーを続いて添加する段階
を含む、請求項1記載の組成物を調製する方法。
pHが6〜7である、請求項9記載の方法。
D-ダイマーを除く総タンパク質含量が3〜7 g/dLである、請求項9記載の方法。
赤血球がヒト赤血球であり、かつ血漿がヒト血漿である、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
対照物質として請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物を用いる段階を含む、全血に基づくD-ダイマーアッセイをモニタリングする方法。
対照物質として、一連の2またはそれ以上の前記組成物を用いる段階を含む方法であって、該組成物の各々が異なる増加量のD-ダイマーを有する、請求項13記載の方法。