KR102261148B1

KR102261148B1 - ABO 및 RhD 혈액형 표현형이 약화된 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 글루타르알데히드 처리 적혈구 생산방법

Info

Publication number: KR102261148B1
Application number: KR1020190077182A
Authority: KR
Inventors: 임영애
Original assignee: 아주대학교 산학협력단
Priority date: 2019-06-27
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2021-06-07
Also published as: KR20210002212A

Abstract

본 발명은 글루타르알데히드를 적혈구에 처리하여 ABO 및 RhD 혈액형 표현형을 동시에 약화시킨 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구 제조방법 및 제조용 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 글루타르알데히드를 적혈구에 처리하여 ABO 및 RhD 혈액형 표현형을 약화시켜 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구를 제공하는 것이다.

Description

ABO 및 RhD 혈액형 표현형이 약화된 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 글루타르알데히드 처리 적혈구 생산방법 {Production of Glutaraldehyde-treated red blood cells with weakened expression of ABO and RhD antigens for use as a quality control material in tube technique}

본 발명은 글루타르알데히드를 적혈구에 처리하여 ABO 및 RhD 혈액형 표현형을 약화시킨 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구 제조방법 및 제조용 조성물에 관한 것이다.

ABO 및 RhD 혈액형 검사는 환자 이식의 성공여부나 환자의 생명과도 직결되므로 검사의 정확성을 요구하는 매우 중요한 검사이다. 특히 약하게 표현되는 헌혈자의 ABO 아형들을 O형으로 간주하거나 환자의 RhD 변이형을 정상 RhD 양성으로 잘못 판정할 경우 수혈 시 환자에게 항체를 유발하거나 용혈수혈부작용을 초래할 가능성이 있다.

대한임상정도관리협회 수혈의학 프로그램에서는 2016년부터 특수항원검사 프로그램을 통하여 연 2회 ABO 아형 검사와 RhD 변이형을 검출하는 약 D 검사를 포함하고 있다. 그러나 2016 ~ 2018년도 ABO 아형 혈액형 검사의 정답율은 회차에 따라 각각 참여기관의 80.7% ~ 96.0%, 약 D 검사에 의도한 RhD 변이형을 보고한 기관은 34.8%~80.9%로 다른 수혈의학 프로그램 검사종목에 비하여 매우 낮은 정답율을 보였다. 특히 2017년에 발송된 약 D 검사 검체들은 모두 RhD 혈액형 검사에서도 정상 RhD 양성에 비해서는 약하지만 응집을 보인 RhD 변이형 검체였음에도 불구하고 이를 RhD 양성으로 보고한 기관들도 47.6%와 21.3%에 달하였으며, 2018년 2차에 발송된 RhD 항원이 약하게 표현된 RhD 변이형 검체를 RhD 음성으로 잘못 보고한 기관들도 63.8%에 달하였다. 이러한 자료는 모든 검사실에서 ABO와 RhD 혈액형 검사 시 내부정도관리물질로 사용하고 있는 4+ 응집 등급을 보이는 정상 적혈구 혈액형에 대한 응집 이외에도 ABO 아형이나 RhD 변이형에서 보이는 약한 응집을(예, 2+ 이하) 보이는 적혈구들도 실제 검사실에서 정도관리물질로 이용될 필요가 있음을 시사한다.

글루타르알데히드가 적혈구 ABO 항원을 감소시킨다는 보고 후에, 적혈구를 글루타르알데히드로 처리하는 시도들은 수혈용 만능공혈혈액 제조 혹은 적혈구 시약의 유효기간 연장 등의 목적으로 보고되었으며, 각 보고마다 제조 방법이 다양하였다. 특히 국내에서 글루타르알데히드를 이용하여 만능공혈혈액 목적의 적혈구제조 가능성에 대한 ABO혈액형과 RhD혈액형 항원 변형에 대한 보고가 있었기는 하나, 이는 만능공혈혈액 목적의 항원 변형의 실험실 연구로만 적용되었고, 혈구형 검사 시약의 역가 저하에 대하여 언급하였고, 2 ~ 3%의 높은 글루타르알데히드 용액을 사용하였는데 약화된 혈구 응집 등급 제시하지 못하였다.

또한 ABO 혈액형 검사용 약한 표현형의 정도관리물질 제조를 위하여 KODE 기술, glycosyltransferase 효소를 이용한 적혈구 H 항원의 변형 방법 등이 약한 ABO 혈액형을 발현하는 방법으로 보고되었으나 글루타르알데히드로 처리한 적혈구에 대한 보고는 없었다. 또한 이러한 화학적 혹은 효소를 이용한 방법은 탄수화물이 주 항원인 ABO 혈액형 항원에 국한되어 단백질이 주 항원인 RhD 혈액형 검사용 약한 표현형 정도관리물질 시도는 거의 전무하다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 시험관법 혈액형 검사용 적혈구 제조를 위하여 예의 연구 노력한 결과, 특정 농도의 글루타르알데히드가 ABO 및 RhD 혈액형 검사에 모두 약한 표현형을 나타내어 정도관리물질로 사용하기에 적합한 적혈구를 제조하는데 이용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 글루타르알데히드를 적혈구에 처리하여 ABO 및 RhD 혈액형 표현형을 약화시키는 단계가 포함되는, 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 글루타르알데히드를 유효성분으로 포함하는, 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구 제조용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 글루타르알데히드를 적혈구에 처리하여 ABO 및 RhD 혈액형 표현형을 동시에 약화시키는 단계를 포함하는, 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명의 다른 양태는 글루타르알데히드를 적혈구에 처리하여 ABO 및 RhD 혈액형 표현형을 약화시키는 단계를 포함하는, 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구 제조용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 용어, “글루타르알데히드(glutaraldehyde)”은 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물을 의미한다. 글루타르알데히드는 보존제 및 고정액로서 검사실에서 널리 사용되고 있는 물질이다. 8 개의 수소 원자, 5 개의 탄소 원자 그리고 2 개의 산소 원자로 구성되어 총 15 개의 원자로 형성되고, 분자에는 14 개의 화학결합이 있으며, 이는 6 개의 비수소결합, 2 개의 다중결합, 4 개의 단일결합, 2 개의 이중결합 그리고 2 개의 알데하이드(지방족)로 구성되어 있다.

[화학식 1]

본 발명의 용어, “적혈구”는 가운데가 패인 원반 모양을 한 세포로, 혈액 속에 존재하는 혈구중의 하나이다. 구체적으로, 적혈구는 폐에서 몸의 모든 세포들에게 산소 운반을 위해 특화된 도너츠 모양의 혈구로, 고도의 산소 보유능력을 가진 헤모글로빈이라는 단백질을 개당 약 2억 8천만 개를 포함하고 있다. 이를 통해, 한 개의 적혈구는 약 11억 2천만개의 산소 분자를 운반할 수 있다. 적혈구의 세포막 외벽에는 탄수화물, 지방 및 단백질의 혼합 구조물로 붙어 있으며, 상기 구조물들이 항원으로 작용하여 혈액형이 결정된다.

본 발명의 적혈구는 혈액형 항원이 약화된 ABO 아형이나 RhD 변이형과 유사한 표현형을 보이는데, 이는 글루타르알데히드가 적혈구막의 모든 종류의 항원을 가릴 수 있기 때문이며 농도가 높을수록 많이 가리게 되어 혈액형 항원이 약하게 나타나기 때문이다. 구체적으로, 본 발명의 용어 “ABO 아형이나 RhD 변이형”은 적혈구막의 항원의 수가 정상보다 적거나 항원이 질적으로 변형된 경우에 나타나게 되며, 대부분 유전적이나 질병 등의 후천적인 요인에 의해서도 생길 수 있다고 알려져 있다.

본 발명의 용어, “ABO 혈액형”은 1901년 오스트리아의 카를 란트슈타이너가 발견한 혈액형 구분법으로, ABO식에 따라 서로 구분되는 인간의 혈액형의 종류는 A형, B형, AB형 그리고 O형 네 가지가 있으며, 상기 AB형은 A_₁B 및 A_₂B형으로 나뉠 수 있다. 기본적으로 혈액형 항원과 항체 반응에 의한 혈구 응집 반응의 여부로 구분한다.

본 발명의 용어 “RhD 혈액형”은 적혈구의 D항원 유무에 따른 구분법으로, D 항원이 있으면 Rh 양성, D 항원이 없으면 Rh 음성으로 구분된다.

본 발명의 용어 “시험관법 혈액형 검사”는 ABO 혈액형 판정 검사 또는 RhD 혈액형 판정 검사 기법 중 하나이다. 구체적으로, 상기 ABO 혈액형 검사는 적혈구내의 항원을 검사하는 혈구형 검사와 혈청 내의 항체를 검사하는 혈청형 검사 두가지를 모두 시행하여야 하며, RhD 혈액형 검사는 혈구형 검사만 시행한다. 보다 구체적으로, 혈액형 검사는 슬라이드나 시험관을 이용하는 수기법이 다수의 기관에서 사용되고 있으며 시험관법이 슬라이드법 보다 정확하고 검사자들에게 검체 노출 위험이 없으므로 더 안전하다고 알려져 있다. 보다 구체적으로, 상기 모든 검사는 혈구응집을 기본으로 하고 있으며, 응집등급은 0, 0.5+(trace), 1+, 2+, 3+와 4+로 나뉘며, 혈액형 항원이 강할수록 혈액형 시약과의 반응에서 혈구응집이 강하여 혈구 응집등급도 증가하며, 정상 A형, B형과 AB형 및 RhD 양성은 혈액형 시약인 항-A, 항-B 및 항-D에 대부분 3+ 이상의 강한 혈구 응집을 보인다. 본 발명의 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구는 슬라이드법과 시험관법 혈액형 검사 모두에 사용할 수는 있으나 최근 도입된 원주응집법 등에는 사용할 수 없다.

본 발명의 용어 “정도관리용 적혈구”는 ABO 혈액형 또는 RhD 혈액형 판정 검사시 환자 검체와 동일하게 검사를 시행하는 이미 결과 값을 알고 있는 적혈구로서 매일 그 검사실에서 시행하는 혈액형 검사의 신뢰도를 확인해 주는 역할을 담당한다. 구체적으로, 항-A, 항-B 및 항-D 시약에 2+의 응집 등급을 보인다고 알려진 적혈구로 ABO 및 RhD 혈액형 검사를 시행하였을 때 만약 항-D 시약에서 예상된 2+가 아니라 0.5+의 응집 등급을 보였다면 당일 항-D 시약으로 시행하는 RhD 혈액형 검사를 신뢰할 수 없으므로 원인을 해결할 때 까지는 다른 환자 검체는 검사를 시행할 수 없다.

ABO 혈액형 검사와 RhD 검사 시, 3+ 이상의 적혈구 응집등급을 보이는 정상 적혈구들만이 실제 검사실에서 정도관리물질로 사용되고 있으므로, 이때 본 발명의 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구가 대신 혹은 추가로 정도관리물질로 사용될 수 있거나 약한 표현형을 검출할 수 있도록 검사실 직원의 교육용 물질로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 “정도관리”는 작업환경측정 및 건강진단에서 측정, 검진의 분석치에 대한 정확도와 정밀도를 확보하기 위하여 통계적 처리를 통한 일정한 신뢰범위 내에서 분석치를 관리하는 모든 수단을 의미한다.

본 발명의 글루타르알데히드를 적혈구에 처리하는 방법은 글루타르알데히드와 적혈구를 냉장상태에서 30분간 반응시키는 단계를 포함할 수 있으며, 글루타르알데히드를 추가하는 농도는 0.1 내지 0.35 부피%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, A_₁B형 RhD 양성 혈액형의 적혈구 농축액을 준비하고, 이를 0.25 %로 희석된 글루타르알데히드와 반응시켜 AB형 항원과 RhD 항원을 동시에 약화시킨 후 이 적혈구들을 ABO 혈액형 시약인 항-A와 항-B, RhD 혈액형 시약인 항-D의 시약과의 반응에서 모두 2+ 등급의 응집이 일어남을 확인하였으며 (도 1 내지 도 2), 0.25 %로 희석된 글루타르알데히드로 처리되어 표현형이 약화된 적혈구를 냉장보관하여 일주일 뒤 이 적혈구들을 ABO 혈액형 시약과 RhD 혈액형과 반응시켜도 약 2+ 등급의 응집등급이 유지되어, 일주일간 보관이 가능함을 확인하였다 (도 3).

본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 적혈구를 식염수로 세척하는 단계; (b) 상기 세척된 적혈구에 글루타르알데히드를 처리하는 단계; (c) 적혈구를 분리하는 단계; 및 (d) 상기 분리된 적혈구로 혈구부유액을 제조하는 단계를 포함하는, 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구 제조방법을 제공한다.

본 발명의 용어, “적혈구”, “글루타르알데히드”, “시험관법 혈액형 검사” 및 “정도관리용 적혈구”,는 상기에서 설명한 바와 같다.

보다 구체적으로, 보다 구체적으로, 상기 (a) 단계에서 적혈구는 A_₁B형 RhD 양성 EDTA 잔여 검체의 농축된 적혈구일 수 있으며, 그 양은 제조하고자 하는 적혈구 량과 비례하므로 이에 제한되지 않는다. 식염수는 pH 6 내지 8, 구체적으로는 7.3 내지 7.4일 수 있으며, 이를 사용하여 2500 내지 3500rpm, 구체적으로는 3000rpm의 조건에서 공지의 방법으로 세척할 수 있다. 또한, 세척 시간은 1 내지 10분, 구체적으로는 2 내지 5분간, 1 내지 5회 세척할 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.

상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 세척된 적혈구에 글루타르알데히드를 처리하는 단계로, 상기 글루타르알데히드는 0.1 내지 5%, 구체적으로는 0.1 내지 0.5%, 보다 구체적으로는 0.1 내지 0.35%로 희석된 글루타르알데히드일 수 있으며, 희석된 글루타르알데히드를 바람직하게는 1 내지 8도의 냉장상태에서 세척된 적혈구와 반응시킬 수 있다.

상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계의 반응물에서 적혈구를 분리하는 단계로, 구체적으로 냉장배양한 글루타르알데히드 처리 적혈구를 식염수를 이용하여 2500 내지 4000rpm, 구체적으로는 3000 내지 3500rpm으로 상층액으로 제거하는 단계일 수 있으며, 그 조건은 5 내지 20초, 구체적으로는 10 내지 18초간, 1 내지 5회 세척하여 상층액을 제거하는 것일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.

상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계에서 분리된 적혈구로 혈구부유액을 제조하는 단계로, 구체적으로는 식염수를 이용하여 1 내지 5%의 혈구부유액, 보다 구체적으로는 2 내지 5%의 혈구부유액을 제조하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 혈구부유액을 제조하는 방법은 통상적으로 널리 공지된 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명은 글루타르알데히드를 적혈구에 처리하여 ABO 및 RhD 혈액형 표현형을 약화시켜 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구를 제공하는 것이다.

도 1은 여러 농도의 글루타르알데히드에 의해 처리된 A_₁B형 RhD 양성 적혈구와 ABO형과 RhD 혈액형 시약들을 반응시켜 혈구 응집 등급을 확인한 사진이다. 0.25 %로 희석된 글루타르알데히드에 의해 처리된 적혈구가 ABO형과 RhD 혈액형 시약들에서 ABO 아형에서 흔히 보이거나 RhD 변이형을 의심하여 하는 2+ 등급의 혈구응집을 나타냄을 알 수 있다.
도 2는 여러 농도의 글루타르알데히드에 의해 처리된 10개의 A_₁B형 RhD 양성 검체의 적혈구와 다양한 혈액형 시약을 반응시켜 응집 등급을 0 ~ 4+까지 확인한 그래프이다. (괄호)안의 숫자는 10개 검체의 평균 혈구 응집 등급을 의미하는데 글루타르알데히드 농도가 강할수록 혈구응집 등급이 감소됨을 나타낸다.
도 3은 0.25%로 희석된 글루타르알데히드에 의해 처리된 10개의 A_₁B형 RhD 양성 검체의 적혈구를 7일간 냉장보관한 뒤, 다양한 혈액형 시약과 반응시켜 시간에 따른 응집 등급 변화를 보여주는 그래프이다. (괄호)안의 숫자는 10개 검체의 평균 혈구 응집 강도 의미한다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 적혈구 농축액 제조

검체로 사용할 적혈구를 준비하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 신선한 A_₁B형 RhD 양성인의 EDTA 잔여 검체의 농축된 적혈구를 파이펫을 이용하여 튜브에 1mL 담은 후, pH 7.3 ~ 7.4 인산완충식염수(phosphate buffer solution)로 3000rpm 조건에서 3분간, 3회 세척하여 적혈구 농축액을 준비하였다.

실시예 2. 희석된 글루타르알데히드 제조

적혈구 표현형 약화를 위한 글루타르알데히드의 적합한 농도를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 25% 글루타르알데히드를 멸균식염수로 희석하여 원하는 농도로 희석할 수 있으며, 보다 구체적으로, 0%, 0.5%, 0.375%, 0.3125%, 0.25% 및 0.125%로 희석하여 실시예 1에서 제조한 A_₁B형 RhD 양성 적혈구 농축액에 처리하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에서 볼 수 있듯이, 글루타르알데히드를 0% 처리한 적혈구를 항-A, 항-B, 및 항-D의 혈액형 시약들과 반응시키자 정상 4+ 등급의 강한 응집반응이 일어나고, 0.5%로 희석된 글루타르알데히드로 처리한 적혈구는 응집이 일어나지 않았다. 반면, 0.25%로 희석된 글루타르알데히드를 처리한 적혈구에서는 검사한 혈액형 시약에서 모두 2+ 등급의 응집이 일어난 것을 확인하였다 (도 1 및 도 2).

이를 통해, 0.25%로 희석된 글루타르알데히드가 적혈구 아형을 제조하는데 적합한 농도라고 사료되었고, 상기 농도의 글루타르알데히드로 하기 실험을 진행하였다.

실시예 3. 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구 제조

표현형이 변형된 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구를 제조하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

실시예 1 제조한 적혈구 농축액 1 mL와 실시예 2에서 희석시킨 글루타르알데히드를 30분간 냉장상태에서 반응시킨 후, 냉장배양한 글루타르알데히드 처리 적혈구를 인산완충식염수로 3400rpm 조건으로 15초간, 3회 세척하고 상층액을 제거한 뒤, 인산완충식염수를 이용하여 3 ~ 5% 혈구부유액을 제조하였다. 이렇게 제조된 글루타르알데히드 처리 적혈구를 7일이 지난 뒤에 시험관법 혈액형 검사를 시행하여도 약 2+의 응집 등급이 유지됨을 확인하여, 최소 일주일간 냉장보관이 가능함을 확인하였다 (도 3).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

글루타르알데히드를 적혈구에 처리하여 ABO 및 RhD 혈액형 표현형을 동시에 약화시키는 단계를 포함하는, 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 적혈구 제조방법으로,
상기 글루타르알데히드의 농도는 0.1 부피% 내지 0.35 부피%인 것이고,
상기 혈액형 검사의 정도관리는 검사 시약의 품질을 확인하기 위한 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 글루타르알데히드는 하기 화학식 I로 표시되는 것인, 제조방법.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 적혈구는 혈액형 검사의 신뢰도를 확인하기 위한 것으로,
상기 신뢰도 확인은 상기 적혈구를 혈액형 검사 시약과 반응시켜 응집등급이 1+ 내지 2+ 인 것으로 판별하는 단계를 포함하여 수행되는 것인, 제조방법.
삭제
글루타르알데히드를 유효성분으로 포함하는, 시험관 혈액형 검사의 정도관리를 위한 적혈구 제조용 조성물로,
상기 글루타르알데히드의 농도는 0.1 부피% 내지 0.35 부피%인 것이고,
상기 혈액형 검사의 정도관리는 검사 시약의 품질을 확인하기 위한 것인, 조성물.
삭제