EA011481B1 - Эритроциты, имеющие ферментативно уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови системы аво, способ их получения и применение - Google Patents

Эритроциты, имеющие ферментативно уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови системы аво, способ их получения и применение Download PDF

Info

Publication number
EA011481B1
EA011481B1 EA200501323A EA200501323A EA011481B1 EA 011481 B1 EA011481 B1 EA 011481B1 EA 200501323 A EA200501323 A EA 200501323A EA 200501323 A EA200501323 A EA 200501323A EA 011481 B1 EA011481 B1 EA 011481B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antigen
expression
blood group
blood
erythrocytes
Prior art date
Application number
EA200501323A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501323A1 (ru
Inventor
Стивен Майкл Генри
Лисса Гуинет Гилливер
Original Assignee
Коуд Биотек Лимитид
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Коуд Биотек Лимитид filed Critical Коуд Биотек Лимитид
Publication of EA200501323A1 publication Critical patent/EA200501323A1/ru
Publication of EA011481B1 publication Critical patent/EA011481B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0641—Erythrocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/96—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood or serum control standard
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Способ получения эритроцитов, экспрессирующих уменьшенные уровни антигенов групп крови, с использованием по меньшей мере одного модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента, например альфа-N-ацетилгалактозаминидазы или альфа-галактозидазы. Полученные эритроциты предпочтительно экспрессируют уровень антигена, по существу, эквивалентный клинически значимому порогу для этого антигена. Эритроциты, полученные в соответствии с указанным способом, используют для контроля качества реагентов для определения группы крови и калибровки тестирующих систем для обеспечения точных и стандартизованных определений групп крови.

Description

Данное изобретение относится к клеткам с модифицированными уровнями экспрессии антигенов групп крови. В частности, данное изобретение относится к способу получения таких клеток и их применению в контроле качества реагентов для определения группы крови и калибровке и оценке пригодности анализов гематологии, иммуногематологии и иммунологии.
Уровень техники
Функцией центров крови является тестирование крови для точного определения типа группы крови индивидуума, из которого эта кровь (или другой продукт) получена. Точное и правильное знание типа группы крови является существенным для различных терапий, в том числе для переливания крови, трансплантации органов и лечения гемолитических заболеваний новорожденного.
Например, тип группы крови индивидуума должен быть определен перед трансфузией крови. Несовпадение типов групп крови между донором и реципиентом может иметь гибельные последствия, потенциально приводящие к смерти трансфузируемого индивидуума, т. е. реципиента.
Классифицирование АВО-групп крови представляет наиболее важные эритроцитарные (ВВС) типы групп крови в серологии трансфузии крови человека. Люди принадлежат к одной из четырех основных групп: А, В, АВ и О. ВВС каждой группы, соответственно, несут А-антиген, В-антиген, как А-, так и Вантигены или ни А-антиген, ни В-антиген.
В крови индивидуума присутствуют антитела против антигена или антигенов АВО-групп крови, которые отсутствуют в ВВС крови этого индивидуума. Так, индивидуумы группы А имеют антитела против В, индивидуумы группы В имеют антитела против А, индивидуумы группы 0 имеют антитела против А и антитела против В, а индивидуумы группы АВ не имеют ни антител против А, ни антител против В.
Перед трансфузией крови из донора реципиенту кровь должна быть проверена на совместимость. Это достигается либо выполнением прямого испытания крови донора против сыворотки реципиента, либо проверкой на совместимость крови со ссылкой на записи в больничной карте типов групп крови донора и реципиента. Проверка на совместимость является необходимой для гарантии того, что ВВС одного типа группы крови не будут введены индивидууму, имеющему антитело против антигенов этого типа группы крови.
Исторически, тест на совместимость (перекрестная проба) прямым тестированием эритроцитов донора против сыворотки реципиента мог бы детектировать несовместимость между слабой подгруппой, ошибочно определенной и предназначенной для трансфузии несовместимому пациенту. Однако тест на совместимость крови донора и реципиента (перекрестная проба) прямым тестированием выполняется в настоящее время менее часто, и вместо этого точное определение группы крови выполняют во многих центрах.
В серологии групп крови определение типа ВВС осуществляют с использованием реагентов, содержащих антитела против специфических антигенов (что известно как прямое определение группы крови), и сыворотку испытывают против ВВС, экспрессирующих известные антигены (что известно как обратное определение группы крови).
Моноклональные антитела (тАЬ) использовали в качестве реагентов для определения группы крови с 1980-ых годов. При сравнении традиционных поликлональных антисывороток моноклональные реагенты предоставляют увеличенную специфичность, более устойчивую реактивность и, в большинстве случаев, увеличенную чувствительность.
Контроль качества реагентов для определения группы крови является существенным для точного и надежного определения группы крови. Реагенты для определения группы крови могут страдать уменьшением специфичности и/или чувствительности во время транспортировки и хранения или в результате загрязнения во время приготовления и использования.
В природе существуют различные АВО-подгруппы, которые экспрессируют низкие уровни Аи/или В-антигена. Уровни экспрессии антигена в каждой из этих подгрупп являются вариабельными и обычно неизвестными, если не выполняют обширный анализ. Принимается, что уровни А-антигена группы крови для обычных и редких А-подгрупп обычно находятся в следующих диапазонах (молекулы антигена на один эритроцит):
А1, 8 х 10® — 1,2 x10е;
А2, 1,5 х 106 — 4 х 105;
АЗ, 4 хЮ4-1,2 10е;
Ах, 7 х 103 - 104;
Аепс1, 2 х 103 - 3 х 103;
Ат, 102-2х 103; и
Аа1, 102-1,5 х 103.
- 1 011481
Соответствующие диапазоны существуют для В-подгрупп. Реагенты для определения групп крови должны быть способны детектировать все клинически значимые АВО - подгруппы.
Для целей контроля качества реагенты для определения группы крови испытывают против КВС. Для этой цели КВС с низким уровнем экспрессии антигена являются предпочтительными в качестве клеток контроля качества (по-другому называемых реагентами контроля).
КВС, экспрессирующие низкий уровень антигена, являются предпочтительными, так как они могут обеспечивать лучшее указание эффективности, сходной с эффективностью реагента, являющегося моноклональным антителом, при использовании в анализах определения группы крови.
Эти КВС могут быть использованы в качестве клеток контроля качества для детектирования порчи реагентов, где эта порча может привести к неспособности детектирования КВС из групп крови, экспрессирующих низкие уровни антигена, например, КВС А2-группы, экспрессирующие антиген при уровне в нижней стороне принятого диапазона, с вытекающим отсюда неправильным определением группы крови.
Эти КВС могут быть также использованы для калибровки и оценки пригодности тестирующих систем для гарантии того, что все АВО-группы и подгруппы клинической важности могут быть детектированы.
Использование КВС природно встречающихся АВО-подгрупп, которые экспрессируют низкие уровни А- и/или В-антигена, в качестве клеток контроля качества является на практике затруднительным. Индивидуумы с этими фенотипами имеют очень низкую частоту встречаемости в популяции. Например, индивидуумы фенотипа Ах оцениваются как 0,003% индивидуумов А-фенотипа. Присутствие других подгрупп часто обнаруживает даже еще более низкую встречаемость.
В отсутствие клеток, экспрессирующих низкие уровни антигена, реагенты для определения группы крови оцениваются посредством тестирования против нормальных клеток. (Оно включает в себя использование КВС, экспрессирующих относительно высокие уровни антигена, и не дает какого-либо указания в отношении чувствительности); или разведения реагентов для определения группы крови. (Оно включает в себя разведение реагента для определения группы крови и тестирование против нормальных клеток).
Многие лаборатории просто полагаются на контроль качества поставщиков реагентов тестирования.
При оценке реагентов для определения групп крови разведение реагентов для определения групп крови является обычной практикой. Однако, лаборатории могут все же использовать тест-реагенты для определения группы крови только одной партии на недельной или месячной основе.
Разведение реагентов для определения групп крови и тестирование против нормальных клеток имеет сомнительную основу. Нормальные клетки экспрессируют высокие уровни антигена, например, в пределах >1,5 х 105 молекул антигена на один эритроцит. При тестировании реагентов для определения группы крови эти реагенты разводят, чтобы показать, что при низком разведении они все еще могут реагировать с этими КВС и давать серологически положительный результат. Результаты экстраполируют для определения уровня детектирования антигена при нормальном разведении.
Кроме того, что этот способ занимает много времени, он имеет слабое место, так как он предполагает, что предсказанная чувствительность реагента для определения группы крови распространяется на детектирование КВС, экспрессирующих низкие уровни антигена. Порча реагента не может быть детектирована, пока фактическая чувствительность реагента для определения групп крови не будет в достаточной степени ниже чувствительности, которая требуется для детектирования некоторых из АВОподгрупп. Детектирование этой степени порчи реагента возможна только в том случае, если предпринимают дополнительные занимающие много времени исследования с использованием разведений.
Следует также отметить, что реагенты в виде моноклональных антител часто являются биклональными и приготовленными таким образом, чтобы обеспечить специфические характеристики эффективности. Хорошо известно, что некоторые клоны являются лучшими, чем другие, в детектировании АВОподгрупп. Вследствие этого реагенты часто готовят в виде смесей. При разведении реагентов для определения группы крови присущие им свойства эффективности сводятся на нет.
В отсутствие надежного тестирования реагентов для определения групп крови лаборатории полагаются на рекомендации изготовителя и историческую эффективность конкретного реагента.
В отсутствие ясного контроля качества реагентов для определения группы крови, определение группы крови может выполняться с использованием реагентов, которые испортились, и клинически важная подгруппа может быть определена неправильно. Альтернативно, реагент может быть испорчен таким образом, что он неспособен детектировать КВС обычных групп крови, экспрессирующих антиген при уровнях ближе к нижней стороне принятого диапазона.
При применении во время трансфузии такая кровь может вызывать от мягкой до тяжелой реакции трансфузии, в том числе возможность смерти трансфузируемого индивидуума.
Очевидно, что существует потребность в надежном обеспечении КВС, экспрессирующих низкие уровни антигена, для применения в качестве клеток контроля качества. Не допускающий возражений
- 2 011481 контроль качества реагентов для определения группы крови и калибровка систем тестирования для получения точных и стандартизованных определений типов групп крови являются существенными для минимизации риска нанесения вреда трансфузируемым индивидуумам.
Эта необходимость подчеркивается общим смещением в сторону лабораторий, укомплектованных многосторонне квалифицированными техниками, которые не имеют обширной практики в области трансфузии крови. Это приведет к увеличению уверенности в не допускающем возражений тестировании, а не к знанию прошлых эксплуатационных качеств реагента для определения группы крови.
Целью данного изобретения является обеспечение эритроцитов для применения для контроля качества реагентов для определения группы крови и калибровки и оценки пригодности тестирующих систем, или по меньшей мере обеспечение общественности возможностью полезного выбора.
Сущность изобретения
Данное изобретение состоит из следующих аспектов.
В первом аспекте данное изобретение обеспечивает эритроциты с ферментативно уменьшенным уровнем экспрессии антигена, предпочтительно в которых этот уменьшенный уровень экспрессии антигена является по существу эквивалентным уровню экспрессии антигена в эритроцитах природной АВОгруппы или подгруппы, используемые для контроля качества серологических анализов определения группы крови и оценки реагентов и/или систем определения групп крови.
Эритроциты с ферментативно уменьшенным уровнем экспрессии антигена получают ίη νίΐτο.
Уменьшенный уровень экспрессии антигена является предпочтительно, по существу, эквивалентным серологическому результату, получаемому для клеток, экспрессирующих менее чем 5 х 105 копий антигена на один эритроцит, более предпочтительно менее чем 1 х 105 копий антигена на один эритроцит, наиболее предпочтительно менее, чем 2 х 104 копий антигена на один эритроцит.
Предпочтительно этот уменьшенный уровень экспрессии антигена является, по существу, эквивалентным клинически значимому порогу для этого антигена.
Уменьшенный уровень экспрессии антигена является предпочтительно эквивалентным серологическому результату, получаемому для клеток, экспрессирующих более чем 1 х 102 копий антигена на один эритроцит, более предпочтительно более чем 1 х 103 копий антигена на один эритроцит.
Предпочтительно иммунодоминантным сахаром антигена является альфа-связанный Νацетилгалактозамин или альфа-связанная галактоза, связанные с Н-антигеном.
Предпочтительно антиген является антигеном типа группы крови, более предпочтительно Аантигеном или В-антигеном.
Уменьшенный уровень экспрессии антигена предпочтительно соответствует уменьшенной на 2-3 единицы оценке агглютинации при определении типа эритроцитов в анализе на основе реакции агглютинации.
Предпочтительно ферментативно уменьшенный уровень антигена достигается применением по меньшей мере одного модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента. Более предпочтительно, ферментативно уменьшенный уровень антигена достигается применением фермента, который расщепляет альфа-1-3-связи. Наиболее предпочтительно, ферментативно уменьшенный уровень антигена достигается применением альфа-№ацетилгалактозаминидазы, или альфа-галактозидазы, или комбинации обеих.
Уменьшенный уровень экспрессии антигена предпочтительно соответствует уменьшению результата реакции агглютинации, по существу эквивалентной оценке реакции агглютинации, когда определение типа встречающихся в природе эритроцитов слабо или плохо экспрессирующей АВО-группы или подгруппы осуществляют в одном и том же анализе на основе агглютинации.
Предпочтительно эритроциты являются эритроцитами человека.
Предпочтительно эритроциты находятся в виде суспензии.
Предпочтительно суспензия содержит клеточный консервант, такой как Се1рге§о1.
Предпочтительно суспензия содержит компоненты для обеспечения дополнительных контрольных характеристик, такие как клинически значимые антитела.
В одном предпочтительном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает суспензию эритроцитов, проявляющих ферментативно уменьшенный уровень экспрессии антигена, предпочтительно, где уменьшенный уровень экспрессии антигена является, по существу, эквивалентным уровню экспрессии антигена встречающегося в природе фенотипа эритроцитов. Более предпочтительно, уменьшенный уровень экспрессии антигена является, по существу, эквивалентным клинически значимому порогу для этого антигена.
Предпочтительно эритроциты используют в качестве клеток контроля качества.
Предпочтительно суспензию используют в качестве контрольного реагента для контроля качества реагентов для определения группы крови и/или калибровки и оценки пригодности систем тестирования.
Во втором аспекте данное изобретение обеспечивает способ получения эритроцитов, экспрессирующих уменьшенный уровень антигена, предусматривающий стадии:
контактирования раствора по меньшей мере одного модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента с эритроцитами с начальным уровнем экспрессии антигена для обеспечения смеси;
- 3 011481 инкубирования смеси при температуре в течение времени, достаточных для уменьшения уровня экспрессии антигена до уменьшенного уровня; и обработки суспензии для предотвращения дополнительного уменьшения уровня экспрессии антигена.
Предпочтительно уменьшение уровня экспрессии антигена определяют периодическим взятием проб и тестированием смеси.
Предпочтительно тестирование осуществляют с использованием анализа на основе реакции агглютинации.
Предпочтительно суспензию обрабатывают для предотвращения дополнительного уменьшения уровня экспрессии антигена, когда этот уменьшенный уровень экспрессии антигена соответствует уменьшению оценки агглютинации на 2-3 единицы, когда определение типа эритроцитов осуществляют в анализе с помощью реакции агглютинации.
Предпочтительно начальный уровень экспрессии антигена для экспрессирующих антиген эритроцитов является эквивалентным серологическому результату, полученному для клеток, экспрессирующих более чем 5 х 105 копий антигена на один эритроцит.
Предпочтительно экспрессирующие антиген эритроциты, контактируемые с раствором по меньшей мере одного модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента, являются эритроцитами Агруппы.
Предпочтительно экспрессирующие антиген эритроциты, контактируемые с раствором по меньшей мере одного модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента, являются эритроцитами Вгруппы.
Предпочтительно экспрессирующие антиген эритроциты, контактируемые с раствором по меньшей мере одного модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента, являются эритроцитами АВгруппы.
Предпочтительно обработкой является промывание эритроцитов для удаления модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента.
Предпочтительно уменьшенный уровень экспрессии антигена является по существу эквивалентным клинически значимому порогу для этого антигена.
Уменьшенным уровнем экспрессии антигена предпочтительно является уровень менее чем 5 х 105 копий антигена на один эритроцит, более предпочтительно менее чем 105 копий антигена на один эритроцит, наиболее предпочтительно менее чем 2 х 104 копий антигена на один эритроцит.
Уменьшенным уровнем экспрессии антигена предпочтительно является уровень более чем 102 копий антигена на один эритроцит, более предпочтительно более чем 103 копии антигена на один эритроцит.
Предпочтительно иммунодоминантным сахаром этого антигена является альфа-связанный Νацетилгалактозамин или альфа-связанная галактоза, связанные с Н-антигеном.
Предпочтительно этот антиген является антигеном типа группы крови, более предпочтительно Аантигеном или В-антигеном.
Предпочтительно этот фермент является по меньшей мере одним модифицирующим иммунодоминантный сахар ферментом. Более предпочтительно этот фермент расщепляет альфа-1-3-связи. Наиболее предпочтительно этот фермент является альфа-№ацетилгалактозаминидазой, или альфа-галактозидазой, или комбинацией обеих.
Уменьшенный уровень экспрессии антигена предпочтительно соответствует уменьшенной оценке агглютинации, по существу эквивалентной оценке агглютинации, когда определение типа встречающихся в природе эритроцитов слабо или плохо экспрессирующей АВО-подгруппы осуществляют в одном и том же анализе на основе реакции агглютинации.
Предпочтительно эти эритроциты являются эритроцитами человека.
В третьем аспекте данное изобретение обеспечивает эритроциты, экспрессирующие ферментативно уменьшенный уровень антигена, полученные способом второго аспекта данного изобретения.
В четвертом аспекте данное изобретение обеспечивает способ контроля качества реагента для определения группы крови, предусматривающий контактирование реагента для определения группы крови с суспензией эритроцитов по первому или третьему аспекту данного изобретения и оценку результата реакции агглютинации.
Предпочтительно эта оценка является оценкой посредством визуализации количества агглютинации.
Предпочтительно этот способ повторяют для диапазона разведений реагента для определения группы крови.
Необязательно, этот процесс может включать стадию определения уровня антигена, экспрессируемого эритроцитами, посредством ссылки на эритроциты, экспрессирующие известный уровень антигена. Эритроциты, экспрессирующие известный уровень антигена, могут быть получены по способу, описан
- 4 011481 ному в международной заявке на патент ΡΟΤ/ΝΖ02/00219.
В пятом аспекте данное изобретение обеспечивает комплект или набор, содержащий две или более суспензий эритроцитов в соответствии с первым или третьим аспектами данного изобретения.
Предпочтительно, комплект или набор содержит контроли чувствительности, включающие эритроциты по первому или третьему аспекту данного изобретения, экспрессирующие антигены группы А или В. Более предпочтительно суспензии содержат консервант клеток, такой как Сс1ргс5о1. Наиболее предпочтительно, суспензии содержат компоненты для обеспечения дополнительных контрольных характеристик, такие как клинически значимые антитела.
Необязательно, комплект или набор содержит дополнительно контроли чувствительности, в том числе эритроциты, экспрессирующие антигены Кй ЭСсе (К1т) и Кй се(гг).
Теперь данное изобретение будет объясняться подробно.
Подробное описание
Иммунодоминантным сахаром А-антигена является альфа-связанный Ν-ацетилгалактозамин. Иммунодоминантным сахаром В-антигена является альфа-связанная галактоза. Эти иммунодоминантные сахара связаны с Н-антигеном.
Ферментативное удаление или модификация иммунодоминантного сахара приводит к потере исходной антигенности. Таким образом, уровень экспрессии А-антигена или В-антигена эритроцитами типа групп крови А, В или АВ может быть ферментативно уменьшен.
Ферментативное расщепление антигенов основано на установленных принципах, что ферменты (гликозидазы) могут специфически деградировать углеводные антигены на мембранах эритроцитов без разрушения структур, не являющихся мишенями, например, белков или углеводов, со связями, на являющимися мишенями.
Денатурирующие ферменты использовали ранее для удаления антигенов типов групп крови АВО из КВС в попытке превращения клеток группы А и группы В в клетки группы О. Исследователи удаляли большинство или почти все антигены КВС с использованием высоких концентраций фермента.
Эти клетки с удаленными антигенами могли бы потенциально использоваться в качестве «универсальных» донорных единиц крови для целей трансфузии (ΌανΑ 1997; Со1б81еш 1989; НоЬЬк 1996; Но8кш8 1995; Бейлу 1991а; ΖΙπ.ι 1996). «Кровь с удаленными антигенами» была успешно испытана в трансфузиях, хотя и не используется рутинным образом в настоящее время (Со1бйеш 1982; Бейлу 1991Ь; Бейлу 1994).
Способы, описанные этими авторами, не обеспечивают эритроциты, экспрессирующие уменьшенный, но имеющий предел уровень антигена, когда уровень экспрессируемого антигена находится на клинически значимом пороге или выше клинически значимого порога. Фактически, эти способы стремятся обеспечить эритроциты, экспрессирующие уровень антигена, который равен нулю или, по меньшей мере, не превышает клинически значимого порога.
В соответствии с описанным здесь изобретением эритроциты, экспрессирующие ферментативно уменьшенные уровни А- и/или В-антигена, получают ίη νίΙΐΌ. Могут быть получены эритроциты, которые являются серологически эквивалентными эритроцитам встречающихся в природе АВО-подгрупп в отношении экспрессии А- и/или В-антигена.
Условия расщепления, такие как время инкубации, температура, активность фермента и отношение КВС к ферменту, изменяют для контроля степени уменьшения в уровне экспрессии антигена. Время для ферментативного расщепления антигенов в клеточных мембранах этих клеток также зависит от относительных концентраций раствора фермента и начального уровня экспрессии этих антигенов на клетке.
Изменения в концентрации фермента могут быть использованы для контроля полученного уровня экспрессии антигена. Если желательными являются слабые А- или слабые В-клетки, то могут быть использованы высокие концентрации раствора фермента. Если требуются сильно агглютинирующие клетки, то могут быть использованы низкие концентрации раствора фермента.
Обычно, клетки для контроля качества для использования в трансфузионной медицине получают из клеток группы А или В, где ферменты удаляли количества А- и/или В-антигена для обеспечения оценок специфической реакции в анализах детектирования антигена. Эти анализы могут включать в себя способы с использованием плитки, пробирки, гелевой пластинки (де1 сатб) и микропланшета, и любой манипулируемой вручную или автоматизированной платформы, которая использует агглютинацию, или любой другой способ детектирования антигена (например, твердофазный иммуноферментный анализ, проточную цитометрию и т.д.).
Обычно используют условия, которые обеспечивают КВС, которые дают серологический результат в анализе на основе агглютинации приблизительно 2+. Фактический необходимый серологический результат зависит от чувствительности используемой системы анализа, например плитка против автоматики.
Прогрессирование расщепления может быть подвергнуто мониторингу посредством периодического взятия проб и выполнения анализа на основе агглютинации. Как только условия расщепления установлены в масштабе испытания, могут быть получены большие объемы эритроцитов, экспрессирующих ферментативно уменьшенные уровни экспрессии антигена, для применения в качестве клеток контроля
- 5 011481 качества.
Агглютинация является одной мерой для детектирования антигена. Агглютинация представляет собой образование конгломератов эритроцитов, вызываемое антителом, сшивающим антигены на различных клетках. Агглютинация может быть визуализирована в ручном способе (с использованием глаз) или в автоматизированных способах с использованием анализаторов групп крови. Визуализация может быть усилена с использованием определенных ферментов или с использованием радиоактивных или флуоресцентных меток.
Выполняемые вручную реакции агглютинации оценивают в соответствии со следующей схемой:
Оценка агглютинации Наблюдение (Единицы)
- вообще нет конгломератов
(+) неясный результат
+ (т.е. 1+) очень малые конгломераты
++(т.е. 1+) несколько малых конгломератов
+++ (т.е. 3+) один большой конгломерат, окруженный
малыми конгломератами
++++ (т.е. 4+) один единственный большой конгломерат
Оценкой уровня агглютинации может быть оценка прямой агглютинации или оценка опосредованной агглютинации, где используют способ индукции агглютинации, такой как потенциирование или использование молекул антиглобулина.
Эритроциты, экспрессирующие ферментативно уменьшенный уровень антигена, где этот уменьшенный уровень экспрессии антигена является серологически, по существу, эквивалентным уровню экспрессии антигена эритроцитов встречающейся в природе АВО-подгруппы, обеспечивают конкретные преимущества и пользу при использовании в качестве клеток контроля качества, как это обсуждалось.
При необходимости фактические уровни экспрессии антигена (молекулы антигена на эритроцит) в клетках контроля качества могут быть определены посредством ссылки на эритроциты, в которых уровень экспрессии антигена является известным. Эти ссылочные эритроциты могут быть встречающимися в природе слабыми или плохо экспрессирующими клетками АВО-подгруппы или эритроцитами, экспрессирующими известный уровень антигена и полученными по способу, описанному в ΡΓΤ/ΝΖ02/00219.
Должно быть понятно, что фактический уровень экспрессии антигена в клетках контроля качества не должен быть обязательно известным. Клетки контроля качества используются для оценки и детектирования ухудшения в работе реагентов для определения группы крови. Важным является уменьшенный, но имеющий предел уровень экспрессии антигена в клетках контроля качества.
Могут быть получены клетки контроля качества с различными уровнями экспрессии антигена. Уровень экспрессии антигена для одной популяции клеток контроля качества может быть выбран таким образом, что он находится на клинически значимом пределе, при котором неуспех детектирования антигена может приводить к клинически значимой реакции трансфузии. Уровень экспрессии антигена для другой популяции клеток контроля качества может быть выбран таким образом, что он находится на уровне, который будет гарантировать доверительный уровень в детектировании слабых подгрупп.
Вместе эти клетки контроля качества могут быть использованы для оценки эффективности тестов определения АВО-групп крови, делая уровни чувствительности измеримыми по всему диапазону. Такие контроли чувствительности могли бы также использоваться для калибровки высокочувствительных машин или даже могли бы использоваться в проточном цитометрическом анализе для кривых для определения количества антигена. Это может гарантировать обеспечение более надежно определенных АВОгрупп крови.
Данное изобретение обеспечивает возможность сделать контроль качества стандартизированным и совпадающим по всему миру. Это могло бы позволить сравнивать работу различных лабораторий и эффективность различных методологий. Включение клеток контроля качества в ТгаийГийюи 8ето1оду Оиа111у Аййигаисе Ртодгашшей могло бы установить «стандарт» для контроля качества тестирования АВОгрупп крови.
Клетки контроля качества данного изобретения могут быть включены в комплект или набор, используемые для оценки определения группы крови фенотипов группы А (слабых) и фенотипов группы В (слабых). Этот комплект или набор мог бы дополнительно включать клетки контроля качества, используемые для оценки определения группы крови фенотипов Ей ЭСее (КТт) и Ей се (гг).
- 6 011481
Применение этих комплектов или наборов гарантировало бы, что реагенты для определения АВО- и ВйО-групп крови могли бы контролироваться по качеству. Другие комплекты или наборы, включающие клетки контроля качества, экспрессирующие антиген в диапазоне уровней, могут быть полезными для более специализированных лабораторий.
Жидкость для ресуспендирования, используемая при приготовлении суспензий клеток контроля качества, может содержать клинически значимые антитела. Таким образом, могут быть введены дополнительные характеристики контроля, такие как контроль действующего одновременно антитела.
Следующие определения и объяснения обеспечены для помощи в понимании данного описания и предполагаемого заявленного объема данного изобретения.
«Клинически значимый порог» является уровнем экспрессии антигена эритроцитами, ниже которого неуспех детектирования антигена не будет иметь клинической значимости при трансфузии крови.
«Фермент, модифицирующий иммунодоминантный сахар», относится к ферментам, которые модифицируют антигенную детерминанту для А- или В-антигена и тем самым уменьшают уровень экспрессии антигена. Примеры модифицирующих иммунодоминантный сахар ферментов включают альфа-Νацетилгалактозаминидазу и альфа-галактозидазу.
«Ферментативно уменьшенный уровень экспрессии антигена» относится к уровню экспрессии антигена, полученному в результате ферментативного расщепления ίη νίίτο антигенов, экспрессируемых на поверхности клетки.
«Экспрессия антигена» относится к присутствию на поверхности клетки антигена, а «уровень экспрессии антигена» обозначает количество антигена, присутствующего на поверхности клетки.
«Клетки контроля качества» являются экспрессирующими антиген клетками, обычно эритроцитами, используемыми для оценки работы реагентов для определения группы крови и калибровки и оценки пригодности тестирующих систем. Примерами клеток контроля качества данного изобретения являются модифицированные ферментами клетки, описанные в примерах 1, 2 и 3.
Когда делается ссылка на уровень экспрессии антигена, являющийся «по существу эквивалентным», это следует понимать таким образом, что это относится к уровню экспрессии антигена, который будет обеспечивать, по существу, эквивалентный результат в серологическом анализе.
Когда уровень экспрессии антигена определяется ссылкой на количество копий на один эритроцит, это следует понимать таким образом, что это относится к уровням экспрессии антигена, которые являются общепринятыми уровнями экспрессии антигена на известных АВО-подгруппах, или к уровню экспрессии антигена, который может обеспечивать серологический результат, эквивалентный клеткам известных АВО-подгрупп.
Когда термины «высокий» и «низкий» относятся к уровню экспрессии антигена, эти термины предназначены для различения между уровнями антигена, экспрессируемыми обычными АВО-подгруппами, такими как А1, и уровнями антигена, экспрессируемыми менее обычными, слабо или плохо экспрессирующими антиген АВО-подгруппами.
Теперь данное изобретение будет проиллюстрировано при помощи примеров.
Пример 1. Ферментативное уменьшение уровня экспрессии В-антигена α-галактозидазой единиц α-галактозидазы, экстрагированной из зеленых кофейных бобов, приобретали у С1усо (Са1. Νο. Х-5001).
100 мкл ВВС АВ-группы крови промывали 3х забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР). Контрольная реакция (с1г1):
мкл эритроцитарной массы добавляли к 40 мкл 100 мМ цитрат-фосфатного буфера, рН 6,5, и 22,5 мкл 500 мМ цитрат-фосфатного буфера, рН 6,5. Ферментативая реакция (οηζ):
мкл эритроцитарной массы добавляли к 40 мкл (4 Е) α-галактозидазы в 100 мМ цитратном буфере, рН 6,5, и 22,5 мкл 500 мМ цитрат-фосфатного буфера, рН 6,5.
Эти смеси инкубировали в водяной бане при 37°С с перемешиванием время от времени. Реакцию останавливали при временных интервалах (6 ч и 9 ч) взятием аликвоты, эквивалентной 15 мкл эритроцитарной массы, и промыванием этих клеток 3х в ЗФР, содержащем 1% БСА.
мкл эритроцитарной массы ресуспендировали в 1 мл С’еМаЬ (раствора, консервирующего клетки) и использовали для оценки разведений реагента для определения группы крови (антисыворотки).
Промытые клетки из контрольной реакции или ферментативной реакции ресуспендировали до 0,8% в Се181аЬ (Όίαιηοά). 50 мкл этой 0,8% суспензии переносили в Э|атсб Сагб, и 50 мкл антисыворотки против реагента для определения В-группы крови (А1Ьа с1опе, 8соЙапб), разведенной 1:4, 1:32 и 1:512, добавляли, соответственно.
Эти смеси инкубировали в течение 5 мин, и затем Э|атеб Сагб центрифугировали в иммунофуге Э|атеб в течение 10 мин в соответствии со стандартным протоколом.
Реакции агглютинации оценивали в баллах в соответствии с инструкциями изготовителя.
- 7 011481
Таблица 1. Результаты агглютинации для разведенной антисыворотки против реагента для определения В-группы крови (А1Ьа с1опе, 8со11анб), тестированной против модифицированных α-галактозидазой (сих) и немодифицированных (с(г1) эритроцитов АВ-группы
Время инкубирования с а-галактозидазой
Анти-В 6ч 9ч
Разведение антител СМ епг с1Н епг
1:4 4+ 3+ 3+ 2+
1:32 3+ 2+ 3+ 2+
1:512 2+ 1+ 2+ 1+
Пример 2. Ферментативное уменьшение уровня экспрессии А-антигена α-Νацетилгалактозаминидазой α-Ν-ацетилгалактозаминидазу приобретали у С1усо (Са1. Νο. Х-5001).
100 мкл ВВС АВ-группы крови промывали 3х ЗФР.
Контрольная реакция (сйг1):
мкл эритроцитарной массы добавляли к 100 мкл 100 мМ цитрат-фосфатного буфера, рН 4, и 26,5 мкл 500 мМ цитрат-фосфатного буфера, рН 6,5.
Ферментативая реакция (епх):
мкл эритроцитарной массы добавляли к 100 мкл (100 мЕ) α-Ν-ацетилгалактозаминидазы в 100 мМ цитратном буфере, рН 4, и 26,5 мкл 500 мМ цитрат-фосфатного буфера, рН 6,5.
Эти смеси инкубировали при 37°С с перемешиванием время от времени. Реакцию останавливали при временных интервалах (6, 12 и 24 ч) взятием аликвоты, эквивалентной 2 мкл упакованных клеток ВВС в 100 мкл С.'е181аЬ с получением 0,8% суспензии (Клетки не промывали в ЗФР для предотвращения потери клеток).
Эту суспензию использовали для оценки разведений реагента для определения группы крови (антисыворотки).
мкл этой суспензии добавляли в Ωίαιικά Сагб с 50 мкл антисыворотки против реагента для определения А-группы крови (А1Ьа с1опе, 8со11апб). разведенной 1:32 и 1:256, соответственно.
Эти смеси инкубировали в течение 5 мин, и затем О|атеб Сагб центрифугировали в иммунофуге О|атеб в течение 10 мин в соответствии со стандартным протоколом.
Реакции агглютинации оценивали в баллах в соответствии с инструкциями изготовителя.
Таблица 2. Результаты агглютинации для разведенной антисыворотки против реагента для определения А-группы крови (А1Ьа с1опе, 8со11апб), тестированной против модифицированных α-Νацетилгалактозаминидазой (епх) и немодифицированных (с1г1) эритроцитов АВ-группы
Время инкубирования с α-Ν-ацетилга лактозаминидазой
Анти-А 6ч 12ч 24 ч
Разведение антител СМ епг сМ епг сМ епг
1:32 4+ 3+ 4+ 2+ 4+ 1 +
1:256 4+ 2+ ПС 0 3+ 0
пс = не было клеток, доступных для тестирования
В обоих примерах 1 и 2 были созданы клетки, которые обеспечивают слабые серологические оценки агглютинации. В обоих примерах модифицированные ферментом клетки были более чувствительными к детектированию уменьшения титра антител - как видно на примере более низких оценок агглютинации при тестировании разведенных реагентов для определения группы крови с модифицированными ферментом клетками.
Такие клетки пригодны в качестве клеток контроля качества для серологических анализов определения группы крови и для оценки реагентов для определения группы крови. Применение модифицированных ферментом клеток является более различающим для детектирования уменьшений титра антитела.
Хотя фактический уровень экспрессии антигена на модифицированных ферментом клетках неиз
- 8 011481 вестей, он мог бы определяться, если это необходимо, с использованием анализов связывания антитела. Однако, специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что возможность детектирования порч в реагентах для определения группы крови с большей чувствительностью не требует знания фактического уровня экспрессии антигена на модифицированных ферментом клетках.
Поскольку исходное количество антигена на различных пробах крови (из различных индивидуумов) является несколько отличающимся, как должно быть понятно, вариации в периодах инкубирования, концентрациях фермента и/или температурах могут быть использованы для получения модифицированных ферментом клеток, которые обеспечат сравнимые результаты при использовании в качестве клеток контроля качества. Процесс реакции может быть подвергнут мониторингу, пока не будет получена желаемая оценка реакции, затем эту реакцию останавливают и получают клетки контроля качества.
Пример 3. Способ получения α-галактозидазы из кофейных бобов α-Галактозидазу экстрагировали из зеленых кофейных бобов (СоГГеа саперйога) в соответствии с протоколом Соийо15 аиб Ре1ек (Соийо15, ГЕ. аиб Ре1ек. Р., а-Са1ас1О51баке Ггот СоГГее Веапк, (1966) Мебюбк оГ Епхуто1о§у, 8: 565-571).
Этот экстракт фермента концентрировали в устройствах С'еШпсоп (Мййроге) и диализовали против цитрат-фосфатного буфера (100 мМ, рН 6,0). Активность этого неочищенного препарата фермента не определяли. Общая концентрация белка была 96 мг/мл.
Способ ферментативного уменьшения уровня экспрессии В-антигена
Контрольная реакция (с!г1):
Промытую эритроцитарную массу человека АВ-группы крови (300 мкл) добавляли к цитратфосфатному буферу (500 мкл, 100 мМ, рН 6,0, и 200 мкл, 500 мМ, рН 6,0) в пробирку Эппендорфа. Ферментативная реакция (епх):
Промытую эритроцитарную массу человека АВ-группы крови (300 мкл) добавляли к αгалактозидазе в цитрат-фосфатном буфере (500 мкл, 100 мМ, рН 6,0) и цитрат-фосфатном буфере (200 мкл, 500 мМ, рН 6,0) в пробирку Эппендорфа.
Эти смеси инкубировали в водяной бане при 37°С в течение 24 ч с перемешиванием время от времени встряхиванием.
Обработанные ферментом РВС промывали 3х в ЗФР, содержащем 1% БСА. Затем промытую эритроцитарную массу суспендировали до 0,9% в растворе для консервирования клеток Се11к1аЬ для И1атеб де1 сагб и ручного серологического тестирования в пробирке.
Суспензию клеток (50 мкл, 0,9% в Се11к1аЬ) и разведения реагента для определения группы крови (антитела) (50 мкл) пипетировали в И1атеб сагб и инкубировали в течение 5 мин перед центрифугированием в центрифуге И1атеб в течение 10 мин, и результаты регистрировали.
Суспензию клеток (25-40 мкл, 0,9% в Се11к!аЬ) и разведения реагента-антитела (25 мкл) инкубировали в стеклянных серологических пробирках перед откручиванием в течение 15 с в иммунофуге и результаты регистрировали.
Контроль качества реагентов для определения группы крови
Коммерческие анти-В-реагенты (моноклональные и одно поликлональное антитело человека) получали из исторического запаса реагентов-антител. Эти хранящиеся реагенты оценивали против одной партии модифицированных ферментом клеток, для которых не был определен фактический уровень экспрессии антигена.
Эти реагенты для определения групп крови выбирали потому, что они были устаревшими и, следовательно, были, вероятно, испорченными и имели нарушенную эффективность. Разведения этих реагентов также оценивали. Имена изготовителей были зашифрованы. Оценивали эффективность реагента для определения группы крови как функцию состояния в сравнении с источником поставки.
Порча реагента для определения группы крови может быть детектирована с использованием модифицированных ферментом клеток. Эта порча является значимой, так как, хотя разведения реагентов для определения группы крови давали значимые оценки агглютинации при тестировании против клеток, экспрессирующих высокие уровни антигена (с1г1), те же самые реагенты не обеспечивали значимых оценок агглютинации при тестировании против клеток контроля качества (епх), экспрессирующих низкие уровни антигена.
Это лучше всего демонстрируется, когда этот реагент дает сильный положительный результат с необработанными контрольными клетками (указывая на хорошую активность), но дает слабую или отрицательную реакцию с модифицированными ферментом клетками (демонстрируя, что эти клетки контроля качества детектируют слабую эффективность данного реагента). Примеры, где антисыворотка утратила значимую активность, но это не детектируется при оценке против немодифицированных клеток, ярко выделены в таблицах.
Как указывалось, не является обязательным определение фактического уровня экспрессии антигена модифицированными ферментом клетками. В действительности, уровень экспрессии может быть выбран в зависимости от требований конечного пользователя. Эти различные уровни экспрессии могут быть получены регуляцией ферментативной реакции.
- 9 011481
ЬВА анти-В (конец срока хранения апрель2004)
Платформа Клетки Концентрации антисывороток
1:1 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048
Οίθπηθά Контрольные 4+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+
Обработанные 4+ 2+ 2+ 1 + 1 + 0 0
Пробирка Контрольные не выполняли 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ 0
Обработанные не выполняли 2+ 1 + 0 0 0 0
ВС анти-В (конец срока хранения ноябрь 1999)
Платформа Клетки Концентрации антисывороток
1:1 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512
0|ате<1 Контрольные 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 2+
Обработанные 4+ 4+ 3+/2+ 2+ 2+ ννν 0
Пробирка Контрольные не выполняли 4+ 4+ 3+ 2+ 1 + 0
Обработанные не выполняли 4+ 3+ 1 + 0 0 0
В!В Нитап анти-В (конец срока хранения июль 1987)
Платформа Клетки Концентрации антисывороток
1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
О|атеб Контрольные 4+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+
Обработанные 3+ 2+ 2+ УШ 0 0
Пробирка Контрольные 4+ 4+ 4+ 3+ 0 0
Обработанные 1 + 0 0 0 0 0
ΕΡΙ анти-В (конец срока хранения май 2000)
Платформа Клетки Концентрации антисывороток
1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
О1атеР Контрольные 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ .. з±
Обработанные 3+ 2+ 2+/1 + 0 0 0
Пробирка Контрольные 4+ 4+ з+ з+ 1 + 0
Обработанные 1 + 0 0 0 0 0
ЮК анти-В (конец срока хранения август 2001)
4 Платформа Клетки Концентрации антисывороток
1:1 1:2 1:4
□|атес1 Контрольные 4+ 3+ 2+
Обработанные 1 + УУУ 0
Пробирка Контрольные з± з+ 2+
Обработанные 0 0 0
- 10 011481
ОКС анти-В (конец срока хранения декабрь 1993)
Платформа Клетки Концентрации антисывороток
1:1 1:4 1:123 1:512
О|атес1 Контрольные 4+ 4+ 4+ 3+
Обработанные 4+ 4+ 3+ 0
Пробирка Контрольные не выполняли не выполняли не выполняли не выполняли
Обработанные не выполняли не выполняли не выполняли не выполняли
Когда в предыдущем описании давалась ссылка на целые числа или соединения, имеющие известные эквиваленты, такие эквиваленты включены здесь, как если бы они были представлены индивидуально.
В частности, авторы данного изобретения имеют в виду, что биологические катализаторы, иные, чем ферменты, могут быть разработаны с эквивалентной активностью относительно модифицирующих иммунодоминантный сахар ферментов, цитируемых в предыдущем описании.
Хотя данное изобретение было описано при помощи примеров и со ссылкой на их возможные варианты осуществления, должно быть понятно, что в них могут быть произведены усовершенствования и/или модификация без отклонения от объема и идеи данного изобретения.
Ссылки
Όανίδ. М. О. с1 а1. Οοηίπμ. 5сс.|испес. апй ехртеввюи οί а Ыоой дгоир В асйуе тееотЫпаи! а1рйа-Эда1ас!о81йаве Ггот ρίηΐο Ьеаи (Рйавео1и8 уц1даг18). Вюсйет.Мо1.Вю1.1и!. 42.3 (1997): 453-67.
Со1йв!еш, 1. Сопуетвюп оГ АВО Ь1оой дгоирв. ТгаивГив. Мей. Веу. 3 (1989): 206-12.
Со1йв!еш, 1. е! а1. Стоир В ету!йтосу!е8 еихушайсайу соиуейей Ю дгоир О 8ШУ1уе иогта11у ш А, В, аий О тй1У1йиа18. 8с1еисе 215 (1982): 168-70.
НоЬЬв, Ь. е! а1. Тйе асйуйу оГ а Ь1оой 1уре В вресШс еход1усо81йаве Ггот С1усте тах. С1ш.СЫт.Ас!а 247.1-2 (1996): 7-21.
Новктиз, Ь. С. е! а1. В1оой дгоир А 1ттииойе1егттаиГ8 ои йитаи гей се11в йГТег т Ью1ощс асйуйу аий 8еи81йуйу Ю а1рйа-№асе1у1да1ас!о8ат1шйаве. ТгащГщюи 35 (1995): 813-821.
Ьеииу, Ь. Ь. е! а1. Тйе ртойисйои оГ дгоир О се11в Вю!есйио1оду 19 (1991а): 75-100.
Ьеииу, Ь. Ь. е! а1. 8шд1е иш! (гащГийощ оГ ВВС еихутаЦсаПу соиуейей Ггот дгоир В !о дгоир О !о А аий О иогта1 уо1ии!еег8. В1оой 77 (1991Ь): 1383-8.
Ьеииу, Ь. Ь. е! а1. ТгащГщющ !о дгоир О 8иЬ)ес18 оГ 2 иш!з оГ гей се11в еихутаЦсаПу соиуейей Ггот дгоир В !о дгоир О. ТгащГщюи 34 (1994): 209-14.
Ζ1π.ι, А. е! а1. Сйатайеп/айои оГ тесотЬтаи! а1рйа-да1ас!о81йаве Гог иве ш вегосоиуегвГои Ггот Ь1оой дгоир В !о О оГ йитаи егу1йтосу!ев. Атсй.Вюсйеш.Вюрйув. 327.2 (1996): 324-29.

Claims (50)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Эритроциты, имеющие ферментативно уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови системы АВО, который, по существу, эквивалентен уровню экспрессии соответствующего антигена природной АВО-группы или подгруппы, используемые для контроля качества серологических анализов определения групп крови и оценки реагентов и/или систем для определения групп крови.
  2. 2. Эритроциты по п.1, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови равен менее чем 5х 105 копий антигена на эритроцит.
  3. 3. Эритроциты по п.2, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови равен менее чем 1х 105 копий антигена на эритроцит.
  4. 4. Эритроциты по п.3, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови равен менее чем 2х 104 копий антигена на эритроцит.
  5. 5. Эритроциты по п.1, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови является, по существу, эквивалентным клинически значимому порогу экспрессии этого антигена.
  6. 6. Эритроциты по любому из пп.1-5, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови равен более чем 1х 102 копий антигена на эритроцит.
  7. 7. Эритроциты по п.6, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови равен более чем 1 х 103 копий антигена на эритроцит.
  8. 8. Эритроциты по любому из пп.1-7, где иммунодоминантным сахаром указанного антигена группы крови является альфа-связанный Ν-ацетилгалактозамин, связанный с Н-антигеном.
  9. 9. Эритроциты по любому из пп.1-7, где иммунодоминантным сахаром указанного антигена группы крови является альфа-связанная галактоза, связанная с Н-антигеном.
  10. 10. Эритроциты по п.8, где указанным антигеном группы крови является А-антиген.
  11. 11. Эритроциты по п.9, где указанным антигеном группы крови является В-антиген.
    - 11 011481
  12. 12. Эритроциты по любому из пп.1-11, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови соответствует уменьшению результата реакции агглютинации на 2-3 единицы при определении типа эритроцитов в соответствующей реакции.
  13. 13. Эритроциты по любому из пп.1-12, где ферментативно уменьшенный уровень антигена группы крови обеспечивают с помощью по меньшей мере одного модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента.
  14. 14. Эритроциты по п.13, где ферментативно уменьшенный уровень антигена группы крови обеспечивают с помощью фермента, который расщепляет альфа-1-3-связи.
  15. 15. Эритроциты по п.13, где ферментативно уменьшенный уровень антигена группы крови обеспечивают с помощью альфа-Ы-ацетилгалактозаминидазы, или альфа-галактозидазы, или их комбинации.
  16. 16. Эритроциты по любому из пп.1-15, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови соответствует уменьшению результата реакции агглютинации, когда определение типа встречающихся в природе эритроцитов АВО-группы или подгруппы, экспрессирующих низкие уровни соответствующего антигена, осуществляют с помощью той же самой реакции агглютинации.
  17. 17. Эритроциты по любому из пп.1-16, где указанные эритроциты являются эритроцитами человека.
  18. 18. Суспензия, содержащая эритроциты по любому из пп.1-17.
  19. 19. Суспензия по п.18, дополнительно содержащая консервант клеток.
  20. 20. Суспензия по п.18 или 19, содержащая компоненты для обеспечения дополнительных характеристик контроля.
  21. 21. Суспензия по п.20, где указанными компонентами являются клинически значимые антитела.
  22. 22. Способ получения эритроцитов по любому из пп.1-17, предусматривающий стадии контактирования раствора по меньшей мере одного модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента с эритроцитами с начальным уровнем экспрессии антигена группы крови;
    инкубирования полученной суспензии при температуре и в течение времени, достаточных для уменьшения уровня экспрессии антигена группы крови до ферментативно уменьшенного уровня; и обработки суспензии для предотвращения дальнейшего уменьшения уровня экспрессии соответствующего антигена группы крови.
  23. 23. Способ по п.22, где уменьшение уровня экспрессии антигена группы крови определяют периодическим взятием проб и тестированием указанной суспензии.
  24. 24. Способ по п.23, где указанное тестирование является анализом на основе агглютинации.
  25. 25. Способ по п.22, где суспензию обрабатывают для предотвращения дальнейшего уменьшения уровня экспрессии антигена группы крови, когда заданный уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови соответствует уменьшению результата реакции агглютинации на 2-3 единицы при определении типа эритроцитов.
  26. 26. Способ по любому из пп.22-25, где начальный уровень экспрессии антигена группы крови для экспрессирующих указанный антиген эритроцитов является эквивалентным серологическому результату, полученному для клеток, экспрессирующих более чем 5х 105 копий антигена на эритроцит.
  27. 27. Способ по любому из пп.22-26, где экспрессирующие антиген группы крови эритроциты, контактируемые с раствором по меньшей мере одного модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента, являются эритроцитами А-группы.
  28. 28. Способ по любому из пп.22-26, где экспрессирующие антиген группы крови эритроциты, контактируемые с раствором по меньшей мере одного модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента, являются эритроцитами В-группы.
  29. 29. Способ по любому из пп.22-26, где экспрессирующие антиген группы крови эритроциты, контактируемые с раствором по меньшей мере одного модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента, являются эритроцитами АВ-группы.
  30. 30. Способ по любому из пп.22-29, где указанной обработкой является промывание эритроцитов для удаления модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента.
  31. 31. Способ по любому из пп.22-29, где указанную суспензию обрабатывают добавлением ингибитора модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента.
  32. 32. Способ по любому из пп.22-29, где указанную суспензию обрабатывают добавлением конкурентного субстрата для модифицирующего иммунодоминантный сахар фермента.
  33. 33. Способ по любому из пп.22-32, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови является, по существу, эквивалентным клинически значимому порогу экспрессии указанного антигена.
  34. 34. Способ по любому из пп.22-32, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови равен менее чем 5х105 копий антигена на эритроцит.
  35. 35. Способ по п.34, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови равен менее чем 105 копий антигена на эритроцит.
  36. 36. Способ по п.35, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови предпочтительно равен менее чем 2х 104 копий антигена на эритроцит.
  37. 37. Способ по любому из пп. 22-36, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови
    - 12 011481 равен более чем 102 копий антигена на эритроцит.
  38. 38. Способ по п.37, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови равен более чем 103 копий антигена на эритроцит.
  39. 39. Способ по любому из пп.22-27 и 29-38, где иммунодоминантным сахаром указанного антигена группы крови является альфа-связанный Ν-ацетилгалактозамин, связанный с Н-антигеном.
  40. 40. Способ по любому из пп.22-26 и 28-38, где иммунодоминантным сахаром указанного антигена группы крови является альфа-связанная галактоза, связанная с Н-антигеном.
  41. 41. Способ по п.38, где указанным антигеном группы крови является А-антиген.
  42. 42. Способ по п.39, где указанным антигеном группы крови является В-антиген.
  43. 43. Способ по любому из пп.22-42, где указанный фермент расщепляет альфа-1-3-связи.
  44. 44. Способ по любому из пп.24-42, где указанным ферментом является альфа-Νацетилгалактозаминидаза, или альфа-галактозидаза, или их комбинация.
  45. 45. Способ по любому из пп.22-44, где уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови соответствует уменьшению результата реакции агглютинации, когда определение типа встречающихся в природе эритроцитов АВО-группы или подгруппы, экспрессирующих низкие уровни соответствующего антигена, осуществляют с помощью той же самой реакции агглютинации.
  46. 46. Способ контроля качества реагента для определения группы крови, предусматривающий:
    a) контактирование реагента для определения группы крови с суспензией по любому из пп.18-21 и
    b) оценку уровня агглютинации.
  47. 47. Способ по п.46, где указанная оценка является количественно визуальной оценкой агглютинации.
  48. 48. Способ по п.46 или 47, где стадию а) повторяют для определенного диапазона разведений реагента для определения группы крови.
  49. 49. Комплект или набор, содержащий суспензию по любому из пп.18-21.
  50. 50. Комплект или набор по п.49, где суспензия содержит эритроциты, экспрессирующие антигены Кй ИСсе (К1г) и Кй се (гг).
EA200501323A 2003-02-17 2004-02-17 Эритроциты, имеющие ферментативно уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови системы аво, способ их получения и применение EA011481B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NZ52421703 2003-02-17
NZ52777703 2003-08-22
PCT/NZ2004/000030 WO2004072306A1 (en) 2003-02-17 2004-02-17 Preparation of red blood cells with a modified level of blood group antigen expression and their use in the quality control of blood typing reagents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501323A1 EA200501323A1 (ru) 2006-04-28
EA011481B1 true EA011481B1 (ru) 2009-04-28

Family

ID=32871331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501323A EA011481B1 (ru) 2003-02-17 2004-02-17 Эритроциты, имеющие ферментативно уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови системы аво, способ их получения и применение

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20070141646A1 (ru)
EP (1) EP1597401A4 (ru)
AU (1) AU2004212104B2 (ru)
CA (1) CA2516123A1 (ru)
EA (1) EA011481B1 (ru)
WO (1) WO2004072306A1 (ru)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005121322A1 (en) * 2004-06-11 2005-12-22 Kiwi Ingenuity Limited Enzymatic modification of cell-surface h antigen by glycosyltransferases
FI20055398A0 (fi) 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
ES2264403B1 (es) 2006-06-22 2007-11-01 Grifols S.A. Medio de suspension de hematies.
FI20075030A0 (fi) 2007-01-18 2007-01-18 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solujen modifioimiseksi
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
US11708559B2 (en) 2017-10-27 2023-07-25 The Children's Hospital Of Philadelphia Engineered red blood cells having rare antigen phenotypes
KR102261148B1 (ko) * 2019-06-27 2021-06-07 아주대학교 산학협력단 ABO 및 RhD 혈액형 표현형이 약화된 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 글루타르알데히드 처리 적혈구 생산방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996007318A1 (en) * 1994-09-08 1996-03-14 The Curators Of The University Of Missouri Buffer system for increasing seroconversion efficiency
WO2003027245A2 (en) * 2001-09-25 2003-04-03 Zymequest, Inc. CONVERSION OF RED BLOOD CELLS A, B, AND AB USING a-N-ACETYLGALACTOSAMINIDASES AND a-GALACTOSIDASE

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4609627A (en) * 1983-08-01 1986-09-02 New York Blood Center, Inc. Enzymatic conversion of certain sub-type A and AB erythrocytes
DD298348B5 (de) * 1989-11-24 1996-01-25 Universitaetsklinikum Charite Verfahren zur qualitaetskontrolle von Erythozytenkonserven und Bluttransfusionen

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996007318A1 (en) * 1994-09-08 1996-03-14 The Curators Of The University Of Missouri Buffer system for increasing seroconversion efficiency
WO2003027245A2 (en) * 2001-09-25 2003-04-03 Zymequest, Inc. CONVERSION OF RED BLOOD CELLS A, B, AND AB USING a-N-ACETYLGALACTOSAMINIDASES AND a-GALACTOSIDASE

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chien, S-F. and Lin-Chu, M., 1991, The conversion of group b red blood cells into group O by an α-D-galactosidase from taro (colocasia esculenta), Carbohydrate Research, 217:191-200. p. 199-200, tables II and III *
Davis, M.O. et al.: 1997, Cloning sequence and expression of a blood group B active recombinant α-D-galactosidase from pinto bean (phaseolus vulgaris), Biochemistry and Molecular Biology International, 42:453-467, p. 463-465, figure 5 *
Hoskins, L.C. and Boulding, E.T., 2001, Changes in immunologic properties of group ARBCs during treatment with an A-degrading exo-α-N-actetylgalactosaminidase, Transfusion, 41:908-916, p. 911-914, table 1,2 and 5 *
Hoskins, L.C. et al.: 1995, Blood group A immunodeterminants on human red cells differ in biologic activity and sensitivity to α-N-acetylgalactosaminidase, Transfusion, 35:813-821, p. 815-819, table 1, figure 1 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1597401A4 (en) 2007-08-22
EA200501323A1 (ru) 2006-04-28
AU2004212104A1 (en) 2004-08-26
US20070141646A1 (en) 2007-06-21
EP1597401A1 (en) 2005-11-23
CA2516123A1 (en) 2004-08-26
WO2004072306A1 (en) 2004-08-26
AU2004212104B2 (en) 2010-01-28
WO2004072306A8 (en) 2004-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Andrews et al. N-glycolylneuraminic acid and N-acetylneuraminic acid define feline blood group A and B antigens
US6977156B2 (en) Flow cytometry reagent and system
US5514557A (en) Method and kit for detecting antibodies specific for HLA and/or platelet glycoproteins
DK174032B1 (da) Sæt samt fremgangsmåde til immunometrisk dosering, der kan anvendes på hele celler
CA2188807A1 (en) Improved evaluation of transplant acceptance
US5437985A (en) Conservative whole blood sample preparation technique
Yamaguchi et al. Immunochemical quantification of crossline as a fluorescent advanced glycation endproduct in erythrocyte membrane proteins from diabetic patients with or without retinopathy
US20070218515A1 (en) Method and kits for the determination of the antigens on the red blood cells and antibodies of serum
EA011481B1 (ru) Эритроциты, имеющие ферментативно уменьшенный уровень экспрессии антигена группы крови системы аво, способ их получения и применение
EA006577B1 (ru) Контроли чувствительности для серологии крови, приготовленные из модифицированных клеток
US6461825B1 (en) Immunometric assay kit and method applicable to whole cells
Peghini et al. Clinical evaluation of an aerolysin‐based screening test for paroxysmal nocturnal haemoglobinuria
US20110312005A1 (en) Enzymatic modification of cell-surface H antigen by glycosyltransferases
US4492761A (en) Complement assay method
Le Pendu et al. α-2-L-fucosyltransferase activity in sera of individuals with H-deficient red cells and normal H antigen in secretions
Fauré et al. A novel rapid method of red blood cell and platelet permeabilization and staining for flow cytometry analysis
Rawlinson et al. Incidence of T activation in a hospital population
CN100588719C (zh) 制备低表达血型抗原红细胞的方法及其在血型试剂质量控制中的应用
Kashif et al. Geographical seroprevalence of Anaplasma marginale infection (anaplasmosis) by ELISA in Ovis aries, in district Peshawar, Pakistan
KR102261148B1 (ko) ABO 및 RhD 혈액형 표현형이 약화된 시험관법 혈액형 검사의 정도관리용 글루타르알데히드 처리 적혈구 생산방법
US3733398A (en) Determining and reversing anticomplementary activity in complement fixation test for australia antigen
Shetty et al. Detection of IgG, IgA, IgM and IgE antibodies in invasive amoebiasis in endemic areas
RU2817215C2 (ru) Способ диагностики аллоиммунной тромбоцитопении новорожденных
HbF et al. Fetal Cell Count™ kit
Johnson et al. Diagnosis of Toxoplasmosis

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU