CN100588719C - 制备低表达血型抗原红细胞的方法及其在血型试剂质量控制中的应用 - Google Patents
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Abstract
采用至少一个优势免疫糖修饰化酶制备低表达血型抗原的红细胞的方法,如N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖苷酶。应用本方法制备的红细胞所表达的抗原实质上只达到临床上所能检测到的抗原水平的阈值。应用本方法所制备的红细胞可以应用于血型试剂的质量控制和测试系统的校正,从而精确和标准化地判断血型。
Description
技术领域
该项发明涉及血型抗原表达水平改变的细胞。特别是,该项发明涉及到这些细胞的制备及其在血型试剂的质量控制和血液学、免疫血液学和免疫学分析的校正和确认。
背景技术
血液中心的功能是检测血液以准确判断个人的血型。对于血型的准确和精确的判断对于多项治疗是必需的,包括输血,器官移植和治疗新生儿的遗传性溶血。
例如,一名病人在接受输血前必需知道其血型。献血者和受血者的血型的错配将会产生严重的后果,甚至会导致受血者的死亡。
在输血血清学中,ABO血型分类是红细胞血型分类中最重要的一种分类方法。人的血型主要被分成四种血型:A,B,AB和O型。每种血型的红细胞分别携带A抗原,B抗原,A抗原和B抗原,既无A抗原也无B抗原。
在每个人的血液中,存在抗ABO血型抗原或红细胞中缺少的抗原的抗体。因此,A型血的人血中含有抗B抗原的抗体,B型血的人血中含有抗A抗原的抗体,O型血的人血中含有抗A抗原和B抗原的抗体,AB型血的人血中既无抗A抗原的抗体也无抗B抗原的抗体。
在从献血者向受血者输血前,必须进行交叉配血。交叉配血是通过直接检测献血者血液对受血者血清的排异性,或者是根据献血者和受血者血型的记录进行配对。交叉配血需要保证一种血型的红细胞不能供给对该血型的抗原可以产生抗体的个人。
从历史上看,直接测试献血者红细胞对受血者血清排异性的交叉配血可以检测出微弱亚型的错误测定和试图给不相容的受体输血之间的不相容性。然而,现在直接测试的交叉配血方法在大部分血液中心很少用到,取而代之的是依赖于血型的正确记录。
在血型血清学中,红细胞的测定是采用含有针对特异抗原的抗体的试剂(正向分组),测定血清对表达已知抗原的红细胞的排异性(反向分组)。
从20世纪80年代开始,单克隆抗体(Mabs)已经被用于血型测定试剂中。与传统的多克隆抗血清相比,单克隆试剂提供了更高的特异性,更加一致的反应性,而且大部分情况下可以提高灵敏度。
血型试剂的质量控制对于血型测定的准确性和可信性是必须的。血型试剂会在运输和储存过程中出现特异性和/或灵敏性的降低,或者是在制备和使用过程中造成的污染。
在人类中,有各种表达低水平A抗原和/或B抗原的ABO亚型。各亚型中抗原的表达水平差异很大,通常如果没有广泛的分析不易查明。大多数A型血和稀有的A亚型的抗原水平通常在以下范围内是可以被接受的(每个红细胞的抗原分子数):
A1,8×105到1.2×106;
A2,1.5×105到4×105;
A3,4×104到1.2×105;
Ax,7×103到104;
Aend,2×103到3×103;
Am,102到2×103;
Ael,102到1.5×103.
B亚型也有相应的抗原表达水平。血型试剂应该能够检测所有临床上显著的ABO亚型。
从质量控制的目标出发,血型试剂用来测定红细胞。因此抗原水平表达低的红细胞更适合用作“质量控制细胞”(或者“标准试剂”)。
抗原表达水平低的红细胞适合用于血型测定分析,因为这种红细胞可以提供更多多克隆抗体试剂可能行为的信息。
这些红细胞可以用作质量控制细胞,用来测定试剂的变化,这种变化会导致不能检测表达低水平抗原的血液亚型的红细胞,例如:A2型的红细胞表达抗原的水平处于趋向于可接受范围的低端,从而导致血型检测的错误发生。
这些红细胞还可以用来校正和确认检测系统,以保证所有临床意义的ABO血型和亚型可以被检测。
实际上,用表达低水平A抗原和/或B抗原的天然的ABO亚型的红细胞作为质量控制细胞是很困难的。人群中具有这样表型的比例很低。例如:据估计,Ax血型的个人是A型血个人数量的0.003%。其他亚型的在人群中的比例还要低。
在那些不表达低水平抗原的细胞中,血型测定试剂是这样评价的:
测定对正常细胞的排异性。(这包括使用表达相对高水平抗原的红细胞,但这一方法缺乏灵敏度);或
稀释血型测定试剂。(这包括稀释血型测定试剂和测定其对正常细胞的排异性)。
很多实验室仅依赖于对测定试剂供应商的质量控制。
血型测定试剂的评价普遍是采用血型测定试剂稀释的方法。然而,实验室只能以每周或每月为周期分批检测血型测定试剂。
稀释血型测定试剂和检测对正常细胞的排异性的方法并不可靠。正常细胞表达高水平的抗原,例如,每个红细胞的抗原分子数大于1.5×105。当检测血型测定试剂时,这些试剂被稀释至较低的稀释度,仍可以与红细胞作用,从而产生血清阳性的结果。用外推法处理这些结果以判断正常稀释度下的抗原表达水平。
这一方法除了耗费时间这一缺点之外,该方法还作了以下的假定:血型测定试剂预测的灵敏度可以扩大至测定表达低水平抗原的红细胞。除非血型测定试剂的真正的灵敏度刚好下降到测定一些ABO亚型所需的阈值,否则试剂的变质无法被检测到。测定这种程度的试剂的变质只可能出现在更进一步耗时的稀释实验的完成。
应该指出的是,多克隆抗体试剂经常是双克隆和具有特异性能的特点。众所周知,在测定ABO亚型方面,某些克隆比其他的更好。因此,试剂经常以混合物的形式出现。当血型测定试剂被稀释时,其内在的行为特点将不起作用。
当缺少可信的血型测定试剂时,实验室常依赖于制造商的说明书和试剂的以往的表现。
当缺少可靠的血型测定试剂的质量控制时,血型测定是用变质的试剂,而且临床上显著区别的亚型可能会被错误的测定。这种试剂变质时,无法检测抗原表达水平位于可接受范围低端的亚型的红细胞。
如果用于输血,这种血液将导致或轻或重的输血反应,包括受血者可能出现死亡。
显而易见,需要一种可信的表达低水平抗原的红细胞作为质量控制细胞。血型测定试剂的可靠的质量控制和测定系统的校正以保证准确和标准化的判断血型,对于使受血者的危险性降低至最小程度是必须的。
缺乏大量输血经验的多技能的技术人员更加需要这种方法。可靠的测定可信度的增加比对于测定试剂过往表现的了解更重要。
这一发明的目的是提供用于血型测定试剂质量控制和测定系统的校正和确认的红细胞,或者是至少为公众提供一个有用的选择。
参考文献:
Davis,M.O.et al.Cloning,sequence,and expression of a blood group Bactive recombinant alpha-D-galactosidase from pinto ean(Phaseolus vulgaris).Biochem.Mol.Biol.Int.42.3(1997):453-67.
Goldstein,J.Conversion of ABO blood groups.Transfus.Med.Rev.3(1989):206-12
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Hobbs,L.et al.The activity of a blood type B specific exoglycosidasefrom Glycine max.Clin.Chim.Acta 247.1-2(1996):7-21.
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Lenny,L.L.et al.The production of group O cells.Biotechnology 19(1991a):75-100.
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发明内容
这项发明包括以下方面:
首先,本项发明提供了表达低水平抗原的红细胞,这种红细胞抗原表达水平低,实质上等同于天然产生ABO血型和亚型的红细胞。
这种表达低水平抗原的红细胞是在体外制备的。
这种红细胞的抗原水平的降低实质上更加等同于血清学上获得的抗原表达少于5×105拷贝数的红细胞,可以达到获得的抗原表达少于1×105拷贝数的红细胞,最好可以达到获得的抗原表达少于2×104拷贝数的红细胞。
表达低水平抗原的红细胞实质上更加等同于临床显著阈值。
表达低水平抗原的红细胞,在血清学结果中,其每个红细胞中的抗原数大于1×102拷贝数,最好每个红细胞中的抗原数大于1×103拷贝数。
抗原的免疫优势糖是连接于H抗原的α-N-乙酰半乳糖胺或α-半乳糖。
血型抗原最好是A抗原或B抗原。
当采用凝集实验分析红细胞时,抗原表达水平的降低相应于凝集分值降低2~3个单位。
酶学上抗原水平的降低是通过使用至少一种免疫优势糖修饰酶来实现的。酶学上更好的抗原水平的降低是通过能够断开1-3键的酶。酶学上更好的抗原水平的降低是通过使用α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶,或者同时使用这两种酶。
低水平的抗原表达优选等同于凝集分值的降低,实质上等同于测定天然红细胞的弱表达ABO血型或亚型在凝集实验中的凝集分值。
红细胞最好是人类的红细胞。
红细胞最好处于悬浮状态。
悬浮液中最好包含细胞防腐剂,比如CelpresolTM。
悬浮液中最好包含可以提供额外控制特性的组分,如临床显著意义的抗体。
这项发明的优势体现在,该项发明提供了一种酶学上低水平抗原表达的红细胞的悬浮液,这种低水平的抗原表达实质上等同于自然存在的红细胞的表型。而且抗原表达的水平优选实质上等同于临床上抗原显著性的阈值。
红细胞被用作质量控制细胞。
悬浮液作为质量控制试剂控制血型测定试剂的质量和/或对测试系统的校正和确证。
第二方面,这项发明提供了一种制备表达低水平抗原的红细胞的方法,步骤包括:
使至少一种免疫优势糖修饰酶的溶液与初始抗原表达水平的红细胞接触,以形成混合物;
将混合物在某温度下培养一段时间,该段时间足以将抗原表达水平降低到一低水平;
处理该悬浮液,以阻止抗原表达水平更进一步的降低。
通过周期性取样和测定混合物判断抗原表达水平的降低。
通过凝集实验检测混合物的抗原表达水平。
在凝集实验中测定红细胞时,当抗原表达水平的降低相应于凝集分值降低2~3个单位时,处理悬浮液以阻止抗原表达水平的降低。
抗原表达红细胞的起始抗原表达水平等于获自每个红细胞抗原表达数量大于5×105拷贝数的细胞的血清学结果。
优选地,与含有至少一种免疫优势糖修饰酶的溶液接触的表达抗原的红细胞免疫优势是A型红细胞。
优选地,与含有至少一种免疫优势糖修饰酶的溶液接触的表达抗原的红细胞免疫优势是B型红细胞。
优选地,与含有至少一种免疫优势糖修饰酶的溶液接触的表达抗原的红细胞免疫优势是AB型红细胞。
通过清洗红细胞去除免疫优势糖修饰酶以阻止抗原水平的过度降低。
抗原表达水平的降低实质上等同于临床显著阈值。
表达低水平抗原的红细胞,在血清学检查中,其每个红细胞中的抗原数少于5×105拷贝数,最好每个红细胞中的抗原数少于1×105拷贝数,最好每个红细胞中的抗原数少于2×104拷贝数。
表达低水平抗原的红细胞,在血清学结果中,其每个红细胞中的抗原数大于1×102拷贝数,最好每个红细胞中的抗原数大于1×103拷贝数。
抗原的免疫优势糖是连接于H抗原的α-N-乙酰半乳糖胺或α-半乳糖。
血型抗原最好是A抗原或B抗原。
所用的酶至少一种是免疫优势糖修饰酶。该酶能够使α1-3键断裂。最好使用α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶,或者同时使用这两种酶。
抗原表达水平的降低优选等同于凝集分值的降低,该凝集分值的降低实质上等同于在同一凝集实验中测定天然红细胞的弱表达ABO亚型在凝集实验中的凝集分值。
红细胞最好是人类的红细胞。
第三方面,该发明提供了由发明的第二方面所提供的酶学上表达低水平抗原的红细胞的制备方法。
第四方面,该法面提供了血型测定试剂的质量控制的方法,包括:
使血型测定试剂与根据第一方面和第三方面的红细胞悬浮液接触;
测定凝集值。
凝集值的测定是通过观察凝集的数量。
优选在血型测定试剂的稀释范围内重复该方法。
可以选择的是,这个过程可以包括一步判断红细胞抗原表达水平的步骤,也就是通过参考已知的红细胞的抗原表达水平。表达已知抗原水平的红细胞可以通过国际专利应用PCT/NZ02/00219中所描述的方法进行制备。
第五方面,这项发明提供了一个试剂盒,该试剂盒包含本发明的第一方面和第三方面的两种或多种红细胞悬浮液。
这个试剂盒包含对表达A型和B型红细胞灵敏度的控制,红细胞的制备参见发明的第一方面和第三方面。悬浮液中包含细胞防腐剂,比如CelpresolTM。悬浮液中包含可以提供额外的控制特性的组分,如临床显著意义的抗体。
可供选择的是,试剂盒中包含灵敏度控制的试剂,包括表达Rh DCce(Rlr)和Rh ce(rr)抗原的红细胞。
下面将详细介绍这项发明。
发明详述:
A抗原的免疫优势优势糖是一个α-N-乙酰半乳糖胺。B抗原的免疫优势优势糖是一个α-半乳糖。免疫优势优势糖连接到H抗原。
免疫优势糖的通过酶的去除和修饰会导致原始抗原性的丢失。因此,A,B或AB血型的红细胞的A抗原和B抗原的表达水平可以被酶降低。
抗原的酶解消化是基于以下标准,酶(糖苷酶)能够在红细胞膜上特异降解糖类抗原,而不会破坏非目标结构,例如:非靶位连接的蛋白质和糖类。
酶的变性以前被用来去除红细胞中的ABO血型抗原,从而将A型细胞和B型细胞转化成O型细胞。研究者用高浓度的酶可以去除大部分甚至全部的红细胞抗原。
在输血时,这些去除抗原的细胞能够用作通用的鲜血单位(Davis1997;Goldstein 1989;Hobbs 1996;Hoskins 1995;Lenny 1991a;Zhu 1996)。“去除抗原的血”在临床输血中试验成功,尽管现在并没有常规应用(Goldstein 1982;Lenny 1991b;Lenny 1994)。
这些作者描述的方法没有提供表达减少但又有限的抗原水平的红细胞,这种抗原的表达水平处于或高于临床上显著性的阈值。实际上,这些方法试图提供不表达抗原的红细胞,或至少不超过临床显著性阈值数量抗原的红细胞。
根据这项发明,表达低水平A抗原或/和B抗原的红细胞是在体外制备的。在A抗原或/和B抗原表达水平方面,制备的红细胞在血清学检查中等于天然存在的ABO亚型的红细胞。
消化作用的条件,例如处理的时间、温度、酶活性和红细胞与酶的比例,在控制抗原表达水平的减少方面是可以调节的。细胞膜上抗原的酶解消化时间也依赖于酶溶液的相对浓度和细胞上抗原初始的表达水平。
酶浓度的改变可以用作控制抗原的表达水平。如果想得到弱表达A抗原或B抗原的细胞,可以使用高浓度的酶。如果需要强凝集的细胞,可以使用低浓度的酶。
医用输血中所用到的典型的质量控制细胞由A型或B型细胞制备,这种条件下酶将去除A抗原和/或B抗原,从而在抗原测定分析中得到特定的反应分数。这项分析将包括板,试管,凝胶卡,和微型板方法,和任何手工或自动化的使用凝集的平台,或任何其他的检测抗原的方法(例如:酶联免疫,流式细胞仪等)。
传统方法获得红细胞在血清学检测中,凝集分析的结果接近于2+。实际的血清学结果需要依赖于所用分析系统的灵敏度,例如板与自动化方法的灵敏度是不同的。
消化的过程可以通过定期取样和分析凝集系统的表现进行监测。一旦消化的条件依赖于实验比例的大量的表达低水平抗原的红细胞,就可以制备可供作为质量控制的细胞。
凝集实验是测定抗原的一种方法。细胞间抗体的交联形成的红细胞结块称为凝集。凝集可以通过观察(用眼睛)或用血型分析仪自动化技术检测。增强对凝集的观察可以通过使用特定的酶或放射活性或荧光标记技术。
根据以下方案对手动的凝集反应进行计分:
对凝集水平的评价可以通过直接观察凝集或通过使用诱导凝集的方法产生非直接的凝集进行评价,例如增强效应或使用抗球蛋白分子。
表达低水平抗原的红细胞,在血清学上实质上等同于天然产生ABO血型和亚型的红细胞,作为质量控制细胞具有特别的优势和优点。
如果需要,质量控制细胞的实际抗原表达水平(每个红细胞上的抗原分子数)可以通过参考已知抗原表达水平的红细胞。这些被参考的红细胞可以是自然存在的弱表达抗原的ABO亚型或表达已知抗原水平的红细胞,可以通过国际专利应用PCT/NZ02/00219中所描述的方法进行制备。
应该说明的是,并不需要知道质量控制细胞的实际抗原表达水平。质量控制细胞被用来评价和检测血型测定试剂的发生的质量上的变化。质量控制细胞抗原表达水平低且有限才是重要之处。
可以制备具有不同抗原表达水平的质量控制细胞。一套质量控制细胞的抗原表达水平可以通过选择临床显著阈值,在此阈值测定抗原的失败将会导致临床上明显的输血反应。另一套质量控制细胞的抗原表达水平可以通过选择有足够把握测定弱亚型的红细胞。
上述提到的质量控制细胞可以通过控制灵敏度在一定范围内,从而确证ABO血型测定的准确性。这些灵敏度控制细胞也可以用在校正高度灵敏的机器或在流式细胞仪测定抗原定量曲线时使用。这可以保证ABO血型供给的安全性。
这项发明使得质量控制的标准化和全球一致性。这项发明使得可以对不同实验室和不同方法学的结果进行比较。将质量控制细胞包含在输血血清学质量保证计划,可以建立的ABO血型测定的质量控制标准。
这项发明中,包含在试剂盒中的质量控制细胞可以用来确证血型测定中A型血(弱)和B型血(弱)的表型。这一试剂盒可以包括质量控制细胞,用来确证对Rh DCce(Rlr)和Rh ce(rr)表型的血型测定结果。这一试剂盒能够保证ABO和RhD血型测定试剂能够进行质量控制。包含表达一定范围抗原水平的质量控制细胞的其他试剂盒对于一些专业化的实验室是很有益处的。
在制备质量控制细胞的悬浮液时,重悬的液体可能含有临床上有显著意义的抗体。因此,应该引入额外的质量控制特征,例如共存的抗体对照。
提供以下的定义和解释辅助理解这项发明的权利要求的描述和要求范围。
“临床显著阈值”是当红细胞的抗原表达水平低于此标准时,如果进行输血,抗原检测的失败在临床上无显著性。
“免疫优势糖修饰酶”是指这些酶能够修改A抗原或B抗原的抗原决定簇,从而导致抗原表达水平的降低。例如:免疫优势糖修饰酶包括α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶。
“酶学上抗原表达低水平”是指通过酶消化细胞表面的抗原,体外得到的抗原表达水平。
“抗原表达”是指细胞表面出现的抗原,“抗原表达水平”是指细胞表面出现的抗原数量。
“质量控制细胞”是指表达抗原的细胞,典型的是红细胞,用来评价血型测定试剂的质量和对测定系统进行校正和确证。这项发明的质量控制细胞的例子是例1,2和3中描述的酶修饰的细胞。
在上述叙述中出现的抗原水平“基本上等于”是指这一抗原表达的水平将在血清学分析中提供基本上同样的结果。
抗原表达水平是通过每个红细胞的抗原拷贝数定义的,抗原表达水平处于可接受的水平是指已知ABO亚型的抗原表达水平,或者该抗原表达水平能够提供血清学上已知ABO亚型的相同的结果。
抗原表达水平的“高”和“低”是用来区别普通ABO亚型如A1和不常见的弱抗原表达的ABO亚型。
具体实施方式
下面将通过具体实施例阐明本项发明。
实施例1
α-半乳糖苷酶作用的B抗原表达水平的降低
绿咖啡豆中提取到的10个单位的α-半乳糖苷酶从Glyko(Cat.No.X-5001)购买。
AB血型的100微升的红细胞用磷酸缓冲液(PBS)清洗三次。
对照反应(ctrl):
50微升包裹的红细胞加入到40微升100mM的pH6.5的柠檬酸盐缓冲液和22.5微升的500mM中的pH6.5的柠檬酸盐缓冲液中。
酶促反应(enz):
50微升包裹的细胞加入到含有40微升的4个单位的α-半乳糖苷酶的100mM pH6.5的柠檬酸盐缓冲液和22.5微升的500mM中的pH6.5的柠檬酸盐缓冲液中。
混合物在37℃水浴中反应,并不时进行混合。该反应结束时间分别是6小时和9小时,中止的方法是去除相当于15微升包裹的红细胞,用含有1%牛血清白蛋白的磷酸缓冲液清洗细胞三次。
15微升包裹的红细胞重悬在1毫升的Celstab(细胞防腐溶液),用来评价血型测定试剂(抗血清)的稀释度。
对照反应或酶反应中清洗的细胞重悬在0.8%的Celstab(Diamed)。50微升0.8%的悬浮液转移到Diamed卡,分别加入以1∶4,1∶32和1∶512稀释的50微升抗B的血型测定试剂(抗血清)。
将混合物反应5分钟,根据标准操作规程,将Diamed卡在Diamed免疫离心机中离心10分钟。
根据制造商的说明书对凝集反应进行打分。
表1:稀释的抗B血型测定试剂(Alba clone,苏格兰)测定α-半乳糖苷酶修饰(酶促)和未修饰(对照)组对AB型红细胞的凝集结果。
实施例2
α-N-乙酰半乳糖胺酶作用的A抗原表达水平的降低
α-N-乙酰半乳糖胺酶(Cat.No.X-5001)从Glyco公司购买。
AB血型的100微升的红细胞用磷酸缓冲液(PBS)清洗三次。
对照反应(ctrl):
6微升包裹的红细胞加入到100微升100mM的pH4的柠檬酸盐缓冲液和26.5微升的500mM中的pH6.5的柠檬酸盐缓冲液中。
酶促反应(enz):
6微升包裹的细胞加入到含有100微升的100个毫单位(mU)的α-N-乙酰半乳糖胺酶的100mM pH4的柠檬酸盐缓冲液和26.5微升的500mM中的pH6.5的柠檬酸盐缓冲液中。
混合物在37℃水浴中反应,并不时进行混合。该反应结束时间分别是6小时、12小时和24小时,中止的方法是取出相当于2微升包裹的红细胞,加入到100微升CelStab试剂中,成为0.8%的悬浮液。(为避免细胞损失,无须用磷酸缓冲液清洗细胞。)
悬浮液用来评价用来评价血型测定试剂(抗血清)的稀释度。
50微升悬浮液转移到Diamed卡,分别加入以1∶32和1∶256稀释的50微升抗A的血型测定试剂(Alba clone,苏格兰)。
将混合物反应5分钟,根据标准操作规程,将Diamed卡在Diamed血库离心机中离心10分钟。
根据制造商的说明书对凝集反应进行打分。
表1:稀释的抗A血型测定试剂(Alba clone,苏格兰)测定α-N-乙酰半乳糖胺酶修饰(酶促)和未修饰(对照)组对AB型红细胞的凝集结果。
nc表示测试中不能看见细胞
在例1和例2中,细胞提供了血清学上弱的凝集值。在这两个例子中,酶修饰的细胞对于抗体滴度减小的检测更加敏感,例如当用酶修饰的细胞检测稀释的血型测定试剂时得到了较低的凝集分值。
这些细胞适合于用作对血清学的血型分析和血型测定试剂的评价质量控制细胞。使用酶修饰的细胞对于检测抗体滴度的减少更加具有鉴别力。
尽管酶修饰细胞的抗原表达的实际水平是未知的,如果需要可以通过抗体结合实验进行分析。然而,技术人员对血型测定试剂的质量变异的更加灵敏检测的能力,不需要知道酶修饰细胞上抗原表达的实际水平。
由于初始抗原来源不同(由不同个体提供),因此实验条件会有细小的差别,尽管反应时间、酶浓度和/或温度的不同,也可以获得提供类似结果的作为质量控制细胞的酶修饰细胞。可以通过监控反应过程,获得需要反应分数的细胞,反应停止后就得到了所制备的质量控制细胞。
实施例3
从咖啡豆中制备α-半乳糖苷酶的方法。
α-半乳糖苷酶是根据Courtois和Petek的方法从绿咖啡豆(中果咖啡)中提取到的。(Courtois,J.E.and Petek,J.,α-Galactosidase from CoffeeBeans,(1996)Methods of Enzymology,8:565-571)。
提取到的酶浓缩到离心超滤装置(Millipore)在柠檬酸盐磷酸缓冲液(100mM,pH6.0)中透析。酶粗提物的活性无需测定。总蛋白质浓度是96mg/ml。
降低B抗原表达的酶学方法
对照反应(ctrl):
AB血型的经过清洗、包裹的红细胞(300微升)加入到装有柠檬酸盐磷酸盐缓冲液(500微升,100mM,pH6.0和200微升,500mM,pH6.0)的Eppendorf离心管中。
酶促反应(enz):
AB血型的经过清洗、包裹的红细胞(300微升)加入到装有α-半乳糖苷酶的柠檬酸盐磷酸盐缓冲液(500微升,100mM,pH6.0)和柠檬酸盐磷酸盐缓冲液(200微升,500mM,pH6.0)的Eppendorf离心管中。
混合物在37℃水浴中反应24小时,并不时通过振摇进行混合。
酶处理的红细胞用含有1%牛血清白蛋白的磷酸缓冲液清洗三次。然后将经过清洗、包裹的红细胞以0.9%的比例悬浮在Celstab细胞防腐剂的溶液中,用来加入到Diamed凝胶卡和手工的试管血清学检测。
细胞悬浮液(50微升,Cellstab中红细胞浓度为0.9%)和血型测定试剂(抗体)的稀释液(50微升)被用吸管加入到Diamed卡上,作用5分钟,然后在Diamed离心机中离心10分钟,记录结果。
细胞悬浮液(25-40微升,Cellstab中红细胞浓度为0.9%)和抗体试剂稀释液(25微升)在玻璃血清试管中进行反应,然后在免疫离心机中离心15秒,记录结果。
血型测定试剂的质量控制
商品化的抗B(单克隆和一个多克隆人)试剂由过去储存的抗体试剂提供。这些储存的试剂通过单批次的酶修饰细胞进行测定,而这些细胞实际的抗原表达水平是未知的。
选择血型测定试剂是因为这些试剂是过期的,因此可能已经发生了变质,而且测定效果受损。这些试剂的稀释液也被选择进行评估。用编码代替了制造商的名称。作为反应条件的一个功能的血型测定试剂的表现与评估的供应商相反。
血型测定试剂的变质可以被酶修饰细胞所检测到。变质是显著的,因为尽管血型测定试剂的稀释液在用表达高水平抗原(对照反应)的细胞时可以获得显著的凝集分值,当用表达低水平抗原的质量控制细胞(酶促反应)进行测定时,这些同样的试剂不能提供显著性的凝集分值。
可以推断的是,当用试剂检测未处理的对照细胞(活性好)产生强阳性结果,而用酶修饰细胞(推断这些质量控制细胞在检测质量不好的试剂)产生弱的或阴性的反应结果。尽管在用未修饰的细胞无法检测抗血清是否显著丢失活性,后面的表格突出列出以下例子。
如前所述,无需判断酶修饰细胞抗原表达的实际水平。实际上,可以根据使用者的要求选择抗原表达的水平。那些不同的表达水平是通过控制酶促反应获得的。
n.d.表示未做。
在前面的描述中,已经有参考文献提及那些已知等价物的整体物或化合物,然后,在这里把这些等价物混合在一起,就如同分别对其进行阐明。
特别指出的是,发明者的意图是除酶以外的生物催化剂可以同样发展成为和前文所述的免疫优势糖修饰酶具有同样活性。
尽管这项发明通过实施例和其有关的可能的具体操作了描述,值得注意的是,在不脱离本发明的精神和范围前提下可以改进和/或修改本发明。
Claims (49)
1.质量控制细胞,其是红细胞,其具有通过酶消化细胞表面的抗原,体外得到的抗原表达水平,其中所述抗原表达水平在血清学上等于天然产生ABO血型或亚型的红细胞的水平,且所述抗原是A抗原或B抗原。
2.如权利要求1的质量控制细胞,其中所述抗原表达水平为每个红细胞少于5×105拷贝数。
3.如权利要求2的质量控制细胞,其中所述抗原表达水平为每个红细胞少于1×105拷贝数。
4.如权利要求3的质量控制细胞,其中所述抗原表达水平为每个红细胞少于2×104拷贝数。
5.如权利要求1的质量控制细胞,其中所述抗原表达水平等于这样的标准:当红细胞的抗原表达水平低于此标准时,如果进行输血,抗原检测的失败在临床上无显著性。
6.如权利要求1的质量控制细胞,其中所述抗原表达水平为每个红细胞大于1×102拷贝数。
7.如权利要求6的质量控制细胞,其中所述抗原表达水平为每个红细胞大于1×103拷贝数。
8.如权利要求1的质量控制细胞,其中当采用凝集实验分析红细胞时,所述抗原表达水平相当于凝集分值降低2~3个单位。
9.如权利要求1的质量控制细胞,其中抗原表达水平是通过使用至少一种能够修改A抗原或B抗原的抗原决定簇,从而导致抗原表达水平的降低的酶来完成的。
10.如权利要求9的质量控制细胞,其中抗原表达水平是通过使用断开血型抗原的免疫优势糖的α1-3键的酶完成的。
11.如权利要求10的质量控制细胞,其中抗原表达水平是通过使用α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶,或者这两种酶的组合完成的。
12.如权利要求1的质量控制细胞,其中抗原表达水平相当于低凝集分值,该低凝集分值等于当在同一凝集分析实验中测定天然存在的表达低水平抗原的ABO血型或亚型的红细胞时的凝集分值。
13.如权利要求1的质量控制细胞,其中所述红细胞是人类的红细胞。
14.一种悬浮液,其特征在于,其为权利要求1的质量控制细胞的悬浮液。
15.如权利要求14的悬浮液,其中所述的悬浮液包含细胞防腐剂。
16.如权利要求15的悬浮液,其中所述悬浮液含有可以提供额外的质量控制特性的组分。
17.如权利要求16的悬浮液,其中所述组分是临床显著意义的抗体。
18.如权利要求17的悬浮液,其中所述悬浮液用于血型测定试剂质量控制和/或血型测定系统的校正和确证。
19.制备质量控制细胞的方法,该质量控制细胞是表达低水平血型抗原的红细胞,该方法包括步骤:
使至少一种能够修改A抗原或B抗原的抗原决定簇,从而导致抗原表达水平的降低的酶的溶液与初始血型抗原表达水平的红细胞接触,以形成混合物;
将混合物在某温度下培养一段时间,该段时间足以将血型抗原表达水平降低到一低水平;
处理该悬浮液,以阻止血型抗原表达水平的进一步降低;
其中血型抗原表达的低水平在血清学上等于天然产生ABO血型或亚型的红细胞的水平,所述的血型抗原是A抗原或B抗原。
20.如权利要求19的方法,其中血型抗原表达水平的降低是由定期采样和测定混合物判断的。
21.如权利要求20的方法,其中所述的测定是凝集实验。
22.如权利要求21的方法,其中当在凝集分析实验中测定红细胞时,当血型抗原表达水平的降低相应于凝集分值降低2~3个单位时,处理悬浮液,以阻止血型抗原表达水平的进一步降低。
23.如权利要求22的方法,其中血型抗原表达红细胞的初始血型抗原表达水平等于获自每个红细胞血型抗原表达数量大于5×105拷贝数的细胞的血清学结果。
24.如权利要求23的方法,其中与含有至少一种酶的溶液接触的表达血型抗原的红细胞是A型红细胞。
25.如权利要求23的方法,其中与含有至少一种酶的溶液接触的表达血型抗原的红细胞是B型红细胞。
26.如权利要求23的方法,其中与含有至少一种酶的溶液接触的表达血型抗原的红细胞是AB型红细胞。
27.如权利要求19的方法,其中处理悬浮液的方法是清洗红细胞去除至少一种酶。
28.如权利要求19的方法,其中处理悬浮液的方法是通过加入至少一种酶的抑制剂。
29.如权利要求19的方法,其中处理悬浮液的方法是通过加入至少一种酶的竞争性底物。
30.如权利要求19的方法,其中所述血型抗原表达的低水平等于这样的标准:当红细胞的抗原表达水平低于此标准时,如果进行输血,抗原检测的失败在临床上无显著性。
31.如权利要求19的方法,其中所述血型抗原表达的低水平为每个红细胞少于5×105拷贝数。
32.如权利要求31的方法,其中所述血型抗原表达的低水平为每个红细胞少于105拷贝数。
33.如权利要求32的方法,其中所述血型抗原表达的低水平为每个红细胞少于2×104拷贝数。
34.如权利要求19的方法,其中所述血型抗原表达的低水平为每个红细胞大于102拷贝数。
35.如权利要求34的方法,其中所述血型抗原表达的低水平为每个红细胞大于103拷贝数。
36.如权利要求19的方法,其中所述的至少一种酶是α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶,或者这两种酶的组合。
37.如权利要求19的方法,其中血型抗原表达的低水平相当于低凝集分值,该低凝集分值等于当在同一凝集分析实验中测定天然存在的表达低水平抗原的ABO血型或亚型的红细胞时的凝集分值。
38.如权利要求19的方法,其中所述红细胞是人的红细胞。
39.质量控制细胞,其是表达低水平血型抗原的红细胞,其由权利要求20所述的方法制备。
40.权利要求39所述质量控制细胞的悬浮液。
41.如权利要求40的悬浮液,其中所述悬浮液包含细胞防腐剂。
42.如权利要求41的悬浮液,其中所述悬浮液包含可以提供额外控制特性的组分。
43.如权利要求42的悬浮液,其中所述组分是临床显著意义的抗体。
44.血型测定试剂的质量控制方法,包括:
a.使血型测定试剂与权利要求40的悬浮液接触;
b.评价凝集的程度。
45.如权利要求44的方法,其中凝集值的测定是通过观察凝集的数量。
46.如权利要求44的方法,其中在血型测定试剂的稀释范围内重复该方法。
47.一种试剂盒,包括权利要求14或权利要求40所述的两种或多种悬浮液。
48.如权利要求47的试剂盒,其中质量控制细胞的血型抗原表达水平等于这样的标准:当红细胞的抗原表达水平低于此标准时,如果进行输血,抗原检测的失败在临床上无显著性。
49.如权利要求47的试剂盒,其中所述试剂盒包含表达Rh DCce(R1r)和Rh ce(rr)抗原的红细胞。
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