CN114137204A - 一种kl-6测定试剂盒及其制备与检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学测定领域，提供了一种KL‑6测定试剂盒，包括样本预处理试剂和胶乳试剂；样本预处理试剂包括：缓冲液10～100mmol/L，稳定剂5～20g/L，防腐剂0.05～2g/L，增敏剂10～50g/L；胶乳试剂包括：缓冲液50～100mmol/L，稳定剂0.5～2g/L，防腐剂0.5～2g/L，抗人KL‑6抗体混合乳胶颗粒20～35mg/L；其中，抗人KL‑6抗体混合乳胶颗粒中采用两种不同粒径的乳胶颗粒。本发明还提供了上述KL‑6测定试剂盒的制备与测定方法。本发明试剂盒用于测定KL‑6含量，且不仅操作简便、适用性强、测定成本低，同时还具备较高灵敏度和精密度，适于大批量标本同时检测。

Description

一种KL-6测定试剂盒及其制备与检测方法
技术领域
本发明涉及免疫学测定领域，尤其涉及一种KL-6测定试剂盒及其制备与检测方法。
背景技术
涎液化糖链抗原(Kerbs von den Lungen-6，KL-6)是分类于第9族肺细胞抗原，相对分子质量约200000的糖蛋白。其主要表达在肺泡Ⅱ型上皮细胞，在正常肺组织和终末细支气管上皮细胞只有极少量表达，而在肺泡I型上皮细胞上不表达。KL-6在间质性肺疾病患者中此项指标较健康人和其他呼吸系统疾病患者显示出有意义的升高，其表达异常与肺间质疾病密切相关，是一类肺间质性疾病(interstitial lung disease，ILD)的生物标志物。
目前，KL-6的检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)和免疫浊度法(INA、ITA)。其中，在酶联免疫吸附法测定中，其检测灵敏度高，但操作过程略显复杂、测定时间较长、影响因素多，且此法主要应用于科学研究，不能用于临床诊断。在化学发光免疫分析法测定中，其自动化操作速度快、准确度高，但是成本高、设备昂贵、稳定性较差，无法普及中基层医院及医疗机构。免疫浊度法又可分为散射比浊(INA)和透射比浊(ITA)，这类方法的优点是快速简便，精密度高、易于自动化，适于大批量标本的同时检测，也可进行少量样本和急诊样本的测定，具有很强的适用性。其中，散射比浊(INA)法由于其光波接收方式的特点，通常测试结果的灵敏度与测速要优于透射比浊，但需要专门仪器的散射比浊仪或特种蛋白仪，与专用配套试剂，测定成本较高，不易于在基层医院中推广使用。而透射比浊(ITA)法，其操作简便，适用性强，普通自动生化分析仪和分光光度计均可使用，更易于被常规分析所采用，几乎所有的各实验室、基层医院均能开展，但不足之处在于：现有方法的灵敏度和精密度不够理想。
据此，目前急需对现有的KL-6透射比浊检测方法进行改进，以获得一种不仅操作简便、适用性强、测定成本低，同时还具备较高灵敏度和精密度的KL-6检测新方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种不仅操作简便、适用性强、测定成本低，同时还具备较高灵敏度和精密度的KL-6测定试剂盒及其制备与检测方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种KL-6测定试剂盒，包括样本预处理试剂和胶乳试剂；所述样本预处理试剂包括：缓冲液10～100mmol/L，稳定剂5～20g/L，防腐剂0.05～2g/L，增敏剂10～50g/L；所述胶乳试剂包括：缓冲液50～100mmol/L，稳定剂0.5～2g/L，防腐剂0.5～2g/L，抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒20～35mg/L；其中，所述抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒中的乳胶颗粒采用两种不同粒径的乳胶颗粒。
作为本发明的优选方式之一，所述样本预处理试剂与胶乳试剂中的缓冲液为硼酸缓冲液、硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Hepes缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Good's缓冲液中的一种或多种，且pH为7～8。
更优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲剂。
作为本发明的优选方式之一，所述样本预处理试剂与胶乳试剂中的稳定剂为蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、甘油、明胶、小牛血清白蛋白、酪蛋白中的一种或多种。
更优选地，所述稳定剂为甘油、小牛血清白蛋白(BSA)。适量的稳定剂可以提供良好稳定的反应环境，使抗原抗体保持天然构象。
作为本发明的优选方式之一，所述样本预处理试剂与胶乳试剂中的防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300、异噻唑啉酮中的一种或多种。
更优选地，所述防腐剂为Proclin300、叠氮钠。
作为本发明的优选方式之一，所述样本预处理试剂中，增敏剂为聚乙二醇6000、氟化钠中的一种。
更优选地，所述增敏剂为聚乙二醇6000(PEG6000)。
作为本发明的优选方式之一，所述胶乳试剂中，抗人KL-6抗体为鼠抗人KL-6单克隆抗体、羊抗人KL-6单克隆抗体、兔抗人KL-6单克隆抗体中的至少一种，或者是鼠抗人KL-6多克隆抗体、羊抗人KL-6多克隆抗体、兔抗人KL-6多克隆抗体中至少一种。
作为本发明的优选方式之一，所述胶乳试剂中，两种不同粒径的乳胶颗粒的粒径分别为100～150nm、150～200nm。
一种上述KL-6测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制样本预处理试剂：
按照样本预处理试剂的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得样本预处理试剂；
(2)制备抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒：
①取粒径为100～150nm的胶乳微球0.5-1.5mL与粒径为150～200nm的胶乳微球0.5-1.5mL进行混合，得混合微球；接着，再将缓冲液A与混合微球按体积比1：(2～4)进行混合；其中，缓冲液A采用50～100mmol/L硼酸缓冲液，pH5.5～7.0；
②加入0.5～1mL的活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应20～30min，温度范围：30～37℃；其中，活化剂包括：NHS25mg/mL，EDC9.0mg/mL；
③加入缓冲液B，调整胶乳溶液的pH值至7.0～7.4；其中，缓冲液B采用20～100mmol/L硼酸钠缓冲液；
④加入1.5-2mg抗人KL-6抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应2～3h，温度范围：30～37℃；
⑤加入1～2mL封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应1～2h，温度范围：30～37℃；其中，封闭液包括：BSA5-15g/L，procline-3000.5-1.5ml/L；
⑥反应完成后离心，离心转速16000rpm，离心时间40min；
⑦离心完成后，去除上清液，即得目标所需的抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒；
(3)配制胶乳试剂：
①按照胶乳试剂的组分含量，将缓冲液、稳定剂与防腐剂混合制成微球稀释液；
②用稀释液重悬步骤(2)制得的抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒，重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，最终制得获得的混合液即为目标所需的胶乳试剂。
一种上述KL-6测定试剂盒的检测方法，采用如下方法检测样本中的KL-6：
(1)吸取2.5μL样本，加入150μL样本预处理试剂，37℃孵育3～5min；
(2)再加入50μL胶乳试剂进行混合，并使其充分反应；
(3)20s后，采用全自动生化分析仪，于570nm主波长、800nm副波长下测定吸光值Al；5min后，相同波长下检测吸光度值A2；
(4)按照△A＝A2-A1来计算吸光度变化值ΔA，并根据ΔA计算出样本中KL-6含量。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，通过将ΔA代入“吸光度变化值与KL-6浓度的线性关系公式”来确定KL-6含量；其中，吸光度变化值与KL-6浓度的线性关系公式通过如下方法获得：
(1)配制校准品缓冲液：
校准品缓冲液包括：甘氨酸缓冲液50～150mmol/L，NaCl5g/L，叠氮钠0.5g/L；
(2)配置各种浓度梯度的校准品
用校准品缓冲液稀释纯化好的KL-6，配置校准品浓度点依次为：200U/mL、1000U/mL、2000U/mL、4000U/mL、8000U/mL；
(3)绘制校准曲线并得到相应公式：
分别向得到的2.5μLKL-6标准品中加入150μL样本预处理试剂，混匀，37℃孵育3～5min；接着，加入50μL胶乳试剂混匀，使其充分反应；20s后，于5于570nm主波长、800nm副波长下检测吸光度值A1；5min后，于相同波长下检测吸光度值A2；分别计算标准品的吸光度变化值△B＝B2-B1，并绘制校准曲线；校准曲线使用多点非线性拟合，得出吸光度变化值与KL-6浓度的线性关系公式。
工作原理：
本发明KL-6(KL-6)测定试剂盒，基于胶乳增强免疫比浊法(PETIA)，其原理是采用化学偶联法将特异性抗体结合于一定粒径的胶乳颗粒表面，当交联有抗体的微球与抗原结合后，短时间内迅速聚集在一起，从而改变反应液的吸光度。根据吸光度增加量，即可在特定波长处测定免疫复合物浊度，定量检测血清中的KL-6含量。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明基于胶乳增强免疫比浊法；胶乳增强免疫比浊检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定；抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等繁琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力；同时，胶乳增强免疫比浊法的适用性强、测试方便；
(2)本发明试剂盒采用不同粒径的胶乳微球组合，能有效的提高KL-6检测试剂盒的灵敏度、精确度与线性范围；
(3)本发明试剂盒可在具备有400～800nm波长的全自动生化分析仪上检测血液中KL-6的含量，直接上机使用，快速精准，成本低廉，自动化程度高，大大提高工作效率；且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种KL-6测定试剂盒，包括样本预处理试剂、胶乳试剂和校准品。其中，样本预处理试剂的主要作用是为了稀释样本，同时处理掉样本中的背景干扰，提高检测结果的准确性。胶乳试剂为核心反应组分。校准品主要是对试剂进行测试前的质量控制，常为液体或干粉状态，用于获得标准曲线。
具体地，样本预处理试剂包括：甘氨酸缓冲液(pH7.0)50mmol/L，蔗糖10g/L，Proclin3000.05g/L，聚乙二醇600040g/L。
胶乳试剂包括：甘氨酸缓冲液(pH7.0)70mmol/L，蔗糖1g/L，Proclin3000.5g/L，抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒20mg/L。其中，抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒中的乳胶颗粒采用两种不同粒径(100nm、150nm)的乳胶颗粒，抗人KL-6抗体采用鼠抗人KL-6单克隆抗体。
校准品包括：甘氨酸缓冲液(pH7.2)50mmol/L，NaCl5g/L，叠氮钠0.5g/L，200～8000U/mLKL-6。
本实施例试剂盒的制备方法：
(1)配制样本预处理试剂：
按照样本预处理试剂的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得样本预处理试剂。
(2)制备抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒：
①取粒径为100nm的胶乳微球0.5mL与粒径为150nm的胶乳微球0.5mL进行混合，得混合微球；接着，再将缓冲液A与混合微球按体积比1：2进行混合；其中，缓冲液A采用50mmol/L硼酸缓冲液，pH5.5；
②加入0.5mL的活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应20min，温度30℃；其中，活化剂包括：NHS25mg/mL，EDC9.0mg/mL；
③加入缓冲液B，调整胶乳溶液的pH值至7.0；其中，缓冲液B采用20mmol/L硼酸钠缓冲液；
④加入1.5mg抗人KL-6抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应2h，温度30℃；
⑤加入1mL封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应1h，温度30℃；其中，封闭液包括：BSA5g/L，procline-3000.5ml/L；
⑥反应完成后离心，离心转速16000rpm，离心时间40min；
⑦离心完成后，去除上清液，即得目标所需的抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒。
(3)配制胶乳试剂：
①按照胶乳试剂的组分含量，将甘氨酸缓冲液、蔗糖和Proclin300混合，制成微球稀释液；
②按照胶乳试剂的组分含量，用稀释液重悬步骤(2)制得的抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒，重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，最终制得获得的混合液即为目标所需的胶乳试剂。
(4)配制校准品：
①校准品缓冲液包括：甘氨酸缓冲液(pH7.2)50mmol/L，NaCl5g/L，叠氮钠0.5g/L；
②用校准品缓冲液稀释纯化好的KL-6，配置校准品浓度点依次为：200U/mL、1000U/mL、2000U/mL、4000U/mL、8000U/mL，最终获得各KL-6浓度梯度的校准品。
实施例2
本实施例的一种KL-6测定试剂盒，包括样本预处理试剂、胶乳试剂和校准品。其中，样本预处理试剂的主要作用是为了稀释样本，同时处理掉样本中的背景干扰，提高检测结果的准确性。胶乳试剂为核心反应组分。校准品主要是对试剂进行测试前的质量控制，常为液体或干粉状态，用于获得标准曲线。
具体地，样本预处理试剂包括：Tris-HCl缓冲液(pH8.0)100mmol/L，BSA20g/L，庆大霉素2g/L，氟化钠50g/L。
胶乳试剂包括：Tris-HCl缓冲液(pH8.0)100mmol/L，BSA2g/L，庆大霉素2g/L，抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒35mg/L。其中，抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒中的乳胶颗粒采用两种不同粒径(150nm、200nm)的乳胶颗粒，抗人KL-6抗体采用兔抗人KL-6多克隆抗体。
校准品包括：甘氨酸缓冲液(pH7.2)150mmol/L，NaCl5g/L，叠氮钠0.5g/L，200～8000U/mLKL-6。
本实施例试剂盒的制备方法：
(1)配制样本预处理试剂：
按照样本预处理试剂的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得样本预处理试剂。
(2)制备抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒：
①取粒径为150nm的胶乳微球1.5mL与粒径为200nm的胶乳微球1.5mL进行混合，得混合微球；接着，再将缓冲液A与混合微球按体积比1：4进行混合；其中，缓冲液A采用100mmol/L硼酸缓冲液，pH7.0；
②加入1mL的活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应30min，温度37℃；其中，活化剂包括：NHS25mg/mL，EDC9.0mg/mL；
③加入缓冲液B，调整胶乳溶液的pH值至7.4；其中，缓冲液B采用100mmol/L硼酸钠缓冲液；
④加入2mg抗人KL-6抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应3h，温度范围：37℃；
⑤加入2mL封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应2h，温度37℃；其中，封闭液包括：BSA15g/L，procline-3001.5ml/L；
⑥反应完成后离心，离心转速16000rpm，离心时间40min；
⑦离心完成后，去除上清液，即得目标所需的抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒。
(3)配制胶乳试剂：
①按照胶乳试剂的组分含量，将Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、BSA和庆大霉素混合，制成微球稀释液；
②按照胶乳试剂的组分含量，用稀释液重悬步骤(2)制得的抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒，重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，最终制得获得的混合液即为目标所需的胶乳试剂。
(4)配制校准品：
①校准品缓冲液包括：甘氨酸缓冲液(pH7.2)150mmol/L，NaCl5g/L，叠氮钠0.5g/L；
②用校准品缓冲液稀释纯化好的KL-6，配置校准品浓度点依次为：200U/mL、1000U/mL、2000U/mL、4000U/mL、8000U/mL，最终获得各KL-6浓度梯度的校准品。
实施例3
本实施例的一种KL-6测定试剂盒，包括样本预处理试剂、胶乳试剂和校准品。其中，样本预处理试剂的主要作用是为了稀释样本，同时处理掉样本中的背景干扰，提高检测结果的准确性。胶乳试剂为核心反应组分。校准品主要是对试剂进行测试前的质量控制，常为液体或干粉状态，用于获得标准曲线。
具体地，样本预处理试剂包括：磷酸盐缓冲液(pH7.3)10mmol/L，甘油5g/L，叠氮钠1g/L，PEG600010g/L。
胶乳试剂包括：甘氨酸缓冲液(pH7.3)50mmol/L，BSA0.5～2g/L，Proclin3001g/L，抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒30mg/L。其中，所述抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒中的乳胶颗粒采用两种不同粒径(150nm、180nm)的乳胶颗粒，抗人KL-6抗体采用鼠抗人KL-6单克隆抗体。
校准品包括：甘氨酸缓冲液(pH7.2)100mmol/L，NaCl5g/L，叠氮钠0.5g/L，200～8000U/mLKL-6。
本实施例试剂盒的制备方法：
(1)配制样本预处理试剂：
按照样本预处理试剂的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得样本预处理试剂；
(2)制备抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒：
①取粒径为150nm的胶乳微球1mL与粒径为180nm的胶乳微球1mL进行混合，得混合微球；接着，再将缓冲液A与混合微球按体积比1：3进行混合；其中，缓冲液A采用80mmol/L硼酸缓冲液，pH6；
②加入0.6mL活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应25min，温度37℃；其中，活化剂包括：NHS25mg/mL，EDC9.0mg/mL，现配现用；
③加入缓冲液B，调整胶乳溶液的pH值至7.2；其中，缓冲液B采用80mmol/L硼酸钠缓冲液；
④加入2mg抗人KL-6抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应2.5h，温度37℃；
⑤加入1.5mL封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应1.5h，温度37℃；其中，封闭液包括：BSA10g/L，procline-3001ml/L；
⑥反应完成后离心，离心转速16000rpm，离心时间40min；
⑦离心完成后，去除上清液，即得目标所需的抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒。
(3)配制胶乳试剂：
①按照胶乳试剂的组分含量，将缓冲液、稳定剂与防腐剂混合制成微球稀释液；
②按照胶乳试剂的组分含量，用微球稀释液重悬步骤(2)制得的抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒，重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，最终制得获得的混合液即为目标所需的胶乳试剂。
(4)配制校准品：
①校准品缓冲液包括：甘氨酸缓冲液(pH7.2)100mmol/L，NaCl5g/L，叠氮钠0.5g/L；
②用校准品缓冲液稀释纯化好的KL-6，配置校准品浓度点依次为：200U/mL、1000U/mL、2000U/mL、4000U/mL、8000U/mL，最终获得各KL-6浓度梯度的校准品。
实施例4
本实施例的一种上述KL-6测定试剂盒的检测方法，采用如下方法检测样本中的KL-6：
(1)吸取2.5μL样本，加入150μL样本预处理试剂，37℃孵育3～5min；
(2)再加入50μL胶乳试剂进行混合，并使其充分反应；
(3)20s后，采用全自动生化分析仪，于570nm主波长、800nm副波长下测定吸光值Al；5min后，相同波长下检测吸光度值A2(反应方法为终点法，主波长为570nm，反应方向为正反应，反应温度为37℃，比色杯光径为1.0cm条件下)；
(4)按照△A＝A2-A1来计算吸光度变化值ΔA，并将ΔA代入“吸光度变化值与KL-6浓度的线性关系公式”来确定KL-6含量。
其中，吸光度变化值与KL-6浓度的线性关系公式通过如下方法获得：
(1)准备200U/mL、1000U/mL、2000U/mL、4000U/mL、8000U/mL各KL-6浓度梯度的校准品：
(2)分别向得到的2.5μLKL-6标准品中加入150μL样本预处理试剂，混匀，37℃孵育3～5min；接着，加入50μL胶乳试剂混匀，使其充分反应；20s后，于5于570nm主波长、800nm副波长下检测吸光度值A1；5min后，于相同波长下检测吸光度值A2；分别计算标准品的吸光度变化值△B＝B2-B1，并绘制校准曲线；校准曲线使用多点非线性拟合，得出吸光度变化值与KL-6浓度的线性关系公式。
实施例5
本实施例用以评价上述KL-6测定试剂盒的使用效果。
一、准确度分析：
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
检测样本：20例KL-6浓度较高的无溶血、黄疸、浑浊现象的血清样本(靶值为5450U/mL)。
对照试剂盒：国家食品药品监督管理局已批准上市的某厂家KL-6检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(包括试剂R1和R2，但成分与本发明不同，以下简称为对照试剂)。
分别使用上述实施例3制备得到的试剂盒和对照试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)同时对KL-6浓度较高的无溶血、黄疸、浑浊现象的人血清样本进行测定，重复3遍，计算均值、CV和偏差。偏差范围在±10％以内视为无干扰，偏差范围超过±10％视为干扰。结果如表1-1、表1-2所示。
表1-1本发明试剂盒的1-10样品检测结果
Figure BDA0003372827330000131
表1-2本发明试剂盒的11-20样品检测结果
Figure BDA0003372827330000132
Figure BDA0003372827330000141
表2 KL-6抗原血清样本检测结果
Figure BDA0003372827330000142
根据表1-1与表1-2检测结果，计算出本发明试剂盒对20例样品检查结果平均值分别为1722.95，计算出的相对偏差为0.17％；同时，根据本发明试剂盒和对照试剂检测结果，靶值为550U/mL的质控品3次测定结果平均值为554.0、547.7，计算出的相对偏差分别为0.73％(如表2所示)，这进一步表明本发明涎液化糖链抗原检测试剂盒检测结果与对照试剂盒结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)。
二、灵敏度分析：
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
检测样本：1份纯化水、1份浓度为200U/mL的涎液化糖链抗原低值样本。
用实施例3制备得到的试剂盒和对照试剂盒(某厂家涎液化糖链抗原检测试剂盒)用各自的检测方法同时定标同时对每份待测样本重复检测20次，记录吸光度数值，计算平均值和标准偏差(SD)；水的吸光度平均值加上2SD作为最低检出限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和200U/mL样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度，即灵敏度。灵敏度＝(水吸光度差值平均值+2SD)*样本浓度/样本吸光度差值平均值。检测结果见表3。
表3本发明试剂盒与对照试剂盒灵敏度分析结果
Figure BDA0003372827330000151
Figure BDA0003372827330000161
结果显示，本发明试剂盒检测涎液化糖链抗原的灵敏度为2.55mg/L，对照试剂的灵敏度为4.69mg/L，表明本发明试剂盒具有较高的灵敏度。
三、精密度分析：
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
检测样本：2份临床血清样本(323U/mL)(低值样本)、(875U/mL)(高值样本)。
用实施例3制备得到的试剂盒和对照试剂盒(某厂家涎液化糖链抗原检测试剂盒)对每份待测样本重复检测10次，检测结果见表4。
表4本发明试剂盒精密度分析结果
Figure BDA0003372827330000162
Figure BDA0003372827330000171
结果显示，本发明试剂盒的精密度：CV低值为0.82％、CV高值为0.31％，均小于等于10％；而对照试剂盒CV低值为0.80％、CV高值为0.28％，表明本发明试剂盒比对照试剂盒具有更高的精密度。
四、线性分析：
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
检测样本：高涎液化糖链抗原血清样本(8000U/mL)。
将高涎液化糖链抗原血清样本(8000U/mL)用校准品稀释液稀释成5个不同浓度，分别为0U/mL、500U/mL、1000U/mL、3000U/mL、7000U/mL，采用实施例3制备得到的试剂盒对上述样品的每个浓度进行检测，每个浓度检测三次，计算相关系数R值，检测结果见表5。
表5本发明试剂盒线性分析结果
Figure BDA0003372827330000172
Figure BDA0003372827330000181
结果显示，本发明试剂盒检测结果得到的回归方程为y＝y＝0.9741x+48.808，相关系数R2＝0.9997，表明本发明试剂盒在8000U/mL范围内具有良好的线性度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种KL-6测定试剂盒，其特征在于，包括样本预处理试剂和胶乳试剂；所述样本预处理试剂包括：缓冲液10～100mmol/L，稳定剂5～20g/L，防腐剂0.05～2g/L，增敏剂10～50g/L；所述胶乳试剂包括：缓冲液50～100mmol/L，稳定剂0.5～2g/L，防腐剂0.5～2g/L，抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒20～35mg/L；其中，所述抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒中的乳胶颗粒采用两种不同粒径的乳胶颗粒。
2.根据权利要求1所述的KL-6测定试剂盒，其特征在于，所述样本预处理试剂与胶乳试剂中的缓冲液为硼酸缓冲液、硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Hepes缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Good's缓冲液中的一种或多种，且pH为7～8。
3.根据权利要求1所述的KL-6测定试剂盒，其特征在于，所述样本预处理试剂与胶乳试剂中的稳定剂为蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、甘油、明胶、小牛血清白蛋白、酪蛋白中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的KL-6测定试剂盒，其特征在于，所述样本预处理试剂与胶乳试剂中的防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300、异噻唑啉酮中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的KL-6测定试剂盒，其特征在于，所述样本预处理试剂中，增敏剂为聚乙二醇6000、氟化钠中的一种。
6.根据权利要求1所述的KL-6测定试剂盒，其特征在于，所述胶乳试剂中，抗人KL-6抗体为鼠抗人KL-6单克隆抗体、羊抗人KL-6单克隆抗体、兔抗人KL-6单克隆抗体中的至少一种，或者是鼠抗人KL-6多克隆抗体、羊抗人KL-6多克隆抗体、兔抗人KL-6多克隆抗体中至少一种。
7.根据权利要求1所述的KL-6测定试剂盒，其特征在于，所述胶乳试剂中，两种不同粒径的乳胶颗粒的粒径分别为100～150nm、150～200nm。
8.一种如权利要求1～7任一所述的KL-6测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制样本预处理试剂：
按照样本预处理试剂的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得样本预处理试剂；
(2)制备抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒：
①取粒径为100～150nm的胶乳微球0.5-1.5mL与粒径为150～200nm的胶乳微球0.5-1.5mL进行混合，得混合微球；接着，再将缓冲液A与混合微球按体积比1：(2～4)进行混合；其中，缓冲液A采用50～100mmol/L硼酸缓冲液，pH 5.5～7.0；
②加入0.5～1mL的活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应20～30min，温度范围：30～37℃；其中，活化剂包括：NHS 25mg/mL，EDC 9.0mg/mL；
③加入缓冲液B，调整胶乳溶液的pH值至7.0～7.4；其中，缓冲液B采用20～100mmol/L硼酸钠缓冲液；
④加入1.5-2mg抗人KL-6抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应2～3h，温度范围：30～37℃；
⑤加入1～2mL封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应1～2h，温度范围：30～37℃；其中，封闭液包括：BSA 5-15g/L，procline-300 0.5-1.5ml/L；
⑥反应完成后离心，离心转速16000rpm，离心时间40min；
⑦离心完成后，去除上清液，即得目标所需的抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒；
(3)配制胶乳试剂：
①按照胶乳试剂的组分含量，将缓冲液、稳定剂与防腐剂混合制成微球稀释液；
②用稀释液重悬步骤(2)制得的抗人KL-6抗体混合乳胶颗粒，重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，最终制得获得的混合液即为目标所需的胶乳试剂。
9.一种如权利要求1～7任一所述的KL-6测定试剂盒的检测方法，其特征在于，采用如下方法检测样本中的KL-6：
(1)吸取2.5μL样本，加入150μL样本预处理试剂，37℃孵育3～5min；
(2)再加入50μL胶乳试剂进行混合，并使其充分反应；
(3)20s后，采用全自动生化分析仪，于570nm主波长、800nm副波长下测定吸光值Al；5min后，相同波长下检测吸光度值A2；
(4)按照△A＝A2-A1来计算吸光度变化值ΔA，并根据ΔA计算出样本中KL-6含量。
10.根据权利要求9所述的KL-6测定试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中，通过将ΔA代入“吸光度变化值与KL-6浓度的线性关系公式”来确定KL-6含量；其中，吸光度变化值与KL-6浓度的线性关系公式通过如下方法获得：
(1)配制校准品缓冲液：
校准品缓冲液包括：甘氨酸缓冲液50～150mmol/L，NaCl 5g/L，叠氮钠0.5g/L；
(2)配置各种浓度梯度的校准品
用校准品缓冲液稀释纯化好的KL-6，配置校准品浓度点依次为：200U/mL、1000U/mL、2000U/mL、4000U/mL、8000U/mL；
(3)绘制校准曲线并得到相应公式：
分别向得到的2.5μLKL-6标准品中加入150μL样本预处理试剂，混匀，37℃孵育3～5min；接着，加入50μL胶乳试剂混匀，使其充分反应；20s后，于5于570nm主波长、800nm副波长下检测吸光度值A1；5min后，于相同波长下检测吸光度值A2；分别计算标准品的吸光度变化值△B＝B2-B1，并绘制校准曲线；校准曲线使用多点非线性拟合，得出吸光度变化值与KL-6浓度的线性关系公式。
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