CN106932588A - 检测α1-微球蛋白的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测α1-微球蛋白的试剂盒及其制备方法。由试剂R1和试剂R2按体积比1﹕1的比例组成。试剂R1:120~150mmol/L缓冲液、3~20g/L稳定剂、5~20g/L电解质、3~20g/L增敏剂、0.5~10g/L表面活性剂、0.2~1g/L防腐剂、和纯化水。R2:1.5~3.5g/L两种粒径的、分别偶联同一种抗人α1-微球蛋白多克隆抗体的胶乳微球、20~150mmol/L的缓冲液、3~20g/L的稳定剂,5~20g/L的电解质,0.5g/L的防腐剂,以及纯化水;pH值为7.0~9.5。本发明检测迅速,准确度高。大幅度降低生产成本,宜于工业化生产,有较大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物试剂,具体涉及检测试剂盒,尤其涉及一种胶乳增强免疫比浊法检测α1-微球蛋白的试剂盒及其制备方法。
背景技术
α1-微球蛋白(α1-MG)是一种广泛分布在体液和淋巴细胞膜表面的糖蛋白,由167个氨基酸组成,分子量约27kDa,主要合成于肝脏和淋巴细胞;血液中,α1-微球蛋白有两种存在形式:游离态α1-MG及与IgA(免疫球蛋白A)结合的α1-MG-1gA;游离态α1-MG可自由通过肾小球过滤,约95%-99%在肾小管重吸收和代谢,只有微量从尿液排出;结合态α1-MG-IgA则不能通过肾小球,其在尿液中的浓度为零。α1-MG在体内的产生量恒定,较少受肾外因素影响,因此α1-MG浓度的测定对肾功能损伤的早期诊断具有意义。
目前,已有检测α1-MG的试剂盒主要根据胶乳增强免疫比浊法的测定制备而成。其制备过程一般包括物理吸附法和化学偶联法;其中,物理吸附法稳定性较差,抗体容易从胶乳颗粒上脱落下来,造成试剂性能下降;而化学偶联法,使用的是带有功能基团(例如羧基)的胶乳微球,在活化剂如EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)的作用下,可与抗体偶联,抗体与微球结合。但是,化学偶联法检测α1-MG的试剂盒对反应体系的要求较苛刻。因此,需要进一步改进。
发明内容
本发明所要解决的在于克服上述不足之处,研究设计具有线性范围宽、灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强、制备成本低,稳定性好等特点的检测α1-微球蛋白的试剂盒。
本发明提供一种检测α1-微球蛋白的试剂盒,具体提供一种胶乳增强免疫比浊法检测α1-MG的试剂盒。
本发明检测α1-微球蛋白的试剂盒。
本发明的试剂盒由试剂R1和试剂R2按体积比1﹕1的比例组成。
本发明试剂盒所述试剂R1由下列配比的成分组成:
20~150mmol/L缓冲液、3~20g/L稳定剂、5~20g/L电解质、3~20g/L增敏剂、0.5~10g/L表面活性剂、0.2~1g/L防腐剂、和纯化水,pH值为7.0~9.5。
所述稳定剂选自牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、氯化胆碱、蔗糖、海藻糖或山梨醇中的一种或几种。
所述增敏剂选自PEG(聚乙二醇)2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000或PEG20000中的一种或几种;
所述电解质选自氯化钠或氯化钾中的一种或几种;
所述表面活性剂选自吐温-20、曲拉通X-100或曲拉通X-405中的一种或几种。
所述防腐剂选自叠氮钠(NaN3)、Proclin-300(商品名,主要成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)或亚硝酸钠(NaNO2)中的一种或几种。
所述pH调节剂为12mol/L浓盐酸或10mol/L NaOH溶液。
试剂R1有利于α1-微球蛋白的抗原与抗体充分结合。
所述试剂R2由下列配比的成分组成:
1.5~3.5g/L两种粒径的、分别偶联同一种抗人α1-微球蛋白多克隆抗体的胶乳微球、20~150mmol/L的缓冲液、3~20g/L的稳定剂,5~20g/L的电解质,0.5g/L的防腐剂,以及纯化水,pH值为7.0~9.5。
所述偶联同一种抗人α1-微球蛋白多克隆抗体的胶乳微球指的是将同一种抗体分别偶联在两种粒径的胶乳微球上,为R2中的主要成分;所述两种粒径按小粒径:大粒径=8:2~5:5的比例小粒径的粒径为:20~125nm;大粒径的粒径为:150~300nm。
所述胶乳微球的粒径为20~300nm的聚苯乙烯微球,其中羧基含量为0.080~0.470mmol/g。
所述抗人α1-MG多克隆抗体选自羊抗人α1-微球蛋白多克隆抗体或兔抗人α1-微球蛋白多克隆抗体中的一种或几种。
所述试剂R1和试剂R2的缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、3-(环已胺)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、硼酸(H3BO3)或氯化铵(NH4Cl)中的一种或几种。
本发明另一目的是提供了所述检测α1-微球蛋白的试剂盒制备方法,该方法包括下列步骤:
一、制备试剂R1:
组成:120~150mmol/L缓冲液、3~20g/L稳定剂、5~20g/L电解质、3~20g/L增敏剂、0.5~10g/L表面活性剂、0.2~1g/L防腐剂、和纯化水,pH值为7.0~9.5。
制备:取纯化水于烧杯中,置于磁力搅拌器上,依次加入缓冲剂、稳定剂、电解质、增敏剂、表面活性剂以及防腐剂于烧杯中,每次添加物料需完全溶解后才能继续添加下一种物料,待所有物料完全溶解后,用12mol/L浓盐酸或10mol/L NaOH调节pH至7.0~9.5,用0.22um滤膜过滤,以去除不溶性的杂质,即为试剂R1;
二、制备试剂R2
组成:1.5~3.5g/L两种粒径的、分别偶联同一种抗人α1-微球蛋白多克隆抗体的胶乳微球、20~150mmol/L的缓冲液、3~20g/L的稳定剂,5~20g/L的电解质,0.5g/L的防腐剂,以及纯化水,pH值为7.0~9.5。
制备:
(1)取0.7~1.5g小粒径20~125nm胶乳微球,加入10ml pH5.5~7.0的缓冲液、2ml新鲜配制的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)溶液10-30mg/ml,加入纯化水至体积100ml,充分混匀,室温混合15~40min;
(2)取0.7~1.5g大粒径150~300nm胶乳微球,加入10ml pH5.5~7.0的缓冲液、1.5ml新鲜配制的EDC溶液10-30mg/ml,加入纯化水至体积100ml,充分混匀,室温20~30℃混合15~40min;
(3)将质量比(微球:抗体)为12:1~20:1的抗人α1-MG抗体(6.2mg/ml)加入步骤1的体系中进行抗体偶联,室温(20~30℃)混合1h;
(4)将质量比(微球:抗体)为35:1~50:1的抗人α1-MG抗体(6.2mg/ml)加入步骤2的体系中进行抗体偶联,室温20~30℃混合1h;
(5)将步骤3和步骤4中反应完全的体系分别于10000~16000rpm离心20~50min,各加入100ml pH值7.0~9.5、50mM的缓冲液,超声重悬;
(6)在步骤5重悬后的各体系中,分别加入5~15ml 20%BSA(牛血清白蛋白)溶液,室温(20~30℃)混合0.5~3h;
(7)用pH7.0~9.0、50mM的缓冲液(含0.2~1.5%BSA,0.3~2%NaCl,0.1~1.0%蔗糖,0.05%NaN3)分别稀释步骤(6)小粒径和大粒径偶联抗体的胶乳微球溶液,至形成的小粒径和大粒径胶乳微球溶液终浓度为0.15~0.35%,稀释后的体积各为500ml;
(8)将小粒径胶乳微球溶液与大粒径胶乳微球溶液按8:2~1:1混合,即得试剂R2。
三、组成试剂盒:
R1:2×60ml/每瓶
R2:2×15ml/每瓶。
现有技术中,由于单独采用小粒径胶乳微球时,试剂的线性、灵敏度及样本检测情况均良好,但是所需抗体的使用量很多,会非常明显的提高生产成本;而加入大粒径的胶乳微球后,对试剂的线性、灵敏度及样本检测情况都有影响,所以,两种粒径的胶乳微球的选择(粒径、比例、两种胶乳微球上偶联抗体的量)都会对试剂性能产生很大的影响。本发明克服了单用的小粒径胶乳微球或大粒径的胶乳微球的缺陷,用于检测血清/血浆样品与进口对照试剂相关性良好,对于与已有技术试剂盒比较,检测样品迅速,准确度高,具有线性范围宽、灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强的特点。
本发明大幅度降低了试剂的生产制备成本,减少抗体的使用量,且可以达到与对照试剂同样的性能,同时可以线性放大制备,宜于规模型工业化生产,有较大的应用价值。
附图说明
图1实施例1试剂与进口对照试剂相关性检测。
图2实施例2试剂与进口对照试剂相关性检测。
图3实施例3试剂与进口对照试剂相关性检测。
纵坐标:对照试剂样本检测值(mg/L)
横坐标:实施例试剂样本检测值(mg/L)
图4进口对照试剂校准曲线
图5自配试剂(实施例1)校准曲线
图6自配试剂与进口对照试剂的线性相关系数
具体实施方式
以下实施例所用原料和药用辅料通过市售得到。
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述,但不仅限于此。
实施例1:检测α1-微球蛋白试剂盒的制备
实施例的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下:
1.抗人α1-微球蛋白抗体(深圳菲鹏生物)
2.胶乳微球:采用直径为68nm和220nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒(日本捷时雅)
制备试剂R1:50mM MOPS缓冲液,加入10g PEG6000,1gNaN3,1.5g BSA,16gNaCl,3g吐温-20,其余为纯化水,总制备量1L,pH值8.0,该试剂为无色或微黄色透明溶液。
试剂R2配方:50mM MOPS缓冲液,含0.35%α1-微球蛋白抗体包被的胶乳微球、1.5%BSA,1.7%NaCl,1.3%蔗糖,0.08%NaN3,pH值7.7,该试剂为乳白色溶液。
制备试剂R2步骤如下:
(1)1.75g68nm胶乳微球(小粒径),加入10ml pH值6.1的MES溶液、2ml新鲜配制的EDC溶液(20mg/ml),纯化水补足体积至100ml,充分混匀,20~30℃混合30min;
(2)取1.75g220nm胶乳微球(大粒径),加入10ml pH6.1的MES溶液、1.5ml新鲜配制的EDC溶液(20mg/ml),纯化水补足体积至100ml,充分混匀,室温20~30℃混合30min;
(3)将质量比(微球:抗体)为12:1的抗人α1-微球蛋白抗体(83.3mg,6.2mg/ml)加入步骤1的体系中进行抗体偶联,20~30℃混合1h;
(4)将质量比(微球:抗体)为35:1的抗人α1-MG抗体(28.6mg,6.2mg/ml)加入步骤2的体系中进行抗体偶联,20~30℃混合1h;
(5)将步骤3和步骤4中反应完全的体系分别经14000rpm(Allegra 64RCentrifuge,Beckman Coulter)离心30min,各加入100ml pH7.7、50mM的MOPS缓冲液,超声破碎仪(JY9R-IIDN,宁波新芝生物)重悬;
(6)在步骤5重悬后的2个体系中,分别加入10ml 20%BSA溶液,20~30℃混合1h;
(7)用pH 7.7、50mM的MOPS缓冲液(1.5%BSA,1.7%NaCl,1.3%蔗糖,0.08%NaN3),分别稀释步骤6的两个体系至微球终浓度为0.35%,分别得到500ml 68nm(小粒径)偶联抗人α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液与500ml220nm(大粒径)偶联抗人α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液。
(8)将500ml 68nm偶联抗人α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液与500ml 220nm偶联抗人α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液按体积比1:1混合即得1000ml试剂R2。
3.α1-微球蛋白校准品制备:在20mM pH7.2的PBS溶液(含0.3%BSA、0.05%NaN3)中加入α1-微球蛋白抗原(市售,深圳菲鹏生物),配制成浓度120mg/L,除菌过滤,校准品均为无色透明液体。
4.α1-微球蛋白的测定
检测工具:AU680型全自动生化分析仪。
分析方法:两点终点法;主波长:600nm,副波长:无;样品量:2.0μl;取实施例1制得的试剂R1:240μl;试剂R2:60μl;
校准模式:多点非线性;反应方向:上升;测定温度:37℃;测试时间:10min
2.0μl血清/血浆样品(从上海新华医院获得)与试剂240μl R1混匀后,于5分钟时加入试剂60μl R2,立即读取吸光度A1;于37℃反应5分钟后读取吸光度A2。
反应吸光度的计算为A2与A1的校准差值。
参考范围:血清10~30mg/L
5.结果说明:
所配试剂与对照试剂样本测试比对
样本例数:50例
仪器:奥林巴斯AU680
从图1中可见,自配试剂与进口对照试剂相关性良好。
实施例2:检测α1-微球蛋白试剂盒的制备
1.本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下:
抗人α1-微球蛋白抗体(深圳菲鹏生物)
胶乳微球:采用直径为95nm和188nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒(日本捷时雅)
2.本实施例的主要试剂的配制如下:
试剂R1:50mMH3BO3缓冲液,加入0.4%PEG6000,0.05%NaN3,0.3%BSA,0.8%NaCl,0.1%吐温-20,pH值8.5,总制备量1L,该试剂为无色或微黄色透明溶液。
试剂R2:50mMH3BO3缓冲液,含0.15%α1-微球蛋白抗体包被的胶乳微球、0.4%BSA,0.5%NaCl,0.3%蔗糖,0.05%NaN3,pH值8.5,该试剂为乳白色溶液。具体制备步骤如下:
(1)1.2g68nm胶乳微球,加入16ml pH值6.1的MES溶液、3.2ml新鲜配制的EDC溶液(20mg/ml),纯化水补足体积至160ml,充分混匀,20~30℃混合30min;
(2)取0.3g220nm胶乳微球,加入4ml pH6.1的MES溶液、0.6ml新鲜配制的EDC溶液(20mg/ml),纯化水补足体积至40ml,充分混匀,室温20~30℃混合30min;
(3)将质量比(微球:抗体)为20:1的抗人α1-微球蛋白抗体(60mg,6.2mg/ml)加入步骤1的体系中,20~30℃混合1h;
(4)将质量比(微球:抗体)为50:1的抗人α1-MG抗体(6mg,6.2mg/ml)加入步骤2的体系中,20~30℃混合1h;
(5)将步骤3和步骤4中反应完全的体系分别经14000rpm(Allegra 64RCentrifuge,Beckman Coulter)离心50min,各加入160/40ml pH8.5、50mM的H3BO3缓冲液,超声破碎仪(JY9R-IIDN,宁波新芝生物)重悬;
(6)在步骤5重悬后的体系中,分别加入10ml 20%BSA溶液,20~30℃混合1h;
(7)用pH8.5、50mM的H3BO3缓冲液(0.4%BSA,0.5%NaCl,0.3%蔗糖,0.05%NaN3),分别稀释步骤6的两个体系至胶乳微球终浓度为0.15%,分别得到800ml 95nm偶联抗人α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液与200ml188nm偶联抗人α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液。
(8)将800ml 95nm偶联抗人α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液与200ml188nm偶联抗人α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液按体积比8:2混合即得1000ml试剂R2。
制备试剂盒:试剂盒装量如下所述
R1:2X60ml/每瓶
R2:2X15ml/每瓶
校准品:1ml,120mg/L
3.α1-微球蛋白校准品制备:在20mM pH7.2的PBS溶液(含0.3%BSA、0.05%NaN3)中加入α1-微球蛋白抗原(市售,深圳菲鹏生物),配制成浓度120mg/L,除菌过滤,校准品均为无色透明液体。
连续配制3个批号的试剂盒(R1+R2+校准品),配方及步骤一致,
4.α1-微球蛋白的测定
检测工具:AU680型全自动生化分析仪。
分析方法:两点终点法;主波长:600nm,副波长:无;样品量:2.0ul;实施例1制得的试剂R1:240ul;试剂R2:60ul;
校准模式:多点非线性;反应方向:上升;测定温度:37℃;测试时间:10min
血清/血浆样品(从医院获得)与试剂R1混匀后,于5分钟时加入试剂R2,立即读取吸光度A1;于37℃反应5分钟后读取吸光度A2。
反应吸光度的计算为A2与A1的校准差值。
参考范围:血清10~30mg/L
5.结果说明:
所配试剂与对照试剂样本测试比对
样本例数:50例
仪器:奥林巴斯AU680
从图2中可见,自配试剂与进口对照试剂相关性良好
实施例3:α1-微球蛋白试剂R2中试放大(切向流过滤)
R2试剂由小样向中试放大过程中,通常包括离心和切向流过滤两种方法;离心方法简便易行,但是单次制备量少,批间差难以控制;相比之下,切向流过滤则可较好的解决批间差问题,只要指标控制得当,便可较稳定的大量制备R2试剂。
本实施例中所用的原材料及试剂组分详见实施例1,制备步骤与实施例1保持一致,制备R2试剂总量为4L(68nm偶联抗α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液2L;188nm偶联抗α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液2L;两种溶液按1:1混合,终体积4L);制备步骤如下:
(1)8.75g68nm胶乳微球,加入50ml pH值6.1的MES溶液、200mg EDC,纯化水补足体积至500ml,充分混匀,20~30℃混合30min;
(2)取8.75g220nm胶乳微球,加入50ml pH6.1的MES溶液、130mg EDC,纯化水补足体积至500ml,充分混匀,室温20~30℃混合30min;
(3)将质量比(微球:抗体)为12:1的抗人α1-微球蛋白抗体(729mg,6.2mg/ml)加入步骤1的体系中,20~30℃混合1h;
(4)将质量比(微球:抗体)为35:1的抗人α1-MG抗体(250mg,6.2mg/ml)加入步骤2的体系中,20~30℃混合1h;
(5)对上述两个500ml体系分别进行切向流过滤(KrosFlo research IIi TFFsystem,SPECTRUM公司),选择合适的中空纤维柱(SPECTRUM公司,mPES/500kD/790cm2),按说明书组装设备和中空纤维柱,控制剪切力值为3000,在此条件下过滤4倍于500ml体系的MOPS pH7.7缓冲液;
(6)过滤完成后,加入50ml 20%BSA溶液,20~30℃混合1h;
(7)用pH7.7、50mM的MOPS缓冲液(1.5%BSA,1.7%NaCl,1.3%蔗糖,0.08%NaN3)分别稀释上述体系至2L(偶联抗人α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液终浓度为0.35%);
(8)2L 68nm偶联抗人α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液与2L220nm偶联抗人α1-微球蛋白抗体的胶乳微球溶液按体积比1:1混合即得4L试剂R2。
5.结果说明:
所配试剂与对照试剂样本测试比对
样本例数:50例
仪器:奥林巴斯AU680
从图3中可见,自配试剂与进口对照试剂相关性良好。
实施例4自配试剂与进口对照试剂校准曲线比较
下表为自配试剂与对照试剂在不同校准品浓度下的吸光度对比;
图6计算可得,两者的线性相关系数R2=0.99881,表明两者校准曲线的一致性较好
校准品浓度(mg/L) | 自配试剂吸光度 | 对照试剂吸光度 |
0 | 0.0045 | -0.01015 |
7.5 | 0.01182 | 0.0124 |
15 | 0.03451 | 0.03775 |
30 | 0.09136 | 0.09455 |
60 | 0.23341 | 0.23015 |
120 | 0.51328 | 0.53075 |
。
Claims (9)
1.检测α1-微球蛋白的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒由试剂R1和试剂R2组成;所述试剂盒由试剂R1和试剂R2按体积比1﹕1的比例组成。
2.根据权利要求1所述检测α1-微球蛋白的试剂盒,其特征在于,所述试剂R1由下列配比的成分组成:
20~150mmol/L缓冲液、3~20g/L稳定剂、5~20g/L电解质、3~20g/L增敏剂、0.5~10g/L表面活性剂、0.2~1g/L防腐剂、和纯化水,pH值为7.0~9.5。
3.根据权利要求1所述检测α1-微球蛋白的试剂盒,其特征在于,所述稳定剂选自牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、氯化胆碱、蔗糖、海藻糖或山梨醇中的一种或几种;所述增敏剂选自PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000或PEG20000中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述检测α1-微球蛋白的试剂盒,其特征在于,所述电解质选自氯化钠或氯化钾中的一种或几种;所述表面活性剂选自吐温-20、曲拉通X-100或曲拉通X-405中的一种或几种;所述防腐剂选自叠氮钠、Proclin-300或亚硝酸钠中的一种或几种;所述pH调节剂为12mol/L浓盐酸或10mol/L NaOH溶液。
5.根据权利要求1所述检测α1-微球蛋白的试剂盒,其特征在于,所述试剂R2由下列配比的成分组成:
1.5~3.5g/L两种粒径的、分别偶联同一种抗人α1-微球蛋白多克隆抗体的胶乳微球、20~150mmol/L的缓冲液、3~20g/L的稳定剂,5~20g/L的电解质,0.5g/L的防腐剂,以及纯化水,pH值为7.0~9.5。
6.根据权利要求5所述检测α1-微球蛋白的试剂盒,其特征在于,所述偶联同一种抗人α1-微球蛋白多克隆抗体的胶乳微球为将同一种抗体分别偶联在两种粒径的胶乳微球上;所述两种粒径的比例:小粒径:大粒径为8:2~5:5;所述小粒径的粒径为:20~125nm;大粒径的粒径为:150~300nm。
7.根据权利要求5所述检测α1-微球蛋白的试剂盒,其特征在于,所述胶乳微球的粒径为20~300nm的聚苯乙烯微球,其中羧基含量为0.080~0.470mmol/g;所述抗人α1-MG多克隆抗体选自羊抗人α1-微球蛋白多克隆抗体或兔抗人α1-微球蛋白多克隆抗体中的一种或几种。
8.根据权利要求2或5所述检测α1-微球蛋白的试剂盒,其特征在于,所述试剂R1和试剂R2的缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷、2-(N-吗啡啉)乙磺酸、3-(环已胺)-2-羟基-1-丙磺酸、3-吗啉丙磺酸、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、硼酸或氯化铵中的一种或几种。
9.如权利要求1所述检测α1-微球蛋白的试剂盒制备方法,其特征在于,该方法包括下列步骤:
一、制备试剂R1:
取纯化水于烧杯中,置于磁力搅拌器上,依次加入缓冲剂、稳定剂、电解质、增敏剂、表面活性剂以及防腐剂于烧杯中,每次添加物料需完全溶解后才能继续添加下一种物料,待所有物料完全溶解后,用12mol/L浓盐酸或10mol/L NaOH调节pH至7.0~9.5,用0.22um滤膜过滤,以去除不溶性的杂质,即为试剂R1;
二、制备试剂R2
组成:1.5~3.5g/L两种粒径的、分别偶联同一种抗人α1-微球蛋白多克隆抗体的胶乳微球、20~150mmol/L的缓冲液、3~20g/L的稳定剂,5~20g/L的电解质,0.5g/L的防腐剂,以及纯化水,pH值为7.0~9.5;
制备:
(1)取0.7~1.5g小粒径20~125nm胶乳微球,加入10mlpH5.5~7.0的缓冲液、2ml新鲜配制的EDC溶液10-30mg/ml,加入纯化水至体积100ml,充分混匀,室温20~30℃混合15~40min;
(2)取0.7~1.5g大粒径150~300nm胶乳微球,加入10mlpH5.5~7.0的缓冲液、1.5ml新鲜配制的EDC溶液10-30mg/ml,加入纯化水至体积100ml,充分混匀,室温20~30℃混合15~40min;
(3)将质量比微球:抗体为12:1~20:1的抗人α1-MG抗体6.2mg/ml加入步骤1的体系中,室温20~30℃混合1h;
(4)将质量比微球:抗体为35:1~50:1的抗人α1-MG抗体6.2mg/ml加入步骤2的体系中,室温20~30℃混合1h;
(5)将步骤3和步骤4中反应完全的体系分别于10000~16000rpm离心20~50min,各加入1L pH值7.0~9.5、50mM的缓冲液,超声重悬;
(6)在步骤5重悬后的各体系中,分别加入5~15ml 20%BSA(牛血清白蛋白)溶液,室温20~30℃混合0.5~3h;
(7)用pH7.0~9.0、50mM的缓冲液:含0.2~1.5%BSA,0.3~2%NaCl,0.1~1.0%蔗糖,0.05%NaN3,分别稀释步骤(6)小粒径和大粒径偶联抗体的胶乳微球溶液,至形成的小粒径和大粒径胶乳微球溶液终浓度为0.15~0.35%,稀释后的体积各为500ml;
(8)将小粒径胶乳微球溶液与大粒径胶乳微球溶液按8:2~1:1混合,即得试剂R2;
三、组成试剂盒:
R1:2×60ml/每瓶
R2:2×15ml/每瓶。
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