CN112698040A - 一种尿微量白蛋白检测试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种尿微量白蛋白检测试剂及其制备方法，包括试剂1和试剂2；试剂1的组分和浓度如下：三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液：200‑500mM；聚乙二醇二琥珀酸：5‑8g/L；月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱：1‑5g/L；肌醇：0.1‑0.5g/L；曲拉通X‑100：0.1‑0.5g/L；叠氮化钠：0.1g/L；溶剂为纯化水，试剂1的PH为6.5～7.5；试剂2的组分和浓度如下：三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液：50‑200mM；氯化钠：20‑40g/L；氯化钾：20‑40g/L；羊抗人尿微量白蛋白抗体包被胶乳颗粒：1‑3％；椰油酸二乙醇酰胺：2‑5g/L；聚甘油‑3‑甲基葡糖二硬脂酸酯：2‑5g/L；肌醇：0.1‑0.5g/L；曲拉通X‑100：0.1‑0.5g/L；叠氮化钠：0.1g/L；溶剂为纯化水，试剂2的PH为6.5～7.5。本发明检测灵敏度高，可报告范围广，稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于一种尿微量白蛋白检测试剂及其制备方法，具体涉及尿微量白蛋白检测领域。
背景技术
1982年Viberti等发现了糖尿病患者尿中总蛋白在正常范围，而尿白蛋白排泄增加的现象，首先提出了尿微量白蛋白的概念，并指出这种蛋白的出现是肾病发生的早期预兆。随着检测技术的进步，目前尿微量白蛋白主要用于对糖尿病、高血压患者的早期监测，以便及时采取保护肾功能的措施，如限制蛋白的摄入量、禁烟、及时控制血糖和血压等。因此，及时检测尿微量白蛋白，对控制和防止早期肾病的发生极为重要。
正常情况下，尿是在肾脏内形成的。体内血流经肾小球毛细管时，其中的细胞、大分子蛋白质和脂类等胶体被截留。病理情况下，由于肾小球内压力增高滤过增加或是基底膜改变，导致高滤过率而出现蛋白尿。健康成年人尿微量白蛋白参考区间为＜30mg/L，当值介于30-200mg/L时则为微量白蛋白尿期，临床可诊断为早期糖尿病肾病，一般认为此时病变经治疗尚可复原，尿微量白蛋白可转为阴性。当值＞200mg/L，诊断为糖尿病肾病，需对糖尿病人早期采取保护肾功能的措施，限制蛋白摄入，控制血糖、血压、禁烟，防止进入不可逆转期(值＞300mg/L)。由于正常人尿液中的尿微量白蛋白含量较低，因此对检测试剂的灵敏度要求较高，又因糖尿病肾病病人进入不可逆转期时尿中尿微量白蛋白含量可达300mg/L以上，因此对检测试剂的可报告范围也有适当要求，以便减少样本稀释的工作量，提高检测效率。
目前市场上尿微量白蛋白的检测方法有免疫扩散法、免疫电泳法、免疫比浊法、放射免疫法、酶联免疫吸附法、胶体金法等。其中免疫扩散法、免疫电泳法、酶联免疫吸附法主要靠手工操作，步骤繁琐且准确度、批间差异大，检测时间长，不适合医院检验科使用。放射免疫法准确度较高，但价格昂贵，操作繁琐。胶体金法因受自身方法学的局限，一般只能达到定性诊断，不能满足医生定量需求，另外由于试纸很难做到结构均匀一致，材料、薄厚、疏密程度也很难完全相同，致使样本检测结果在不同测试卡上的重复性较差。所以现在多采用免疫比浊法测定。胶乳免疫比浊法属于普通免疫比浊技术的衍生技术，克服了普通免疫比浊技术信号量非常有限的缺点，使抗体体积有了数量级上的增长，大幅提升了可检测性，但该方法也存在不足之处，如胶乳微球的粒径大小对试剂的测试性能会产生较大影响，粒径过大，由于微球表面积跟自身体积比率小，易造成单位体积内抗体包被量小，导致抗原过剩，无法对浓度高的分析物进行检测，粒径过小则胶乳表面积跟自身体积比率大，不易产生凝集现象，导致吸光度变化缓慢，试剂的检测灵敏度降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测灵敏度高，可报告范围广，稳定性好的胶乳免疫比浊法尿微量白蛋白检测试剂及其制备方法。
本发明提供了如下的技术方案：
一种尿微量白蛋白检测试剂及其制备方法，包括试剂1和试剂2；
试剂1的组分和浓度如下：
三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液：200-500mM
聚乙二醇二琥珀酸：5-8g/L
月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱：1-5g/L
肌醇：0.1-0.5g/L
曲拉通X-100：0.1-0.5g/L
叠氮化钠：0.1g/L
溶剂为纯化水，试剂1的PH为6.5～7.5；
试剂2的组分和浓度如下：
三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液：50-200mM
氯化钠：20-40g/L
氯化钾：20-40g/L
羊抗人尿微量白蛋白抗体包被胶乳颗粒：1-3％
椰油酸二乙醇酰胺：2-5g/L
聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯：2-5g/L
肌醇：0.1-0.5g/L
曲拉通X-100：0.1-0.5g/L
叠氮化钠：0.1g/L
溶剂为纯化水，试剂2的PH为6.5～7.5。
优选的，试剂2中的羊抗人尿微量白蛋白抗体包被胶乳颗粒选用两种胶乳颗粒的混合物，较大直径的粒径为100nm～120nm；较小直径的胶乳颗粒的粒径在10nm～20nm；
优选的，小直径胶乳颗粒数量∶大直径胶乳颗粒数量＝1:3
尿微量白蛋白检测试剂的制备方法具体如下：
S1：试剂1的制备：
按照试剂1的组分量，依次将聚乙二醇二琥珀酸、月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中充分搅拌混匀后将溶剂水加入，继续搅拌混匀后，调溶液的pH至6.5～7.5后，将溶液利用微孔滤膜过滤所得滤液为即试剂1；
S2：试剂2的制备：
S21、按照试剂2的组分量依次将氯化钠、氯化钾、椰油酸二乙醇酰胺、聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液中，搅拌均匀后加入小直径的尿微量白蛋白抗体胶乳颗粒，超声振动30-60min后，加入溶剂水，继续搅拌30-60min后用微孔滤膜过滤，保存滤液。
S22、按照试剂2的组分量依次将氯化钠、氯化钾、椰油酸二乙醇酰胺、聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液中，搅拌均匀后加入大直径的尿微量白蛋白抗体胶乳颗粒，超声振动30-60min后，加入溶剂水，继续搅拌30-60min后，利用微孔滤膜过滤，保存滤液。
S23、将等体积的S22液滴加到S21液中，超声振动30-60min后，混匀，得混合液1；再滴入与上述混合液1等体积的S22液，超声振动30-60min，直至全部混合均匀，即得试剂2溶液。
本发明检测试剂测定样本中的尿微量白蛋白的测试条件如下：温度：37℃；比色杯光径1.0cm。检测主波长340nm，副波长700nm。
应用本发明试剂测定样本中尿微量白蛋白的方法如下：样本与试剂1混匀后，置37℃孵育3-5分钟，读吸光度A1，之后加入试剂2，混匀，37℃孵育5分钟，读吸光度A2；ΔA＝A2-A1。其中样本用量8μl，试剂1用量300μl，试剂2用量60μl；
本发明的有益效果：
(1)试剂2中的羊抗人尿微量白蛋白抗体包被胶乳颗粒选用大小两种胶乳颗粒的混合物，这样能使试剂的空白吸光度低，灵敏度高，线性范围大；并采用等量递增法进行混合操作，使两种胶乳颗粒能均匀分布，试剂的检测稳定性好。
(2)采用椰油酸二乙醇酰胺和聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯作为助悬剂，可以促进和维持试剂2溶液的稳定，改善试剂2的稳定性。
(3)聚乙二醇二琥珀酸和月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱联合应用作为增敏剂，有助于增加试剂的检测灵敏度。
具体实施方式
实施例1：
试剂1的组分和浓度如下：
三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液：200mM
聚乙二醇二琥珀酸：5g/L
月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱：1g/L
肌醇：0.1g/L
曲拉通X-100：0.1g/L
叠氮化钠：0.1g/L
溶剂为纯化水，试剂1的PH为6.5；
试剂2的组分和浓度如下：
三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液：50mM
氯化钠：20g/L
氯化钾：20g/L
羊抗人尿微量白蛋白抗体包被胶乳颗粒：1％
椰油酸二乙醇酰胺：2g/L
聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯：2g/L
肌醇：0.1g/L
曲拉通X-100：0.1g/L
叠氮化钠：0.1g/L
溶剂为纯化水，试剂2的PH为6.5。
试剂2中的羊抗人尿微量白蛋白抗体包被胶乳颗粒选用两种胶乳颗粒的混合物，较大直径的粒径为100nm；较小直径的胶乳颗粒的粒径在10nm；小直径胶乳颗粒数量∶大直径胶乳颗粒数量＝1:3。
尿微量白蛋白检测试剂的制备方法具体如下：
S1：试剂1的制备：
按照试剂1的组分量，依次将聚乙二醇二琥珀酸、月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中充分搅拌混匀后将溶剂水加入，继续搅拌混匀后，调溶液的pH至6.5后，将溶液利用微孔滤膜过滤所得滤液为即试剂1；
S2：试剂2的制备：
S21、按照试剂2的组分量依次将氯化钠、氯化钾、椰油酸二乙醇酰胺、聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液中，搅拌均匀后加入小直径的尿微量白蛋白抗体胶乳颗粒，超声振动30min后，加入溶剂水，继续搅拌30min后用微孔滤膜过滤，保存滤液。
S22、按照试剂2的组分量依次将氯化钠、氯化钾、椰油酸二乙醇酰胺、聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液中，搅拌均匀后加入大直径的尿微量白蛋白抗体胶乳颗粒，超声振动30min后，加入溶剂水，继续搅拌30min后，利用微孔滤膜过滤，保存滤液。
S23、将等体积的S22液滴加到S21液中，超声振动30min后，混匀，得混合液1；再滴入与上述混合液1等体积的S22液，超声振动30min，直至全部混合均匀，即得试剂2溶液。
本发明检测试剂测定样本中的尿微量白蛋白的测试条件如下：温度：37℃；比色杯光径1.0cm。检测主波长340nm，副波长700nm。应用本发明试剂测定样本中尿微量白蛋白的方法如下：样本与试剂1混匀后，置37℃孵育3分钟，读吸光度A1，之后加入试剂2，混匀，37℃孵育5分钟，读吸光度A2；ΔA＝A2-A1。其中样本用量8μl，试剂1用量300μl，试剂2用量60μl。
实施例2：
试剂1的组分和浓度如下：
三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液：500mM
聚乙二醇二琥珀酸：8g/L
月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱：5g/L
肌醇：0.5g/L
曲拉通X-100：0.5g/L
叠氮化钠：0.1g/L
溶剂为纯化水，试剂1的PH为7.5；
试剂2的组分和浓度如下：
三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液：200mM
氯化钠：40g/L
氯化钾：40g/L
羊抗人尿微量白蛋白抗体包被胶乳颗粒：3％
椰油酸二乙醇酰胺：5g/L
聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯：5g/L
肌醇：0.5g/L
曲拉通X-100：0.5g/L
叠氮化钠：0.1g/L
溶剂为纯化水，试剂2的PH为7.5。
试剂2中的羊抗人尿微量白蛋白抗体包被胶乳颗粒选用两种胶乳颗粒的混合物，较大直径的粒径为120nm；较小直径的胶乳颗粒的粒径在20nm；小直径胶乳颗粒数量∶大直径胶乳颗粒数量＝1:3。
尿微量白蛋白检测试剂的制备方法具体如下：
S1：试剂1的制备：
按照试剂1的组分量，依次将聚乙二醇二琥珀酸、月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中充分搅拌混匀后将溶剂水加入，继续搅拌混匀后，调溶液的pH至7.5后，将溶液利用微孔滤膜过滤所得滤液为即试剂1；
S2：试剂2的制备：
S21、按照试剂2的组分量依次将氯化钠、氯化钾、椰油酸二乙醇酰胺、聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液中，搅拌均匀后加入小直径的尿微量白蛋白抗体胶乳颗粒，超声振动60min后，加入溶剂水，继续搅拌60min后用微孔滤膜过滤，保存滤液。
S22、按照试剂2的组分量依次将氯化钠、氯化钾、椰油酸二乙醇酰胺、聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液中，搅拌均匀后加入大直径的尿微量白蛋白抗体胶乳颗粒，超声振动60min后，加入溶剂水，继续搅拌60min后，利用微孔滤膜过滤，保存滤液。
S23、将等体积的S22液滴加到S21液中，超声振动60min后，混匀，得混合液1；再滴入与上述混合液1等体积的S22液，超声振动60min，直至全部混合均匀，即得试剂2溶液。
本发明检测试剂测定样本中的尿微量白蛋白的测试条件如下：温度：37℃；比色杯光径1.0cm。检测主波长340nm，副波长700nm。应用本发明试剂测定样本中尿微量白蛋白的方法如下：样本与试剂1混匀后，置37℃孵育5分钟，读吸光度A1，之后加入试剂2，混匀，37℃孵育5分钟，读吸光度A2；ΔA＝A2-A1。其中样本用量8μl，试剂1用量300μl，试剂2用量60μl。
实施例3：
试剂1的组分和浓度如下：
三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液：350mM
聚乙二醇二琥珀酸：6.5g/L
月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱：3g/L
肌醇：0.3g/L
曲拉通X-100：0.3g/L
叠氮化钠：0.1g/L
溶剂为纯化水，试剂1的PH为7；
试剂2的组分和浓度如下：
三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液：100mM
氯化钠：30g/L
氯化钾：30g/L
羊抗人尿微量白蛋白抗体包被胶乳颗粒：2％
椰油酸二乙醇酰胺：3.5g/L
聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯：3.5g/L
肌醇：0.3g/L
曲拉通X-100：0.3g/L
叠氮化钠：0.1g/L
溶剂为纯化水，试剂2的PH为7。
试剂2中的羊抗人尿微量白蛋白抗体包被胶乳颗粒选用两种胶乳颗粒的混合物，较大直径的粒径为110nm；较小直径的胶乳颗粒的粒径在15nm；小直径胶乳颗粒数量∶大直径胶乳颗粒数量＝1:3。
尿微量白蛋白检测试剂的制备方法具体如下：
S1：试剂1的制备：
按照试剂1的组分量，依次将聚乙二醇二琥珀酸、月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中充分搅拌混匀后将溶剂水加入，继续搅拌混匀后，调溶液的pH至7后，将溶液利用微孔滤膜过滤所得滤液为即试剂1；
S2：试剂2的制备：
S21、按照试剂2的组分量依次将氯化钠、氯化钾、椰油酸二乙醇酰胺、聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液中，搅拌均匀后加入小直径的尿微量白蛋白抗体胶乳颗粒，超声振动45min后，加入溶剂水，继续搅拌45min后用微孔滤膜过滤，保存滤液。
S22、按照试剂2的组分量依次将氯化钠、氯化钾、椰油酸二乙醇酰胺、聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液中，搅拌均匀后加入大直径的尿微量白蛋白抗体胶乳颗粒，超声振动45min后，加入溶剂水，继续搅拌45min后，利用微孔滤膜过滤，保存滤液。
S23、将等体积的S22液滴加到S21液中，超声振动45min后，混匀，得混合液1；再滴入与上述混合液1等体积的S22液，超声振动45min，直至全部混合均匀，即得试剂2溶液。
本发明检测试剂测定样本中的尿微量白蛋白的测试条件如下：温度：37℃；比色杯光径1.0cm。检测主波长340nm，副波长700nm。应用本发明试剂测定样本中尿微量白蛋白的方法如下：样本与试剂1混匀后，置37℃孵育4分钟，读吸光度A1，之后加入试剂2，混匀，37℃孵育5分钟，读吸光度A2；ΔA＝A2-A1。其中样本用量8μl，试剂1用量300μl，试剂2用量60μl。
下面结合表格对本发明实施例1至3所得试剂盒的性能进行说明。
1.空白吸光度
用蒸馏水测试试剂，结果显示，本发明技术试剂空白吸光度显著小于市售常规技术试剂，说明本发明技术的试剂空白较低。
2.分析灵敏度试验
用浓度70mg/L的样品测试试剂，重复2次，记录在试剂规定参数下产生的吸光度改变，计算其差值平均值。结果显示，测试同一份样本，本发明技术试剂测试的吸光度差值显著大于市售常规技术试剂，说明本发明技术试剂的分析灵敏度较好。
3.HOOK效应评估
用生理盐水溶解标准物质后添加到高值样本，分别配制成线性范围高值，线性范围高值1.25倍，线性范围高值1.5倍，线性范围高值2倍等4个不同浓度的高值样本，对以上样本进行重复测定，吸光度下降的浓度即为钩状效应拐点值，根据此来确定试剂的钩状效应最高点浓度。结果显示，市售常规技术试剂出现吸光度下降的浓度小于本发明技术试剂，说明本发明技术试剂的可报告范围较广。
4.精密度试验
在重复性条件下，用低值质控品(130.2mg/L)和高值质控品(204.6mg/L)测试本发明实施例1试剂，重复测试10次，分别计算测量值的平均值
和标准差(s)。
按以下公式计算变异系数(CV)。
结果表明，本发明技术检测试剂测试低、高值质控品的变异系数分别为2.01％和1.46％，说明本发明试剂的检测稳定性良好。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种尿微量白蛋白检测试剂，其特征在于：包括试剂1和试剂2；
试剂1的组分和浓度如下：
三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液：200-500mM
聚乙二醇二琥珀酸：5-8g/L
月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱：1-5g/L
肌醇：0.1-0.5g/L
曲拉通X-100：0.1-0.5g/L
叠氮化钠：0.1g/L
溶剂为纯化水，试剂1的PH为6.5～7.5；
试剂2的组分和浓度如下：
三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液：50-200mM
氯化钠：20-40g/L
氯化钾：20-40g/L
羊抗人尿微量白蛋白抗体包被胶乳颗粒：1-3％
椰油酸二乙醇酰胺：2-5g/L
聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯：2-5g/L
肌醇：0.1-0.5g/L
曲拉通X-100：0.1-0.5g/L
叠氮化钠：0.1g/L
溶剂为纯化水，试剂2的PH为6.5～7.5。
2.根据权利要求1所述的一种尿微量白蛋白检测试剂，其特征在于：试剂2中的羊抗人尿微量白蛋白抗体包被胶乳颗粒选用两种胶乳颗粒的混合物，较大直径的粒径为100nm～120nm；较小直径的胶乳颗粒的粒径在10nm～20nm。
3.根据权利要求2所述的一种尿微量白蛋白检测试剂，其特征在于：小直径胶乳颗粒数量∶大直径胶乳颗粒数量＝1:3。
4.根据权利要求1所述的一种尿微量白蛋白检测试剂制备方法，其特征在于，具体如下：S1：试剂1的制备：
按照试剂1的组分量，依次将聚乙二醇二琥珀酸、月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中充分搅拌混匀后将溶剂水加入，继续搅拌混匀后，调溶液的pH至6.5～7.5后，将溶液利用微孔滤膜过滤所得滤液为即试剂1；
S2：试剂2的制备：
S21、按照试剂2的组分量依次将氯化钠、氯化钾、椰油酸二乙醇酰胺、聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液中，搅拌均匀后加入小直径的尿微量白蛋白抗体胶乳颗粒，超声振动30-60min后，加入溶剂水，继续搅拌30-60min后用微孔滤膜过滤，保存滤液。
S22、按照试剂2的组分量依次将氯化钠、氯化钾、椰油酸二乙醇酰胺、聚甘油-3-甲基葡糖二硬脂酸酯、肌醇、曲拉通X-100、叠氮化钠加入到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液中，搅拌均匀后加入大直径的尿微量白蛋白抗体胶乳颗粒，超声振动30-60min后，加入溶剂水，继续搅拌30-60min后，利用微孔滤膜过滤，保存滤液。
S23、将等体积的S22液滴加到S21液中，超声振动30-60min后，混匀，得混合液1；再滴入与上述混合液1等体积的S22液，超声振动30-60min，直至全部混合均匀，即得试剂2溶液。
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