JPH11344494A - 免疫学的凝集反応試薬およびこれを用いたプロゾーン現象の抑制方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 測定すべき抗原または抗体が検体中に高濃度
に含まれる場合であっても、検体を希釈することなく原
液のままで用いることができる免疫学的凝集反応試薬お
よびこれを用いたプロゾーン現象の抑制方法を提供する
こと。 【解決手段】 抗体または抗原を結合させた不溶性担体
粒子と、該不溶性坦体粒子を懸濁させる媒体とを含む免
疫学的凝集反応試薬において、１．０〜２０w／v%のジ
カルボン酸を含有させたことを特徴とする免疫学的凝集
反応試薬およびこれを用いたプロゾーン現象の抑制方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的凝集反応試薬
およびこれを用いたプロゾーン現象の抑制方法に関する
もので、特に測定すべき抗原または抗体が検体中に高濃
度に含まれる場合であっても、検体を希釈することなく
原液のままで用いることができる免疫学的凝集反応試薬
およびこれを用いたプロゾーン現象の抑制方法に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、各種疾患と関連して生体中に出現
する蛋白質等の免疫学的活性物質を抗原抗体反応を利用
して検出し、診断に利用することが広く行われている。
このような抗原抗体反応を利用した測定方法としては、
放射免疫測定法（ＲＩＡ)、酵素免疫測定法(ＥＩＡ)、
蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス凝集法（Ｌ
Ａ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）等の種々の方法が実用化さ
れている。

【０００３】とりわけ、ＬＡは操作が簡便で、しかも短
時間で測定可能なため広く利用されている。ＬＡでは、
測定すべき抗原（または抗体）に対応する抗体（または
抗原）がその表面に結合されたラテックス粒子が用いら
れる。このようなラテックス粒子は、緩衝液などの媒体
中に懸濁され、検体と混合される。

【０００４】検体中の抗原（または抗体）と、ラテック
ス表面上の抗体（または抗原）とが抗原抗体反応を起こ
し、免疫複合体を形成し、検体中の抗原（または抗体）
を介してラテックス粒子が架橋されて凝集する。この凝
集の程度は、吸光度の変化または散乱光の強度の変化に
より簡単に測定することができる。ＬＡは、Ｂ／Ｆ分離
が必要なＲＩＡやＥＩＡに比べて反応ステップが少ない
ため、測定方法が簡単で、しかも自動分析装置に適して
いる。

【０００５】しかしながら、検体中に高濃度に含まれる
抗原（または抗体）、例えば、血清中に比較的高濃度に
含まれるＣ反応性たんぱく質（ＣＲＰ）などを従来のＬ
Ａ用試薬を用いて測定すると、プロゾーン現象を起こ
し、実際よりかなり低い測定値しか得られず、正確に診
断することができない場合があった。

【０００６】測定値からこのプロゾーン現象を判断する
ことは困難であり、反応の起ち上がり即ち吸光度の上昇
速度からプロゾーンを判定する手段が自動分析器の一部
に搭載されているものの効果は十分ではない.。最も確
実な手段は、測定を終了後に反応混合液中にさらにＣＲ
Ｐを添加し、測定値がさらに上昇するか、逆に減少する
かによってプロゾーン現象であるかどうかを判断するこ
とである。プロゾーン現象であると判断された場合に
は、検体を希釈するか検体採取量を減じて、再度測定し
なければならない。このような繁雑な操作を避けるため
プロゾーン現象を生じない試薬の提供が望まれていた。

【０００７】このプロゾーン現象を改善する方法として
は、測定に用いる水性溶媒のイオン強度を下げる方法、
凝集試験用水性溶媒に特定分子量のデキストランを含有
させた免疫定量法（特開昭５９−２２０６４６号公
報）、検体と媒体との混合物中にアミノ酸を含有させた
ラテックス凝集法に基づく免疫定量法（特開昭６２−２
７２１５７号公報）、添加剤としてポリエチレングリコ
ール等の界面活性剤を含有させた免疫学的活性物質測定
試薬（特開平８−２８５８４７号公報、特開平９−５４
０９２号公報、特開平９−９６６３８号公報）、特定量
の塩化ナトリウムを含有させた免疫学的測定法（特開平
９−８９８９４号公報）等が提案されている。

【０００８】一方、ＬＡは、一般に普及されている自動
分析装置に使用すると、その親水性材料の表面に免疫グ
ロブリン分子が吸着や凝集されることにより、非特異的
な凝集や沈殿を生ずることが知られている。この問題を
解決するため、ホウ酸、シュウ酸、クエン酸、フタル酸
などの多塩基酸を用いたＬＡが提案されている（特開平
２−６１５６１号公報）。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記特
開平２−６１５６１号公報に記載された方法は、非特異
的な凝集や沈殿を防止する方法を開示しているに過ぎ
ず、プロゾーン現象に対する改善に関しては、全く示唆
していない。また、上記の他の公報に記載された方法で
は、確かにプロゾーン現象に対する改善は認められるも
のの、測定すべき抗原（または抗体）が検体中に高濃度
に含まれる場合には、プロゾーン現象の抑制効果は未だ
不十分であり、更に改善された方法が強く望まれてい
た。

【００１０】従って本発明は、このような従来の課題に
着目してなされたものであって、測定すべき抗原（また
は抗体）が検体中に高濃度に含まれる場合であっても、
プロゾーン現象を十分に抑制することのできる免疫学的
凝集反応試薬およびこれを用いたプロゾーン現象の抑制
方法を提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく鋭意研究した結果、従来の免疫学的凝集反応
試薬に、所定量のジカルボン酸類、および必要に応じて
硫酸塩類および／またはポリエチレングリコールを含有
させることにより、プロゾーン現象の高い抑制効果が得
られることを見い出し、本発明に到達した。

【００１２】本発明の上記の課題は、抗体または抗原を
結合させた不溶性担体粒子と、該不溶性坦体粒子を懸濁
させる媒体とを含む免疫学的凝集反応試薬において、
１．０〜２０w／v%のジカルボン酸類を含有することを
特徴とする免疫学的凝集反応試薬、およびこれを用いた
プロゾーン現象の抑制方法により達成された。

【００１３】以下、本発明について更に詳細に説明す
る。

【００１４】本発明に使用するジカルボン酸類は、公知
のジカルボン酸類の中から適宜選択して使用することが
できる。その具体例としては、例えばリンゴ酸、グルタ
ル酸、アジピン酸およびコハク酸から成る群から選択さ
れる少なくとも１種が挙げられる。また、ジカルボン酸
は、例えばＮａ等の塩であっても良く、アルコール等と
エステルを形成しても良い。

【００１５】本発明においては、上記試薬全量に対して
ジカルボン酸類を１．０〜２０w／v%、好ましくは５．
０〜１５w／v%となるように含有させる。ジカルボン酸
類の添加量が１．０w／v%未満になると、プロゾーン現
象を効果的に抑制することができない。

【００１６】本発明においては、ジカルボン酸類を単独
で添加した場合であっても、プロゾーン現象の抑制効果
が不十分な場合には、更に硫酸塩類および／またはポリ
エチレングリコールを添加することによってプロゾーン
現象の抑制効果をより一層向上させることができる。

【００１７】本発明に使用する硫酸塩類は、公知の硫酸
塩類の中から適宜選択して使用することができる。これ
らの硫酸塩類の中でも、特に硫酸ナトリウムおよび／ま
たは硫酸アンモニウムが好ましい。

【００１８】本発明においては、上記試薬全量に対して
硫酸塩類を１．０〜１０w／v%、好ましくは５．０〜１
０w／v%、より好ましくは７．５w／v%となるように含有
させる。硫酸塩類の添加量が１．０w／v%未満になる
と、プロゾーン現象を効果的に抑制することができず、
逆に１０w／v%を超えると、低濃度域においても凝集反
応が阻害される。

【００１９】本発明に使用するポリエチレングリコール
も、公知のものの中から適宜選択して使用すれば良い。
その平均分子量は１０００〜１００００、好ましくは６
０００である。ポリエチレングリコールは、試薬全体に
対して０．０５〜１．０w／v%となるように含有させ
る。

【００２０】プロゾーン現象は、不溶性担体粒子の表面
に結合された抗体（または抗原）に対し、過剰の抗原
（または抗体）が混合物中に存在する場合に、混合物中
の抗原（または抗体）を介して不溶性担体粒子同士が架
橋されなくなり、不溶性担体粒子の凝集が生じなくなる
ために起こると考えられている。従ってジカルボン酸
類、ポリエチレングリコールおよび硫酸塩類の組み合わ
せや添加量は、測定すべき検体中に含まれる抗原または
抗体の濃度範囲に応じて適宜選択すれば良い。

【００２１】本発明において使用される不溶性担体粒子
としては、従来から免疫学的凝集反応の担体粒子として
使用されているものの中から適宜選択して使用すること
ができる。その具体例としては、例えば無機物質粉末、
有機高分子物質粉末、微生物、血球、細胞膜片などが挙
げられる。無機物質としては、特に限定されないが、
金、チタン、鉄、ニッケル等の金属、アルミナ、チタニ
ア等の金属酸化物、シリカ等が挙げられる。有機高分子
としては、特に限定されないが、スチレン重合体、スチ
レン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重
合体、アクリル酸重合体、アクリルニトリル−ブダジエ
ン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステ
ル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体
等が挙げられるが、特にこれらの重合体粉末を水に均一
に懸濁させたラテックス粒子が好ましい。

【００２２】これら不溶性担体粒子への抗原または抗体
の感作は、公知の方法に従って行うことができる。その
具体例としては、例えば、グルタルアルデヒド、ビスジ
アゾベンジジン、トリレンジトイソシアネート、ジフロ
ロニトロベンゼン、カルボジイミド類、キノン類、塩化
クロム、タンニン酸等のいわゆるカップリング剤を用い
た化学的結合法、抗原または抗体と担体を水溶性溶媒中
（例えば、水、生理食塩水、各種緩衝液など）で接触さ
せる物理的吸着法等が挙げられる。

【００２３】本発明においては、上記担体粒子に感作さ
せる抗原または抗体としては、特に限定されず、公知の
ものの中から適宜選択して使用することができる。その
具体例としては、例えば、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、
リウマチ因子（ＲＦ）、トランスフェリン等の血漿蛋白
に対する抗体、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、トリヨ
ードサイロニン、サイロキシン、サイロキシン結合性蛋
白、サイログロブリン、インスリン、エストリオール、
ヒト胎盤性ラクトーゲン等のホルモンに対する抗体、癌
胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦ
Ｐ）等の腫瘍関連物質に対する抗体、ＨＢｓ抗原、ＨＢ
ｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体等のウイルス肝炎の抗
原に対する抗体および抗体に対する抗原、ムンプス、ヘ
ルペス、麻疹、風疹等のウイルス、各種生体成分に対す
る抗体または抗原、フェノバルビタール、アセトアミノ
フェノン、サリチル酸、シクロスポリン等の各種薬剤に
対する抗体が挙げられる。

【００２４】上記担体粒子を浮遊させる媒体としては、
従来既知のあらゆる凝集試験用水性媒体が利用でき、例
えば水、生理食塩水、各種緩衝液（グッド緩衝液、リン
酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン
緩衝液）、およびこれらの組み合わせからなる溶液が例
示される。

【００２５】本発明の免疫学的凝集反応試薬は、従来の
方法に従って検体と試薬とを混合して反応させて生ずる
担体粒子の凝集の程度を、その混合物の吸光度の変化や
散乱光の強度の変化を測定することによって使用するこ
とができる。

【００２６】

【発明の効果】本発明は、測定すべき抗原または抗体が
検体中に高濃度に含まれる場合であっても、検体を希釈
することなく原液のままで免疫測定を行うことを可能と
する。従って本発明によれば、検体を正確に希釈すると
いう時間と労力を要する作業を省略することができる。

【００２７】

【実施例】以下、実施例によって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれによって限定されるものではな
い。

【００２８】実施例１ ０〜１５０mg／ｄｌのＣＲＰを含む生理食塩水溶液３μ
lに、０、５．０w／v%のリンゴ酸を含む０．１ＭのＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４)２００μlを加えた。抗ＣＲ
Ｐ抗体（動物名：ヤギ）を結合した粒径０．０８μmの
ラテックス粒子の懸濁液（０．２w／v％)２００μlを混
合物に加え、３７℃で反応させ、１〜５分後にかけて波
長５７０ｎｍで吸光度を測定し、各測定点の間の吸光度
変化量を求めた。測定には全自動分析装置日立７０７０
（日立製作所製）を用いた。

【００２９】その結果を図１に示す。図１に示すよう
に、５．０w／v%のリンゴ酸を添加した場合には、抗原
過剰によるプロゾーン現象は生じなかった。これに対
し、リンゴ酸を含まない場合には、抗原過剰によるプロ
ゾーン現象が生じていた。

【００３０】実施例２ 実施例１で用いたリンゴ酸の代わりに、０、５．０w／v
%のグルタル酸を用いた以外は、実施例１と全く同様に
してプロゾーン現象の抑制効果を調べた。その結果を図
２に示す。図２に示すように、５．０w／v%のグルタル
酸を添加した場合には、抗原過剰によるプロゾーン現象
は生じなかった。これに対し、グルタル酸を含まない場
合には、抗原過剰によるプロゾーン現象が生じていた。

【００３１】実施例３ 実施例１で用いたリンゴ酸の代わりに、０、３．７５、
７．５w／v%のアジピン酸を用いた以外は、実施例１と
全く同様にしてプロゾーン現象の抑制効果を調べた。そ
の結果を図３に示す。図３に示すように、３．７５、
７．５w／v%のアジピン酸を添加した場合には、抗原過
剰によるプロゾーン現象は生じなかった。これに対し、
アジピン酸を含まない場合には、抗原過剰によるプロゾ
ーン現象が生じていた。

【００３２】実施例４ 実施例１で用いたリンゴ酸の代わりに、０、５．０、１
０w／v%のジメチルグルタル酸を用いた以外は、実施例
１と全く同様にしてプロゾーン現象の抑制効果を調べ
た。その結果を図４に示す。図４に示すように、５．
０、１０w／v%のジメチルグルタル酸を添加した場合に
は、抗原過剰によるプロゾーン現象は生じなかった。こ
れに対し、ジメチルグルタル酸を含まない場合には、抗
原過剰によるプロゾーン現象が生じていた。

【００３３】実施例５ 実施例１で用いたリンゴ酸の代わりに、０、２．５、
５．０、１０、１５w／v%のコハク酸ジカリウムを用い
た以外は、実施例１と全く同様にしてプロゾーン現象の
抑制効果を調べた。その結果を図５に示す。図５に示す
ように、５．０、１０、１５w／v%のコハク酸ジカリウ
ムを添加した場合には、抗原過剰によるプロゾーン現象
は生じなかった。これに対し、２．５w／v%のコハク酸
ジカリウムを添加した場合には、プロゾーン現象の抑制
効果は認められるものの、未だ不十分であり、またコハ
ク酸ジカリウムを含まない場合には、抗原過剰によるプ
ロゾーン現象が生じていた。

【００３４】実施例６ ２．５w／v%のコハク酸を添加し、更に２．５、５．０w
／v%の硫酸ナトリウムを添加した以外は、実施例１と全
く同様にしてプロゾーン現象の抑制効果を調べた。その
結果を図６に示す。図６に示すように、コハク酸と硫酸
ナトリウムを組み合わせた場合には、実施例１〜５で得
られた効果と比較して更にプロゾーン現象の抑制効果が
向上したことが認められる。

【００３５】実施例７ ２．５w／v%のコハク酸を添加し、更に０．０８、０．
５w／v%のポリエチレングリコールを添加した以外は、
実施例１と全く同様にしてプロゾーン現象の抑制効果を
調べた。その結果を図７に示す。図７に示すように、コ
ハク酸とポリエチレングリコールを組み合わせた場合に
は、実施例１〜５で得られた効果と比較して更にプロゾ
ーン現象の抑制効果が向上したことが認められる。

【図面の簡単な説明】

【図１】リンゴ酸を用いた場合のプロゾーン現象の抑制
効果を示すグラフ

【図２】グルタル酸を用いた場合のプロゾーン現象の抑
制効果を示すグラフ

【図３】アジピン酸を用いた場合のプロゾーン現象の抑
制効果を示すグラフ

【図４】ジメチルグルタル酸を用いた場合のプロゾーン
現象の抑制効果を示すグラフ

【図５】コハク酸ジカリウムを用いた場合のプロゾーン
現象の抑制効果を示すグラフ

【図６】コハク酸と硫酸ナトリウムを組み合わせた場合
のプロゾーン現象の抑制効果を示すグラフ

【図７】コハク酸とポリエチレングリコールを組み合わ
せた場合のプロゾーン現象の抑制効果を示すグラフ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗体または抗原を結合させた不溶性担体粒
   子と、該不溶性担体粒子を懸濁させる媒体とを含む免疫
   学的凝集反応試薬において、１〜２０w／v%のジカルボ
   ン酸類を含有することを特徴とする免疫学的凝集反応試
   薬。
2. 【請求項２】ジカルボン酸類がリンゴ酸、グルタル酸、
   アジピン酸およびコハク酸、またはそれらの塩もしくは
   それらのエステル類から成る群から選択される少なくと
   も１種である請求項１記載の免疫学的凝集反応試薬。
3. 【請求項３】硫酸塩類を含有する請求項１または２記載
   の免疫学的凝集反応試薬。
4. 【請求項４】硫酸塩類の含有量が１〜１０w／v %の範囲
   である請求項３記載の免疫学的凝集反応試薬。
5. 【請求項５】硫酸塩類が硫酸ナトリウムおよび／または
   硫酸アンモニウムである請求項３または４記載の免疫学
   的凝集反応試薬。
6. 【請求項６】ポリエチレングリコールを含有する請求項
   １または２記載の免疫学的凝集反応試薬。
7. 【請求項７】ポリエチレングリコールの含有量が０．０
   ５〜１．０w／v%の範囲である請求項６記載の免疫学的
   凝集反応試薬。
8. 【請求項８】硫酸塩類およびポリエチレングリコールを
   含有する請求項１または２記載の免疫学的凝集反応試
   薬。
9. 【請求項９】抗体または抗原を結合させた不溶性担体粒
   子と、該不溶性担体粒子を懸濁させる媒体とを用いた免
   疫学的凝集反応において、１〜２０w／v%のジカルボン
   酸類を含有させたことを特徴とするプロゾーン現象の抑
   制方法。
10. 【請求項１０】ジカルボン酸類がリンゴ酸、グルタル
    酸、アジピン酸およびコハク酸、またはそれらの塩もし
    くはそれらのエステル類から成る群から選択される少な
    くとも１種である請求項９記載のプロゾーン現象の抑制
    方法。
11. 【請求項１１】硫酸塩類を含有させた請求項９または１
    ０記載のプロゾーン現象の抑制方法。
12. 【請求項１２】硫酸塩類の含有量が１．０〜１０w／v %
    の範囲である請求項１１記載のプロゾーン現象の抑制方
    法。
13. 【請求項１３】硫酸塩類が硫酸ナトリウムおよび／また
    は硫酸アンモニウムである請求項１１または１２記載の
    プロゾーン現象の抑制方法。
14. 【請求項１４】ポリエチレングリコールを含有させた請
    求項９または１０記載のプロゾーン現象の抑制方法。
15. 【請求項１５】ポリエチレングリコールの含有量が０．
    ０５〜１w／v%の範囲である請求項１４記載のプロゾー
    ン現象の抑制方法。
16. 【請求項１６】硫酸塩類およびポリエチレングリコール
    を含有させた請求項９または１０記載のプロゾーン現象
    の抑制方法。