JPH10311830A

JPH10311830A - 免疫測定試薬および免疫測定法

Info

Publication number: JPH10311830A
Application number: JP11937397A
Authority: JP
Inventors: Makoto Takahara; 誠高原; Ryoko Kono; 良子河野
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1997-05-09
Filing date: 1997-05-09
Publication date: 1998-11-24

Abstract

(57)【要約】【課題】血清の非働化等の面倒な処理を行うことな
く、非特異的凝集反応が抑制され、かつ検出感度の高い
免疫測定試薬および免疫測定法を提供する。【解決手段】被測定物質（例、ヒトＨＢＳ抗原）に対
する抗体または抗原を担持した不溶性担体（例、ポリス
チレンラテックス）と、硝酸塩（例、硝酸カリウム）お
よび／またはチオシアン酸塩（例、チオシアン酸ナトリ
ウム）とから構成された免疫測定試薬。被測定物質に対
する抗体または抗原を不溶性担体に担持させ、被測定物
質との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度
合いを検出することにより、被測定物質を測定するにあ
たり、該抗原抗体反応の反応系に硝酸塩および／または
チオシアン酸塩を存在させる免疫測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、不溶性担体を使用
した免疫凝集反応に基づいて被測定物質を測定するため
に用いられ、非特異的凝集反応が抑制され、かつ検出感
度の高い免疫測定試薬および免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】体液中の微量成分等の測定法のひとつと
して、目的とする被測定物質に対する抗体または抗原を
不溶性担体に担持させ、被測定物質との抗原抗体反応に
より生じた不溶性担体の凝集の度合いを検出することに
より、被測定物質を測定する方法がある。このような測
定法としては、ラテックス凝集反応、赤血球凝集反応等
が知られている。

【０００３】この凝集の程度を検出する方法としては、
凝集の有無を肉眼で判定する方法と、反応液に光を照射
して散乱光あるいは透過光を測定する方法がある。光学
的な測定方法は試料中の抗原または抗体の定量に用いら
れている。

【０００４】しかし、上記のような測定法においては、
いずれも血清等のような検体と反応させたとき、被測定
物質である抗原または抗体を含む陽性血清のみならず、
これらの抗原または抗体を含まない陰性血清に対して
も、凝集反応を起こすことがある。このような凝集反応
は非特異的凝集反応と呼ばれており、しばしば誤った測
定結果を与えることがある。このような非特異的凝集反
応が起こる理由は、必ずしも明らかではないが、一つに
は血清中に含まれる補体等の因子によるものと考えられ
ている。

【０００５】一方、従来から上記のような非特異的凝集
反応を防ぐことを目的として、血清をグリシン緩衝液等
の緩衝液で希釈したり、または血清中の補体を失活させ
る非働化処理が行われている。しかし、このような処理
では非特異的凝集反応を十分に抑制することは困難であ
り、また手間がかかるという問題があった。

【０００６】上記のような問題を解決するために、従来
より、非特異的凝集反応を抑制することを目的として、
測定試薬中に添加剤を加えることが一般に行われてい
る。上記添加剤としては、例えば、ゼラチン、アルブミ
ン等の蛋白質や、グリコール類、またはポリアニオン等
が知られている。また、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミドや低
級アルキルスルホキシド（特開昭５５−１６０８５３号
公報）等も提案されている。しかしながら、これらの添
加剤においても依然として非特異的凝集反応を抑制する
効果は一般には十分とはいえなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題を
解決するものであり、その目的は、血清の非働化等の面
倒な処理を行うことなく、非特異的凝集反応が抑制さ
れ、かつ検出感度の高い免疫測定試薬および免疫測定法
を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
を解決するために鋭意研究した結果、不溶性担体懸濁液
と検体との混合物中に硝酸塩および／またはチオシアン
酸塩を存在せしめることによって、非特異的凝集反応が
抑制されることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００９】すなわち、本発明による免疫測定試薬は、
被測定物質に対する抗体または抗原を担持した不溶性担
体と、硝酸塩および／またはチオシアン酸塩とから構成
されたものである。

【００１０】また、本発明による免疫測定法は、被測定
物質に対する抗体または抗原を不溶性担体に担持させ、
被測定物質との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の
凝集の度合いを検出することにより、被測定物質を測定
するにあたり、該抗原抗体反応の反応系に硝酸塩および
／またはチオシアン酸塩を存在させる方法である。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明で用いられる硝酸塩として
は、硝酸のカリウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩等の
アルカリ金属塩；硝酸のバリウム塩、カルシウム塩等の
アルカリ土類金属塩；硝酸のアンモニウム塩などが挙げ
られる。

【００１２】本発明で用いられるチオシアン酸塩として
は、チオシアン酸のナトリウム塩、リチウム塩等のアル
カリ金属塩；チオシアン酸のバリウム塩、カルシウム塩
等のアルカリ土類金属塩；チオシアン酸のアンモニウム
塩などが挙げられる。

【００１３】上記の硝酸塩またはチオシアン酸塩は、一
種類だけが用いられてもよいし、二種類以上が併用され
てもよい。

【００１４】本発明で用いられる不溶性担体としては、
有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球および細
胞膜片等が挙げられる。有機高分子粉末としては、不溶
性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等が例
示でき、好ましくはラテックス懸濁液が用いられる。ラ
テックスとしては、例えばポリスチレン、スチレン−ス
チレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、ア
クリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチ
レン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合
体、ポリ酢酸ビニルアクリレート等がある。用いるラテ
ックスの平均粒径は、測定対象物の検出濃度あるいは測
定機器によって０．０５〜１．０μｍの範囲で適宜選択
される。無機物質粉末としてはシリカ、アルミナ等や、
金、チタン、鉄、ニッケルのような金属片等が例示され
る。

【００１５】本発明により測定されるべき物質は特に限
定されず、一般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生
理活性物質はいずれも測定可能である。被測定物質とし
ては、タンパク、脂質等があり、より詳しくは、例え
ば、各種抗原、抗体、レセプター、酵素等が挙げられ
る。具体的には、Ｃ反応性たんぱく（ＣＲＰ）、ヒトフ
ィブリノーゲン、リウマチ因子、α−フェトプロティン
（ＡＦＰ）、抗ストレプトリジンＯ抗体、梅毒トレポネ
ーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、ＨＢＳ抗体、Ｈ
ＢＳ抗原、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗体等が例示される。

【００１６】本発明により被測定物質を測定する方法に
おいて、測定系は、例えば、ラテックス凝集反応や血球
凝集法等の凝集法である。試薬の調製は、まず公知の方
法により、不溶性担体に抗原または抗体を物理的または
化学的結合により感作させる。用いる抗体は、免疫グロ
ブリン分子自体のほか、Ｆａｂ' やＦ（ａｂ）₂のよう
な断片であってもよい。

【００１７】次に、反応系に上記硝酸塩および／または
チオシアン酸塩を存在させておく方法について述べる。
例えば、ラテックス試薬を用いた抗原抗体反応により、
被測定物質を測定する場合には、被測定物質に対する抗
体または抗原を感作したラテックス試薬に予め上記硝酸
塩および／またはチオシアン酸塩を添加しておく。別法
としては、上記硝酸塩および／またはチオシアン酸塩を
含まないラテックス試薬を使用することも可能であり、
この場合には抗原抗体反応時に上記硝酸塩および／また
はチオシアン酸塩が該反応系に存在するようにすればよ
い。例えば、検体に予め上記硝酸塩および／またはチオ
シアン酸塩を添加しておく方法；使用する緩衝液にこれ
を加えておく方法等があり、特に限定されない。言い換
えれば、本発明の測定試薬は、例えば、抗体または抗原
を感作した不溶性担体と上記硝酸塩および／またはチオ
シアン酸塩との両方を含む１液系の試薬；抗体または抗
原を感作した不溶性担体を含む第１試薬と、上記硝酸塩
および／またはチオシアン酸塩を含む緩衝液である第２
試薬とで構成される２液系の試薬；等種々の形態であり
うる。

【００１８】測定系においては、上記のような試薬を用
いて凝集反応を行い、生じた凝集の度合いを光学的に観
察または目視観察することにより被測定物質が測定され
得る。具体的には、不溶性担体の凝集の程度を光学的に
検出する方法においては、散乱光強度、吸光度または透
過光強度を測定する光学機器を用いて測定を行う。好ま
しい測定波長は３００〜２４００ｎｍである。測定方法
は、公知の方法に従い、用いる不溶性担体の大きさ、ま
たは濃度の選択、反応時間の設定により散乱光強度、吸
光度または透過光強度の増加もしくは減少を測定するこ
とにより行われる。また、これらの方法を併用すること
も可能である。

【００１９】不溶性担体の凝集の程度を肉眼で判定する
試薬においては、通常、試料と感作不溶性担体を含む溶
液を判定板上で混合し、１〜５分間揺り動かした後、凝
集の有無を判定する。凝集判定には、単に肉眼判定以外
に、凝集状態をビデオカメラで撮影し、画像処理を施す
ことも可能である。

【００２０】この免疫測定法において、抗原抗体反応の
反応系に存在させる上記硝酸塩および／またはチオシア
ン酸塩の濃度は、共存する塩、タンパク、糖類等の添加
物の濃度によって適宜選ばれる。一般には、該反応系
に、上記硝酸塩および／またはチオシアン酸塩が好まし
くは０．０５〜１５重量％、より好ましくは０．２〜１
０重量％になるように、それぞれ調整される。上記硝酸
塩および／またはチオシアン酸塩の濃度が低すぎると、
非特異的凝集反応の抑制効果が十分でなくなり、逆に高
すぎると、被測定物質と、それに対する抗体または抗原
を担持した不溶性担体との間の特異的凝集反応も抑制し
てしまい、検出感度が悪くなる。

【００２１】上記抗原抗体反応の条件は通常の条件と同
様であってよく、反応媒体としては、被測定物質の種類
に応じた各種緩衝液が適宜選ばれる。この緩衝液は、被
測定物質を失活させることがなく、かつ抗原抗体反応を
阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであれ
ばよい。例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリ
ス緩衝液が使用される。反応のｐＨは、５〜１０、特に
６〜８が好ましい。反応温度は０〜５０℃、特に２０〜
４０℃が好ましい。反応時間は適宜決められる。反応時
には、免疫反応の促進剤として、ポリエチレングリコー
ル、ポリビニルピロリドン、ポリ（グリコシルエチルメ
タクリレート）、プルランなどの水溶性高分子、さらに
測定系の特異性を高めるために、塩化コリン等の第４級
アンモニウム塩、ＥＤＴＡ、ポリアニオン、ゼラチンな
どを添加することも可能である。

【００２２】本発明によれば、上記硝酸塩および／また
はチオシアン酸塩の働きにより、非特異的凝集反応の抑
制が可能となる。

【００２３】以下に、本発明の実施例を述べ、その効果
を具体的に説明する。

【００２４】

【実施例】本発明を以下の実施例にて説明する。

【００２５】実施例１ヒトＨＢＳ抗原測定試薬および測定法（１）抗ＨＢＳ抗体感作ラテックス液の調製抗ＨＢＳ抗体を１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０３６Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解した液１．２５ｍｌ
に、平均粒径０．４６４μｍのポリスチレンラテックス
（固形分１０重量％、積水化学工業社製）１ｍｌを添加
し、４０℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にＢ
ＳＡを１重量％含有するリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を
添加し、４０℃にて６０分間攪拌した後、この混合液を
１８０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物に牛
血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）を０．５重量％
含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍｌ
を添加し、ラテックスを懸濁させ、抗ＨＢＳ抗体感作ラ
テックス液を調製した。

【００２６】（２）硝酸塩含有緩衝液の調製硝酸カリウムを、１重量％濃度でポリエチレングリコー
ル（和光純薬社製、平均分子量：７００００）、および
１重量％濃度でＢＳＡを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に、３．０重量％の濃度になるように
溶解した。

【００２７】（３）ヒトＨＢＳ抗原測定試薬本実施例のヒトＨＢＳ抗原測定試薬は、上記（１）項の
抗ＨＢＳ抗体感作ラテックスからなる第１試薬と、上記
（２）項の硝酸塩含有緩衝液からなる第２試薬とから構
成される２液系の試薬である。

【００２８】（４）標準ＨＢＳ抗原液ＨＢＳ抗原を０、５０、１００、３００、５００ＩＵ／
ｍｌ濃度で含むヒト血清を使用した。

【００２９】（５）ＨＢＳ抗原陽性検体、およびＨＢＳ
抗原陰性検体酵素免疫測定法にて、ＨＢＳ抗原が陽性と判定された血
清５検体と、ＨＢＳ抗原が陰性と判定された血清１５検
体を使用した。

【００３０】（６）測定方法標準ＨＢＳ抗原液２０μｌに、上記（２）項の硝酸塩含
有緩衝液１５０μｌを混合し、３７℃で適時保持した
後、上記（１）項の抗ＨＢＳ抗体感作ラテックス液１５
０μｌを添加攪拌し、この後、１分後および５分後の波
長７００ｎｍでの吸光度を測定した。この間の吸光度の
変化量を吸光度変化量（ΔAbs ）とする。測定は日立自
動分析装置７０５０形を用いて行った。

【００３１】実施例２実施例１における（２）硝酸塩含有緩衝液の調製の項
を、次のようにして行ったことを除いては、実施例１と
同様にして、ＨＢＳ抗原測定試薬を作成した。

【００３２】（２）チオシアン酸塩含有緩衝液の調製チオシアン酸ナトリウムを、１重量％濃度でポリエチレ
ングリコール（和光純薬社製、平均分子量：７０００
０）、および１重量％濃度でＢＳＡを含有する０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、２．５重量％の濃度
になるように溶解した。

【００３３】比較例１実施例１における（２）硝酸塩含有緩衝液の調製の項
を、次のようにして行ったことを除いては、実施例１と
同様にして、ＨＢＳ抗原測定試薬を作成した。

【００３４】（２）尿素含有緩衝液の調製尿素を、１重量％濃度でポリエチレングリコール（和光
純薬社製、平均分子量：７００００）、および１重量％
濃度でＢＳＡを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に、６．０重量％の濃度になるように溶解し
た。

【００３５】比較例２実施例１における（２）硝酸塩含有緩衝液の調製の項
を、次のようにして行ったことを除いては、実施例１と
同様にして、ＨＢＳ抗原測定試薬を作成した。

【００３６】（２）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド含有
緩衝液の調製Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを、１重量％濃度でポリ
エチレングリコール（和光純薬社製、平均分子量：７０
０００）、および１重量％濃度でＢＳＡを含有する０．
０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、８．０重量％の
濃度になるように溶解した。

【００３７】実施例１、２および比較例１、２の結果を
表１および表２に示した。表１は、実施例１、２および
比較例１、２の試薬により、標準ＨＢＳ抗原液を測定し
たときの吸光度変化量（ΔAbs ）を示す。また、表２
は、実施例１、２および比較例１、２の試薬により、Ｈ
ＢＳ抗原陽性検体、およびＨＢＳ抗原陰性検体を測定し
たときの測定値（ＩＵ／ｍｌ）を示す。なお、表２中の
測定値は、標準ＨＢＳ抗原液を用いて吸光度変化量とＨ
ＢＳ抗原濃度との間の検量線を作成しておき、ＨＢＳ抗
原陽性検体、およびＨＢＳ抗原陰性検体を測定して得ら
れた吸光度変化量を上記検量線にあてはめてＨＢＳ抗原
濃度を求めたものである。また、表２中の判定欄は、カ
ットオフポイントを１０ＩＵ／ｍｌに設定し、測定値が
１０ＩＵ／ｍｌ未満の検体を陰性（−）、１０ＩＵ／ｍ
ｌ以上の検体を陽性（＋）と判定した結果である。

【００３８】

【表１】

【００３９】

【表２】

【００４０】表２から明らかなように、ＨＢＳ抗原陰性
検体の中の数例で、実施例１、２の免疫測定試薬では、
陰性と判定されるにもかかわらず、比較例１、２の免疫
測定試薬では陽性と判定され、非特異的凝集反応が起こ
っていることが示唆される。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、以上のように、不溶性
担体を使用し免疫凝集反応に基づく被測定物質の測定に
おいて、血清の非働化等の面倒な処理を行うことなく、
非特異的凝集反応が抑制され、かつ検出感度の高い免疫
測定試薬および免疫測定法が提供される。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被測定物質に対する抗体または抗原を担
持した不溶性担体と、硝酸塩および／またはチオシアン
酸塩とから構成された免疫測定試薬。
【請求項２】被測定物質に対する抗体または抗原を不
溶性担体に担持させ、被測定物質との抗原抗体反応によ
り生じた不溶性担体の凝集の度合いを検出することによ
り、被測定物質を測定するにあたり、該抗原抗体反応の
反応系に硝酸塩および／またはチオシアン酸塩を存在さ
せる免疫測定法。