JPH0650312B2 - 非特異性混濁を除去する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、免疫検定法の原理に従った測定の実施の際の
非特異性混濁を除去する方法に関する。

［従来の技術］ 免疫検定法（Immunoassay）の原理に従った測定の発展
は、特異的結合能力のある物質、例えば蛋白質、ハプテ
ンおよび抗体の測定時における感度および選択性を決定
的に改良し、従って、特に臨床化学研究所においては大
きな意義を持つ。ラジオイムノアッセイに由来するこれ
らの方法のさらに進んだ発展は、現在の標識法を広める
とともに、種々の分析技術を発展させた。今日、標識と
して酵素や蛍光を発する化合物を用いる免疫検定法が広
まっている。ここで、標識およびそれで検査すべき物質
の測定は、測定法で把握される吸光度の変化または発光
度にもとづく。これらの方法の基本となる前提条件はこ
れらの方法が測定すべき物質の量に正比例する測定信号
を出すことであり、その際、同時に、被検溶液、例えば
血清に含まれている構成成分による阻害が確実に避ける
べきであり、かつこれらの方法がピコーモル単位の領域
においても、十分正確な結果が導かれるように非常に高
い感度を有することである。これらの新規測定法によれ
ば、従来公知の分析法での検出がまったく不可能であっ
た血清中の物質を検出することが可能となった。微量に
存在する物質、例えばＴＳＨまたはＡＦＰの検出時に
は、結果を誤らせる障害を排除することは、当然、特に
重要である。血清試料もしくは血清に基づき製造される
標準液中の臨床パラメーターの測定時には屡々非特異性
凝集反応による障害が起こる。この非特異性凝集反応
は、多かれ少なかれ測光法の利用を阻む僅かな混濁をも
たらす。この非特異性凝集反応は、従来は、カオトロピ
ック試薬（chaotroper Reagenzien）の使用によって
も、また界面活性剤の添加によっても、完全に除去する
ことはできなかった。

［発明が解決しようとする課題］ 従って、本発明の課題は、血清試料中の非特異性反応を
抑えもしくは除くための方法を提供することであった。

［課題を解決するための手段］ この課題は、免疫検定法の原理による測定の実施の際の
非特異性混濁を除去する方法によって解決され、この方
法は、試料に、ホウ素化合物を緩衝系と組み合わせて添
加することよりなる。

意外にも、本発明による双方の添加物の組み合わせの使
用によって、非特異性凝集は完全に抑制され、血清中に
最小濃度で存在する物質の測光法による測定時に、もは
や障害は現れない。

自体公知の免疫検定法の原理による測定の実施の際に、
本発明によれば、試料溶液に、無機ホウ素化合物と緩衝
系の組み合わせ物を添加する。これにより、非特異性混
濁が除去できる。本発明による物質の添加は、測光法に
よる測定前に行い、免疫検定法の実施のために使用され
る試薬とともに行うことが可能であるかまたは、予め血
清に添加するかまたは試薬の添加後に添加する。重要な
のは、測光法による測定の実施の前に懸濁を除くことだ
けである。

重要な成分は、無機ホウ素化合物である。本発明に好適
である化合物は、多数存在する。ホウ酸の無機誘導体
は、市販されており、安定であり、反応系中で溶解性で
あるので有利に使用される。特にホウ酸塩、メタホウ酸
塩、テトラホウ酸塩、過ホウ酸塩をアルカリ金属塩の形
で、特にナトリウム塩として使用するのが有利である。

ホウ酸塩、メタホウ酸塩、テトラホウ酸塩は、すべての
免疫検定法に好適である。過ホウ酸塩は、ホウ素化合物
として、非常に有効であるが、これは、酸化に対して安
定な抗体が使用される免疫検定法でのみ使用すべきであ
る。酸化に対して敏感な抗体、例えばＴＳＨ−抗体を使
用しなければならない免疫検定法では、過ホウ酸塩の使
用によって、抗体反応が影響される。従ってこの場合
は、別のホウ素化合物を使用すべきである。

無機ホウ素化合物は、１００〜１５０mモル／の濃度
で使用するのが有利である。１００mモル／より少な
いホウ酸塩の使用時には、場合によっては、混濁の除去
はもはや最適ではない。１５０mモル／より多いホウ
酸塩の量は、更に改善をもたらされないので、より高い
濃度を使用することは無意味である。

第２の成分として、ホウ酸塩緩衝液とは異なる緩衝系を
添加する。ここでは、免疫学的方法にとって公知の緩衝
系が好適である。有利には、グッド（Good）−緩衝系、
例えばトリス（Tris）−またはヘペス（Hepes）−緩衝
液が使用される。特に有利には、本発明によるトリス−
緩衝液を使用する。

この緩衝系は７０〜１００ mモル／の濃度で使用す
る。より低い濃度は、最高の結果をもたらさず、それに
対して、１００ mモル／より多い緩衝系は、さらに改
良を導き出すことはできない。

本発明による方法は、測光法により測定を行う免疫検定
法、例えばELISAまたはLPIA に好適である。特にこの本
発明による方法は、非常に低い濃度で存在する物質の検
出に好適である。

［実施例］ 次の実施例につき本発明を詳説する。

例 １ 種々異なる緩衝物質および種々のホウ素化合物の使用下
で、ＡＦＰの測定の免疫検定法を実施した。次の試薬を
使用した。

試薬１：緩衝液(pH7.5) 100mモル/ ホウ素化合物 120mモル/ 平均分子量6000のポリエチレングリコール(PEG6000)
２重
量％ プルロニック(Pluronic) F68（アルキレンオキシドを基
礎とする界面活性剤、ポリオキサマー(Polyoxamer)) 0.5重量％ 牛血清アルブミン 1重量％ 試薬２として次のようにして製造されたラテックス粒子
分散液を使用した。その製造はシアナミド法による(J.E
x.med.(１９８１)１５１−１巻、１５３９−１５５３
頁；米国特許第３８５７９３１号明細書並びにJ.Immuno
l.Meth.（１９７８）、２２巻１６５−１７４頁参
照）。このために、直径７０〜３００nmを有し、活性カ
ルボキシル基を有するポリスチロール粒子と抗ＡＦＰポ
リクローナル抗体とを、各粒子の大きさに応じて、抗体
３〜４００μg／ラテックスmgの負荷密度で、反応させ
た。引き続き、グリシン緩衝液（pH７．５）２００mモ
ル／＋牛血清アルブミン１％中で３回洗浄し、遠心し
た。グリシン緩衝液（pH７．５）２００mモル／中の
このラテックス粒子０．３５重量％の分散液８０μｌを
その都度使用した。試料として非分析の標準ヒト血清を
使用した。

３７℃で、それぞれ試薬１ ８６０μｌおよび試薬１０
０μｌを一緒にし、６２３nmで空値を測定する。引き続
き、試薬２ ８０μｌを添加し、５分後に６２３nmで混
濁度を測定する。結果は、第１表に示す通りである。非
特異性凝集は、緩衝液とホウ素化合物との本発明による
組み合わせ物の添加の際には１００％まで阻止された
が、緩衝液またはホウ素化合物の単独の添加時には、混
濁を除くことができないことは明らかである。

例 ２ ＴＳＨ測定の多くの免疫検定法を実施し、この際、その
都度、緩衝液としてトリス緩衝液を使用し、ホウ素化合
物を種々に変えた。本質的には、例１と同様に実施した
が、この際試薬１は次の組成を有した： 緩衝液 （pH７．０） ７０ｍモル／ ホウ素化合物 １２０ｍモル／ ＰＥＧ ６０００ ２重量％ プルロニックＦ６８ ０．５重量％ 牛血清アルブミン １重量％ ＥＤＴＡ １８ｍモル／ チオシアン酸ナトリウム １０ｍモル／ 抗体として、抗ＴＳＨポリクローナル抗体を使用した。
結果を第２表に示す。ここでも、トリス緩衝液とホウ酸
塩との組み合わせが、非特異性凝集を実質的に完全に抑
制したことが明らかである。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭54−104896（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−102161（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−68673（ＪＰ，Ａ)

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】免疫検定法の原理により測定を実施する際
   の非特異性混濁を除去するために、試料溶液に、無機ホ
   ウ素化合物をホウ酸塩緩衝液とは異なる緩衝系と組み合
   わせて添加することを特徴とする、免疫検定法の原理に
   よる測定を実施する際の非特異性混濁を除去する方法。
2. 【請求項２】前記無機ホウ素化合物として無機ホウ酸誘
   導体を使用する請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】前記無機ホウ酸誘導体としてホウ酸塩、メ
   タホウ酸塩、テトラホウ酸塩、過ホウ酸塩を使用する請
   求項２記載の方法。
4. 【請求項４】前記無機ホウ素化合物を１００〜１５０ｍ
   モル／ｌの量で使用する請求項１〜３のいずれか１項記
   載の方法。
5. 【請求項５】前記緩衝系としてグッドの緩衝液又はリン
   酸緩衝液を使用する請求項１〜４のいずれか１項記載の
   方法。
6. 【請求項６】前記グッドの緩衝液としてトリス−緩衝液
   又はヘペス−緩衝液を使用する請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】前記緩衝系を７０〜１００ｍモル／ｌの量
   で使用する請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。