CN105241830A

CN105241830A - 一种糖化血清白蛋白检测试剂及其应用

Info

Publication number: CN105241830A
Application number: CN201510609529.8A
Authority: CN
Inventors: 燕启江; 郭周萍; 庞柳; 刘菲菲
Original assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2016-01-13

Abstract

本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种糖化血清白蛋白检测试剂及其应用。该试剂包括试剂R1、试剂R2和试剂R3，所述试剂R1主要由MES缓冲液、糖化氨基酸氧化酶、蛋白酶、氯化钠和防腐剂组成；所述试剂R2主要由MES缓冲液、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐、4-氨基安替吡啉、过氧化物酶、多元醇、烷基聚葡萄糖苷和防腐剂组成；所述试剂R3主要由醋酸盐缓冲液、溴甲酚紫、烷基聚葡萄糖苷和防腐剂组成。本发明提供的糖化血清白蛋白检测试剂具有抗干扰能力强、精密度高、测定结果重复性好和检测试剂稳定性高的优点，有利于该糖化血清白蛋白检测试剂的临床应用。

Description

一种糖化血清白蛋白检测试剂及其应用

技术领域

本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种糖化血清白蛋白检测试剂及其应用。

背景技术

糖化血清白蛋白（glyecatedalbumin，GA）是葡萄糖通过非酶促糖基化反应与血浆中白蛋白结合形成的酮胺类化合物。糖化血清白蛋白值可以反映糖尿病患者检测前2-3周的平均血糖水平，与血糖监测的金标准HbA_IC相比，GA可以反映血糖短期波动的情况，可以更准确的反映糖尿病患者的血糖情况。良好的血糖控制能有效延缓糖尿病、慢性并发症的发生和发展。因此，糖化血清白蛋白的测定在糖尿病的诊断、近期监控和疗效评价方面均具有重要的意义。

在上世纪80年代，日本学者就研发了高压液相离子交换法（HPLC法）进行GA测定。虽然HPLC法测定GA可准确检测糖尿病患者短期血糖控制的总体水平，但是该测定方法在当时的价格较高，处理样本量小，不利于临床常规的开展和应用。接着美国研制出一种特异性较高的糖化血清白蛋白的测定方法，该检测方法是一种固体酶法，解决了当时检测糖化血清白蛋白价格高的问题。但是，该检测方法操作繁琐，检测时需要复溶，而且测定的结果重复性较低，大大的限制了该检测试剂的应用。

近年来，随着对糖化血清白蛋白检测的深入研究，为了更方便、快捷的检测出糖化血清白蛋白的浓度，学者们研究出了一种液态酶法检测的糖化血清白蛋白的检测方法，该液态酶法是一种简单、快速、灵敏、准确定量的检测方法，而且该检测方法的测定结果准确高、重复性好，是一种较为理想的糖化血清白蛋白的检测方法。

中国专利申请201410401260.X公开了一种稳定的糖化白蛋白检测试剂盒，该试剂盒由试剂R1、试剂R2和试剂R3组成，所述试剂R1主要由缓冲液、糖化氨基酸氧化酶、白蛋白蛋白酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、4-氨基安替比林和稳定剂组成；所述试剂R2主要由缓冲液、白蛋白蛋白酶、过氧化物酶、色原和稳定剂组成；所述试剂R3主要由缓冲液、溴甲酚绿和表面活性剂组成。该试剂是一种简单、快速、灵敏、准确的检测试剂，而且该试剂稳定性高，有利于延长检测试剂的保质期。但是，该检测试剂中的溴甲酚绿可以与非白蛋白类蛋白质结合，影响血清白蛋白的检测浓度，从而导致检测结果误差较大，影响诊断结果，不利于该试剂的推广和应用。

因此，研究和发开出一种稳定性高，检测结果误差小，检测结果重复性高的糖化血清白蛋白检测试剂是目前亟需解决的难题。

发明内容

为了克服现有技术中糖化血清白蛋白检测试剂存在检测结果准确性差、重复性低的缺陷，本发明的目的是提供一种糖化血清白蛋白检测试剂及其应用，以解决上述问题。

本发明提供了一种糖化血清白蛋白检测试剂，包括试剂R1、试剂R2和试剂R3，所述试剂R1包括以下组分：

MES缓冲液10-60mmol/L、糖化氨基酸氧化酶2-15U/ml、蛋白酶5-10U/ml、氯化钠20-50μmol/L和防腐剂0.1-1g/L；

所述试剂R2包括以下组分：

MES缓冲液10-60mmol/L、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐1-10mmol/L、4-氨基安替吡啉5-20mmol/L、过氧化物酶1-8U/ml、多元醇5-10mg/ml、烷基聚葡萄糖苷10-30mmol/L和防腐剂0.1-1g/L；

所述试剂R3包括以下组分：

醋酸盐缓冲液20-50mmol/L、溴甲酚紫2-15mmol/L、烷基聚葡萄糖苷30-80mmol/L和防腐剂0.1-1g/L。

优选地，所述的糖化血清白蛋白检测试剂包括试剂R1、试剂R2和试剂R3，所述试剂R1包括以下组分：

MES缓冲液40mmol/L、糖化氨基酸氧化酶8U/ml、蛋白酶6U/ml、氯化钠30μmol/L和防腐剂0.2g/L；

所述试剂R2包括以下组分：

MES缓冲液40mmol/L、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐4mmol/L、4-氨基安替吡啉10mmol/L、过氧化物酶4U/ml、多元醇8mg/ml。烷基聚葡萄糖苷20mmol/L和防腐剂0.2g/L；

所述试剂R3包括以下组分：

醋酸盐缓冲液30mmol/L、溴甲酚紫5mmol/L、烷基聚葡萄糖苷50mmol/L和防腐剂0.2g/L。

进一步地，所述防腐剂为proclin300。所述的proclin300具有优越的兼容性、稳定性和低毒性的优点而被广泛应用于诊断试剂或产品中控制微生物含量的高效灭菌剂，可以有效的延长检测试剂的保质期。

进一步地，所述多元醇为乙二醇。

进一步地，所述醋酸盐缓冲液的pH值为4.5-5.5，所述醋酸盐缓冲液的pH值优选为4.9。

本发明的MES缓冲液是2-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液，2-吗啉乙磺酸的分子式为C₆H₁₃NO₄S，CAS号为4432-31-9。N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐的分子式为C₁₅H₂₃NNa₂O₆S₂，CAS号为127544-88-1。

本发明的检测试剂添加的氯化钠可以有效的保持糖化氨基酸氧化酶和蛋白酶的构象，维持其活性，保证试剂检测结果的准确性。多元醇是分子中含有三个或三个以上羟基的醇类，可以提高检测试剂的稳定性。烷基聚葡萄糖苷是一种非离子表面活性剂，具有杀菌性能强、配伍性好和提高酶活性的优点，可以有效的提高过氧化物酶的活性，提高试剂的稳定性。

本发明提供的糖化血清白蛋白检测试剂检测糖化血清白蛋白（GA）的原理：在样本中先加入糖化氨基酸氧化酶，将内源性糖化氨基酸变成葡萄糖酮醛、氨基酸和过氧化氢除去；然后在处理液中，加入蛋白酶，将糖化血清白蛋白反应生成糖化氨基酸，接着加入糖化氨基酸氧化酶将糖化氨基酸生成葡萄糖酮醛、氨基酸和过氧化氢，在生成的过氧化氢的环境下，N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐和4-氨基安替吡啉可以定量变换成蓝紫色色素。通过测定该蓝紫色色素的吸光度从而计算出糖化血清白蛋白的浓度。

本发明提供的糖化血清白蛋白检测试剂检测血清白蛋白（ALB）的原理：在pH为4.5-5.5的环境中，溴甲酚紫与血清白蛋白结合形成绿色复合物，在600nm波长处的吸光度与血清白蛋白浓度成正比，与同样处理的血清白蛋白标准比较，可计算样本血清中的白蛋白浓度。

糖化血清白蛋白（GA）值（%）的计算是将糖化血清白蛋白浓度除以血清白蛋白浓度，计算出糖化血清白蛋白值（%），从而反映出糖尿病患者检测前2-3周的平均血糖水平。

本发明提供的糖化血清白蛋白检测试剂检测GA浓度是采用终点法检测，该试剂的检测方法包括以下步骤：采用自动生化分析仪进行检测，其主波长设为546nm，副波长设为700nm，加入样本，接着加入试剂R1和试剂R2反应4-8min。

本发明提供的糖化血清白蛋白检测试剂检测ALB浓度是采用终点法检测，该试剂的检测方法包括以下步骤：采用自动生化分析仪进行检测，其主波长设为600nm，副波长设为660nm，加入样本和试剂R3反应4-8min。

另外，本发明还提供了糖化血清白蛋白检测试剂在检测糖化血清白蛋白中的应用。

总之，与现有技术相比，本发明提供的糖化血清白蛋白检测试剂具有具有抗干扰能力强、精密度高、测定结果重复性好和检测试剂稳定性高的优点，而且该试剂回收率高，是一种理想的糖化血清白蛋白检测试剂，有利于该试剂的推广和应用。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。

实施例1、糖化血清白蛋白检测试剂

糖化血清白蛋白检测试剂包括试剂R1、试剂R2和试剂R3，所述试剂R1包括以下组分：

MES缓冲液20mmol/L、糖化氨基酸氧化酶2U/ml、蛋白酶5U/ml、氯化钠25μmol/L和proclin3000.1g/L；

所述试剂R2包括以下组分：

MES缓冲液20mmol/L、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐1mmol/L、4-氨基安替吡啉5mmol/L、过氧化物酶2U/ml、乙二醇5mg/ml、烷基聚葡萄糖苷10mmol/L和proclin3000.1g/L；

所述试剂R3包括以下组分：

pH值为4.5的醋酸盐缓冲液20mmol/L、溴甲酚紫2mmol/L、烷基聚葡萄糖苷30mmol/L和proclin3000.1g/L。

实施例2、糖化血清白蛋白检测试剂

MES缓冲液40mmol/L、糖化氨基酸氧化酶8U/ml、蛋白酶6U/ml、氯化钠30μmol/L和proclin3000.2g/L；

所述试剂R2包括以下组分：

MES缓冲液40mmol/L、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐4mmol/L、4-氨基安替吡啉10mmol/L、过氧化物酶4U/ml、乙二醇8mg/ml、烷基聚葡萄糖苷20mmol/L和proclin3000.2g/L；

所述试剂R3包括以下组分：

pH值为4.9的醋酸盐缓冲液30mmol/L、溴甲酚紫5mmol/L、烷基聚葡萄糖苷50mmol/L和proclin3000.2g/L。

实施例3、糖化血清白蛋白检测试剂

MES缓冲液60mmol/L、糖化氨基酸氧化酶10U/ml、蛋白酶10U/ml、氯化钠50μmol/L和防腐剂0.3g/L；

所述试剂R2包括以下组分：

MES缓冲液60mmol/L、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐8mmol/L、4-氨基安替吡啉20mmol/L、过氧化物酶6U/ml、多元醇10mg/ml、烷基聚葡萄糖苷30mmol/L和防腐剂0.3g/L；

所述试剂R3包括以下组分：

pH值为5.5的醋酸盐缓冲液50mmol/L、溴甲酚紫10mmol/L、烷基聚葡萄糖苷80mmol/L和防腐剂0.3g/L。

试验例一、糖化血清白蛋白检测试剂的稳定性试验

1、试验试剂：实施例2制备的糖化血清白蛋白检测试剂、高值及低值质控样本。

2、试验方法：将实施例2制备的糖化血清白蛋白（GA）检测试剂开启后，当日的校正K值为23.860，将开启后的糖化血清白蛋白检测试剂在2-8℃的试剂舱内放置4周，每周校正，第4周的校正K值为23.324，K值变化率为-2.24%；同时检测血清白蛋白（ALB）的K值，检测每周高低值质控的平均值和靶值。

3、试验结果

试验结果如表1所示。

表1糖化血清白蛋白检测试剂的稳定性试验数据

时间	GA（K值）	ALB（K值）	高值质控平均值	高值质控靶值	低值质控平均值	低值质控靶值
							第一周	23.860	20.520	37.8	36.6	12.2	12.3
第二周	24.012	20.386	38.3	36.6	12.4	12.3
							第三周	24.988	20.896	38.0	36.6	12.5	12.3
第四周	23.324	20.120	37.1	36.6	12.8	12.3

由表1可知，每周检测的高低值质控的靶值均在±2SD范围内，证明本发明的制备的糖化血清白蛋白检测试剂在开启的4周内相当稳定。

试验例二、糖化血清白蛋白检测试剂的精密度试验

1、试验试剂：实施例2制备的糖化血清白蛋白检测试剂、混合血清样本、高值及低值质控样本。

2、试验方法：采用奥林巴斯AU2700全自动生化分析仪在同一天重复测定混合血清样本、高值及低值质控样本20次，计算批内变异系数（CV）。将混合血清样本、高值及低值质控样本分别分装成20管，放置-20℃中保存，采用奥林巴斯AU2700全自动生化分析仪每天测一管，连续测定20天，计算批间变异系数（CV）。

3、试验结果：

试验结果如表2所示。

表2糖化血清白蛋白检测试剂的批内和批间的变异系数

	批内平均值	批内变异系数（%）	批间平均值	批间变异系数（%）
					混合血清样本	13.4	1.3	12.8	2.1
低值质控样本	12.6	0.8	12.6	2.3
					高值质控样本	37.8	0.8	38.1	1.8

由表2得出，本发明提供的糖化血清白蛋白检测试剂检测的混合血清样本、高值及低值质控样本的变异系数小于5%，证明本发明提供的糖化血清白蛋白检测试剂的测定结果精密度高。

试验例三、糖化血清白蛋白检测试剂的干扰试验

1、试验试剂：实施例2制备的糖化血清白蛋白检测试剂。

2、试验方法：采用不同浓度的葡萄糖，结合胆红素、游离胆红素、乳糜及溶血血红蛋白，观察以上物质对实施例2制备的糖化血清白蛋白检测试剂的干扰。

3、试验结果

经检测结果表明：葡萄糖浓度少于55.5mmol/L、乳糜少于1540FTU（福尔马肼浊度）、溶血血红蛋白少于1.76g/L、结合胆红素浓度少于290μmol/L、游离胆红素浓度少于200μmol/L时对检测结果无明显干扰，证明本发明提供的糖化血清白蛋白检测试剂抗干扰能力强。

试验例四、糖化血清白蛋白检测试剂的回收试验

1、试验方法：以糖化血清白蛋白（GA）浓度4.80g/L，血清白蛋白（ALB）浓度37.2的血清作为基础样本，以GA浓度为5.30g/L，ALB浓度为41.2g/L血清样本作为回收样本一，以GA浓度为6.40g/L，ALB浓度41.2g/L血清样本作为回收样本二。使用实施例2制备的糖化血清白蛋白检测试剂进行检测。

2、试验结果：

经回收试验的结果计算得出：GA浓度的平均回收率为97.23%，ALB的平均回收率为97.12%，是一种回收率高的糖化血清白蛋白检测试剂。

Claims

1.一种糖化血清白蛋白检测试剂，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和试剂R3，所述试剂R1包括以下组分：

所述试剂R2包括以下组分：

所述试剂R3包括以下组分：

2.如权利要求1所述的糖化血清白蛋白检测试剂，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和试剂R3，所述试剂R1包括以下组分：

所述试剂R2包括以下组分：

MES缓冲液40mmol/L、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐4mmol/L、4-氨基安替吡啉10mmol/L、过氧化物酶4U/ml、多元醇8mg/ml、烷基聚葡萄糖苷20mmol/L和防腐剂0.2g/L；

所述试剂R3包括以下组分：

3.如权利要求1或2所述的糖化血清白蛋白检测试剂，其特征在于，所述防腐剂为proclin300。

4.如权利要求1或2所述的糖化血清白蛋白检测试剂，其特征在于，所述多元醇为乙二醇。

5.如权利要求1或2所述的糖化血清白蛋白检测试剂，其特征在于，所述醋酸盐缓冲液的pH值为4.5-5.5。

6.如权利要求5所述的糖化血清白蛋白检测试剂，其特征在于，所述醋酸盐缓冲液的pH值为4.9。

7.一种如权利要求1-6任一所述的糖化血清白蛋白检测试剂在检测糖化血清白蛋白中的应用。