CN103760357B - 一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒 - Google Patents
一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及缺血修饰白蛋白含量检测技术领域,特别涉及一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒,包括试剂1和试剂2,试剂1中含有缓冲液,氯化钴,稳定剂,防腐剂;试剂2中含有缓冲液,二硫苏糖醇,稳定剂,还原保护剂,防腐剂。可以加速钴离子与正常白蛋白结合的效率,在一定时间内,完全与正常白蛋白结合,保证了试剂检测样本结果的准确性;保护了二硫苏糖醇在溶液中的稳定性,而且不影响二硫苏糖醇与钴离子的结合,从而保证试剂室温开瓶避光保存稳定30天,2-8℃闭瓶保存稳定12个月,完全满足临床检验的需要;促进了二硫苏糖醇与钴离子的结合的结合速度,使试剂尽快达到反应重点,保证了试剂的高效检测效果,显著提高了试剂检测的准确度。
Description
技术领域
本发明涉及缺血修饰白蛋白(IMA)含量检测技术领域,特别涉及一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒。
背景技术
IMA是心肌早期缺血的敏感指标,结合其他血生化指标可提高敏感性及特异性,主要用于ACS患者的早期诊断,还用于PCI、起搏器和除颤器植入术后、扩张性心肌病心功能、急性心肌缺血患者的预后评价。
完整的白蛋白在肝脏中合成,由585个氨基酸残基组成,相对分子量为66.5KD,在血液中的浓度为0.63mmol/L,半衰期为19-20d。其氨基末端为人类特有的一段序列,正常生理情况下,能够与过渡金属如钴、铜、镍等结合。
在缺血缺氧时人体组织进行无氧代谢,消耗ATP;同时酸性代谢产物,局部微环境pH值下降,致使循环蛋白上的金属结合位点释放,在还原剂如维生素C等存在时,Cu2+被转化为Cu2+,后者可与氧反应生成超氧自由基,在超氧化物歧化酶的作用下将其歧化为过氧化氢(H2O2)和氧。正常情况下,H2O2是无害的,由过氧化物酶降解成水和氧气,而当有金属离子存在时,H2O2可通过Fenton反应形成烃自由基,后者具有高度活性,导致蛋白、核酸损伤和脂质过氧化。患者血清白蛋白易受自由基损害,,由于自由基等破坏了血清白蛋白的氨基酸序列,而导致白蛋白与过渡金属的结合能力改变,这种因缺血而发生与过渡金属如钴、铜及镍等结合能力改变的白蛋白则称为缺血修饰白蛋白(Ischemiamodifiedalbumin,IMA)。
近年来,IMA作为早期诊断急性心肌缺血的标记物在国内外受到广泛关注,美国食品与药物管理局(FDA)于2003年批准其用于急性冠状动脉综合征(ACS)的排除诊断,以降低对非心肌缺血性患者的收治率和心血管病高危个体的漏诊率,节省医疗资源。
对于IMA检测的临床意义有:
(1)IMA是检测早期心肌缺血的敏感指标,故能更早发现急性心肌缺血,更早预测心脏事件的相对危险。
(2)IMA是急性冠脉综合征(ACS)诊断的生物标志。ACS具有发病急、变化快、临床表现与危险性不均一等特征,早期诊断困难。传统的生物标志物如肌钙蛋白(cTn)、肌红蛋白(Myo)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)只有在心肌发生坏死时才升高,但这时已给患者带来了不可逆的病理损害。因此,急需一种可以反映心肌缺血的早期敏感的生化指标用于早期诊断,而IMA是近年来的研究热点,为ACS早期诊断的研究开辟了新的道路。IMA对ACS患者心肌缺血检出的灵敏度是ECG的2倍、cTn的4倍。
测定IMA方法很多,包括比色测定法、液相色谱法、质谱测定法以及核磁共振等,目前得到FDA认可批准的检测方法是根据白蛋白-钴结合试验(Thealbumincobaltbindingtest,ACB)原理,用比色法测定IMA。其基本原理是:在非缺血个体血浆中的白蛋白多以活性形式存在,当加人氯化钴(COC12)溶液时,CO2+与结合能力正常的白蛋白结合,血浆中游离的CO2+浓度就会降低,而缺血个体血浆中的白蛋白多处于修饰状态,当加人相同浓度的COC12溶液时,由于IMA与CO2+结合的能力减弱,使溶液中存在较高浓度的游离CO2+,加人二巯苏糖醇,溶液可与游离CO2+发生颜色反应,显色越强,表明未结合CO2+越多,而Alb-CO2+结合的越少,即Alb-CO2+结合力与反应显色强度呈负相关。换言之,IMA与反应显色强度呈正相关。
目前,根据最初FDA认可批准的白蛋白-钴结合试验方法配制的IMA检测试剂,在临床检测应用中存在一些技术问题,这些问题,限制了该试剂其在临床检测应用过程中的应用。主要的技术问题有:
(1)反应原理中钴离子先结合正常白蛋白,剩余游离的钴离子再与二硫苏糖醇反应显色,如果钴离子没有与正常白蛋白反应完全将影响测定的准确度。
(2)由于IMA测定采用二硫苏糖醇为显色剂,其水溶液冷藏或冷冻保存稳定时间相对较短,影响试剂的稳定性。
(3)钴结合二硫苏糖醇的反应,在正常情况反应速度较慢,在某些规定时间的检测过程(如全自动生化分析仪检测中),检测高值时有可能无法达到反应终点,而影响检测的效率。
发明内容
为了解决现有技术中存在的IMA检测准确度低、稳定性差、检测效率低的问题,本发明提供了一种检测准确度高、稳定性好、检测效率高的缺血修饰白蛋白检测试剂盒。
本发明的通过以下措施实现的:
一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒,包括试剂1和试剂2,其中,
试剂1中含有以下组分:
pH为7.5-8.5的缓冲液0.05~0.5mol/L,
氯化钴10~40mmol/L,
稳定剂0.1~5g/L,
防腐剂0.1~1g/L;
试剂2中含有以下组分:
pH为7.0-8.0的缓冲液0.5~5mol/L,
二硫苏糖醇20~40mmol/L,
稳定剂0.1~5g/L,
还原保护剂1~10mmol/L,
防腐剂0.1~1g/L。
所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,优选所述试剂1中的稳定剂为三乙醇胺。
所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,优选所述试剂2中的稳定剂为烷基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚、三乙醇胺、烷基糖苷、曲拉通或吐温。
所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,优选所述试剂2中的还原保护剂为谷胱甘肽、亚硫酸氢钠或巯基乙醇。
所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,优选所述试剂1中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液或4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液。
所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,优选所述试剂1和试剂2中的防腐剂为叠氮化钠或PC300。
所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,优选所述试剂2中的缓冲液为甘氨酸缓冲液、咪唑缓冲液或醋酸盐缓冲液。
所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,优选所述试剂1与试剂2的体积比为1~4:1。
所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,优选所述试剂1与试剂2的体积比为2:1。
本发明的有益效果:
(1)在试剂1中加入三乙醇胺作为稳定剂,可以加速钴离子与正常白蛋白结合的效率,在一定时间内,完全与正常白蛋白结合,保证了试剂检测样本结果的准确性;
(2)在试剂2中加入还原保护剂,选择应用巯基乙醇作为保护剂,有效地保护了二硫苏糖醇在溶液中的稳定性,而且不影响二硫苏糖醇与钴离子的结合,从而保证试剂室温开瓶避光保存稳定30天,2-8℃闭瓶保存稳定12个月,完全满足临床检验的需要;
(3)在试剂2中加入非离子表面活性剂作为稳定剂,有效促进了二硫苏糖醇与钴离子的结合的结合速度,使试剂尽快达到反应终点,保证了试剂的高效检测效果,显著提高了试剂检测的准确度。
附图说明
图1为4-8℃稳定性实验检测结果图,
图2对比相关性检测曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明,下述实施例只是用于解释本发明,而不是对本发明的技术方案的限制。
实施例1:
试剂1各组分及浓度为:
Tris缓冲液(pH7.6)0.1mol/L,
氯化钴20mmol/L,
PC-3001g/L,
试剂2各组分及浓度为:
咪唑缓冲液(pH7.0)1mol/L,
二硫苏糖醇20mmol/L,
PC-3001g/L。
实施例1中的配方为FDA认可的市场上常规应用的一种配方,用作理论对照。
试剂1和试剂2的配制方法为常规方法,即试剂1和试剂2所述组分分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。
本发明试剂盒测定样本中的IMA的测试条件如下:
温度:37℃;比色杯光径为1.0cm。检测波长510nm。(现在临床全自动生化分析仪器都能够达到该要求)
应用本发明IMA测定试剂盒测定样本中IMA的方法如下:
样品(检测的样品包括蒸馏水、标准品和临床样本)加试剂1混匀,37℃孵育5min后读取吸光度A0,立即加入试剂2混匀,37℃反应5min后,读取吸光度A1,ΔA=A1-A0。其中样本用量30μl,试剂1用量200μl,试剂2用量100μl。
本发明试剂盒测定样本中IMA含量按以下公式进行计算:
单位定义:每ml血清中白蛋白失去结合1μg钴离子的能力为1U。
实施例2:
试剂1各组分及浓度为:
Tris缓冲液(pH7.6)0.1mol/L
氯化钴20mmol/L
PC-3001g/L
试剂2各组分及浓度为:
咪唑缓冲液(pH7.0)1mol/L
二硫苏糖醇20mmol/L
巯基乙醇6mol/L
PC-3001g/L
实施例2试剂盒的制备方法同实施例1,检测方法同实施例1。
实施例3
试剂1各组分及浓度为:
Tris缓冲液(pH7.6)0.1mol/L
氯化钴20mmol/L
PC-3001g/L
试剂2各组分及浓度为:
咪唑缓冲液(pH7.0)1mol/L
二硫苏糖醇20mmol/L
亚硫酸氢钠6mol/L
PC-3001g/L
实施例3试剂盒的制备方法同实施例1,检测方法同实施例1。
实施例4:
试剂1各组分及浓度为:
Tris缓冲液(pH7.6)0.1mol/L
氯化钴20mmol/L
三乙醇胺0.5g/L
PC-3001g/L
试剂2各组分及浓度为:
咪唑缓冲液(pH7.0)1mol/L
二硫苏糖醇20mmol/L
巯基乙醇6mol/L
三乙醇胺0.5g/L
PC-3001g/L
实施例4试剂盒的制备方法同实施例1,检测方法同实施例1。
实施例5:
试剂1各组分及浓度为:
Tris缓冲液(pH7.6)0.05mol/L
氯化钴10mmol/L
三乙醇胺0.1g/L
PC-3000.1g/L
试剂2各组分及浓度为:
咪唑缓冲液(pH7.0)0.5mol/L
二硫苏糖醇20mmol/L
巯基乙醇1mol/L
十六烷基糖苷0.1g/L
PC-3000.1g/L
实施例5试剂盒的制备方法同实施例1,检测方法同实施例1。
实施例6:
Tris缓冲液(pH7.6)0.5mol/L
氯化钴40mmol/L
三乙醇胺5g/L
PC-3001g/L
试剂2各组分及浓度为:
咪唑缓冲液(pH7.0)5mol/L
二硫苏糖醇40mmol/L
巯基乙醇10mol/L
TX-1005g/L
PC-3001g/L
实施例6试剂盒的制备方法同实施例1,检测方法同实施例1。
实施例7:
试剂1各组分及浓度为:
Tris缓冲液(pH7.6)0.1mol/L
氯化钴20mmol/L
三乙醇胺0.5g/L
PC-3001g/L
试剂2各组分及浓度为:
咪唑缓冲液(pH7.0)1mol/L
二硫苏糖醇20mmol/L
巯基乙醇6mol/L
烷基酚聚氧乙烯醚0.5g/L
PC-3001g/L
实施例7试剂盒的制备方法同实施例1,检测方法同实施例1。
实施例8:
试剂1各组分及浓度为:
Tris缓冲液(pH7.6)0.1mol/L
氯化钴20mmol/L
三乙醇胺0.5g/L
PC-3001g/L
试剂2各组分及浓度为:
咪唑缓冲液(pH7.0)1mol/L
二硫苏糖醇20mmol/L
巯基乙醇6mol/L
吐温-200.5g/L
PC-3001g/L
实施例8试剂盒的制备方法同实施例1,检测方法同实施例1。
试剂盒效率验证
对理论靶值为20.4U/mL的样本1、44.1U/mL的样本2、76.4U/mL的样本3、114.6U/mL的样本4、143.9U/mL的样本5在相同的检测条件下,采用实施例1、2、3、4制备的试剂盒对各个浓度进行检测,结果如表1所示:
表1不同实施例检测反应达到终点的时间
由以上数据明显显示,本发明实施例4配制的试剂达到终点的时间明显加快,说明试剂盒中加入去干扰剂和稳定剂显著加快了反应达到终点的试剂,试剂盒反应效率明显提高。
准确性、精密度实验
对靶值为63.1±5U/mL的质控液Ⅰ和靶值为76.4±5U/mL的质控液Ⅱ在相同条件下,采用实施例4、5、6、7、8制备的试剂盒对同一质控液的同一浓度连续检测20次,将检测结果的平均值与靶值范围进行比较,以检测所述的试剂盒的准确性,同时比较每个测定的变异系数,以检测所述的试剂盒实施例的准确性和精密度,结果如表2所示:
表2试剂盒准确度、精密度检测结果
经过对中低值质控品检测,采用实施例4、5、6、7、8制备的试剂盒准确度在靶值要求的范围内,达到准确度要求,其中采用实施例4、5、6制备的试剂盒重复20次检测的变异系数都小于3,达到常规生化试剂CV(变异系数)≤5%的要求,而采用实施例7、8制备的试剂盒重复20次检测的变异系数出现大于5%的情况,本发明选用三乙醇胺、十六烷基糖苷或TX-100作为试剂2的稳定剂,更好地改善了试剂的准确度和精密度。
试剂盒稳定性实验
(1)37℃加速稳定性实验
将实施例4、7、8配制的试剂进行37℃加速稳定性实验(37℃加速稳定性试验保证了试剂在运输和短期存放期间的稳定性),需要达到7天后检测结果依然在靶值范围内。操作流程为:采用实施例4、7、8制备的试剂盒,分别按照试剂装量要求进行分装,三种试剂盒各需要8组试剂,每组试剂包含一瓶试剂1和一瓶试剂2,将24组试剂瓶放置在37℃水浴锅内,每种试剂盒每天定时取出一组对靶值为76.4±5U/mL质控品进行检测,检测结果如表3所示:
表337℃加速稳定性实验检测结果
通过以上数据,采用实施例4配制的试剂盒,虽然检测结果出现下降,但是结果偏差不大,经过37℃热加速7天后,检测结果还是在靶值范围内,采用实施例7、8配制的试剂盒随着时间增长,在37℃加速试验中检测结果下降严重,3天后已经严重偏出质控范围,对比检测结果,本发明实施例4配制的试剂37℃加速稳定性好。
(2)4-8℃稳定性实验
将实施例4、7、8配制的试剂进行4-8℃稳定性实验,检测试剂能否稳定保存1年,即在一年时间内检测结果都在靶值范围内。操作流程为:采用实施例4、7、8制备的试剂盒,分别按照试剂装量要求进行分装,两种试剂盒各需要13组试剂,每组试剂包含一瓶试剂1和一瓶试剂2,将39组试剂瓶放置在4-8℃冰箱内,每种试剂盒每天定时取出一组对靶值为76.4±5U/mL质控品进行检测,检测结果如图1所示:
通过图1检测结果的变化趋势,采用实施例4配制的试剂随着放置时间的增长,试剂检测结果出现下滑,但是到一年(12个月)后,检测结果依旧在靶值范围内。然而采用实施例7、8配制的试剂,检测结果持续下降,在4个月后已经查处靶值的范围。通过对比检测结果,本发明采用实施例4配制的试剂盒能在4-8℃稳定保存12个月。
由稳定性检测数据显示,本发明采用实施例4配制的试剂稳定性好,能在37℃环境下稳定放置7天,同时在4-8℃闭瓶保存稳定12个月,完全满足临床检验的需要。
试剂盒比对相关性试验
采用实施例4配制的试剂,与市场上常见公认的某缺血修饰白蛋白检测试剂盒(比色法)进行对照检测,同时检测了40个临床血清样本,检测结果如图2所示,并获得了两种试剂的相关性曲线。通过图2检测结果显示,两个试剂盒的相关系数为0.9978,说明了两者有极大的相关性,从而证明了本发明的试剂盒与市场上应用的试剂盒临床检测结果具有一致性。
Claims (7)
1.一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒,其特征在于包括试剂1和试剂2,
其中,试剂1中含有以下组分:pH为7.5-8.5的缓冲液0.05~0.5mol/L,氯化钴10~40mmol/L,稳定剂0.1~5g/L,防腐剂0.1~1g/L;
试剂2中含有以下组分:pH为7.0-8.0的缓冲液0.5~5mol/L,二硫苏糖醇20~40mmol/L,稳定剂0.1~5g/L,还原保护剂1~10mmol/L,防腐剂0.1~1g/L;
所述试剂1中的稳定剂为三乙醇胺;
所述试剂2中的稳定剂为三乙醇胺、十六烷基糖苷或TX-100。
2.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,其特征在于所述试剂2中的还原保护剂为巯基乙醇。
3.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,其特征在于所述试剂1中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液或4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,其特征在于所述试剂1和试剂2中的防腐剂为叠氮化钠或PC300。
5.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,其特征在于所述试剂2中的缓冲液为甘氨酸缓冲液、咪唑缓冲液或醋酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,其特征在于所述试剂1与试剂2的体积比为1~4:1。
7.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒,其特征在于所述试剂1与试剂2的体积比为2:1。
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