CN1888907B - 一种缺血修饰白蛋白的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种缺血修饰白蛋白的测定方法，该方法利用缺血修饰白蛋白对钴结合能力减弱的特性，使用化学试剂检测反应体系中的游离钴，通过吸光度变化表示游离钴含量变化，进而间接表示缺血修饰白蛋白的浓度；检测中所使用显色试剂为二硫赤藓糖醇，二硫赤藓糖醇结构单一，不存在同分异构体，性质较稳定，测定结果变化小。可避免因为试剂本身的差别，导致检测结果随试剂生产厂家、试剂种类、批号等引起结果不稳定问题。所述的对游离钴检测的结果以游离钴浓度指标替代吸光度，避免由于仪器或试剂性能差别和不稳定导致缺血修饰白蛋白检测结果的不稳定。

Description

一种缺血修饰白蛋白的测定方法

技术领域

本发明涉及对人血清中缺血修饰白蛋白进行检测的方法。该方法利用急性冠状动脉综合症(ACS)患者血清中缺血修饰白蛋白与外源性Co²⁺结合能力减弱的特性，在血清中加入一定浓度钴溶液，使其与血清中白蛋白充分结合，再加入试剂检测反应体系中的游离钴，通过吸光度变化表示游离钴含量变化，进而间接表示缺血修饰白蛋白的浓度。

背景技术

急性冠状动脉综合症(Acute coronary syndromes ACS)是指冠状动脉粥样硬化斑块脱落，血小板聚集，血栓形成致使冠状动脉狭窄、阻塞，引起心肌缺血以及梗死的病理现象，从临床角度看，他涵盖了一组连续进展的病症，包括不稳定心绞痛、非ST段抬高的心肌梗死和ST段抬高的心肌梗死。

人血清白蛋白(HSA)是一种循环蛋白，其氨基末端序列为人类所特有，能与金属钴、铜和镍等离子结合，与其它种属动物白蛋白相比，HSA的金属结合位点更易受生物化学因素的影响而被降解。人血清白蛋白在氧自由基作用下，其氨基末端结构发生改变，导致其与某些外源性金属钴、铜、镍结合能力减弱的白蛋白，称为缺血修饰白蛋白(Ischemiamodified albumin IMA)。

研究人员在寻找冠状动脉综合症(ACS)生化标志物时观察到患者血清白蛋白与外源性Co²⁺结合能力减弱，同时阐明缺血再灌注引起白蛋白改变的机制主要为内皮细胞损伤及细胞外缺氧，酸中毒，自由基损伤，细胞膜能量依赖的钠钾泵破坏和游离Co²⁺增多，这些反应在急性心肌缺血后数分钟内发生。当各种原因引起缺血时，局部血液灌注和供氧减少，组织细胞进行无氧代谢，消耗ATP。同时代谢产物(如乳酸)堆积，导致酸中毒，局部微环境pH下降致使Cu²⁺从循环蛋白的金属结合位点释放，在还原剂如VitC存在时，Cu²⁺→Cu⁺，后者可与氧反应生成氧自由基[O^-]，在超氧化物歧化酶(SOD)的作用下，使其转化为过氧化氢和氧。正常情况下过氧化氢无害，由SOD降解生成水和O₂，当有金属离子存在时，过氧化氢通过Fenton反应形成[O^-]，后者具有高度活性，导致蛋白、核酸损伤和脂质过氧化。HSA易受[O^-]损害，使N-末端序列2-4个氨基酸(天冬氨酸-丙氨酸-丝氨酸-赖氨酸)发生转变形成IMA。也有报道是乙酰化或缺失1-2氨基酸。在这一过程中，游离Cu²⁺具有很高的毒性作用。游离Cu²⁺释放后，血清白蛋白的N-末端序列与其结合，迅速将其清除，当白蛋白在[O^-]作用下被修饰后，结合Cu²⁺的能力减弱，Cu²⁺从结合位点释放，再次进入[O^-]的形成过程或与正常的白蛋白结合，这就形成了一个链式反应，最终使IMA在缺血数分钟内迅速升高。

理想的心肌缺血标志物应具有以下特征：(1)无论是否具有心肌坏死，都能查出心肌缺血，其他器官缺血、炎症或坏死时不增高。(2)缺血早期即可查出，升高程度与缺血程度一致。(3)标志物稳定，有足够的诊断窗口期，12-24小时内应能恢复至正常，以利于查出再次缺血。

研究表明IMA基本具备理想心肌缺血标志物基本特征，在以下几个方面具有重要价值：

(1)对于因胸痛或不适来就诊的急诊患者进行危险分层，对低危患者有助排除ACS诊断。

(2)作为对疑似ACS患者最早升高的短期缺血危险分层标志物，有助于临床医师早期恰当处理病人。传统的心肌损伤标志物常在心肌细胞发生坏死后血中浓度方可升高，IMA在心肌可逆的心肌缺血阶段血中浓度即迅速升高，可早期并灵敏地反应心肌缺血状况，将心肌缺血的诊断窗由原来的缺血发生后4-6小时提前到5-10分钟。

目前，IMA测定一般利用正常人血清中白蛋白能与Co²⁺结合而缺血修饰白蛋白与Co²⁺结合能力减弱的特性，采用白蛋白-钴结合试验(ACB)进行。正常人白蛋白以活性形式存在，加入钴试剂后，Co²⁺与人血清白蛋白N-末端结合，溶液中游离Co²⁺浓度下降，心肌缺血病人血清标本中含有大量的IMA，加入同等量的钴试剂后，由于IMA与Co²⁺的结合能力下降，溶液中存在较多量的游离Co²⁺，加入二硫苏糖醇试剂后，游离钴可与二硫苏糖醇反应，产生棕红色化合物。游离钴含量越高，颜色欲深，用分光光度计测定吸光度值大小，即可间接测出血清中游离钴含量，从而间接表示血清中IMA含量，并以吸光度或吸光度单位报告结果。

但是，DTT做显色剂存在下列问题：

(1)DTT在结构上存在四种同分异构体，有左旋、消旋结构，有1、4位-SH与2、3位-SH等结构，不同厂家、不同批号的DTT因生产流程的不同，结构、性质有所不同。即使能购到的同一结构、不同厂家的DTT试剂本身也存在一定差别。因市场上DTT品种多，试剂本身有一定差别，导致检测结果常随生产厂家、试剂种类、批号等引起结果不稳定。而且，DTT溶液冷藏或冷冻保存稳定时间相对较短。

(2)分析灵敏度：采用DTT做游离钴显色剂，制作标准曲线的斜率不高(与DTE比较)，因而表明采用DTT做游离钴显色剂分辨率明显不高。

(3)试剂价格：由于DTT空间结构的特点，与不同浓度游离钴反应时，最适显色浓度较高，按目前市场价格计算，虽然DTT每克价格不高，但由于DTT法测定所用浓度较高，故配成采用DTT检测IMA的测试溶液后价格略高(与DTE比较)。

发明内容

本发明的目的在于建立一种缺血修饰白蛋白的检测方法，利用缺血修饰白蛋白的钴结合能力减弱特性的原理，使用二硫赤藓糖醇作为显色试剂检测反应体系中的游离钴，以游离钴含量间接表示缺血修饰白蛋白浓度。

本发明的另一个目的在于将检测结果以游离钴浓度报告，避免采用吸光度报告时由于仪器或试剂性能差别和不稳定导致缺血修饰白蛋白检测结果不稳定的问题，本检测方法所使用的钴标准溶液可以溯源至国家标准。

本发明提出一种缺血修饰白蛋白测定方法，其利用缺血修饰白蛋白钴结合能力减弱的特性，使用试剂检测反应体系中的游离钴，采用吸光度表示游离钴含量，间接表示缺血修饰白蛋白的浓度，检测中所使用试剂为二硫赤藓糖醇代替二硫苏糖醇，用以检测反应体系中的游离钴。

所述的对游离钴检测的结果以游离钴浓度指标替代吸光度，避免由于仪器或试剂性能差别和不稳定导致缺血修饰白蛋白检测结果的不稳定，该数据可以溯源至国家标准。

所述的测定方法使用测定管，标准管，测定对照管和标准对照管进行吸光度的测定，其中，先在测定管和测定对照管分别加入血清、氯化钴溶液、缓冲液，在标准管和标准对照管分别加入标准液、氯化钴溶液、缓冲液，混匀后放37℃水浴箱8分钟；然后，测定管和标准管分别加入DTE，测定对照管和标准对照管分别加入缓冲液，混匀放37℃温育2分钟；用分光光度计，比色杯，在480nm处以蒸馏水调零，分别读取4管的吸光度。

所述的测定管和测定对照管先加入的血清为180μl，氯化钴溶液120μl，pH7.8的Tris-HCl缓冲液1600ul；

所述的标准管和标准对照管先加入的标准液为180μl，氯化钴溶液120μl，pH7.8的Tris-HCl缓冲液1600ul；

测定管和标准管后加入的DTE为200ul，测定对照管和标准对照管后加入的缓冲液位为pH7.8的Tris-HCl缓冲液200ul。

根据上述测定所测得的4个试管的吸光度值，用下述计算公式确定游离钴浓度：

C_测定＝A_{(测定-测定对照管)}/A_{(标准-标准对照管)}*C_标准

其中：C_标准为标准液含游离钴的浓度，C_测定为所测血清含游离钴的浓度，A_{(测定-测定对照管)}为所测得测定管吸光度与测定对照管吸光度的差值，A_{(标准-标准对照管)}为所测得标准管吸光度与标准对照管吸光度的差值，游离钴浓度以μmol/L为单位表达。

所述血清的制备方式为：取静脉血3ml，1500g/分离心5分钟，血清分离后在室温2小时内，或在2℃～8℃条件下储存48小时内，或在-40℃条件下储存一个月内测定。

在测试中所采用的缓冲液的浓度为0.1mmol/L；在测试中所采用的DTE浓度为0.48mmol/L；氯化钴浓度为0.143mmol/L；游离钴浓度与血清量比例为1.12∶1较适宜。

本发明的检测方法有以下优点：

1、显色改用二硫赤藓糖醇(DTE)，与二硫苏糖醇(DTT)相比，结构单一，不存在同分异构体，性质较稳定，测定结果变化小；可避免DTT做显色剂存在的试剂本身有一定差别，导致检测结果常随生产厂家、试剂种类、批号等引起结果不稳定问题。

2.DTE与DTT溶液稳定性也不尽相同，DTE溶液冷藏或冷冻保存稳定时间长于DTT溶液。

3.DTE法分辨率高于DTT法。在两法各自最适反应条件下检测正常人与心肌缺血者，采用DTE做游离钴显色剂分辨率明显高于DTT。

4.DTE法测定所用浓度低于DTT法，故配成测试溶液后采用DTE检测IMA价格略低。

5.检测结果以游离钴浓度报告，避免采用吸光度报告时由于仪器或试剂性能差别和不稳定导致IMA检测结果吸光度不稳定的问题。本检测方法用钴标准溶液目前已溯源至国家标准(GBW08613 200604)。

具体实施方式

本发明的测定方法所用的测试管采用血清180μl，加入2.48mmol/L氯化钴溶液120μl，加pH7.8的Tris-HCl缓冲液1600ul，混匀放37℃水浴箱8分钟，加入5mmol/L的DTE 200ul，混匀放37℃温育2分钟，在UV-2800紫外可见分光光度计下，在波长480nm处比色，测定游离钴浓度。具体的测试方案见表1：

表1

	测定管	标准管	测定对照管	标准对照管
					血清(μl)	180	--	180	--
标准液(μl)	--	180	--	180
					钴试剂(μl)	120	120	120	120
缓冲液(μl)	1600	1600	1600	1600
					混匀，放37℃水浴箱8分钟
DTE(μl)	200	200	--	--
					缓冲液(μl)	--	--	200	200
混匀，放37℃水浴箱2分钟

用分光光度计，10mm比色杯，在480nm处以蒸馏水调零，分别读取上述4个测试管的吸光度，将测得的数值根据计算公式：

C_测定＝A_{(测定-测定对照管)}/A_{(标准-标准对照管)}*C_标准

其中，C_标准为标准液含游离钴的浓度，C_测定为所测血清含游离钴的浓度，A_{(测定-测定对照管)}为测定管吸光度与测定对照管吸光度的差值，A_{(标准-标准对照管)}为标准管吸光度与标准对照管吸光度的差值。

利用测定的反应体系中游离钴含量，间接表示IMA浓度。以标本中含游离钴浓度(umol/l血清)报告结果。

本发明的测定方法所采用的试剂包括：

钴试剂采用氯化钴/六水合氯化钴(CoCL₂·6H₂O)，其主要成分为CoCL₂.6H₂O，DW：237.93，含量＞99.0％；

显色剂为二硫赤藓糖醇(DTE)，其主要成分：C₄H₁₀O₂S₂，DW：154.25，含量＞99.0％；

缓冲液采用pH 7.8，0.1mol/L的Tris-HCL缓冲液，其中，

三羟甲基氨基甲烷(Tris)，其主要成分为C₄H₁₁NO₃，DW：121.14，含量＞99.5％；

HCl浓度为1mol/L；

实验室用水：纯净水，电导率＜1us。

2.48mmol/L氯化钴溶液配制方法是：称590.1mg氯化钴，加水800ml溶解，倒入1000ml容量瓶中，补足至刻度线即可。

利用2.48mmol/L氯化钴溶液的配制系列钴标准液的稀释方法是：

0μmol/L：(用生理盐水NS替代)

620μmol/L：2480μmol/L的氯化钴溶液250ul+蒸馏水750ul；

1240μmol/L：2480μmol/L的氯化钴溶液500ul+蒸馏水500ul；

1860μmol/L：2480μmol/L的氯化钴溶液500ul+1240μmol/L的氯化钴溶液500ul。

5mmol/L DTE溶液的配制方法是：称取38.6mg，加去离子水30ml溶解，用去离子水补足至50ml，放置2-8℃24小时后备用，冰箱保存可使用一周。

0.2mmol/L Tris溶液的配制方法是：称取24.228g Tris，加去离子水800ml溶解，移至1000ml容量瓶中，补足至1000ml。

缓冲液的配制方法是：取0.2mol/L Tris溶液500ml，用1mol/LHCl调制pH7.8，用水补足至近1000ml，复测pH为7.8，用水补至1000ml。

本发明的测定方法所采用的仪器包括：

(1)紫外可见分光光度计(如日立UV-2800)，其安装条件：温度：5-35℃，湿度：45-85％；数据测定范围：ABS：-2.000-3.000；测定模式：ABS；％T；Conc；技术指标：波长：190-1100nm，波长准确度：±0.3nm，波长重现性：≤0.3nm，吸光度准确性：±0.002-0.004，吸光度重现性：±0.001-0.002，噪声：≤0.0003Abs，基线稳定性：≤0.0003Abs/h，光谱带宽：≤1.5nm，杂散光：≤0.05％T，双光束。

(2)pH计(如美国Orion公司的Orion250A型，分辨率：0.001)，其安装条件：温度：5-45℃ 湿度：5-85％；基本性能特征：pH范围：-2.0～19.99，Resolution：0.01/0.1，accuracy：±0.02，Slope：80％-120％，Temperature range：-5～105℃。

(3)分析天平(如北京分析仪器厂，精度：1/万)

(4)容量瓶

本发明的测定方法受下列因素影响，应尽量避免。

①低白蛋白血症；

②大剂量使用含有还原性的药物如VitC；

③静脉采血不利，标本储储存不当导致溶血；

④非空腹采血或油腻饮食。

本发明的测定方法的标本要求为：空腹静脉取血3ml，室温2小时内离心分离血清，血清分离后储存于室温，2小时内测定结束。暂不能测定时，可在2℃～8℃储存48小时，或置-40℃一个月内测定。

在测量系统的操作中，应当对设备与辅助设备测量功能的有效性验证，分光光度计每年由计量部门定时检定。在每次使用前利用蒸馏水调零点，验证仪器性能。蒸馏水为空白，测定标准对照，标准，质控对照，质控，标本对照，标本，记录吸光度。

pH计校准：在室温25±1℃，使用pH7.00和pH10.01的标准缓冲液校准。

水浴箱的温度应恒定在37±0.1℃。

校准品范围：2480μmol/l钴标准液按本发明的方法测试吸光度应在0.95±0.1范围内。

样本检测范围：游离钴浓度在770-1925μmol/l之间。

试剂对照范围：吸光度在0.008±0.004之间。

对检测的数据处理方法是将将测定的吸光度值，按测量函数转化为游离钴浓度值。

测量结果计算方程：X＝A₁Y+b或C_测定＝A_{(测定-测定对照管)}/A_{(标准-标准对照管)}*C_标准

计算的结果以游离钴含量表达，游离钴含量的单位为μmol/L。

检测的数据可靠性分析根据分析校准函数(测量函数的反函数)

Y＝X/A₁-b/A₁，分析灵敏度R应在2700～3000之间；不确定度CV＜5％，线性：0-2480mmol/L。

测试中的影响量(干扰)分析如下：

(1)血红蛋白Hb的影响：Hb有负影响。当Hb大于26g/L时，对IMA测定有负影响。随Hb含量升高，IMA受影响越大，测定结果偏低越明显。当血清中Hb含量小于26g/L时，对IMA检测影响不明显。

(2)胆红素的影响：低浓度胆红素小于80umol/l时，对IMA测定影响很小，高浓度胆红素大于100umol/l有正影响。

(3)乳糜(TG)的影响：.TG对IMA测定有负影响。低浓度小于2mmol/L时无明显干扰，高浓度有正干扰。对于正常人血清而言，随TG含量升高，IMA逐渐降低。对于ACS患者血清而言，IMA含量降低幅度较正常人血清小。

利用空白测量可以修正部分由于血清本身原因带来的光学干扰，如溶血、黄疸、乳糜等的影响。但不能修正由于上述原因引起的化学干扰。依据各种成分在480nm处吸光度变化情况，选择空白成分，在UV-2800紫外可见分光光度计上480nm处，以蒸馏水为空白比色，记录各管吸光度。以盐水+血清做空白吸光度最低，Tris+血清+CoCl2做空白时吸光度值最高，考虑工作方便，以Tris+血清+CoCl2做空白。

本发明的检测方法的误差和不确定度为：仪器内CV＜5％，批内CV＜5％。测量正确度：该方法所用钴标准溶液已溯源至国家标准。(标准号GBW08613，200604)。

测量精密度：按EP5-A2文件要求，对本法进行精密度测试：高低二个浓度连续测定5日，每日测定8批，每批测定2个数据，共80个数据。统计结果：仪器内CV均＜5％。表明本试验精密度良好。

测量的检测限：受分析灵敏度、正确度、精密度和空白值的影响。本法检测限为：0-2480μmol/L。

测量的测定低限与高限：已测最低结果为770μmol/L，已测最高结果为1925μmol/L。

测量的质控品的制备和有效期：

(1)采用低、高IMA浓度混合血清，分装后冷冻于-40℃冰箱，至少稳定一个月。

(2)采用牛血清白蛋白分别配成20g/L、60g/L浓度，冷藏保存，可稳定数日。

测量条件的选择

1.缓冲体系与pH：

(1)缓冲体系：不同缓冲体系对测定结果有一定的影响，本方法对实验室常使用的三种缓冲体系(磷酸盐、Tris-HCI、二氨基二甲基1，3丙二醇)进行比较，以Tris-HCI缓冲液适宜该反应。

(2)缓冲液pH：缓冲液pH对该反应也有影响，通过实验证实pH7.8左右适于该反应的进行。Tris-HCI缓冲液在此pH条件下缓冲能力最强，故最终选择pH7.8Tris-HCI缓冲液做为该反应的缓冲体系。

(3)缓冲液浓度：比较了三种浓度的pH7.8Tris-HCI缓冲液，以0.1mmol/L浓度分辨正常与异常分辨率最高。

2.DTE浓度：比较了浓度为0.24、0.36、0.48、0.60、0.72mmol/L的DTE溶液，随浓度增加，显色虽逐渐加深，但正常与异常分辨率在0.36-0.60之间无明显变化，考虑DTE在该反应中的作用与试剂成本，选择的反应液DTE浓度为0.48mmol/L。

3.氯化钴浓度：氯化钴浓度在整个反应体系中作用至关重要，直接影响正常与异常的分辨能力，经实验证实反应液中氯化钴浓度为0.143mmol/L时较适宜。

4.标本量的选择：采用钴浓度与血清量(μmol/L∶μL)比例分别为0.98∶1、1.12∶1、1.26∶1、1.40∶1四种比例进行试验，以1.12∶1比例分辨正常与异常分辨率最高。

本发明的DTE法替代现有的DTT法以及对检验数据处理方面具备以下优势：

由于市场上DTE主要从细菌中提取，来源相对DTT固定，空间结构单一，保证了DTE每批产品保持较好的均一性。通过试验发现，DTE稳定性也明显优于DTT，这也与DTE空间结构有关。这一点在缺血修饰白蛋白检测方面表现出明显优势即采用DTE测定CV明显低于采用DTT测定CV，使得缺血修饰白蛋白检测结果稳定性、精密度明显提高。

国外目前的检测试剂盒采用U/l报告缺血修饰白蛋白检测结果，是一种反映血清与钴结合程度的单位，是一个相对的单位，无法实现溯源，这对定量检测试验而言，属通常不采用的方式，应在无法溯源与无确定标准的情况下迫不得已才采取的一种方式。本方法从另一个角度去考虑如何表达缺血修饰白蛋白与钴结合力的下降，即检测反应体系中剩余钴含量的方式，以游离钴含量表示血清与钴结合程度，从根本上解决了缺血修饰白蛋白定量问题。

Claims (9)

1.一种缺血修饰白蛋白测定方法，利用缺血修饰白蛋白钴结合能力减弱的特性，使用化学试剂检测反应体系中的游离钴，通过吸光度变化表示游离钴含量变化，间接表示缺血修饰白蛋白的浓度，其特征在于：检测中所使用试剂为二硫赤藓糖醇，用以检测反应体系中的游离钴。

2.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白测定方法，其特征在于：所述的对游离钴检测的结果以游离钴浓度指标替代吸光度，避免由于仪器或试剂性能差别和不稳定导致缺血修饰白蛋白检测结果的不稳定，可以实现数据的溯源。

3.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白测定方法，其特征在于：所述的测定方法使用测定管，标准管，测定对照管和标准对照管进行吸光度的测定，其中，先在测定管和测定对照管分别加入血清、氯化钴溶液、缓冲液，在标准管和标准对照管分别加入标准液、氯化钴溶液、缓冲液，混匀后放37℃水浴箱8分钟；然后，测定管和标准管分别加入DTE，测定对照管和标准对照管分别加入缓冲液，混匀放37℃温育2分钟；用分光光度计，比色杯，在480nm处以蒸馏水调零，分别读取4管的吸光度。

4.根据权利要求3所述的缺血修饰白蛋白测定方法，其特征在于：

所述的测定管和测定对照管先加入的血清为180μl，氯化钴溶液120μl，pH7.8的Tris-HCl缓冲液1600ul；

所述的标准管和标准对照管先加入的标准液为180μl，氯化钴溶液120μl，pH7.8的Tris-HCl缓冲液1600ul；

测定管和标准管后加入的DTE为200ul，测定对照管和标准对照管后加入的缓冲液为pH7.8的Tris-HCl缓冲液200ul。

5.根据权利要求1至4所述的缺血修饰白蛋白测定方法，其特征在于：根据所测得的4管的吸光度值，用下述计算公式确定游离钴浓度：

C测定＝A(测定-测定对照管)/A(标准-标准对照管)*C标准其中：C标准为标准液含游离钴的浓度，C测定为所测血清含游离钴的浓度，A(测定-测定对照管)为所测得测定管吸光度与测定对照管吸光度的差值，A(标准-标准对照管)为所测得标准管吸光度与标准对照管吸光度的差值，游离钴浓度以μmol/L为单位表达。

6.根据权利要求3或4所述的缺血修饰白蛋白测定方法，其特征在于：所述缓冲液的浓度为0.1mol/L。

7.根据权利要求3或4所述的缺血修饰白蛋白测定方法，其特征在于：所述的反应体系中DTE浓度为0.48mol/L。

8.根据权利要求3或4所述的缺血修饰白蛋白测定方法，其特征在于：所述的反应体系中氯化钴浓度为0.143mol/L。

9.根据权利要求3所述的缺血修饰白蛋白测定方法，其特征在于：游离钴浓度与血清量比例为1.12∶1。